Summary
Aquí, describimos una nueva técnica rápida que modela la lesión abierta de la médula espinal en ratas que elimina la laminectomía. La hemisección lateral se realiza mientras se observa a través de un microscopio. La técnica es versátil y también se puede utilizar en las regiones cervical, torácica y lumbar de la médula espinal de otros animales.
Abstract
Las técnicas de lesión abierta de la médula espinal que modelan lesiones similares a laceraciones requieren mucho tiempo y son invasivas porque implican laminectomía. Esta nueva técnica elimina la laminectomía mediante la extirpación de dos apófisis espinosas y el levantamiento, y luego la inclinación del arco vertebral caudal. El área quirúrgica se abre sin necesidad de laminectomía. A continuación, se realiza la hemisección lateral con control visible directo al microscopio. El trauma se minimiza, requiriendo solo una pequeña herida ósea.
Esta técnica tiene varias ventajas: es más rápida y, por lo tanto, menos pesada para el animal, y la herida ósea es más pequeña. Debido a que se elimina la laminectomía, hay menos posibilidades de lesiones no deseadas en la médula espinal y no hay astillas óseas que puedan causar problemas (las astillas óseas incrustadas en la médula espinal pueden causar hinchazón y daño secundario). El canal vertebral permanece intacto. La principal limitación es que la hemisección solo se puede realizar en los espacios intervertebrales.
Los resultados muestran que esta técnica se puede realizar mucho más rápido que el abordaje quirúrgico tradicional, utilizando laminectomía (11 min vs. 35 min). Esta técnica puede ser útil para los investigadores que trabajan con modelos animales de lesión abierta de la médula espinal, ya que es ampliamente adaptable y no requiere ningún instrumento especializado adicional.
Introduction
Desafortunadamente, las lesiones de la médula espinal (LME) son lesiones frecuentes en los seres humanos. Las lesiones de la médula espinal pueden complicarse de diferentes maneras, por ejemplo, por infecciones, y es clínicamente importante estudiar estas lesiones1. Debido a que no existe una cura única y definitiva para las lesiones de la médula espinal, aún se necesitan modelos animales para ampliar la comprensión de los investigadores y avanzar en posibles tratamientos 2,3. A pesar de que las lesiones cerradas son las más comúnmente modeladas (compresión y contusión), es clínicamente importante entender las laceraciones, que solo pueden ser modeladas en lesiones abiertas4. Los modelos de heridas abiertas que utilizan transección o hemisección se pueden utilizar para demostrar una localización más precisa de una herida en comparación con los modelos de lesiones cerradas, debido a la naturaleza de la lesión (contusión frente a corte quirúrgico). Los experimentos de heridas abiertas pueden arrojar luz sobre lesiones neuronales más específicas de una manera controlada, confiable y replicable5. La transección completa o parcial de la médula espinal es una técnica de herida abierta ampliamente utilizada y se puede ver en detalle en el artículo de Brown y Martínez6.
Al estudiar la lesión abierta de la médula espinal en ratas, varios animales presentaron problemas derivados de la cirugía: las astillas óseas de la laminectomía se incrustaron en la médula espinal y causaron hinchazón; la herida ósea más grande necesitó mucho tiempo para sanar; La cirugía duró demasiado. Se desarrolló una técnica quirúrgica alternativa para eliminar estos problemas. El objetivo era desarrollar una técnica más rápida y suave para el animal. Esta técnica recientemente desarrollada es mucho más rápida que las técnicas tradicionales de LME. El abordaje quirúrgico es mínimamente invasivo, lo que da como resultado una herida ósea más pequeña y elimina los problemas derivados de la laminectomía.
Todas las técnicas de herida abierta implican la apertura de la duramadre7. Varios estudios recientes han examinado diferentes técnicas recientemente desarrolladas, con el objetivo de mejorar los métodos anteriores 8,9. A pesar de que la apertura de la duramadre no se puede excluir con esta nueva técnica, causa una herida más pequeña en la duramadre al tiempo que ofrece una lesión confiable y controlada de la médula espinal. Consultando la literatura sobre las técnicas de lesión medular, muchos autores intentaron minimizar el tiempo de la cirugía mediante la implementación de cambios menores en la técnica original10. La laminectomía siempre forma parte de estos procedimientos quirúrgicos, aunque requiere mucho tiempo y requiere la realización de una herida ósea de mayor tamaño6. Esta técnica quirúrgica puede ser apropiada para los investigadores que utilizan modelos de lesión medular de herida abierta, específicamente la transección completa o la hemisección lateral realizada en los espacios intervertebrales (Figura 1).
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Protocol
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva de la UE (2010/63/UE) y fueron aprobados por el comité de ética animal de la Oficina Nacional de Seguridad de la Cadena Alimentaria de Hungría (PEI/001/2894-11/2014). Durante este estudio se siguieron todas las regulaciones institucionales y gubernamentales aplicables en relación con el uso ético de los animales.
1. Preparación antes de la cirugía
- Esterilice todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento (consulte la Tabla de materiales) y desinfecte las superficies donde se realizará el trabajo antes del procedimiento.
- Inyectar una dosis única de antibióticos subcutáneos de forma profiláctica.
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer los detalles de la dosis de antibióticos. - Dejar a los animales en el quirófano durante 1 h para aclimatarlos y disminuir su estrés previo a la cirugía.
- Anestesiar a la rata mediante una inyección intramuscular de una combinación de ketamina y xilacina (ketamina 80 mg/kg de peso corporal (pc) y xilacina 8 mg/kg de peso corporal).
NOTA: Además de la anestesia, la combinación deketamina y xilacina proporciona suficiente analgesia para este procedimiento. El régimen de analgesia puede ser modificado según las pautas institucionales de uso de animales. - Mantenga a la rata caliente durante el procedimiento usando una mesa caliente o luz infrarroja y mantenga los ojos húmedos durante toda la anestesia con ungüento oftálmico (vuelva a aplicarlo según sea necesario).
- Fije al animal en la mesa de operaciones con cinta quirúrgica en las patas delanteras y traseras y en la cola y, dependiendo del lugar de la lesión, también en el cuello. Si es necesario, coloque a la rata en un marco estereotáxico para estabilizarla durante la cirugía.
- Usando una sutura quirúrgica estéril, coloque un lazo alrededor de los dientes frontales superiores de la rata y fíjelo en el borde de la mesa de operaciones.
- Tire de la lengua hacia los lados para controlar las vías respiratorias.
- Afeitar el pelaje de la espalda, al menos 2 cm en cada dirección de donde se realizará la incisión.
- Desinfectar la piel de la zona quirúrgica al menos tres veces, utilizando una solución de povidona yodada y una gasa estéril. Tenga especial cuidado de remojar el pelaje que rodea el área. Asegure el sitio quirúrgico con un paño estéril.
- Evalúe la idoneidad de la anestesia antes de realizar la primera incisión pellizcando los dedos de los pies y la cola del animal. Continúe monitoreando la idoneidad de la anestesia durante todo el procedimiento.
2. Cirugía
- Coloque la incisión en la piel con una hoja de bisturí 20. Para abrir el área quirúrgica, coloque una incisión de 2-2,5 cm de largo a lo largo de la columna vertebral, cortando todas las capas de la piel. Coloque esta incisión paralela a la columna vertebral utilizando la vértebra L1 como punto medio, haciendo que se extienda ~ 1 cm tanto en dirección craneal como caudal a lo largo de la columna vertebral.
- Moviliza los lados de la herida cortando el tejido conectivo que rodea los músculos.
- Coloque dos incisiones paralelas a lo largo de la columna vertebral, penetrando en el periostio. Coloque las incisiones justo al lado de las apófisis espinales en ambos lados, abarcando la distancia entre las vértebras Th13 y L1.
- Diseccionar los músculos unidos a las vértebras con la ayuda de un raspatorium hasta que todos los ligamentos espinales sean visibles. Poner en marcha un retractor.
- Extirpar las apófisis espinales de la 13ª vértebra torácica y la1ª vértebra lumbar utilizando pinzas óseas dentales para visualizar toda el área quirúrgica. A continuación, controle el procedimiento viendo una imagen microscópica ampliada (aumento de 4x-16x).
- Use gasas estériles para controlar el sangrado durante todo el procedimiento, cuando sea necesario.
- Levante con cuidado el resto de las apófisis espinales L1, elevando el arco vertebral L1. Corta el ligamento flavum para acceder a la médula espinal. Eleva aún más las apófisis espinales caudales, permitiendo el acceso a la duramadre espinal, que también está cortada. Inclina las apófisis espinales caudales en dirección craneal para visualizar la piamadre.
- Mira a través de la piamadre la vena mediana posterior, mostrando la línea media de la columna vertebral.
- Usando la vena como una bisectriz direccional, coloque una incisión con un bisturí microquirúrgico sin afectar la vena. Colocar la incisión debajo de la vena, en el plano transversal a través del diámetro anteroposterior de la médula espinal. Corta la mitad de la médula espinal moviendo la cuchilla lateralmente lejos de la línea central.
NOTA: La incisión es unilateral, en el lado derecho, en el4º segmento lumbar. - Trate de colocar la incisión para evitar cortar la arteria espinal anterior. Asegúrese de que no se aplique un exceso de presión sobre el cuerpo vertebral al cortar la médula espinal para evitar la arteria espinal anterior en el lado ventral de la médula espinal.
Figura 1: Ilustración que muestra los pasos de la nueva técnica de LME abierta en ratas. (A) Las vértebras expuestas. (B) Extirpación de las apófisis espinales (Th13 y L1). (C) El arco vertebral levantado e inclinado de la vértebra L1. (D) Hemisección realizada en el lado derecho, con la médula espinal hemiseccionada mostrada por separado, ampliada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- No cierre la duramadre directamente durante el cierre de la herida. Suturar firmemente (tamaño de sutura 4-0) los músculos a lo largo de las apófisis espinales, cerrando indirectamente la pequeña herida en la duramadre.
- Cierre la capa de tejido conectivo dorsal con suturas.
- Finalmente, sutura la piel alrededor del sitio de la incisión.
3. Cuidados postquirúrgicos y seguimiento
- Deja que los animales se despierten en sus jaulas. Mantenga a los animales calientes usando una lámpara de calor además de la habitación con temperatura controlada. No deje a las ratas solas después de que se despierten después de la cirugía, y no las ponga juntas con otras ratas en la misma jaula.
- Controle su frecuencia respiratoria al menos cada 10 minutos hasta que esté completamente despierto. Si es necesario, aplique una estimulación suave (p. ej., frote la cabeza) para ayudar a que se despierten de la anestesia.
- Cuando los animales estén alerta y adecuadamente activos, transpórtelos de manera segura de regreso a la casa de los animales.
- Mantenga a las ratas bajo estrecha vigilancia durante las primeras 24 horas después de la cirugía. Después de las primeras 24 horas después de la cirugía, revise a los animales al menos dos veces al día hasta el final del experimento, monitoreando los signos de angustia.
- Evalúelos minuciosamente una vez al día para detectar signos de angustia utilizando el protocolo institucional de bienestar animal pertinente y tenga especial cuidado en revisar sus heridas en busca de signos de infección e inflamación.
NOTA: El estrés y la infección afectan el bienestar de los animales y el resultado de los experimentos. - Administrar antibióticos por vía subcutánea todos los días hasta el final de los experimentos. Mantenga a los animales en jaulas estériles, un animal por jaula, y dele comida y agua ad libitum, igual que antes. Al final de los experimentos (o si se observa alguna reacción adversa grave durante el período de tiempo del experimento), sacrificar a los animales de forma humanitaria, de acuerdo con el protocolo institucional de bienestar animal pertinente.
NOTA: Aquí, los animales fueron sacrificados (en un sueño profundo inducido por la combinación de ketamina y xilacina) administrando primero una perfusión fisiológica de solución salina (1/3 mL/g de peso corporal) seguida de una perfusión de paraformaldehído al 4% (1 ml/g de peso corporal).
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Representative Results
Después de la hemisección, las ratas muestran parálisis en la extremidad posterior ipsilateral (prueba in vivo de hemisección exitosa). La evaluación exhaustiva de la muestra solo se puede realizar después de la extirpación de la médula espinal (véase la Figura 2, donde la médula espinal extirpada se puede ver tanto desde el lado ventral como desde el dorsal).
Figura 2: Vistas ventral y dorsal de la médula espinal extirpada después de la hemisección. Toda la médula espinal extirpada vista desde el lado ventral (A) y el lado dorsal (B) se muestran uno al lado del otro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En primer lugar, la médula espinal extirpada se analiza en su totalidad bajo un microscopio con un aumento de 4x-16x (para evaluar el grado y la precisión de la lesión). A continuación, la muestra se analiza más a fondo mediante histología, donde se puede ver el sitio de la lesión con mayor detalle. Para la preparación de las muestras se utilizó tinción de hematoxilina y eosina (H&E) (Figura 3).
Figura 3: Muestra histológica que muestra la hemisección. Muestra histológica teñida con hematoxilina y eosina, que muestra la hemisección, vista al microscopio (aumento de 16x). Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2 y la Figura 3 muestran que la incisión es perfectamente aceptable en longitud y colocación. La calidad de las muestras fue al menos tan buena como la obtenida de animales cuya médula espinal fue hemiseccionada utilizando el abordaje quirúrgico tradicional con laminectomía (para una descripción detallada del método quirúrgico tradicional, ver 6). Las imágenes no difieren cualitativamente del resultado de cualquier otro abordaje quirúrgico, a pesar de que esta técnica es más rápida y no existe laminectomía.
Los resultados muestran que esta técnica se puede realizar mucho más rápido que el abordaje quirúrgico tradicional mediante laminectomía (11 min vs. 35 min). La médula espinal se expone durante 10-15 s con este método, en comparación con un mínimo de 3,5 min con laminectomía (hasta el cierre de la duramadre). En conclusión, este nuevo método de LM mínimamente invasivo sin laminectomía es mucho más rápido y no requiere ningún instrumental especializado adicional.
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Discussion
Esta técnica mínimamente invasiva de lesión de la médula espinal se desarrolló al estudiar ratas con lesiones de la médula espinal, y el equipo se enfrentó a problemas derivados de la propia cirugía (astillas óseas de la laminectomía que provocaban compresión y daño a la médula espinal, cirugía que tardaba demasiado tiempo, cicatrización lenta de una herida ósea grande). Al eliminar la laminectomía, el procedimiento se volvió mucho más rápido (11 min vs. 35 min), la estructura del canal vertebral permaneció intacta, la herida ósea era mucho más pequeña y no había astillas óseas que pudieran dañar la médula espinal.
La eliminación de las apófisis espinosas no se puede eliminar porque la extirpación de la apófisis espinosa superior (craneal) es necesaria para inclinar la apófisis espinosa inferior (caudal) hacia atrás. La extirpación de la apófisis espinosa inferior mejora en gran medida la visibilidad de la médula espinal, facilitando la hemisección.
La hemisección es la parte más crítica del protocolo. En este caso, la hemisección se realiza a mano alzada, aunque no es un requisito previo. En su lugar, se puede utilizar un instrumento estereotáxico. La rata también puede ser colocada en un marco estereotáxico para estabilizar al animal durante la cirugía6. Este paso requerirá solo una ligera modificación en la técnica descrita aquí. Esto también puede ser útil si alguien con poca experiencia está realizando el procedimiento.
Esta nueva técnica es extremadamente versátil. En este caso, el procedimiento se realizó en el segmento lumbar L4 (vértebra L1); Sin embargo, se puede utilizar en otros segmentos de la médula espinal adaptados a las necesidades específicas del experimento real (esta técnica también se ha utilizado en las regiones torácica y cervical). También se puede ajustar fácilmente para implementar una transección completa de la médula espinal en lugar de una hemisección. La elevación del arco vertebral permite la inspección directa de la parte dada de la médula espinal. Por lo tanto, también se puede extraer un pequeño disco de tejido de la médula espinal para garantizar una transección completa.
El uso de esta nueva técnica no se limita a las ratas, sino que también se puede aplicar a otras especies utilizadas para modelar las lesiones de la médula espinal (por ejemplo, ratones, cerdos, perros). La principal limitación de esta técnica es que debido a que la hemisección (o transección) solo se puede realizar en espacios intervertebrales, no es adecuada para aquellos que específicamente necesitan que el corte se coloque en los espacios vertebrales. Además, al tratarse de una técnica de herida abierta, no es óptima para modelar contusiones o lesiones por compresión.
Sin embargo, esta técnica puede ser la opción ideal para el estudio de la LM abierta, ya que la hemisección (o transección) se realiza con precisión y es fácilmente reproducible. Las vías de la columna vertebral también se pueden estudiar con menos artefactos, ya que el canal vertebral permanece intacto. Puede ser especialmente útil cuando se estudian enfoques terapéuticos mínimamente invasivos. Con esta técnica, el foco de atención puede estar únicamente en el tratamiento y no en los posibles efectos secundarios de la cirugía11.
En conclusión, esta nueva técnica mínimamente invasiva no requiere ni nuevos equipos ni costosos ajustes, ya que solo se utilizan equipos disponibles en los laboratorios que trabajan con animales. Se puede adaptar fácilmente a las necesidades específicas de un estudio determinado (lugar de la lesión, hemisección o transección, tipo de animal). También es fácil de aprender. Por lo tanto, esta modificación podría ser de interés para los investigadores que trabajan con modelos animales abiertos de LME.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros o relaciones personales que puedan haber influido en el trabajo reportado en este artículo.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Gergely Ángyán por la obra original. Este trabajo de investigación fue financiado por la Universidad de Semmelweis, Budapest, Hungría. Este estudio también contó con el apoyo del Programa Operativo de Desarrollo de Recursos Humanos de Hungría (EFOP-3.6.2-16-2017-00006). Se recibió apoyo adicional del Programa de Excelencia Temática (2020-4.1.1.-TKP2020) del Ministerio de Innovación y Tecnología de Hungría, en el marco del programa temático de Terapia de la Universidad de Semmelweis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Augmentin (1,000 mg/200 mg powder) | GlaxoSmithKline, UK | One-time dose of s.c. antibiotics prophylactically (10 mg of amoxicillin and 2 mg clavulanic acid; Augmentin 1,000 mg/200 mg powder). Every day following surgery, 10 mg of amoxicillin and 2 mg of clavulanic acid (Augmentin 1,000 mg/200 mg powder) per day per animal | |
| Betadine | EGIS, Hungary | Disinfect the skin of the surgical area using a povidone-iodine solution | |
| Calypsol (50 mg/mL) | Richter Gedeon, Hungary | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| CP XYLAZIN 2% (20 mg/mL) | Produlab Pharma B.V., the Netherlands | Anesthesia: combination of ketamine 80 mg/kg and xylazine 8 mg/kg intramuscularly | |
| Dental bone forceps | Dentech, Hungary | BS 0127 | Remove the spinous processes of the 13th thoracic vertebra and the 1st lumbar vertebra using dental bone forceps |
| dental surgical micromotor | W&H, Austria | MF-TECTORQUE | Using a dental surgical micromotor, a laminectomy is performed at the L1 vertebra |
| optical microscope | Zeiss, Germany | OPMI19-FC | Control the procedure by viewing an enlarged (16x magnification) microscopic image |
| physiological saline solution (0.9% NaCl) | Fresenius Kabi, Germany | Keep the rat's eyes moist throughout the entire anesthesia using physiological saline solution drops (reapply as necessary) | |
| raspatorium | Dentech, Hungary | FK 1164 | Dissect the muscles attached to the vertebrae with the aid of a raspatorium, until all the spinal ligaments are visible. |
| retractor | Dentech, Hungary | RT 1253 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 173 | |
| scalpel | Dentech, Hungary | BB 184 | |
| scalpel blade 12 | B. Braun, Germany | 12 | |
| scalpel blade 20 | B. Braun, Germany | 20 | |
| sterile cut gauze 10 x 10 cm | Sterilux, Hartmann, Germany | ||
| sutures (monofilament, synthetic; absorbable and nonabsorbable), size: 4-0 | B. Braun, Germany | ||
| tweezer (13 cm) | Dentech, Hungary | BD 1555 | |
| tweezer (delicate tissue forceps) | Dentech, Hungary | BD 1670 |
References
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