Summary
CUT&RUN y sus variantes se pueden utilizar para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina. Este protocolo describe cómo determinar la localización de proteínas en la cromatina utilizando uliCUT&RUN unicelular.
Abstract
Determinar las ubicaciones de unión de una proteína en la cromatina es esencial para comprender su función y los posibles objetivos reguladores. La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para determinar la localización de proteínas durante más de 30 años y se define por el uso de un anticuerpo para extraer la proteína de interés de la cromatina sonicada o digerida enzimáticamente. Más recientemente, las técnicas de anclaje de anticuerpos se han vuelto populares para evaluar la localización de proteínas en la cromatina debido a su mayor sensibilidad. Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease (CUT&RUN) es el derivado de todo el genoma del inmunoaprestigio de cromatina (ChIC) y utiliza la proteína A recombinante unida a la nucleasa microcócica (pA-MNasa) para identificar la región constante IgG del anticuerpo dirigida a una proteína de interés, lo que permite la escisión específica del sitio del ADN que flanquea la proteína de interés. CUT&RUN se puede utilizar para perfilar modificaciones de histonas, factores de transcripción y otras proteínas de unión a la cromatina, como los factores de remodelación de nucleosomas. Es importante destacar que CUT&RUN se puede utilizar para evaluar la localización de proteínas asociadas eucromáticas o heterocromáticas y modificaciones de histonas. Por estas razones, CUT&RUN es un método potente para determinar los perfiles de unión de una amplia gama de proteínas. Recientemente, CUT&RUN ha sido optimizado para el perfil del factor de transcripción en poblaciones bajas de células y células individuales y el protocolo optimizado se ha denominado CUT&RUN de entrada ultra baja (uliCUT&RUN). Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de factor de una sola celda utilizando uliCUT& RUN en un formato manual de 96 pocillos.
Introduction
Muchas proteínas nucleares funcionan interactuando con la cromatina para promover o prevenir actividades basadas en plantillas de ADN. Para determinar la función de estas proteínas que interactúan con la cromatina, es importante identificar las ubicaciones genómicas en las que se unen estas proteínas. Desde su desarrollo en 1985, la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) ha sido el estándar de oro para identificar dónde se une una proteína a la cromatina 1,2. La técnica chIP tradicional tiene el siguiente flujo de trabajo básico: las células se cosechan y se reticulan (generalmente con formaldehído), la cromatina se corta (generalmente con métodos de sonicación severos, lo que requiere reticulación), la proteína de interés se inmunoprecipita utilizando un anticuerpo que se dirige a la proteína (o proteína marcada) seguido de un anticuerpo secundario (acoplado a agarosa o perlas magnéticas), la reticulación se invierte, la proteína y el ARN se digieren para purificar el ADN, y este ADN enriquecido con ChIP se utiliza como plantilla para el análisis (utilizando sondas radiomarcadas 1,2, qPCR3, microarrays 5,6 o secuenciación4). Con el advenimiento de los microarrays y la secuenciación profunda masivamente paralela, ChIP-chip 5,6 y ChIP-seq4 se han desarrollado más recientemente y permiten la identificación de todo el genoma de la localización de proteínas en la cromatina. La reticulación ChIP ha sido una técnica potente y fiable desde su advenimiento con importantes avances en resolución por ChIP-exo7 y ChIP-nexus8. En paralelo al desarrollo de ChIP-seq, se han establecido protocolos nativos (no reticulación) para ChIP (N-ChIP), que utilizan la digestión de nucleasas (a menudo utilizando nucleasa microcócica o MNasa) para fragmentar la cromatina, a diferencia de la sonicación realizada en las técnicas tradicionales de ChIP de reticulación9. Sin embargo, un inconveniente importante de las tecnologías de reticulación ChIP y N-ChIP ha sido el requisito de un alto número de células debido al bajo rendimiento de ADN después de la manipulación experimental. Por lo tanto, en años más recientes, muchos esfuerzos se han centrado en optimizar las tecnologías ChIP para la entrada de células bajas. Estos esfuerzos han dado lugar al desarrollo de muchas tecnologías poderosas basadas en ChIP que varían en su aplicabilidad y requisitos de insumos 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Sin embargo, han faltado tecnologías basadas en ChIP-seq de una sola célula, especialmente para las proteínas no histonas.
En 2004, se desarrolló una tecnología alternativa para determinar la ocupación de proteínas en la cromatina denominada Escisión Endógena de Cromatina (ChEC) e Inmunoapalamento de Cromatina (ChIC)19. Estas técnicas de locus único utilizan una fusión de MNasa a la proteína de interés (ChEC) o a la proteína A (ChIC) para el corte directo del ADN adyacente a la proteína de interés. En años más recientes, tanto ChEC como ChIC se han optimizado para el perfil de proteínas de todo el genoma en la cromatina (ChEC-seq y CUT&RUN, respectivamente)20,21. Si bien ChEC-seq es una técnica poderosa para determinar la localización de factores, requiere el desarrollo de proteínas de fusión de MNasa para cada objetivo, mientras que ChIC y su variación de todo el genoma, CUT&RUN, se basan en un anticuerpo dirigido hacia la proteína de interés (como con ChIP) y la proteína A-MNasa recombinante, donde la proteína A puede reconocer la región constante IgG del anticuerpo. Como alternativa, se ha desarrollado una fusión proteína A/proteína G-MNasa (pA/G-MNasa) que puede reconocer una gama más amplia de regiones constantes de anticuerpos22. CUT&RUN se ha convertido rápidamente en una alternativa popular a ChIP-seq para determinar la localización de proteínas en todo el genoma de la cromatina.
La entrada ultrabaja CUT&RUN (uliCUT&RUN), una variación de CUT&RUN que permite el uso de entradas bajas y de una sola celda, se describió en 201923. Aquí, se describe la metodología para una aplicación manual de una sola celda en formato de 96 pocillos. Es importante destacar que desde el desarrollo de uliCUT&RUN, se han desarrollado dos alternativas para el perfilado de histonas, CUT&Tag e iACT-seq, proporcionando perfiles robustos y altamente paralelos de proteínas histonas24,25. Además, scCUT&Tag ha sido optimizado para perfilar múltiples factores en una sola célula (multiCUT&Tag) y para su aplicación a proteínas no histonas26. Juntos, CUT&RUN proporciona una alternativa atractiva a ChIP-seq de baja entrada donde uliCUT&RUN se puede realizar en cualquier laboratorio de biología molecular que tenga acceso a un clasificador celular y equipo estándar.
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Protocol
Declaración de ética: Todos los estudios fueron aprobados por la Oficina Institucional de Bioseguridad de Protecciones de Investigación de la Universidad de Pittsburgh.
1. Prepara cuentas magnéticas
NOTA: Realice antes de la clasificación de celdas y mantenga el hielo hasta su uso.
- Pipetear 30 μL de microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA mezcla de lodo de perlas por reacción a un tubo de microfuge fresco de 1,5 ml y agregar 850 μL de binding buffer, pipeteando suavemente para mezclar.
NOTA: Las microesferas paramagnéticas conjugadas con A son perlas magnéticas recubiertas de lectina que permiten la unión a la membrana lipídica. - Coloque el tubo en una rejilla magnética y permita que las perlas se imanten durante 1-2 minutos. Una vez que el sobrenadante se haya despejado, retire y deseche el sobrenadante sin molestar las cuentas.
- Retire el tubo de la rejilla magnética y lave las perlas resuspiendo en 1 ml de binding buffer.
- Repita los pasos 1.2 y 1.3.
- Magnetizar las perlas durante 2 min y retirar el sobrenadante para desecharlo.
- Retire el tubo de la rejilla magnética y vuelva a suspender las perlas en 30 μL de binding buffer por reacción.
- Sostenga la mezcla de cuentas lavadas sobre hielo hasta que se clasifiquen las células.
2. Células de cosecha
NOTA: Este paso está escrito para células adheridas y optimizado para células madre embrionarias murinas E14. El cultivo y la cosecha de las células dependen del tipo de célula.
- Retire las células de la incubadora de 37 °C y examínelas bajo un microscopio para asegurar la calidad.
- Aspire el medio de la placa celular y enjuague con 5 ml de 1x PBS.
- Aspire PBS de la placa y recolecte las células (utilizando métodos tradicionales de recolección de células que diferirán según el tipo de célula). Obtenga la suspensión unicelular canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica contra el plato de cultivo, si es necesario.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y gire hacia abajo a 200 x g durante 5 min.
- Aspirar fuera del medio para desechar y lavar el pellet celular con 5 mL de PBS + 1% FBS.
- Gire hacia abajo las células a 200 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 5 ml de PBS + 1% FBS.
- Cuente las células y transfiera 1 ml de 1 x 106 células a un tubo de microfuge fresco de 1,5 ml.
- Agregue 5 μL de 7-amino-actinomicina D (7-AAD), invierta el tubo bien para mezclar y luego aplique la muestra al clasificador celular para clasificar células individuales vivas en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos.
NOTA: El colorante 7-AAD está excluido de las células vivas y, por lo tanto, se puede utilizar en la clasificación de células vivas.
3. Clasificación celular y lisis
- Prepare una placa de 96 pocillos compatible con el clasificador de celdas con 100 μL de tampón de extracción nuclear (NE) en cada pozo antes de la clasificación de celdas.
- Clasifique las celdas en placas de 96 pocillos siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Haga girar rápidamente la placa (600 x g durante 30 s) para asegurarse de que las células estén en el tampón dentro de los pozos.
NOTA: Vale la pena probar en un experimento preliminar si las células que se utilizan se llevan de manera confiable al fondo de los pozos. - Mantenga las muestras en hielo durante 15 minutos.
- Gire las muestras a 600 x g durante 5 min a 4 °C y pipetee cuidadosamente para eliminar el sobrenadante (dejando atrás 5 μL).
- Resuspender cada muestra en 55 μL de tampón NE y añadir 30 μL de las microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA prelavadas (a partir del paso 1.7; en Binding Buffer) a cada reacción.
- Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
4. Muestras prebloqueadas para prevenir la digestión temprana por MNasa
- Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos, permita que las perlas se unan durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante.
- Agregue 100 μL de buffer de bloqueo a las perlas unidas al núcleo y mezcle con pipeteo suave.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Adición de anticuerpos primarios
- Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
- Retire la placa de la rejilla magnética y vuelva a suspender las perlas en 100 μL de wash buffer por reacción con un pipeteo suave.
- Vuelva a colocar la placa en el bastidor magnético de 96 pocillos, permita que el sobrenadante se despeje y luego retire y deseche el sobrenadante.
- Resuspend las perlas en 25 μL de Wash Buffer por reacción con pipeteo suave.
- Haga una mezcla maestra de anticuerpos primarios: 25 μL de Wash Buffer + 0,5 μL de anticuerpo por reacción.
- Mientras vórtice suavemente las perlas unidas a los núcleos, agregue 25 μL de la mezcla maestra de anticuerpos primarios a cada muestra que se esté tratando con un anticuerpo dirigido a la proteína de interés (típicamente dilución final 1:100). Añadir 25 μL de Wash Buffer sin anticuerpos, si se realiza un control.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
- Coloque las muestras en un bastidor magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
- Retire la placa de la rejilla magnética y lave las perlas con 100 μL de Wash Buffer, resuspiendo por pipeteo.
6. Adición de pA-MNasa o pA/G-MNasa
NOTA: La proteína A tiene una alta afinidad por las moléculas de IgG de ciertas especies, como los conejos, pero no es adecuada para las IgG de otras especies, como ratones o ratas. Alternativamente, se puede utilizar la proteína A /G-MNasa. Este híbrido se une a igG de conejo, ratón y rata, evitando la necesidad de anticuerpos secundarios cuando se utilizan anticuerpos primarios de ratón o rata.
- Coloque la placa de nuevo en un estante magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
- Retire la placa de la rejilla magnética y vuelva a suspender cada muestra en 25 μL de wash buffer.
- Haga una mezcla maestra de pA-MNasa (25 μL de Wash Buffer + cantidad optimizada de pA-MNasa por reacción).
- Mientras vórtice suavemente, agregue 25 μL de la mezcla maestra pA-MNasa a cada muestra, incluidas las muestras de control.
NOTA: La concentración de pA-MNasa varía según la preparación, si es casera, y debe probarse antes de su uso en cada purificación independiente. Para la pA/G-MNasa, se deben utilizar 2,5 μL de la culata 20x. - Incubar las muestras durante 30 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
- Retire la placa de la rejilla magnética y lave las perlas con 100 μL de Wash Buffer, resuspiendo mediante pipeteo suave.
7. Digestión dirigida del ADN
- Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos, deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y luego retire y deseche el sobrenadante.
- Retire las muestras del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 50 μL de Wash Buffer mediante pipeteo suave.
- Equilibre las muestras a 0 °C en una mezcla de hielo y agua durante 5 min.
- Retire las muestras del baño de hielo/agua a 0 °C y agregue 1 μL de CaCl2 de 100 mM utilizando una pipeta multicanal. Mezcle bien (3-5 veces) con pipeteo suave utilizando una pipeta multicanal de mayor volumen, y luego devuelva las muestras a 0 ° C.
NOTA: Mezclar bien aquí es esencial. Se añade CaCl2 para activar la digestión de la MNasa del ADN que flanquea la proteína de interés. - Inicie un temporizador de 10 minutos tan pronto como la placa vuelva al baño de hielo / agua.
- Detenga la reacción canalizando 50 μL de 2XRSTOP+ Buffer en cada pozo, en el mismo orden en que se agregó el CaCl2 .
NOTA: Haga 2XRSTOP + Buffer antes de que termine la digestión de 10 minutos para evitar la digestión excesiva.
8. Fraccionamiento de muestras
- Incubar las muestras durante 20 min a 37 °C.
- Girar la placa a 16.000 x g durante 5 min a 4 °C.
- Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos, permita que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de 5 minutos y transfiera los sobrenadantes a una placa fresca de 96 pocillos. Descarta las cuentas.
9. Extracción de ADN
- Añadir 1 μL de dodecil sulfato de sodio al 10% (SDS) y 0,83 μL de 20 mg/ml de proteinasa K a cada muestra.
PRECAUCIÓN: El polvo de SDS es dañino si se inhala. Los usuarios deben usar en espacios bien ventilados usando gafas, guantes y un respirador de grado N95, manejando con cuidado. - Mezclar las muestras mediante pipeteo suave.
- Incubar las muestras durante 10 min a 70 °C.
- Devolver la placa a temperatura ambiente y añadir 46,6 μL de 5 M de NaCl y 90 μL de 50% de PEG 4000. Mezclar mediante pipeteo suave.
- Añadir 33 μL de perlas de poliestireno-magnetita a cada muestra e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Asegúrese de llevar las perlas de poliestireno-magnetita a temperatura ambiente (~ 30 min) y mezcle bien antes de usar. - Coloque la placa en un estante magnético y deje que el sobrenadante se despeje durante ~ 5 minutos, y luego deseche cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las cuentas.
- Enjuague 2x con 150 μL de etanol al 80% sin molestar las perlas.
PRECAUCIÓN: El etanol es altamente inflamable y causa irritación de la piel, los ojos y los pulmones. Realice este paso con la ropa de laboratorio adecuada y en una capucha ventilada. - Gire la placa brevemente a 1000 x g durante 30 s. Vuelva a colocar la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos y retire todo el EtOH residual sin molestar las perlas.
- Seque al aire las muestras durante ~ 2-5 min.
NOTA: No seque las perlas por más de 5 minutos. Si es diligente en la eliminación del EtOH, 2-3 minutos de secado son suficientes. - Resuspendir las perlas con 37,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en un estante magnético y deje que las cuentas se unan durante 5 minutos.
- Transfiera 36,5 μL del sobrenadante a una placa de 96 pocillos compatible con termociclador fresco. Descarta las cuentas.
NOTA: El experimento se puede detener aquí almacenando muestras a -20 °C o puede continuar con la compilación de la biblioteca (pasos 10-15).
10. Reparación final, fosforilación, adenilación
NOTA: Los reactivos se obtienen como se hace referencia en la Tabla de Materiales. El siguiente protocolo sigue un método similar al kit comercial como el kit NEBNext Ultra DNA II.
- Diluir 5 U/μL de ADN polimerasa T4 1:20 en 1 tampón de ADN ligasa T4.
- Preparar una mezcla maestra de reparación final/3'A: 2 μL de tampón de la ligasa de ADN T4 10x, 2,5 μL de dNTP de 10 mM, 1,25 μL de ATP de 10 mM, 3,13 μL de PEG 4000 al 40%, 0,63 μL de 10 U/μL T4 PNK, 0,5 μL de ADN polimerasa T4 diluida, 0,5 μL de ADN polimerasa Taq 5U/μL, con un volumen total de 13,5 μL por reacción.
NOTA: Asegúrese de llevar el 40% de PEG 4000 a temperatura ambiente antes de pipetear. - Añadir 13,5 μL de mezcla maestra de reparación final/3'A a 36,5 μL de ADN.
- Mezcle la reacción por vórtice rápido y luego un giro rápido (500 x g durante 10 s).
- Incubar utilizando las siguientes condiciones de reacción en un termociclador preenfriado con una tapa calentada para temperaturas >20 °C. Utilice las condiciones de reacción: 12 °C durante 15 min, 37 °C durante 15 min, 72 °C durante 20 min, mantener a 4 °C.
11. Ligadura del adaptador
NOTA: Mantenga las muestras en hielo mientras configura la siguiente reacción. Permita que el tampón de ligasa llegue a temperatura ambiente antes de pipetear. Diluir el adaptador (ver Tabla de Materiales) en una solución de 10 mM Tris-HCl que contenga 10 mM NaCl (pH 7.5). Debido al bajo rendimiento, no precuantifique el ADN enriquecido con CUT&RUN. Más bien, genere diluciones de 25 veces del adaptador, utilizando una concentración final del adaptador de trabajo de 0,6 μM.
- Haga una mezcla maestra de ligadura: 55 μL de tampón de ligasa (2x), 5 μL de ADN ligasa T4 y 5 μL de adaptador diluido, con un volumen total de 65 μL por reacción.
- Añadir 65 μL de la mezcla de ligadura maestra a 50 μL de ADN a partir del paso 10.5.
- Mezclar por vórtice rápido, seguido de hilado rápido (500 x g durante 10 s).
- Incubar a 20 °C en un termociclador (sin tapa calefactada) durante 15 min.
NOTA: Continúe inmediatamente con el siguiente paso.
12. Digestión del USUARIO
- Agregue 3 μL de enzima USER a cada muestra, vórtice y espín (500 x g durante 10 s).
- Incubar en termociclador a 37 °C durante 15 min (tapa calentada a 50 °C).
13. Limpieza de perlas de poliestireno-magnetita después de la reacción de ligadura
NOTA: Permita que las perlas de poliestireno-magnetita se equilibren a temperatura ambiente (~ 30 min). Vórtice para homogeneizar la solución de perlas antes de usarla. Realice los siguientes pasos a temperatura ambiente.
- Añadir 39 μL (0,33x) de solución de perlas de poliestireno-magnetita a cada pocillo que contenga ADN ligado por adaptador.
- Mezcle bien mediante pipeteo y luego incube las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que el ADN se una a las cuentas.
- Coloque las muestras en un estante magnético de 96 pocillos e incube durante 5 minutos hasta que el sobrenadante esté despejado.
- Mantenga la placa en la rejilla magnética y retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las perlas.
- Enjuague las perlas con 200 μL de 80% etOH sin molestar las perlas.
- Incubar durante 30 s en un bastidor magnético de 96 pocillos para permitir que la solución se despeje.
- Retire y deseche el sobrenadante sin molestar las cuentas.
- Repita los pasos 13.5-13.7 para un total de dos lavados.
- Gire la placa brevemente a 500 x g durante 10 s, vuelva a colocar la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos y elimine el EtOH residual sin molestar las perlas.
- Mantenga la placa en el estante magnético y seque al aire las muestras durante 2 minutos.
NOTA: No seque en exceso las cuentas. - Retire la placa del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 28,5 μL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es muy corrosivo. Los usuarios deben manejarlo con cuidado en una capucha de humo químico usando gafas, guantes y una bata de laboratorio. - Resuspenda completamente las cuentas mediante pipeteo, teniendo cuidado de no producir burbujas.
- Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y deje que la solución se despeje durante 5 minutos.
- Transfiera 27,5 μL de sobrenadante a una nueva placa de PCR y deseche las perlas.
14. Enriquecimiento de la biblioteca
NOTA: Los cebadores se diluyen con la misma solución que el adaptador. Para esta construcción de biblioteca, utilice una concentración final de imprimación de trabajo de 0,6 μM.
- Añadir 5 μL de imprimación indexada diluida (ver Tabla de Materiales) a cada muestra.
NOTA: Cada muestra necesita un índice diferente para ser identificado después de la secuenciación. - Preparar una mezcla maestra de PCR: 10 μL de tampón de PCR de alta fidelidad 5x, 1,5 μL de dNTP de 10 mM, 5 μL de imprimación universal diluida, 1 μL de polimerasa de alta fidelidad de inicio en caliente de 1 U, con un volumen total de mezcla maestra de 17,5 μL por muestra.
- Añadir 17,5 μL pf mezcla de PCR a 32,5 μL de ADN ligado por adaptador purificado (en este volumen se incluyen 5 μL de imprimación indexada).
- Mezclar la solución mediante pipeteo.
- Incubar en un termociclador utilizando las siguientes condiciones de reacción con una velocidad de rampa máxima de 3 °C/s: 98 °C durante 45 s, 98 °C durante 45 s, 60 °C durante 10 s, repetir el segundo y tercer paso 21 veces, 72 °C durante 1 min, mantener a 4 °C.
NOTA: Las muestras se pueden mantener a 4 °C para almacenamiento a corto plazo o -20 °C para almacenamiento a largo plazo.
15. Limpieza de cuentas de poliestireno-magnetita
- Añadir 60 μL (1,2x) de perlas de poliestireno-magnetita a cada muestra.
- Resuspend las perlas mediante pipeteo e incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en una rejilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución esté clara.
- Deseche el sobrenadante y enjuague las perlas con 200 μL de 80% etOH sin molestar las perlas.
- Repita el paso de lavado para un total de dos lavados al 80% de EtOH.
- Gire la placa a 500 x g durante 10 s, coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y permita que las cuentas se unan durante 5 minutos.
- Pipeta para eliminar el exceso de EtOH sin molestar las perlas y dejar que las perlas se sequen al aire durante 2 min.
NOTA: No seque en exceso las cuentas. - Resuspend las perlas en 21 μL de agua libre de nucleasa e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en un estante magnético y deje que la solución se despeje durante 5 minutos.
- Transfiera 20 μL del sobrenadante a una nueva placa.
NOTA: El experimento se puede detener aquí almacenando la muestra a -20 °C. - Cuantificar las concentraciones de la biblioteca con un fluorómetro (ver Tabla de Materiales), utilizando un reactivo 1x HS.
- Si la concentración lo permite, ejecute 30 ng de muestra en gel de agarosa al 1,5% con una escalera de bajo peso molecular para visualizar. Alternativamente, visualice en un analizador de fragmentos o instrumento relacionado.
- Bibliotecas de secuencias en una plataforma Illumina para obtener ~50,000-100,000 lecturas mapeadas de forma única.
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Representative Results
Aquí, se presenta un protocolo detallado para el perfil de proteínas unicelulares en cromatina utilizando un formato manual de 96 pocillos uliCUT&RUN. Si bien los resultados variarán según la proteína que se perfila (debido a la abundancia de proteínas y la calidad de los anticuerpos), el tipo de célula y otros factores contribuyentes, los resultados anticipados para esta técnica se discuten aquí. La calidad celular (apariencia celular y porcentaje de células viables) y la clasificación de una sola célula deben evaluarse antes o en el momento de la clasificación de células vivas en el tampón NE. Un ejemplo de colonias de células ES y clasificación celular se muestra en la Figura 2A, B. Específicamente, no se deben usar células de baja calidad, y si la calidad es un problema, se debe tener cuidado de seguir las pautas para el tipo de célula específico. Además, la clasificación precisa de células por el instrumento de clasificación de células debe evaluarse antes de la experimentación. Por ejemplo, las células de prueba podrían clasificarse y teñirse utilizando la tinción Hoechst 33342 y contarse para asegurar que se encuentre 0 o 1 celda en cada pozo. Si no se encuentran celdas individuales, se deben optimizar las condiciones de clasificación. Después de la preparación de la biblioteca, las muestras se pueden evaluar en un gel de agarosa (si la concentración permite una carga de 30 ng o más, ya que hay un límite inferior para la visualización del ADN en un gel de agarosa) o un analizador de fragmentos (o dispositivo similar como una tapetación o un bioanalizador) antes de la secuenciación y los resultados de ejemplo se muestran en la Figura 2C, D. Específicamente, la distribución de tamaño esperada es de ~ 150 a ~ 500 pb. En cantidades celulares más altas, CUT&RUN realizado en proteínas grandes (como las histonas) tendrá una distribución de tamaño del lado derecho, donde la mayoría del ADN se verá ~ 270 pb; sin embargo, este hombro generalmente no se observa en experimentos unicelulares.
Después de la secuenciación, la calidad de las lecturas de secuenciación debe evaluarse utilizando FASTQC. Se debe determinar el porcentaje de lecturas de mapeo único. Por lo general, se observan lecturas de mapeo único de 0.5% -10% en experimentos de una sola célula. Estos porcentajes de mapeo son similares a otras técnicas unicelulares basadas en ADN30. A continuación, se debe determinar la distribución de tamaño de las lecturas después del mapeo para garantizar que el perfil sea similar a la secuenciación previa (con la secuencia del adaptador ya no contribuyendo a los tamaños de lectura).
Después de evaluar la calidad de los datos, la ocupación de proteínas se puede visualizar utilizando varios métodos: las imágenes del navegador del genoma de locus único se pueden visualizar utilizando el navegador del genoma UCSC o IGV (Figura 3A) y los patrones de ocupación de todo el genoma sobre coordenadas genómicas específicas se pueden visualizar utilizando metatramas (Figura 3B, abajo), mapas de calor (Figura 3B, arriba) o mapas de calor 1D (Figura 3C). Para obtener más información sobre el análisis de datos, consulte el estudio de Patty y Hainer27. Los datos de una sola célula de una célula diploide darán como resultado hasta cuatro lecturas que contribuyen a cada locus (cuatro lecturas si la célula estaba en mitosis), pero más a menudo una o dos lecturas. Por lo tanto, los datos son binarios, y un fondo alto puede confundirse más fácilmente con ocupación, en relación con los experimentos de células altas. Por lo tanto, se recomienda realizar un experimento CUT&RUN paralelo en un número de células alto (5.000 a 100.000 células), si es posible, para adquirir todas las ubicaciones de unión posibles para la proteína de interés. A continuación, los datos de una sola celda se pueden comparar con posibles ubicaciones de enlace. En los ejemplos que se muestran en la Figura 3, los resultados de CTCF uliCUT&RUN de una sola célula se comparan con CTCF uliCUT&RUN de células altas (Figura 3A) o ChIP-seq (Figura 3B, C). Como se demostró anteriormente, los picos CTCF, SOX2 y NANOG de una sola célula uliCUT&RUN representaron en gran medida picos más fuertes de conjuntos de datos ChIP-seq de células altas23.
Figura 1: Esquema del protocolo uliCUT&RUN. Las células se cosechan y se clasifican en una placa de 96 pocillos que contiene un tampón NE. Los núcleos individuales se unen a microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA, y secuencialmente se agrega un anticuerpo (dirigido a la proteína de interés) y pA-MNasa o pA / G-MNasa. El ADN adyacente a la proteína se escinde a través de la MNasa, y el ADN se purifica para su uso en la preparación de la biblioteca. Esta figura fue creada con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos de resultados de la clasificación celular y el control de calidad de las bibliotecas uliCUT&RUN. (A) Imagen de células madre embrionarias murinas (ES) de alta calidad. Barra de escala: 200 μm. (B) Salida de la clasificación de una sola celda después de agregar 7AAD a las células ES cosechadas y clasificar en un instrumento FACS. (C) Gel de agarosa teñido de bromuro de etidio que representa bibliotecas uliCUT&RUN completas. El carril 1 es una escalera de bajo peso molecular y los carriles 2-21 son ejemplos de bibliotecas uliCUT&RUN unicelulares individuales exitosas antes de la secuenciación. (D) Gel de agarosa teñido de bromuro de etidio que representa bibliotecas uliCUT&RUN completadas subóptimas y óptimas. El carril 1 es una escalera de bajo peso molecular, el carril 2 es una biblioteca subóptima debido a la digestión ineficiente de la MNasa, y el carril 3 es una biblioteca exitosa con una digestión adecuada. (E) Distribución del analizador de fragmentos de una biblioteca uliCUT&RUN de una sola célula antes de la secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de resultados esperados para datos de células ES individuales uliCUT&RUN. (A) Seguimiento del navegador de alto número de células (5.000 células) CTCF o control negativo (Sin anticuerpo, No Ab) uliCUT&RUN (dos pistas principales) y CTCF uliCUT&RUN de una sola célula. La imagen es reproducida, con permiso, de Patty y Hainer27. (B) Mapas de calor (arriba) y metatramas (abajo) de CTCF unicelular o control negativo (No Ab) uliCUT&RUN sobre sitios CTCF ChIP-seq publicados anteriormente (GSE11724). La imagen se reproduce, con permiso, de Hainer et al.23. (C) Mapas de calor 1D de CTCF unicelular o control negativo (No Ab) uliCUT&RUN sobre sitios CTCF ChIP-seq publicados anteriormente (GSE11724). La imagen se reproduce, con permiso, de Hainer et al.23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Composición de varios buffers utilizados en este protocolo. El volumen de solución de stock requerido se enumera con la concentración final escrita entre paréntesis. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
CUT&RUN es un protocolo eficaz para determinar la localización de proteínas en la cromatina. Tiene muchas ventajas en relación con otros protocolos, que incluyen: 1) alta relación señal-ruido, 2) protocolo rápido y 3) baja cobertura de lectura de secuenciación requerida, lo que lleva a ahorros de costos. El uso de proteína A o proteína A/G-MNasa permite aplicar CUT&RUN con cualquier anticuerpo disponible; por lo tanto, tiene el potencial de perfilar rápida y fácilmente muchas proteínas. Sin embargo, la adaptación a una sola célula para cualquier perfil de proteína en la cromatina ha sido difícil, especialmente en comparación con la transcriptómica de una sola célula (es decir, scRNA-seq), debido al bajo número de copias de ADN en relación con el ARN (dos a cuatro copias de ADN frente a posibles miles de copias de ARN).
En el protocolo detallado anteriormente, se deben considerar varios pasos críticos. En primer lugar, la clasificación adecuada de las células depende del tipo de célula (o tejido), y se debe tener cuidado con la clasificación precisa. Se recomienda probar qué tan efectiva es la clasificación de una sola célula con el instrumento antes de cualquier experimento. En segundo lugar, la elección efectiva de anticuerpos es esencial. Antes de proceder a una aplicación de una sola célula, se recomienda probar el anticuerpo en un experimento de alto número de células (así como otras pruebas de anticuerpos estándar, como confirmar la especificidad utilizando western blot después del derribo, la titulación del anticuerpo en experimentos CUT&RUN, etc.). En tercer lugar, utilizar un control negativo, como IgG o ningún anticuerpo primario, porque una comparación adecuada con las muestras experimentales es esencial para la interpretación de la calidad de los datos y los resultados biológicos. Al comparar los resultados experimentales de una sola célula con un conjunto de datos de alto número de células, los experimentos de una sola célula de control negativo deberían tener menos cobertura de lectura sobre los sitios de unión identificados en el experimento de células altas y más bien tener una distribución aleatoria de lecturas en todo el genoma (con un sesgo para regiones abiertas de cromatina). Cuarto, se debe tener cuidado al agregar y activar la proteína A o la proteína A / G-MNasa para no digerir en exceso la cromatina: no sobrecaliente las muestras con las manos, mantenga las muestras a una temperatura de baño de hielo / agua (0 ° C) y quele la reacción en el momento adecuado. Quinto, se debe tener cuidado durante todo el experimento uliCUT&RUN y la preparación de la biblioteca, debido al bajo material. Por ejemplo, la incubación prolongada en el bastidor magnético durante la unión de la perla para garantizar que el sobrenadante se haya despejado y tener cuidado de no molestar las perlas al retirar el sobrenadante es esencial para un rendimiento suficiente. En sexto lugar, dependiendo de las preguntas que se aborden, el número de experimentos unicelulares que se realizan es una consideración importante. Algunos de los experimentos de una sola célula fracasarán (como con todos los experimentos de bajo insumo) y, por lo tanto, el número de resultados experimentales positivos requeridos para una interpretación adecuada debe considerarse antes de comenzar el experimento. El número de células a incluir en el experimento depende de la cantidad de datos experimentales requeridos por el investigador y de la calidad del anticuerpo. Por último, tenga en cuenta que se podrían lograr resultados equivalentes con volúmenes reducidos de muchos aspectos de este protocolo. Los pasos en los que el volumen se redujo en un 50% incluyen el volumen de tampón NE, tampón de lavado, mezcla de anticuerpos primarios (incluida la cantidad de anticuerpo primario), mezcla de pA-MNasa (incluida la cantidad de pA-MNasa) y todos los pasos en la preparación de la biblioteca.
Sobre la base de la naturaleza complicada de la elaboración de perfiles factoriales en la cromatina, hay muchas fuentes potenciales de problemas y lugares donde la solución de problemas puede ser necesaria. Si bien puede haber muchos pasos donde pueden surgir problemas, se han observado tres problemas principales: 1) bajo rendimiento de ADN para la entrada en la construcción de la biblioteca; 2) alta señal de fondo en muestras experimentales, y 3) bajo rendimiento después de la construcción de la biblioteca. Si no hay suficiente ADN para la preparación y secuenciación de la biblioteca (punto 1), tenga en cuenta los siguientes consejos de solución de problemas: a) puede haber habido una lisis de membrana incompleta y, por lo tanto, se puede aumentar el tiempo de lisis con el tampón NE; b) puede haber habido una unión ineficiente del núcleo a las microesferas paramagnéticas conjugadas con ConA y esto podría remediarse mediante una mezcla adecuada tras la adición de estas perlas; c) puede haber habido muy poco anticuerpo añadido, y por lo tanto se recomienda realizar una titulación de anticuerpos para identificar la cantidad más efectiva; d) los tiempos de incubación con el anticuerpo primario o la proteína A- o la proteína A/G-MNasa son demasiado cortos (es decir, no tienen tiempo suficiente para permitir la unión) o demasiado largos (estas son muestras nativas no entrecruzadas), y podrían optimizarse; e) la interacción de la proteína diana con la cromatina podría ser demasiado transitoria para ser capturada en condiciones nativas y por lo tanto se podría realizar la reticulación de CUT&RUN28. Si bien los conjuntos de datos de una sola celda producirán un fondo alto, puede haber un fondo excesivamente alto donde la señal es difícil de interpretar desde el fondo (punto 2). Para este problema, tenga en cuenta los siguientes consejos: a) el paso de bloqueo con EDTA para prevenir la digestión preventiva de la MNasa podría aumentarse u optimizarse; b) si hay un corte excesivo, podría deberse a tener demasiada proteína A- o proteína A/ G-MNasa, y por lo tanto se puede realizar una titulación de las cantidades adecuadas; c) la sobredigestión por la MNasa podría dar lugar a un alto fondo y, por lo tanto, se debe evaluar la mezcla adecuada de cloruro de calcio tras la adición y optimización para el tiempo de digestión de la MNasa. Finalmente, es posible que se haya recuperado ADN enriquecido con uliCUT&RUN eficiente, pero se puede recuperar una baja cantidad de biblioteca (punto 3). Para este problema, se recomienda lo siguiente: a) manejo y uso adecuados de perlas de poliestireno-magnetita para asegurar la purificación correcta y sin pérdida de ADN; específicamente, se recomienda tener incubaciones de 15 minutos y un mínimo de 5 minutos para magnetizar las cuentas para evitar la pérdida; b) la subamplificación de la biblioteca en la etapa de PCR daría lugar a un bajo rendimiento y, por lo tanto, los ciclos apropiados deberían determinarse utilizando qPCR (como se estableció previamente para las bibliotecas ATAC-seq29).
Al igual que con todas las tecnologías, existen limitaciones para uliCUT&RUN que deben considerarse antes de iniciar cualquier experimentación. En primer lugar, estos experimentos están diseñados y optimizados para condiciones nativas y, por lo tanto, si una proteína solo interactúa transitoriamente con la cromatina, puede ser necesario un enfoque de reticulación para garantizar la recuperación de la interacción. En segundo lugar, como con todas las técnicas basadas en anticuerpos, la calidad del anticuerpo es importante. Se debe tener cuidado de garantizar la calidad y consistencia del anticuerpo antes de llevar a cabo cualquier experimento. En tercer lugar, el corte de fondo de la MNasa puede ocurrir y, si bien hay una señal de fondo consistentemente más baja en CUT&RUN en relación con otros experimentos, la señal de fondo puede ser alta en experimentos de una sola célula y, por lo tanto, se deben realizar los controles y análisis apropiados. Si bien la naturaleza binaria de los datos de perfiles de una sola célula limita la visualización, se pueden realizar tecnologías genómicas computacionales más avanzadas, como la reducción dimensional y otras (como se describió anteriormente27). Finalmente, si bien el perfil de una sola celda se ha expandido aquí al formato de 96 pocillos, este es un bajo rendimiento en relación con otras tecnologías de una sola celda que utilizan 10xGenomics u otros formatos.
Las tecnologías de perfiles basadas en tethering, como ChEC-seq20, CUT&Tag24, CUT&RUN21 y uliCUT&RUN23, pueden determinar la localización de factores en la cromatina con una línea de tiempo experimental más rápida, un fondo más bajo y un costo más bajo que las tecnologías de perfiles tradicionales, como ChIP-seq. Por lo tanto, estas son tecnologías muy emocionantes para su aplicación a muestras preciosas, como muestras de pacientes o muestras de desarrollo temprano. Además, la aplicación a células individuales puede proporcionar estudios complementarios realizados utilizando otros experimentos de células individuales como scRNA-seq y scATAC-seq30. Como se describe utilizando estas tecnologías de una sola célula más ampliamente utilizadas, se pueden obtener nuevos conocimientos en relación con los experimentos de células a granel. Se prevé que el perfil de proteínas unicelulares en la cromatina se utilice con mayor regularidad a medida que las tecnologías continúen mejorando y permitan una mayor paralelización.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses contrapuestos relacionados con este proyecto.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del Laboratorio Hainer por leer y comentar una versión anterior de este manuscrito. Este proyecto utilizó el NextSeq500 disponible en el Núcleo de Secuenciación de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pittsburgh en el Hospital Pediátrico UPMC de Pittsburgh para la secuenciación con un agradecimiento especial a su director, William MacDonald. Esta investigación fue apoyada en parte por el Centro de Computación de Investigación de la Universidad de Pittsburgh a través de los recursos informáticos proporcionados. Este trabajo fue apoyado por el Número de Subvención R35GM133732 de los Institutos Nacionales de Salud (a S.J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
References
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