Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية الحصول على "بصمة" طيفية كتلة من الكريات البيض كارديوليبين لتشخيص متلازمة بارث. تقييم ارتفاع نسبة أحادي السول ثنائي الكارديوليبين إلى الكارديوليبين يميز المرضى الذين يعانون من متلازمة بارث من السيطرة على مرضى قصور القلب الذين يعانون من حساسية وخصوصية 100٪.
Abstract
Cardiolipin (CL) ، وهو فوسفوليبيد ثنائي يحمل أربع سلاسل من الأحماض الدهنية في هيكله ، هو علامة الدهون للميتوكوندريا ، حيث يلعب دورا حاسما في عمل الغشاء الداخلي. مستقلبه أحادي السوروكارديوليبين (MLCL) غائب تقريبا من الناحية الفسيولوجية في مستخلص الدهون للخلايا الحيوانية ومظهره هو السمة المميزة لمتلازمة بارث (BTHS) ، وهو مرض وراثي نادر وغالبا ما يتم تشخيصه بشكل خاطئ ويسبب اعتلال عضلة القلب الحاد في مرحلة الطفولة. الطريقة الموصوفة هنا تولد "بصمة كارديوليبين" وتسمح بإجراء فحص بسيط للمستويات النسبية لأنواع CL و MLCL في ملفات تعريف الدهون الخلوية. في حالة الكريات البيض ، هناك حاجة إلى 1 مل فقط من الدم لقياس نسبة MLCL / CL عن طريق تأين الامتزاز بالليزر بمساعدة المصفوفة - وقت الطيران / قياس الطيف الكتلي (MALDI-TOF / MS) في غضون 2 ساعة فقط من سحب الدم. الفحص مباشر ويمكن دمجه بسهولة في العمل الروتيني لمختبر الكيمياء الحيوية السريرية لفحص BTHS. يظهر الاختبار حساسية وخصوصية بنسبة 100٪ ل BTHS ، مما يجعله اختبارا تشخيصيا مناسبا.
Introduction
متلازمة بارث (BTHS) هو مرض نادر مرتبط ب X يتميز باعتلال عضلة القلب المبكر ، واعتلال عضلة العضلات الهيكلية ، وتأخر النمو ، وقلة العدلات ، وخلل سلسلة الجهاز التنفسي المتغير للميتوكوندريا ، وبنية الميتوكوندريا غير الطبيعية1،2،3،4،5. ينتشر مرض BTHS حالة واحدة لكل مليون ذكر مع أقل من 250 حالة معروفة حاليا في جميع أنحاء العالم ، على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن المرض غير مشخص بشكل كاف 2,6. ينتج BTHS عن طفرات فقدان الوظيفة لجين Tafazzin (TAFAZZIN) المترجمة إلى كروموسوم Xq28.127,8 مما يسبب إعادة تشكيل ناقصة للكارديوليبين الفوسفوليبيد الميتوكوندريا (CL) ، وهي عملية تؤدي عادة إلى تكوين أسيل متماثل للغاية وغير مشبع 9,10. يعتبر CL الدهون المميزة للميتوكوندريا ، حيث يعد مكونا مهما للغشاء الداخلي ، وهو حيوي للفسفرة التأكسدية (أي استقلاب طاقة الميتوكوندريا) ، وتكوين المركب الفائق ، واستيراد البروتين ، ويشارك في ديناميكيات الميتوكوندريا ، و mitophagy ، وموت الخلايا المبرمج11،12،13،14،15،16 . عند فقدان TAFAZZIN للوظيفة ، تفشل إعادة تشكيل CL وتنشأ تشوهات فوسفوليبيد محددة في الميتوكوندريا لمرضى BTHS: يتم تقليل مستوى CL الناضج (CLm) ، في حين تحدث مستويات متزايدة من monolysocardiolipin (MLCL) وتغيير تكوين CL acyl (أي أنواع CL غير الناضجة ، CLi). هذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في نسبة MLCL / CL17.
غالبا ما يكون تشخيص BTHS صعبا ، حيث يقدم الاضطراب ميزات سريرية وكيميائية حيوية متغيرة للغاية وقد يختلف بين الأفراد المصابين من نفس العائلة وداخل المريض بمرور الوقت 3,5. يظهر العديد من الأولاد BTHS مستوى عال جدا من إفراز البول من حمض 3-methylglutaconic (3-MGCA) ، ولكن قد يكون مستوى البول طبيعيا أو يزداد بشكل طفيف فقط في المرضى بمرور الوقت3. ومع ذلك ، فإن زيادة 3-MGCA هي سمة من سمات العديد من اضطرابات الميتوكوندريا الأخرى وغير الميتوكوندريا ، مثل نقص الهيدراتيز 3-methylglutaconyl-CoA (عيب AUH) ، وحمض 3-methylglutaconic ، وخلل التوتر العضلي ، واعتلال الدماغ ، ومتلازمة Leigh-like (MEGDEL) ، ومتلازمة Costeff ، واعتلال عضلة القلب الموسع مع متلازمة الرنح (DCMA)18,19 . وبالتالي ، فإن ضعف خصوصية 3-MCGA كعلامة ل BTHS والتباين الهائل في المرضى يجعل التشخيص الكيميائي الحيوي غامضا.
علاوة على ذلك ، تم وصف أكثر من 120 طفرة TAFAZZIN مختلفة تسبب الاضطراب5 ، وبالتالي ، يمكن أن يكون التشخيص الوراثي معقدا وبطيئا ومكلفا. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي التحليل الجزيئي لجين TAFAZZIN إلى نتائج سلبية كاذبة في وجود طفرات في تسلسلات غير مشفرة أو منظمة3. يمكن اختبار BTHS بشكل لا لبس فيه عن طريق تحديد الكميات النسبية وتوزيع أنواع CL (monolyso-) وتأكيدها عن طريق تسلسل جين TAFAZZIN أو العكس.
الاختبار العملي للتشخيص هو قياس نسبة MLCL / CL بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) وتحليل التأين الكهربائي بالرش / قياس الطيف الكتلي (ESI / MS) في بقعة الدم20,21. قياس مستوى CL وحده غير كاف للتشخيص لأن بعض المرضى لديهم مستويات شبه طبيعية من CL ولكن نسبة MLCL / CL متغيرة. لذلك ، فإن قياس نسبة MLCL / CL له حساسية وخصوصية 100٪ لتشخيص BTHS21. تم إعداد طريقة أخرى تم التحقق من صحتها تعتمد على تحليل HPLC و ESI / MS على الكريات البيض22 ، لكن التقنيات الكروماتوغرافية المعقدة لفصل الدهون المستخرجة سابقا وتكلفة الأدوات تقيد هذا التحليل لعدد قليل من المختبرات السريرية. كل هذه العوامل ، إلى جانب عدم وجود اختبار تشخيصي مباشر ، ساهمت في نقص تشخيص الحالة.
MALDI-TOF / MS هي أداة صالحة أخرى في تحليل الدهون23,24. يمكن استخدام هذه التقنية التحليلية للحصول مباشرة على ملفات تعريف الدهون لمختلف العينات البيولوجية ، وبالتالي تخطي خطوات الاستخراج والفصل25،26،27،28،29 ، بما في ذلك في أقسام الأنسجة لتطبيقات التصوير MS30. بالنظر إلى هذه الميزة ، تم تطوير طريقة بسيطة وسريعة لتشخيص BTHS عن طريق تنميط الميتوكوندريا CL في الكريات البيض السليمة مع MALDI-TOF / MS28. عزل الكريات البيض من 1 مل فقط من الدم الكامل عن طريق ترسيب كريات الدم الحمراء وتحللها أمر بسيط ولا يتطلب معدات أو كواشف خاصة. وعلاوة على ذلك، تم وصف بروتوكول "الاستخراج المصغر" السريع للدهون المطبق على كميات دقيقة من الكريات البيض لتبرير النجاح في الحصول على أطياف تحتوي على إشارات MS أنظف مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى (S/N) مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها من الكريات البيضالسليمة 28. تستغرق هذه الخطوة الإضافية القليل من الوقت وتسمح بأن تكون التحليلات قابلة للتكرار حتى عند تنفيذها على أجهزة MS ذات الحساسية الضعيفة. باختصار ، تتطلب الطريقة التحليلية الموضحة هنا الحد الأدنى من إعداد العينات لأنه يمكن تخطي فصل الدهون الكروماتوغرافي الذي يستغرق وقتا طويلا وكثافة في العمالة ، وبالتالي تسريع الاختبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع عينات الدم من المتبرعين الأصحاء ومرضى قصور القلب في مستشفى بوليكلينيك في باري (إيطاليا) ، في حين تم الحصول على عينات من مرضى BTHS من قبل عيادة BTHS الوطنية للخدمات الصحية في المملكة المتحدة في مستشفى بريستول الملكي للأطفال (المملكة المتحدة). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المتبرعين الأصحاء والمرضى وأولياء الأمور (عند الاقتضاء) وموافقات لجان الأخلاقيات المعنية.
ملاحظة: إذا لم يتم استخدامه على الفور ، يمكن تخزين الدم (في أنبوب هلام K-EDTA) عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24-48 ساعة.
1. عزل الكريات البيض عن طريق ترسيب ديكستران لخلايا الدم الحمراء (RBCs)
- ضع عينات الدم (في K-EDTA) على شاكر مداري لمدة 10 دقائق لخلط الدم.
- إلى 0.9 مل من الدم الكامل في أنبوب 1.5 مل ، أضف 0.1 مل من محلول ديكستران 20٪ (الكتلة الجزيئية > 100 كيلو دال ، في 0.9٪ كلوريد الصوديوم). ماصة وتفريق التعليق بلطف 20 مرة مع تجنب فقاعات الهواء التي من شأنها أن تحتفظ بكرات الدم الحمراء في الجزء العلوي من الأنبوب. دع رواسب كرات الدم الحمراء لمدة 1 ساعة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
- باستخدام حقنة ، قم بجمع ونقل supernatant الأصفر إلى أنبوب 15 مل ، ثم جهاز طرد مركزي عند 400 × g لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (بدون فرامل ، دوار دلو متأرجح).
- تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الكريات البيض التي تحتوي بشكل رئيسي على الكريات البيض وكرات الدم الحمراء المتبقية في 0.6 مل من الماء المقطر ثنائي الثلج البارد (ddH2O).
- بعد ~ 15 ثانية ، أضف 0.2 مل من 0.6 M KCl إلى تعليق الخلية لاستعادة الأسمولية الصحيحة. الصدمة الأسموزية القصيرة سوف تتحلل RBC وتترك الكريات البيض سليمة. اضبط مستوى الصوت النهائي إلى 2.5 مل باستخدام 1x PBS.
- قم بطرد مركزي لنظام التعليق عند 400 × g لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (بدون فرامل ، دوار دلو متأرجح). تخلص من supernatant واغسل حبيبات الكريات البيض مرة أخرى مع 2.5 مل من 1x PBS.
- جهاز طرد مركزي كما في الخطوة 1.6 وتجاهل supernatant. أعد تعليق الكريات البيض التي تحتوي على الكريات البيض في 200 ميكرولتر من DDH2O المعقمة.
ملاحظة: في تجربة المؤلفين ، يتوافق هذا مع محتوى بروتين يتراوح من 200 ميكروغرام إلى 400 ميكروغرام. - قم بتجميد التعليق عند -80 درجة مئوية أو قم بإجراء استخراج الدهون مباشرة على النحو التالي.
2. "استخراج مصغر" من الدهون من الكريات البيض المعزولة
- نقل 20 ميكرولتر من تعليق الكريات البيض (حوالي 20-40 ميكروغرام من البروتينات) إلى أنبوب 1.5 مل وتدور عند 16000 × غرام لمدة 30 ثانية.
- تخلص من السوبرناتانت ، وأضف 10 ميكرولتر من CHCl3 إلى الكريات المتبقية ، وماصة مرارا وتكرارا لتعزيز استخراج الدهون.
- أخيرا ، أضف 10 ميكرولتر من محلول مصفوفة 9-aminoacridine (9-AA) (10 mg / mL 9-AA في 2-propanol / acetonitrile ، 60:40 v / v) إلى الكريات في CHCl3. ماصة وتشتت مرارا وتكرارا للخلط.
- قم بتدوير المحلول الذي يحتوي على الدهون في CHCl3 و 9-AA عند 16000 × g لمدة 30 ثانية ، ثم قم بإيداع supernatant كقطرات من 0.35 ميكرولتر (ثلاثة تكرارات لكل عينة) على هدف MALDI (لوحة العينة) ليتم تحليلها (طريقة ترسيب "القطيرات المجففة").
- دع القطرات تجف في الهواء لمدة 10-15 دقيقة على الأقل.
3. تحليل الدهون بواسطة MALDI-TOF/MS
- الحصول على أطياف كتلة من العينات في ثلاثة أضعاف على مطياف الكتلة MALDI-TOF.
- بعد المعايرة باستخدام معايير الدهون (انظر جدول المواد) ، قم بتعيين التحليلات في وضع الأيونات السالبة وتحسين نطاق الكشف m / z من 200 Th إلى 2000 Th لتحليل الجزيئات الصغيرة.
- حافظ على طلاقة الليزر بنسبة 5٪ فوق العتبة (من CL و MLCL) للحصول على S / N (2 على الأقل).
- احصل على الأطياف في وضع العاكس باستخدام الاستخراج النبضي المتأخر. لكل طيف كتلي، متوسط 2000 طلقة ليزر واحدة (مجموع 4 × 500). تطبيق قمع مصفوفة مسورة على 400 Th لمنع تشبع الكاشف.
4. كيفية حساب نسبة (MLCL + CLi) / CLm
- قم بتشغيل برنامج أداة MALDI-TOF/MS (انظر جدول المواد) لتحليل الأطياف المكتسبة.
- باستخدام الأمر فتح ، افتح مربع الحوار Spectrum Browser الذي يسمح بتحديد طيف الاهتمام وتحميله.
- على شريط القوائم ، انقر فوق الرموز Smooth Mass Spectrum وطرح خط الأساس للطيف الكتلي.
- انقر فوق ملف > تصدير > الطيف الكتلي واختر تنسيق ASCII لتصدير الطيف كجدول من عمودين مع أزواج من نقاط البيانات: m / z (x) والكثافة (y). انسخ الإحداثيات والصقها في برنامج جدول بيانات (*.xls).
- كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.4 للثلاثة أضعاف لكل عينة تم تحليلها، مع لصق الإحداثيات في نفس ملف برنامج جدول البيانات كما هو موضح في الشكل 1 (الخطوة 1 ).
- باتباع النطاقات x الموضحة في الشكل 1 (الخطوة 2) لكل نوع مدرج، احسب مجموع قيم y 1 وy2 وy3 (ثلاثة أضعاف) بواسطة الدالة SUM للحصول على منطقة الذروة (الشكل 1; الخطوة 3).
- تنفيذ متوسط قيم المساحة الثلاثية بواسطة الدالة AVERAGE (الشكل 1; الخطوة 3).
- ضع متوسط قيم المساحة لكل نوع في العمود كما هو موضح في الشكل 1 (الخطوة 2).
- من أجل النظر فقط في النظير الأول من أنواع CLm 72: 7 كما هو الحال في28 ، احسب التصحيح النظيري للتداخل بين النظير M + 2 ل CLm 72: 8 وذروة النظير الأحادي CLm 72: 7 كما هو موضح في الشكل 1 (الخطوة 4).
- أخيرا ، احسب نسبة (MLCL + CLi) / CLm كما هو موضح في الشكل 1 (الخطوة 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة ، تم وصف طريقة بسيطة وسريعة لعزل الكريات البيض من 1 مل من الدم الكامل والحصول على بصمات CL بواسطة MALDI-TOF / MS (انظر الشكل 2). ويبين الشكل 3 مقارنة بين البصمات التمثيلية لكريات الدم البيضاء التي تم الحصول عليها من الأشخاص الخاضعين للمراقبة والأولاد الصغار في BTHS، في نطاق كتلة CL وMLCL (m/z). يسرد الجدول 1 أنواع CL و MLCL المكتشفة في هذه الأطياف الكتلية.
عادة ما تحدد العيوب في جين TAFAZZIN ملف تعريف الدهون الخاص ب BTHS ، أي ظهور أشكال MLCL و CLi جنبا إلى جنب مع تقليل أشكال CLm في بصمة CL. عادة ما يعرض ملف تعريف الدهون لكريات الدم البيضاء لمواضيع التحكم نوعين جزيئيين فقط من CLm (اللوحة العليا من الشكل 3). القمم الوحيدة ذات الأهمية الموجودة في هذا الطيف الكتلي هي أنواع CLm: tetralinoleoyl CL (18: 2) 4 عند m / z 1,448.0 و CL (18: 2)3 (18: 1)1 عند m / z 1,450.0. تسمح هذه الطريقة بتصورها في ملف تعريف الدهون MALDI بحيث يمكن بسهولة تحديد نوعي CL وقياسهما في النمط الظاهري الصحي.
تظهر بصمات CL التمثيلية لصبي متأثر ب BTHS نمطا مختلفا من إشارات MALDI (اللوحة السفلية من الشكل 3). والإشارات التي تعزى إلى أنواع CLm أقل، في حين توجد أيضا قمم مخصصة لنوعين من CLi (عند m/z 1,404.0 و 1,430.0) ونوعين من MLCL (عند m/z 1,165.8 و 1,191.8) (انظر الجدول 1). وبإيجاز، تبين البيانات الواردة في الشكل 3 بوضوح أن أنواع الميتوكوندريا CL و MLCL يمكن اكتشافها بسهولة من خلال تحليلات MALDI-TOF/MS لكريات الدم البيضاء.
أظهرت دراسة سابقة أن نسبة (MLCL + CLi) / CLm المحسوبة في ملفات تعريف الدهون من الكريات البيض التي تم الحصول عليها بواسطة MALDI-TOF / MS يمكن استخدامها كمعلمة تشخيصية ل BTHS28. في تلك الدراسة ، تمت مقارنة بصمات CL لكريات الدم البيضاء المعزولة من الأشخاص الأصحاء والأولاد BTHS28. هنا ، تمت إضافة النتائج التي تم الحصول عليها من ملف تعريف الدهون MALDI لكريات الدم البيضاء المعزولة من 11 مريضا بقصور القلب لدى الأطفال (واحد مصاب ب BTHS و 10 غير متأثر ب BTHS).
ويبين الشكل 4 النسب المحسوبة (MLCL + CLi)/CLm في أطياف كتلة MALDI لمستخلصات الدهون المصغرة من الكريات البيض من تسعة مرضى BTHS، و 10 أشخاص غير متأثرين ب BTHS (أي مرضى قصور القلب)، و 22 شخصا يتمتعون بصحة جيدة؛ وقد تم حساب النسبة من خلال النظر في مساحة قمم CL و MLCL المكتشفة في أطياف الكتلة ، كما هو موضح ، ولكن يمكن أيضا استخدام الكثافات مع نتائج مماثلة (البيانات غير معروضة).
كانت نسبة (MLCL + CLi) / CLm لمرضى BTHS 7.2 ± 2.9 ، في حين أن تلك المحسوبة للأشخاص الأصحاء ومرضى قصور القلب كانت 0.19 ± 0.10 و 0.13 ± 0.07 ، على التوالي (متوسط ± SD). يمكن ملاحظة أن المجموعات الضابطة (كل من الأشخاص الأصحاء ومرضى قصور القلب) ومرضى BTHS مفصولة بأكثر من ترتيب واحد من الحجم ، مما يدل على أن هذه الطريقة لديها قوة تشخيصية قوية.
الشكل 1: (MLCL+CLi)/CLm تحديد نسبة. يتم إجراء حساب نسبة (MLCL + CLi) / CLm باستخدام برنامج Excel. الخطوة 1: جدول m/z (x) / الكثافة (y) للأنواع ذات الأهمية (في الثلاثيات). الخطوة 2: جدول نطاقات x لحساب كل منطقة ذروة. الخطوة 3: حساب SUM ومتوسط قيم y1 و y2 و y3 (ثلاثة أضعاف). الخطوة 4: حساب تصحيح النظائر. الخطوة 5: حساب نسبة (MLCL + CLi) / CLm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط تدفق العمل. من سحب الدم إلى نتائج الاختبار ، من الضروري فقط 2 ساعة. تشخيص BTHS القائم على MALDI-TOF / MS في خطوات قليلة: (1) انسحاب الدم. (2) ترسيب دكستران لكريات الدم الحمراء، (3) تحلل كريات الدم الحمراء المتبقية (PP1) وجمع الكريات البيض (PP2) عن طريق الطرد المركزي، (4) "استخراج مصغر" للدهون، (5) ترسب العينة، (6) تحليل MALDI-TOF/MS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بصمات أصابع الكريات البيض CL التشخيصية BTHS. تظهر مقارنة بين بصمات الكارديوليبين لكريات الدم البيضاء المعزولة من موضوع التحكم (CTRL) ومريض متلازمة بارث التمثيلي (BTHS). تسلط الأشرطة الحمراء الضوء على قمم الشكل غير الناضج من أنواع الكارديوليبين (CLi) و monolysocardiolipin (MLCL) ، في حين أن النطاق الأزرق يمثل قمم الأشكال الناضجة من CL (CLm). تشير الإشارات الموسومة بعلامة نجمية إلى العقديات ولا تهم هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نسب (MLCL + CLi) / CLm في الضوابط ومرضى BTHS. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية التي تم الحصول عليها من متوسط قياسات جميع الأشخاص لكل مجموعة من المجموعات الثلاث: تسعة مرضى BTHS ، و 10 مرضى قصور القلب غير المصابين ب BTHS ، و 22 شخصا يتمتعون بصحة جيدة. تم تحليل كل عينة بواسطة MALDI-TOF / MS (في ثلاثة أضعاف). يظهر المحور y مقياسا لوغاريتميا. القيمة القصوى القصوى للضوابط، المحسوبة كما في المراجع22,28 هي 0.4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| م / ض [M-H]- | مهمة |
| 1165.8 | MLCL 52:2 |
| 1191.8 | MLCL 54:1 |
| 1404.0 | ج٦٨:٢ |
| 1430.0 | ج70:3 |
| 1448.0 | CLm 72:8 |
| 1450.0 | CLm 72:7 |
الجدول 1: قائمة القمم المكتشفة المخصصة لأنواع CL و MLCL في أطياف كتلة MALDI-TOF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
متلازمة بارث هي خطأ فطري في التمثيل الغذائي وحالة تغير الحياة من المرجح أن يتم تشخيصها بشكل أقلمن 2,6. كما ذكرنا من قبل ، قد يكون العامل المساهم هو عدم وجود اختبار تشخيصي مباشر. هنا ، تم وصف طريقة بسيطة وسريعة لقياس نسبة MLCL / CL بواسطة MALDI-TOF / MS في الكريات البيض لفحص BTHS. علاوة على ذلك ، يتم توزيع مطياف الكتلة MALDI-TOF على نطاق واسع بين المختبرات السريرية في جميع أنحاء العالم ولا تتطلب خبرة تحليلية عالية31,32.
تتمتع الطريقة الحالية بميزة كبيرة على النهج الحالية من حيث أنها يمكن أن تكتشف في وقت واحد في دفعة واحدة من تحليل MS أنواع CL و MLCL في إجمالي ملف تعريف الدهون لكريات الدم البيضاء المعزولة ، وتجنب الخطوات التي تستغرق وقتا طويلا لاستخراج الدهون القياسية وفصلها عبر HPLC. بالإضافة إلى عامل الوقت ، يمكن أن يؤدي وجود المزيد من الخطوات في سير العمل إلى حدوث أخطاء. الطريقة الحالية سهلة حتى بالنسبة للمشغلين الذين ليس لديهم خبرة ذات صلة في علم الدهون.
لا تعتمد طريقة فحص BTHS الموصوفة هنا على انخفاض مستويات CLm فحسب ، بل تأخذ في الاعتبار أيضا زيادة أنواع CLi ، والتي تشير إلى جانب وجود أنواع MLCL على وجه التحديد إلى عيب استقلاب CL ، أي الطفرات في جين TAFAZZIN. هذا النهج ناجح بسبب استخدام 9-AA كمصفوفة لتحليل MALDI ، وهو مناسب بشكل خاص للكشف عن أنواع CL23,25 ، حتى عندما تكون هذه الأنواع مكونات ثانوية في ملامح الدهون المعقدة.
بمقارنة هذه النتائج بتلك التي تم الحصول عليها في دراسات LC / MS على الكريات البيض أو بقع الدم 20,21,22 ، فإن متوسط نسبة MLCL / CL في مرضى BTHS حوالي10 في جميع التقارير. على العكس من ذلك ، تختلف النسبة المتوسطة في عناصر التحكم ووجد أنها ~ 0.001 في22 ، و 0.01 في 21 ، وأخيرا 0.1 في28. والسبب في أن القيمة الأخيرة أعلى قليلا هو النهج المتحفظ المتبع في الحسابات28. في الواقع ، تتضمن الطريقة التي تم الإبلاغ عنها سابقا في28 والطريقة الموصوفة هنا قياسات ل MLCL و CLi أيضا في أطياف كتلة الضوابط ، حيث تكون هذه غائبة تقريبا. هذا يعني في الواقع حساب مستويات الضوضاء ، والتي تزيد بشكل مصطنع من النسبة في الضوابط الصحية. والسبب في هذا النهج التحذيري هو أن أدوات MALDI-MS منخفضة الأداء قد لا تكون حساسة بما يكفي للكشف عن المستويات المنخفضة من الدهون ذات الاهتمام. من خلال النظر في مستويات الضوضاء ، تفترض هذه الطريقة مستوى قاعديا من MLCL و CLi غير القابل للكشف في الضوابط ، و CLm في المرضى. ومن الجدير بالذكر أنه حتى مع وجود مثل هذا النهج التحوطي، فإن تطبيق نسبة MLCL / CL ينتج عنه فرق >10 أضعاف في نسبة MLCL / CL بين مرضى BTHS والمجموعات الضابطة (انظر الشكل 4). لذلك ، يحافظ الفحص الموصوف هنا على حساسية وخصوصية 100٪21،22،28.
أحد قيود هذه الطريقة هو أنها تستخدم 1 مل من الدم ، على الرغم من أنه يمكن تقليصها إلى 500 ميكرولتر في الممارسة العملية. هذا بالتأكيد عيب عند مقارنته بطرق LC / MS التي تستخدم بقع الدم ، حيث يمكن شحن هذه الأخيرة بالبريد العادي وعادة ما تكون مصنوعة من ~ 50 ميكرولتر من الدم. ومع ذلك ، فإن طريقة MALDI هذه لها ميزة رئيسية تتمثل في كونها قابلة للتنفيذ من قبل المشغلين الذين ليس لديهم خبرة سابقة في تحليلات MS ، وفي غضون 2 ساعة فقط من السحب.
باختصار ، الفحص المقترح بسيط ويمكن دمجه بسهولة في العمل الروتيني لمختبر الكيمياء الحيوية السريرية. ومن المحتمل أن يؤدي ذلك إلى زيادة عدد العينات القابلة للتحليل، مما يسهم في تحديد الحالات الخفية الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أن الدراسة أجريت في غياب أي علاقة تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
نحن ممتنون للأفراد الذين لديهم BTHS وعائلاتهم للمشاركة في بحثنا. نشكر مؤسسة متلازمة بارث في الولايات المتحدة وصندوق متلازمة بارث في المملكة المتحدة على دعمهما ومساعدتهما في جمع عينات الدم في الاجتماع السنوي في بريستول. تم تمويل هذه الدراسة من قبل مؤسسة متلازمة بارث الأمريكية ، بارث إيطاليا أونلوس ، ومنطقة بوليا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
References
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al. syndrome (X linked cardiac and skeletal myopathy, neutropenia, and organic aciduria): rarely recognised, frequently fatal [abstract]. Archives of Disease in Childhood. 89, 48 (2004).
- Clarke, S. L. N., et al.
- Zegallai, H. M., Hatch, G. M. Barth syndrome: cardiolipin, cellular pathophysiology, management, and novel therapeutic targets. Molecular and Cellular Biochemistry. 476 (3), 1605-1629 (2021).
- Taylor, C., et al. Clinical presentation and natural history of Barth Syndrome: An overview. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 7-16 (2022).
- Miller, P. C., Ren, M., Schlame, M., Toth, M. J., Phoon, C. A. Bayesian analysis to determine the prevalence of Barth syndrome in the pediatric population. The Journal of Pediatrics. 217, 139-144 (2020).
- Bione, S., et al. A novel X-linked gene, G4.5. is responsible for Barth syndrome. Nature Genetics. 12 (4), 385-389 (1996).
- Whited, K., Baile, M. G., Currier, P., Claypool, S. M. Seven functional classes of Barth Syndrome mutation. Human Molecular Genetics. 22 (3), 483-492 (2013).
- Schlame, M., Ren, M., Xu, Y., Greenberg, M. L., Haller, I.
- Schlame, M., Xu, Y. The function of Tafazzin, a mitochondrial phospholipid-lysophospholipid acyltransferase. Journal of Molecular Biology. 432 (18), 5043-5051 (2020).
- Schlame, M., Rua, D., Greenberg, M. L. The biosynthesis and functional role of cardiolipin. Progress in Lipid Research. 39 (3), 257-288 (2000).
- Mileykovskaya, E., Dowhan, W. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (10), 2084-2091 (2009).
- Claypool, S. M., Koehler, C. M. The complexity of cardiolipin in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 37 (1), 32-41 (2011).
- Ren, M., Phoon, C. K., Schlame, M. Metabolism and function of mitochondrial cardiolipin. Progress in Lipid Research. 55, 1-16 (2014).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Role of cardiolipin in mitochondrial function and dynamics in health and disease: Molecular and pharmacological aspects. Cells. 8 (7), 728 (2019).
- Acoba, M. G., Senoo, N., Claypool, S. M. Phospholipid ebb and flow makes mitochondria go. The Journal of Cell Biology. 219 (8), 03131 (2020).
- Schlame, M., et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. Journal of the American College of Cardiology. 42 (11), 1994-1999 (2003).
- Wortmann, S. B., et al. Inborn errors of metabolism with 3-methylglutaconic aciduria as discriminative feature: proper classification and nomenclature. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (6), 923-928 (2013).
- Ikon, N., Ryan, R. O. On the origin of 3-methylglutaconic acid in disorders of mitochondrial energy metabolism. Journal of Inherited Metabolic Disease. 39 (5), 749-756 (2016).
- Kulik, W., et al. Bloodspot assay using HPLC-tandem mass spectrometry for detection of Barth syndrome. Clinical Chemistry. 54 (2), 371-378 (2008).
- Vaz, F. M., et al. An improved functional assay in blood spot to diagnose Barth syndrome using the monolysocardiolipin/cardiolipin ratio. Journal of Inherited Metabolic Disease. 45 (1), 29-37 (2022).
- Bowron, A., et al. Diagnosis of Barth syndrome using a novel LC-MS/MS method for leukocyte cardiolipin analysis. Journal of Inherited Metabolic Disease. 36 (5), 741-746 (2013).
- Sun, G., et al. Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometric analysis of cellular glycerophospholipids enabled by multiplexed solvent dependent analyte-matrix interactions. Analytical Chemistry. 80 (19), 7576-7585 (2008).
- Leopold, J., Popkova, Y., Engel, K. M., Schiller, J. Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of lipids. Biomolecules. 8 (4), 173 (2018).
- Angelini, R., Babudri, F., Lobasso, S., Corcelli, A. MALDI-TOF/MS analysis of archaebacterial lipids in lyophilized membranes dry-mixed with 9-aminoacridine. The Journal of Lipid Research. 51 (9), 2818-2825 (2010).
- Angelini, R., et al. Lipidomics of intact mitochondria by MALDI-TOF MS. The Journal of Lipid Research. 53 (7), 1417-1425 (2012).
- Angelini, R., Vormieter, G., Corcelli, A., Fuchs, B. A fast method for the determination of PC/LPC ratio in intact horse serum by MALDI-TOF-MS: an easy-to-follow lipid biomarker of inflammation. Chemistry and Physics of Lipids. 183, 169-175 (2014).
- Angelini, R., et al. Cardiolipin fingerprinting of leukocytes by MALDI-TOF/MS as a screening tool for Barth syndrome. The Journal of Lipid Research. 56 (9), 1787-1794 (2015).
- Lobasso, S., et al. A lipidomic approach to identify potential biomarkers in exosomes from melanoma cells with different metastatic potential. Frontiers in Physiology. 12, 748895 (2021).
- Angelini, R., et al. Visualizing cholesterol in the brain by on-tissue derivatization and quantitative mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 93 (11), 4932-4949 (2021).
- Greco, V., et al. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical proteomics. Expert Review of Proteomics. 15 (8), 683-696 (2018).
- Duncan, M., DeMarco, M. L. MALDI-MS: Emerging roles in pathology and laboratory medicine. Clinical Mass Spectrometry (Del Mar, Calif). 13, 1-4 (2019).
