Summary
El presente protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Las córneas regeneradoras o completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.
Abstract
Las heridas corneales embrionarias de los pollitos muestran una notable capacidad para regenerarse completa y rápidamente, mientras que las córneas heridas adultas experimentan una pérdida de transparencia debido a la cicatrización fibrótica. La integridad tisular de las córneas embrionarias lesionadas se restaura intrínsecamente sin formación de cicatrices detectables. Dada su accesibilidad y facilidad de manipulación, el embrión de pollito es un modelo ideal para estudiar la reparación de heridas corneales sin cicatrices. Este protocolo demuestra los diferentes pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. Primero, los óvulos se ventanan a edades embrionarias tempranas para acceder al ojo. En segundo lugar, se realizan una serie de manipulaciones in ovo físicas a las membranas extraembrionarias para garantizar que el acceso al ojo se mantenga a través de etapas posteriores de desarrollo, correspondientes a cuando se forman las tres capas celulares de la córnea. En tercer lugar, las heridas lineales de la córnea que penetran en la capa epitelial externa y el estroma anterior se realizan con un cuchillo microquirúrgico. El proceso de regeneración o las córneas completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida. Los estudios realizados hasta la fecha utilizando este modelo han revelado que las córneas embrionarias heridas muestran activación de la diferenciación de queratocitos, se someten a una remodelación coordinada de las proteínas ECM a su macroestructura tridimensional nativa y se vuelven a inervar adecuadamente por los nervios sensoriales corneales. En el futuro, el impacto potencial de los factores endógenos o exógenos en el proceso regenerativo podría analizarse en la curación de córneas mediante el uso de técnicas de biología del desarrollo, como el injerto de tejido, la electroporación, la infección retroviral o la implantación de perlas. La estrategia actual identifica al pollito embrionario como un paradigma experimental crucial para dilucidar los factores moleculares y celulares que coordinan la cicatrización de heridas corneales sin cicatrices.
Introduction
La córnea es el tejido transparente y externo del ojo que transmite y refracta la luz que conduce a la agudeza visual. En la córnea adulta, el daño o la infección del estroma corneal conduce a una respuesta de cicatrización de heridas rápida y robusta caracterizada por proliferación de queratocitos, fibrosis, aumento de la inflamación que conduce a la apoptosis inducida por citoquinas, generación de miofibroblastos reparadores y remodelación general de la matriz extracelular (ECM)1,2 . Después de la lesión, dicha reparación del tejido corneal da como resultado un tejido cicatricial opaco que reduce la transparencia corneal y ocluye el paso de la luz, distorsionando así la visión y, en los casos más graves, dando lugar a la ceguera corneal3. Por lo tanto, existe una clara necesidad de desarrollar modelos animales confiables para abordar las complejidades de la cicatrización de heridas e identificar los factores celulares y moleculares responsables del cierre de heridas y la regeneración de tejidos.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que examinan la cicatrización de heridas corneales han utilizado modelos postnatales4 o animales adultos 1,2,5,6,7. Si bien estos estudios han llevado a un avance significativo en la comprensión de la respuesta de curación de heridas corneales y los mecanismos subyacentes a la formación de cicatrices, los tejidos corneales dañados en estos modelos de curación no se regeneran por completo, lo que limita su utilidad para identificar los factores moleculares y los mecanismos celulares responsables de recapitular completamente la morfología y la estructura corneal después de la lesión. Por el contrario, las heridas fetales generadas con un cuchillo en la córnea embrionaria del pollito poseen una capacidad intrínseca para sanar completamente de una manera sin cicatrices8. En concreto, la córnea embrionaria del pollito exhibe regeneración no ficbrótica con la recapitulación completa de la estructura de la matriz extracelular y patrones de inervación 8,9.
El presente protocolo describe una secuencia de pasos involucrados en la herida de la córnea de un pollito embrionario en ovo. En primer lugar, los óvulos se bloquean a edades embrionarias tempranas para facilitar el acceso al embrión. En segundo lugar, se realizan una serie de manipulaciones físicas in ovo a las membranas extraembrionarias para garantizar que el acceso al ojo se mantenga a través de etapas posteriores de desarrollo, correspondientes a cuando se forman las tres capas celulares de la córnea y se desea la herida. En tercer lugar, las incisiones lineales de la córnea central que penetran a través del epitelio corneal y en el estroma anterior se realizan con un cuchillo microquirúrgico. El proceso de regeneración o las córneas completamente restauradas se pueden analizar para determinar su potencial regenerativo utilizando diversas técnicas celulares y moleculares después del procedimiento de herida.
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Protocol
La cepa de huevos utilizada en este protocolo fue White Leghorn, y todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Wesleyana de Illinois.
1. Incubación de huevos de pollitos
- Mantenga los huevos a ~ 10 ° C durante hasta 1 semana después de que se pongan para detener el desarrollo. Cuando esté listo para iniciar el desarrollo del embrión de pollito, limpie toda la cáscara del huevo con toallitas sin pelusa (consulte la Tabla de materiales) saturadas con agua a temperatura ambiente para eliminar la suciedad y los desechos.
- Asegúrese de que la cáscara del huevo esté desinfectada. Limpie toda la superficie del huevo con toallitas sin pelusa humedecidas con etanol al 70%. Limpie rápidamente el etanol para secar el huevo y evite la absorción de etanol a través de la cáscara del huevo hasta el embrión.
- Coloque los huevos horizontalmente en una bandeja. Marque la parte superior del óvulo para denotar la posición esperada del embrión. Incubar los huevos horizontalmente, con la función de balanceo activada, en una incubadora humidificada a 38 °C.
2. Ventanar los óvulos para prepararse para la disección de la membrana
- Retire los huevos de la incubadora al tercer día de desarrollo embrionario (E3). Esteriliza la parte superior de los huevos con toallitas sin pelusa humedecidas con etanol al 70%. Seque el etanol de las superficies de la cáscara del huevo.
NOTA: Para garantizar que el desarrollo no se retrasara durante el procedimiento de ventana, se retiraron 6-12 huevos, y el procedimiento se llevó a cabo rápidamente en estos mientras que los huevos restantes se dejaron en la incubadora. - Coloque un huevo horizontalmente en un soporte de huevo seguro (consulte la Tabla de materiales). Usando el extremo afilado de las tijeras de disección, cree un pequeño agujero en la parte superior de la cáscara del huevo cerca del extremo puntiagudo del huevo.
NOTA: Este orificio facilitará la eliminación de la albúmina, que es necesaria para dejar caer la yema y el embrión lejos de la superficie interna de la cáscara del huevo. Para los titulares de huevos, se utilizaron pisos de relleno de huevos de pulpa de papel, dentro de los cuales se envían los huevos. - A través del orificio (Paso 2.2.), inserte una aguja hipodérmica biselada de 18 G. Con la aguja empujada hacia la superficie interna inferior del huevo y el lado biselado de la aguja hacia el extremo puntiagudo del huevo (por ejemplo, lejos de la ubicación esperada de la yema y el embrión cerca de la mitad del huevo), retire 2-3 ml de albúmina del huevo de gallina y deséchelo.
NOTA: Si la aguja corta el embrión o su vasculatura asociada durante este paso, dará como resultado que la sangre se aspire con la albúmina. Esto resultará en la muerte del embrión. Además, si la yema se aspira inadvertidamente junto con la albúmina durante este paso, el embrión no será viable. En cualquier caso, el óvulo debe descartarse si el embrión no puede utilizarse inmediatamente para otros fines. - Limpie la superficie de la cáscara de huevo que rodea el orificio con toallitas sin pelusa ligeramente humedecidas con etanol al 70% y séquelas. Selle el orificio hecho para quitar la albúmina con cinta transparente.
- Con el extremo afilado de las tijeras de disección, haga un segundo orificio de "ventana" en la parte superior de la cáscara del huevo en el sitio de marcado (Paso 1.3.). Asegúrese de que las tijeras no se extiendan demasiado en la cáscara del huevo para evitar el contacto y el daño del embrión o la vasculatura embrionaria, que a menudo se colocarán dentro del huevo directamente debajo del sitio del segundo agujero.
- Usando pinzas de iris curvas, ensanche el orificio de la "ventana" para abarcar ~ 2-3 cm de diámetro y sirva como una "ventana" al embrión en desarrollo debajo de la cáscara.
- Inserte un extremo de los fórceps en el orificio, manteniéndolo paralelo y yuxtapuesto estrechamente con la cáscara del huevo. Con el extremo de las otras pinzas colocadas fuera de la cáscara del huevo, pellizque cuidadosamente los dos extremos de las pinzas juntas, lo que les permite romperse y eliminar pequeños trozos de la cáscara del huevo. Continúe rompiendo y eliminando los fragmentos de cáscara de huevo hasta que quede una ventana de 2-3 cm que se superponga directamente al embrión.
NOTA: Huevos en los que los embriones no se encuentran directamente debajo del orificio realizado en el Paso 2.6. no debe utilizarse, ya que las próximas disecciones de membrana serían difíciles de completar. Incluso balanceando los óvulos horizontalmente, alrededor del 10% de los huevos son inutilizables debido al mal posicionamiento del embrión. Estos embriones se pueden utilizar para otros fines.
- Inserte un extremo de los fórceps en el orificio, manteniéndolo paralelo y yuxtapuesto estrechamente con la cáscara del huevo. Con el extremo de las otras pinzas colocadas fuera de la cáscara del huevo, pellizque cuidadosamente los dos extremos de las pinzas juntas, lo que les permite romperse y eliminar pequeños trozos de la cáscara del huevo. Continúe rompiendo y eliminando los fragmentos de cáscara de huevo hasta que quede una ventana de 2-3 cm que se superponga directamente al embrión.
- Para limitar la contaminación bacteriana, agregue a través del orificio de la ventana (por ejemplo, en el huevo) ~ 100-200 μL de solución de Ringer (8 g de NaCl, 0.37 g de KCl y 0.23 g de CaCl2.2H 20 por L de H20 destilado) que contenga antibióticos de penicilina / estreptomicina (50 U / ml de penicilina y 50 μg / ml de estreptomicina, ver Tabla de Materiales).
- Selle el orificio de la ventana con cinta adhesiva transparente. Realice el sellado del huevo alineando una esquina de la cinta en el eje largo del orificio y presionando la cinta contra la cáscara ~ 1-2 cm de distancia del borde del agujero.
- Continúe sellando alrededor de la abertura hasta que quede una solapa colgante de cinta adhesiva en un lado. Presione los dos trozos de cinta juntos, creando una forma abovedada sobre el agujero, y presione la solapa de cinta colgante sobre la cáscara para terminar de sellar el huevo.
NOTA: Los huevos deben ser ventanados en E2 o E3. Según la experiencia, las ventanas antes de E2 dan como resultado una baja viabilidad embrionaria. Además, por E4, el embrión y las membranas extraembrionarias se unen a la cáscara del huevo10, y cualquier intento de ventana en E4 o posterior a menudo resulta en daño embrionario o desgarro de los vasos sanguíneos extraembrionarios, con cualquiera de los eventos que conducen al resultado de la muerte embrionaria.
- Continúe sellando alrededor de la abertura hasta que quede una solapa colgante de cinta adhesiva en un lado. Presione los dos trozos de cinta juntos, creando una forma abovedada sobre el agujero, y presione la solapa de cinta colgante sobre la cáscara para terminar de sellar el huevo.
- Devuelva los huevos "con ventanas" a la incubadora para un mayor desarrollo. Asegúrese de mantener los huevos horizontales y apague la función de balanceo de la incubadora.
- Repita los pasos 2.2.-2.9. por cada huevo.
3. Microdisección de las membranas extraembrionarias
- Retire un huevo con ventana E5.5 de la incubadora. Exponga el embrión cortando la cinta lejos de la ventana con tijeras de disección esterilizadas.
- Use un microscopio de disección para observar el embrión y sus membranas extraembrionarias a través de la ventana. Si es necesario, use tijeras o pinzas de iris curvas para ensanchar la ventana de modo que el embrión esté bien posicionado debajo de la ventana, teniendo cuidado de no dañar la vasculatura embrionaria.
- Agregue dos gotas de la solución de Ringer que contengan antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
- Utilice un microscopio de disección para asegurarse de que el embrión se encuentra en la etapa de desarrollo adecuada (estadio 27 de Hamburger Hamilton, ~E5.5)11,12 y localice las posiciones de la membrana amniocoriónica (ACM) y la membrana corioalantoica (CAM).
NOTA: En esta etapa, el embrión está rodeado por el ACM, que comprende la membrana amniótica y la membrana coriónica suprayacente fusionada y parcialmente cubierta por la alantois altamente vascularizada, que se extiende desde la región intestinal del embrión y se fusiona con el corion superpuesto para formar el CAM11,12. El ACM no está muy vascularizado, lo que permite diseccionar estas membranas para exponer el embrión sin dañar los vasos sanguíneos y dañar al embrión. - Realizar disecciones de membrana extraembrionaria en esta etapa (E5.5).
NOTA: E5.5 es el momento ideal para realizar las disecciones de membrana extraembrionaria. La disección de las membranas antes (por ejemplo, en E4) antes de la formación de CAM reduce la accesibilidad del embrión en etapas posteriores11. Además, en E5.5, el embrión solo está parcialmente cubierto por el CAM altamente vascularizado, sin embargo, durante los próximos 1-2 días, el CAM envuelve rápidamente e impide un mayor acceso al embrión 11,12. Por esta razón, la disección de membrana en E6 o posterior es un desafío a medida que aumenta el riesgo de desgarro de los vasos sanguíneos.- Use un par de fórceps finos esterilizados para agarrar suavemente el ACM y alejarlo del embrión. Luego use tijeras microdisecantes esterilizadas para cortar un agujero en el ACM directamente sobre la extremidad anterior que se extiende desde la membrana que recubre la extremidad anterior hasta la membrana que recubre la cabeza.
NOTA: Este paso relaja las membranas coriónicas y amniónicas, lo que las hace más fáciles de agarrar y diseccionar aún más con fórceps en los siguientes pasos. Consulte la Figura 1 para obtener un esquema útil de cómo se diseccionan las membranas a través de la ventana de la cáscara del huevo.
- Use un par de fórceps finos esterilizados para agarrar suavemente el ACM y alejarlo del embrión. Luego use tijeras microdisecantes esterilizadas para cortar un agujero en el ACM directamente sobre la extremidad anterior que se extiende desde la membrana que recubre la extremidad anterior hasta la membrana que recubre la cabeza.
- Use dos pares de fórceps finas y estériles para agarrar suavemente el amnios en dos posiciones adyacentes entre el ACM y el CAM (por ejemplo, un área entre el corte hecho por encima de la extremidad anterior y el borde más cercano del CAM).
- Mueva cuidadosamente cada par de fórceps, ambos agarrando firmemente la membrana amniótica, lejos el uno del otro, con un par moviéndose dorsalmente hacia el embrión y el otro ventralmente.
NOTA: Este movimiento sirve para desgarrar aún más el amnios al tiempo que separa el ACM (que es tirado en la dirección dorsal con respecto al embrión por un par de fórceps) y el CAM (que es tirado en la dirección ventral con respecto al embrión por el otro par de fórceps). - Asegúrese de que las membranas estén separadas cuando el CAM ya no cubra el embrión y la arteria y vena alantoica, que emanan del intestino embrionario al CAM, son fácilmente evidentes.
- Mueva cuidadosamente cada par de fórceps, ambos agarrando firmemente la membrana amniótica, lejos el uno del otro, con un par moviéndose dorsalmente hacia el embrión y el otro ventralmente.
- Use fórceps finos esterilizados para diseccionar y eliminar cualquier membrana amniónica restante que cubra el embrión. Se observa más comúnmente que el amnios restante cubrirá parcialmente la mitad caudal del embrión.
- Usando fórceps esterilizados, agarre el amnios cerca de la región craneal media del embrión y tire cuidadosamente del amnios en una dirección caudal con respecto al embrión hacia el CAM desplazado anteriormente. El embrión ahora estará completamente expuesto, y un mayor crecimiento del CAM ocurrirá principalmente lejos del embrión en desarrollo.
NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener un esquema útil sobre cómo aparecerá el embrión expuesto después de la disección de la membrana. Además, consulte un informe publicado anteriormente11 para obtener diagramas esquemáticos útiles de los pasos 3.3.-3.6.
- Usando fórceps esterilizados, agarre el amnios cerca de la región craneal media del embrión y tire cuidadosamente del amnios en una dirección caudal con respecto al embrión hacia el CAM desplazado anteriormente. El embrión ahora estará completamente expuesto, y un mayor crecimiento del CAM ocurrirá principalmente lejos del embrión en desarrollo.
- Agregue unas gotas de la solución de Ringer que contiene antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
- Vuelva a sellar el orificio de la ventana con cinta transparente, como se describe en el paso 2.8. Devuelva el huevo a la incubadora para un mayor desarrollo, manteniendo el huevo horizontal y manteniendo inactivada la función de balanceo de la incubadora.
- Repita los pasos 3.1.-3.8. por cada huevo.
NOTA: Las disecciones de membrana extraembrionaria en E5.5 descritas anteriormente permitirán el acceso al embrión a través de E7, que es cuando se puede realizar la herida 8,9. En E8, el crecimiento continuo del tejido CAM comienza a cubrir la región craneal del embrión, lo que impide un mayor acceso a la córnea. Si se desea llevar a cabo la herida en córneas E8-E9 más antiguas, es posible reposicionar el CAM en crecimiento ventralmente con respecto al embrión (Paso 3.10.). Si uno desea enrollar en E7, Paso 3.10. no es necesario realizarlo y se puede proceder al Paso 4, herida corneal. - Retire un huevo E7 de la incubadora cuyas membranas extraembrionarias se diseccionaron previamente en E5.5 (Pasos 3.1.-3.8.). Agarre con fórceps esterilizados cualquier tejido de membrana amniónica disponible fusionado al CAM y tire suavemente de la membrana amniónica lejos de la región craneal del embrión en una dirección ventral con respecto al embrión.
NOTA: Dado que la membrana amniónica que se desplaza lejos del embrión se fusiona con la CAM, la CAM en crecimiento y altamente vascularizada seguirá a las pinzas de agarre amniónico y se alejará de la región craneal. Repita este paso diariamente para desplazar continuamente el CAM lejos del embrión hasta que el embrión esté en la edad deseada para la herida.
4. Heridas en la córnea
- Obtenga un óvulo de la incubadora para herir a la edad embrionaria deseada, E7-E9. Exponga el embrión cortando la cinta lejos de la ventana con tijeras de disección esterilizadas. Agregue unas gotas de la solución de Ringer que contiene antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
- Use un cuchillo de microdisección para hacer una incisión que abarque la extensión de la córnea del ojo derecho (debido a cómo el embrión se pone en el óvulo, el ojo izquierdo no es accesible pero puede servir como un control no herido), que es paralelo y está en línea con la fisura coroidea (Figura 1). El primer corte atravesará el epitelio corneal.
- Use el cuchillo de microdisección para lacerar nuevamente la córnea en el mismo lugar que la primera incisión 2 veces más (por ejemplo, tres cortes en total, con corte 2 y corte 3 que ocurren junto con la misma posición en la córnea que el corte 1)11. La segunda laceración atravesará la membrana basal, y la tercera penetrará en el estroma anterior.
NOTA: Si el embrión se ha asentado debajo de la CAM diseccionada, se pueden usar pinzas de iris curvas esterilizadas para mover cuidadosamente la cabeza fuera de debajo de la CAM. Coloque las pinzas de iris curvas debajo de la cabeza, haciendo contacto con el lado izquierdo de la cabeza. Acuna toda la cabeza sobre pinzas de iris curvas cerradas y levanta suavemente la cabeza alrededor y por encima del CAM. Para ayudar con la viabilidad, use una técnica similar con las pinzas de iris curvas para volver a meter el embrión debajo de la CAM después de la cirugía para promover el crecimiento adecuado de la CAM.
- Use el cuchillo de microdisección para lacerar nuevamente la córnea en el mismo lugar que la primera incisión 2 veces más (por ejemplo, tres cortes en total, con corte 2 y corte 3 que ocurren junto con la misma posición en la córnea que el corte 1)11. La segunda laceración atravesará la membrana basal, y la tercera penetrará en el estroma anterior.
- Agregue 3-4 gotas de solución de Ringer que contengan antibióticos de penicilina / estreptomicina para hidratar el embrión y esterilizar el óvulo.
- Vuelva a sellar el orificio de la ventana con cinta transparente y vuelva a la incubadora, dejando el huevo horizontal. Permita que el embrión se desarrolle y que la herida corneal sane durante el período deseado (por ejemplo, 0.5-11 días), y luego eutanasia humanamente al embrión por decapitación.
- Use fórceps de iris curvos para cosechar el ojo de un embrión sacrificado que flota en una placa de Petri de la solución salina de Ringer agarrando suavemente el ojo en su lado posterior, donde el ojo y el tejido facial se encuentran, y levantando cuidadosamente todo el ojo lejos y libre del tejido facial.
- Use fórceps finos para hacer un pequeño orificio (3-5 cm) en la parte posterior de todo el ojo y fije todo el ojo en paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante la noche con agitación leve.
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Representative Results
Después de la disección anterior de la ACM y CAM en E5.5 para exponer la región craneal del embrión en desarrollo, se realizó una serie de laceraciones que abarcaron la córnea central E7 en ovo (Figura 1). Una herida ideal para estudiar la regeneración de la córnea se produce después de tres laceraciones, cada una hecha en la misma ubicación de la córnea. La primera laceración atraviesa el epitelio corneal, mientras que la segunda y tercera laceraciones penetran en la membrana basal subyacente y el estroma anterior, respectivamente. Para lograr una herida ideal, es crucial usar un cuchillo de microdisección afilado (ver Tabla de Materiales) y aplicar la cantidad correcta de presión a medida que se realiza la laceración (Figura 2, ver herida ideal). La aplicación de muy poca presión dará lugar a una herida poco profunda que desgarra el epitelio corneal sin penetrar lo suficiente en el estroma anterior (Figura 2, ver herida poco profunda). Sin embargo, la aplicación de demasiada presión da como resultado una herida de extensión completa que penetra en todo el estroma y expone el humor acuoso al entorno externo (Figura 2, ver herida de extensión completa).
La realización de las incisiones lacerantes adecuadas produce una herida ideal (Figura 2) que inicialmente se agranda (0-3 días después de la herida)8 (Figura 3). Se ha postulado que la fase de agrandamiento de la herida que se produce al herir las córneas de pollo E7 está relacionada con la rápida expansión del tamaño del ojo en esta etapa embrionaria8. Los ojos embrionarios de pollo crecen a un ritmo significativamente más rápido de E4 a E10 en comparación con el crecimiento ocular de E10 a la eclosión. Estas fases tempranas y rápidas del crecimiento ocular se atribuyen al crecimiento elevado dependiente de la presión intraocular (PIO)13. Por lo tanto, es probable que la rápida tasa de crecimiento del ojo junto con la PIO elevada promueva la retracción de la herida durante las primeras fases del proceso de curación (0-3 días después de la herida), que es exclusivo de la progresión de la cicatrización de la herida de córnea embrionaria. Después de eso, se produce una reepitelización y la formación de nuevo tejido (4-9 días después de la herida) para finalmente cerrar la herida de una manera libre de cicatrices a los 11 días posteriores a la herida8 (Figura 3A).
Un análisis más detallado de la profundidad y la regeneración de la herida fue posible mediante la tinción de secciones transversales con un anticuerpo de laminina que marca la membrana basal rica en laminina y la contra-tinción de las secciones con el marcador nuclear DAPI, que revela la extensión de la herida a través del epitelio corneal8. Las córneas recientemente heridas (0 dpw) y las que están al principio del proceso de regeneración (3 dpw) mostraron que la herida penetró en la capa epitelial y la membrana basal, como lo demuestra la tinción por rotura del marcador nuclear DAPI dentro del epitelio corneal y la ausencia de tinción de anticuerpos de laminina, que marca la membrana basal rica en laminina entre el epitelio corneal y el estroma subyacente8 (Figura 3B ). Sin embargo, las secciones transversales a través de 11 córneas dpw teñidas con DAPI y anticuerpos de laminina revelaron una córnea completamente curada que había sido reepitelizada y contenía una membrana basal continua rica en laminina en el sitio de la herida regenerada8 (Figura 3B).
Después de la incisión corneal, se logró una caracterización detallada del proceso de curación de la herida mediante la realización de inmunohistoquímica en tejidos corneales seccionados y heridos. Las proteínas de la matriz extracelular fibronectina y tenascina se asocian con la migración de células epiteliales y queratocitarias en la curación de heridas corneales adultas14,15. La localización espaciotemporal de las proteínas de la matriz extracelular, fibronectina y tenascina es evidente dentro de la herida cicatrizante y se encontró elevada en los puntos temporales correspondientes a la reepitelización corneal (5 días después de la herida)8 (Figura 4). Dicho análisis sugiere la importancia de la fibronectina y la tenascina para el cierre de heridas y, específicamente, su implicación en la migración y supervivencia de las células epiteliales, consistente con tales funciones en heridas corneales adultas16,17.
Comenzando en E8-E9, la córnea se vuelve densamente inervada por las fibras nerviosas sensoriales del trigémino que emanan de un anillo nervioso pericorneal y atraviesan el estroma anterior a medida que se proyectan hacia el centro de la córnea y el epitelio corneal por E12 18,19,20. Dado que las heridas corneales en este modelo se producen en E7, poco antes de la proyección nerviosa en la córnea, este modelo investiga más a fondo los nervios corneales a medida que navegan por una córnea curativa después del insulto. Mediante el uso de inmunohistoquímica de montaje completo para rastrear los nervios corneales con anticuerpos anti-tubulina neural β (Tuj1)21, es evidente que los nervios se inhiben temporalmente del tejido corneal curativo que yuxtapone directamente la córnea central herida (5 días después de la herida)8 (Figura 5A, B). A pesar de la inhibición anterior, los nervios corneales eventualmente inervan el tejido corneal completamente curado (11 días después de la herida) a niveles de densidad similares y en patrones similares a los controles no heridos y emparejados por etapas (E18C) (Figura 5C, D).
Sorprendentemente, los tejidos corneales completamente reepitelizados que se han curado de una manera no cerebrovascular y sin cicatrices muestran una recapitulación completa de la arquitectura normal del tejido de colágeno. Como lo demuestra la imagen armónica de segunda generación22,23, los haces de fibras de colágeno a lo largo de diferentes profundidades del área de la herida de la córnea central están dispuestos ortogonalmente, coincidiendo con la macroestructura nativa del tejido corneal central no herido9 (Figura 6).
Figura 1: Esquema de disecciones de membrana extraembrionaria in ovo y heridas corneales. En E5.5, la región craneal del embrión se expone diseccionando las membranas ACM y CAM y posicionando el amnios y la alantois lejos del ojo en desarrollo. Los huevos se sellan e incuban en E7 cuando se hiere la córnea central, utilizando pinzas curvas como cuna para la cabeza del embrión mientras la punta de un cuchillo microquirúrgico hace una incisión en la córnea central. La herida está orientada paralelamente a la fisura coroidea (asterisco). Para garantizar que la profundidad de la incisión alcance el estroma anterior, se deben realizar tres cortes simultáneos con el cuchillo, cada uno en la misma posición relativa, uno sobre el otro. Barra de escala = 1 mm. La figura se adapta con permiso de las referencias 8,11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Variaciones en las heridas generadas en ovo. (A) Después de las disecciones de membrana en E5.5, el ojo derecho es accesible en ovo. (B-D) Imágenes tomadas de un embrión in ovo inmediatamente después de laceraciones de diversos grados que abarcan la extensión de la córnea y están en línea con la fisura coroidea (cf). (B) Después de tres laceraciones en las que se aplicó una presión débil, se ve una herida poco profunda. La punta de flecha marca un sitio en la córnea donde el epitelio ha sido cortado pero el estroma anterior no ha sido penetrado. Las puntas de flecha denotan una pequeña región de la córnea donde se ha penetrado el estroma anterior. (C) Después de tres laceraciones en las que se aplicó una cantidad ideal de presión, se ve una herida ideal. Las puntas de flecha denotan una herida que abarca toda la extensión de la córnea donde se ha penetrado el estroma anterior. (D) Después de tres laceraciones en las que se aplicó una presión excesiva, se ve una herida de toda la extensión y el humor acuoso se ha expuesto al entorno externo. Abreviaturas: tca, arteria ciliar temporal; cf, fisura coroidea; CAM: membrana corioalantoica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Progresión de la cicatrización de la herida. (A) La progresión de la cicatrización en las córneas heridas en comparación con los controles emparejados por etapas se muestra desde el momento de la herida (0 dpw) y 16 h después de la herida (hrpw) hasta 3-11 días después de la herida (dpw). Las puntas de flecha delinean los bordes dorsal y ventral de la herida, lo que indica un período de expansión de la herida (0-3 dpw) seguido de un cierre progresivo de la herida (5-11 dpw). (B) Córneas heridas seccionadas con DAPI (azul) y laminina (rojo) a 0, 3 y 11 dpw. Los corchetes muestran la extensión de la región herida, que revela la expansión de la herida en 3 dpw y la reparación completa de la córnea reepitelizada por E11. Los asteriscos denotan la región curada de la córnea. La barra de escala es (A) 1 mm, (B) 100 μm. La figura se adapta con permiso de la referencia8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis histológico de córneas heridas. Secciones transversales a través de (A) 3 dpw y (B) 5 dpw. Las córneas heridas teñidas de DAPI (azul) revelan la localización de fibronectina (FN, rojo) y tenascina-C (TN-C, verde). Los corchetes en (A) y (B) denotan la región herida. Barra de escala: 100 μm. Abreviaturas: ep, epitelio; st, estroma; es, endotelio. La figura se adapta con permiso de la referencia8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inervación de córneas heridas. (A-D) Visualización de los nervios corneales después de la inmunotinción de montura completa de tubulina neural (Tuj1) anti-β en (B) 5 dpw y (D) 11 dpw córneas, así como (A) E12 (E12C, etapa emparejada para 5 dpw) y (C) controles E18 (E18C, etapa emparejada para 11 dpw). (B) La línea discontinua en la córnea de 5 dpw denota la extensión de la herida. El área entre corchetes directamente adyacente a la herida denota el área de la córnea que es temporalmente repulsiva a los nervios y se somete activamente a una reepitelización. (B') La exploración óptica a través del tejido corneal en curación directamente adyacente a la herida abierta revela un raro haz de nervios estromales que se extiende hacia el tejido (flecha) y las correas del nervio epitelial (punta de flecha). (C,D) Las córneas completamente regeneradas a 11 dpw muestran patrones de inervación similares y densidades nerviosas comparables a los controles emparejados por etapas. Abreviatura: w, herida. La figura se adapta con permiso de la referencia8. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ultraestructura de colágeno en córneas embrionarias curadas. (A) En escaneo facial de córneas de 10 dpw completamente curadas y controles emparejados por etapas utilizando imágenes armónicas de segunda generación (SGH). Las profundidades de escaneo varían de 2 a 66 μm de la superficie anterior de la córnea (0 μm es el estroma más anterior) y se enumeran a la izquierda de las imágenes respectivas. Los recuadros para cada imagen corresponden al análisis rápido de la transformada de Fourier del área central de la herida para esa profundidad de escaneo en particular. (B) Pilas segmentadas manualmente del análisis bidimensional de la transformada de Fast Fourier, que representan la organización del colágeno dentro de la córnea de control herida y emparejada por etapas. Barra de escala = 50 μm. La figura se adapta con permiso de la referencia9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El pollito es un sistema modelo ideal para estudiar la reparación de la herida de la córnea fetal sin cicatrices. A diferencia de los mamíferos, el polluelo es fácilmente accesible durante todo el desarrollo utilizando las estrategias in ovo8 o ex ovo 24. La córnea embrionaria del pollito es mucho más grande que las córneas de los roedores, con casi el 50% del volumen craneal dedicado al ojo25, lo que la hace altamente susceptible a manipulaciones físicas como heridas. Además, los huevos de gallina están fácilmente disponibles durante todo el año, a menudo en granjas locales, y son rentables, y solo requieren una incubadora humificada para apoyar el desarrollo.
Este protocolo informa de una serie de procedimientos que permiten la herida de la córnea embrionaria del pollito. Las heridas hechas a la córnea embrionaria del pollito se regeneran completamente, lo que permite una recapitulación completa de la estructura corneal nativa sin cicatrices detectables. Esta técnica ha convertido al pollito embrionario en un modelo animal vital para dilucidar los factores moleculares y celulares que coordinan la cicatrización de heridas corneales sin cicatrices.
A pesar de la clara promesa inherente al modelo de curación de heridas fetales descrito en este documento, vale la pena señalar que existen claras diferencias entre la cicatrización de heridas corneales fetales y adultas. La córnea embrionaria expresa factores de crecimiento y señales morfogenéticas que son silenciadas o ausentes en los tejidos adultos26. Además, los tejidos corneales adultos heridos presentan fibrosis y forman tejido cicatricial, probablemente debido a una mayor respuesta inflamatoria mediada por citoquinas y factores de crecimiento27, que están amortiguados o aún no establecidos en etapas embrionarias. Tales diferencias relacionadas con la edad dentro del tejido corneal podrían complicar los esfuerzos para restaurar completamente el tejido herido adulto. Sin embargo, la determinación de factores moleculares clave y proteínas de la matriz que regulan la cicatrización de heridas fetales sin cicatrices allanará el camino para terapias que fomenten un proceso de curación más restaurador con menos cicatrices y una mejor recapitulación de la arquitectura normal del tejido.
El método de herida descrito aquí se basa en una técnica desarrollada por primera vez por Spurlin et al.11 para obtener acceso in ovo a embriones de pollitos en etapa tardía (por ejemplo, >E6). Al ventanar el óvulo y diseccionar las membranas extraembrionarias lejos de la región craneal, el ojo embrionario es accesible a etapas tan tardías como E7. Como hemos informado anteriormente, la eliminación y el desplazamiento de las membranas amniocoriónica y corioalantoica, respectivamente, no afectan el desarrollo embrionario11. Los embriones expuestos son viables y son fácilmente susceptibles de manipulación física. En esta etapa, la córnea tiene tres capas distintas (epitelio, estroma y endotelio), lo que la hace adecuada para estudios de cicatrización de heridas después de una incisión lineal en el estroma anterior. Cabe señalar que, debido al aumento del crecimiento de la alantois con el tiempo, el acceso al ojo finalmente se ocluye en E8. Para evitar este problema, si es deseable el acceso a los ojos en etapas posteriores para la herida, hemos encontrado que el acceso al ojo se puede mantener a través de E9 mediante la manipulación diaria de las membranas extraembrionarias (por ejemplo, en E7, E8, etc.), en la que el alantois se reposiciona cuidadosamente lejos de la región craneal para garantizar que su crecimiento se produzca direccionalmente lejos del embrión. Esto permite que las córneas se hieren en estas etapas posteriores (por ejemplo, después de la inervación).
En general, la viabilidad embrionaria y la capacidad de supervivencia en esta técnica se basan en varios factores, como garantizar que se mantenga un ambiente de óvulos estéril e hidratado, al tiempo que se toma precaución para no infligir daño a los vasos sanguíneos embrionarios o a los allantois. Toda la superficie del huevo debe esterilizarse con etanol antes de la ventana para mantener la esterilidad. Esto se debe a que los pequeños fragmentos de cáscara de huevo, que a menudo están cargados de microbios, generalmente caerán en el huevo durante el procedimiento de ventana. Del mismo modo, todas las herramientas involucradas en ventanas, disecciones de membrana y hacer la incisión corneal deben enjuagarse bien con etanol y secarse o esterilizarse al fuego antes de su uso. Además, se deben agregar antibióticos al óvulo cada vez que el embrión se expone al ambiente exterior. Además, es fundamental que el embrión conserve la hidratación adecuada después de la ventana. Se debe tener mucho cuidado para garantizar que la ventana esté completamente sellada con cinta adhesiva y que no queden espacios de aire. Dada la importancia de que la cinta permanezca completamente adherida a la superficie de la cáscara del huevo y selle completamente el agujero, la superficie de la cáscara del huevo que rodea el orificio debe limpiarse y secarse antes de aplicar la cinta. Finalmente, es imperativo que no se corten inadvertidamente los vasos sanguíneos y que el alantois, que almacena los desechos líquidos del embrión, no se dañe durante la disección de las membranas extraembrionarias, ya que cualquiera de los dos es letal para el embrión. Cabe señalar que la viabilidad embrionaria es mayor cuando se hacen desgarros más pequeños en el corion y el amnios, aunque el desgarro debe ser lo suficientemente grande como para colocar las membranas extraembrionarias lejos de la región craneal. Si se toman estas medidas cuidadosas durante la disección y eliminación de membranas de óvulos de alta calidad, se puede esperar que casi todos los embriones sobrevivan al procedimiento de ventana (~ 99%), mientras que ~ 40% de los embriones expuestos sobreviven a E9 y ~ 30% a E1211. En nuestra experiencia, herir las córneas de embriones disecados por membrana E7-E9 tiene poco impacto en la viabilidad embrionaria, y amplios embriones permanecen viables a través de E18, momento en el que la herida de la córnea está completamente curada.
Lograr heridas que atraviesen el epitelio corneal y penetren en el estroma anterior es esencial para producir resultados confiables y reproducibles. Es necesario un cuchillo de microdisección de alta calidad para que se deba aplicar muy poca presión. El uso de un par de pinzas de iris curvas puede ser útil para acunar suavemente la cabeza a medida que se realiza la laceración con la otra mano. De esta manera, las pinzas curvas del iris sirven como respaldo para que la córnea permanezca estacionaria durante la herida. La penetración de la herida en el estroma es variable, especialmente cuando se aprende, pero se vuelve más reproducible a medida que el investigador aprende la sensación y el aspecto de romper el epitelio corneal. A medida que se aprende, puede ser útil ver las córneas heridas en sección transversal para que se pueda evaluar la profundidad de penetración de la herida en el estroma corneal (consulte la Figura 3B para un ejemplo de una córnea de sección transversal que muestra la profundidad ideal de la herida inmediatamente después de la laceración corneal).
Cuando se combina con técnicas clásicas de biología del desarrollo, como el injerto de tejido y la implantación de perlas, o enfoques modernos para la manipulación de genes, como la electroporación del ADN y la infección retroviral, este modelo animal de regeneración corneal promete revelar los factores moleculares y los mecanismos celulares necesarios para lograr la recuperación completa del tejido corneal después del daño. Además, este modelo animal podría usarse para probar la utilidad potencial de los compuestos terapéuticos exógenos para aumentar la regeneración corneal.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos con respecto a la información presentada en este manuscrito.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención de Desarrollo Artístico y Académico a través de Illinois Wesleyan University a TS y financiado en parte por NIH-R01EY022158 (PL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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