Summary
Questo protocollo presenta i dettagli operativi della legatura e puntura cecale (CLP) in un modello murino di sepsi. Il CLP è una delle tecniche più utilizzate per creare un modello animale di sepsi. Pertanto, è necessario un protocollo CLP standardizzato per il raggiungimento di risultati di ricerca affidabili.
Abstract
La sepsi è una grave malattia pericolosa per la vita e in rapido sviluppo che causa milioni di morti ogni anno in tutto il mondo. I ricercatori hanno compiuto enormi sforzi per chiarire la fisiopatologia della sepsi utilizzando vari modelli animali; il modello murino di sepsi indotta dalla legatura e puntura cecale (CLP) è ampiamente utilizzato nei laboratori. I tre aspetti tecnici che influenzano la gravità e la replicabilità del modello CLP sono la percentuale di cieco legato, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura cecale e il volume di feci schiacciate nella cavità addominale. La diagnosi rapida e specifica della sepsi è un fattore cruciale che influenza l'esito. Il gold standard per la diagnosi della sepsi è la coltura microbica; Tuttavia, questo processo richiede molto tempo e talvolta è impreciso. La rilevazione di biomarcatori specifici per la sepsi è rapida, ma i biomarcatori esistenti sono insoddisfacenti a causa di una breve emivita, non specificità e sensibilità insufficiente. Pertanto, vi è un urgente bisogno di un biomarcatore affidabile di sepsi nelle fasi iniziali. Pubblicazioni precedenti suggeriscono che eccessive trappole extracellulari dei neutrofili (NET) si verificano nella sepsi. L'istone citrullinato H3 (CitH3), come componente NET, è elevato sia negli animali settici che nei pazienti e la presenza di CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi. Il presente studio mirava a descrivere un modello murino standardizzato di sepsi indotta da CLP e stabilire un biomarcatore ematico affidabile della sepsi. Il nostro lavoro può contribuire alla diagnosi precoce e accurata della sepsi in futuro.
Introduction
La sepsi è definita come una disfunzione d'organo pericolosa per la vita causata da una risposta disregolata dell'ospite all'infezione1 e lo shock settico è la principale causa di morte nei casi gravi di sepsi2. La sepsi e lo shock settico causano milioni di morti in tutto il mondo ogni anno3. La chiave per migliorare l'esito dei pazienti con sepsi è l'inizio tempestivo di trattamenti come gli antibiotici4. Il metodo gold standard per la diagnosi di sepsi è la coltura microbica; Tuttavia, la coltura microbica richiede molto tempo e può portare a risultati falsi positivi e falsi negativi, che limitano notevolmente il significato clinico5. Pertanto, è altamente desiderabile identificare un biomarcatore del sangue della sepsi. La procalcitonina è riconosciuta come un biomarcatore ideale per la sepsi, ma ha un'efficacia diagnostica limitata perché non è in grado di distinguere la sepsi dalle malattie sterili6.
La legatura e puntura cecale del topo (CLP) è comunemente usata per creare un modello di sepsi nella ricerca scientifica. Il CLP è uno dei modelli di sepsi più utilizzati perché imita la peritonite polimicrobica, attivando risposte immunitarie sia proinfiammatorie che antinfiammatorie7. È ben noto che il CLP crea un modello di sepsi clinicamente più rilevante rispetto a tecniche alternative, come l'iniezione di endotossina batterica. Pertanto, il CLP è considerato il modello classico di sepsi da utilizzare nella ricerca8. Tuttavia, uno dei principali svantaggi del CLP è la sua riproducibilità, poiché la gravità del modello è influenzata da diversi fattori come la percentuale di cieco legato, la dimensione dell'ago, il numero di punture e la tecnica di laparotomia. Pertanto, è necessario standardizzare il modello di sepsi indotta da CLP. Il presente studio descrive i dettagli del protocollo del modello di sepsi indotta da CLP per mostrare la procedura standardizzata e aumentarne la riproducibilità.
La risposta infiammatoria si verifica nella fase iniziale della sepsi, con i neutrofili che rilasciano quantità eccessive di ossidanti e proteasi che causano danni agli organi8. Un fattore chiave nella fisiopatologia della sepsi è la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET), che rilasciano componenti nucleari e citosolici come DNA, istoni citrullinati e proteinasi antimicrobiche9. Studi recenti suggeriscono che l'eccessiva generazione di NET media la patologia della sepsi; nel frattempo, una diminuzione dei NET, attraverso l'inibizione enzimatica della peptidil arginina deiminasi (PAD) da parte di sostanze chimiche come YW3-56 o Cl-amidina, esercita un effetto pro-sopravvivenza nei modelli murini di sepsi10,11. L'istone citrullinato H3 (CitH3) è stato identificato come proteina specifica per la sepsi nel 201112, e successive pubblicazioni hanno dimostrato che la concentrazione circolante di CitH3 è un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi13,14. CitH3 è considerato un biomarcatore più sensibile e duraturo della procalcitonina ed è più specifico nel distinguere la sepsi rispetto alle citochine infiammatorie13.
In questo studio, abbiamo valutato un biomarcatore diagnostico affidabile della sepsi in un modello murino di sepsi indotto da CLP.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate dal Comitato di revisione degli animali presso l'ospedale di Xiangya e la Central South University (n. 202103149).
1. Preparazione
- Selezionare topi maschi C57BL/6J (peso: 20-25 g; età: 8-12 settimane) e alloggiare per 3 giorni prima di eseguire qualsiasi procedura.
- Pesare il mouse.
- Anestetizzare il topo con isoflurano all'1,5% per inalazione e pizzicare le dita dei piedi per verificare la profondità dell'anestesia.
- Fissare il mouse sul termoforo. Applicare la crema depilatoria sull'addome e lasciare agire per non più di 1 minuto prima di rimuovere la crema e i capelli.
NOTA: La normale temperatura corporea deve essere mantenuta posizionando un cuscinetto caldo sotto il topo anestetizzato durante l'intervento chirurgico.
2. Funzionamento
- Preparare strumenti chirurgici sterili adatti alla chirurgia degli animali roditori. Indossare guanti sterili, una maschera facciale e un camice chirurgico per garantire condizioni asettiche.
- Disinfettare la pelle addominale con salviette di iodio almeno tre volte. Coprire l'area chirurgica operatoria con teli chirurgici sterili.
- Utilizzare forbici chirurgiche sterili per fare un'incisione di circa 2 cm nella parete addominale lungo la linea alba.
NOTA: Non danneggiare gli organi. - Identificare e isolare il cieco dalla cavità peritoneale con pinzette sterili.
- Ligate il 75% del volume del cieco con 4-0 suture di seta. Non ligare i vasi sanguigni mesenterici.
NOTA: La percentuale del cieco che è legato determina la gravità della sepsi. - Forare il cieco creando una perforazione passante (due fori) con un ago da 21 G (da un lato attraverso la parete cecale al lato opposto) nel punto medio tra l'estremità della coda e il set di legatura.
- Eliminare l'ago. Spremere delicatamente una piccola goccia di feci dal cieco attraverso i fori di penetrazione.
NOTA: La quantità di feci schiacciate nella cavità peritoneale deve essere coerente, in quanto ciò determina anche la gravità della sepsi. I passaggi 2.5-2.7 dovrebbero essere saltati per i topi fittizi. - Sostituire delicatamente il cieco nella cavità addominale.
- Chiudere il muscolo addominale e la pelle separatamente con suture di seta 6-0.
- Disinfettare l'incisione con iodio.
- Iniettare ketoprofene (5 mg/kg) nel quadrante inferiore sinistro dell'addome per evitare il cieco. Posizionare il mouse su un pad caldo fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestetico.
- Mettere il topo in una gabbia in una stanza a temperatura controllata (22 °C) e dare libero accesso al cibo e all'acqua. Controllare il mouse ogni 6 ore per la prima settimana postoperatoria.
- Eutanasia del topo per overdose di anidride carbonica quando i sintomi della sepsi incontrano gli endpoint predefiniti.
3. Trattamento
- Dividere casualmente i topi nel gruppo fittizio, nel gruppo CLP, nel gruppo CLP + YW3-56 (Figura 2a) e nel gruppo CLP + Cl-amidina (Figura 1).
Nota : il gruppo fittizio è stato sottoposto alle stesse procedure dei gruppi CLP ad eccezione del CLP. YW3-56 (5 mg/kg) o Cl-amidina (40 mg/kg) è stato somministrato tramite iniezione peritoneale 1 ora dopo la fase 2.9 durante la sutura dello strato muscolare e cutaneo. - Raccolta dei campioni
- Raccogliere il sangue periferico dal plesso retrobulbare15 24 ore dopo l'operazione.
- Preparare il siero mediante centrifugazione (1.000 x g, 5 min) e conservare a -80 °C fino all'uso.
- Misurare la concentrazione di CitH3 utilizzando un kit ELISA sandwich indiretto come descritto in precedenza13.
- Rivestire l'anticorpo monoclonale anti-CitH3 su una piastra a 96 pozzetti per catturare la proteina CitH3.
- Trattare il siero con DNasi I (150 unità/ml, 37° per 1 ora) e incubare nei pozzetti (20 μL, temperatura ambiente).
- Aggiungere l'anticorpo policlonale anti-CitH3 (0,33 μg/mL, 100 μL, 2 h) per rilevare la proteina CitH3 catturata.
- Incubare l'anticorpo secondario marcato con perossidasi anti-coniglio (0,02 μg/mL, 100 μl, 1 h) nei pozzetti.
- Dopo un accurato lavaggio, sviluppare i pozzetti con 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (100 μL, 20 min).
NOTA: Ulteriori dettagli sul protocollo del kit ELISA sono forniti nella precedente pubblicazione13.
- Analisi statistica
- Esegui ANOVA unidirezionale per analizzare le differenze tra i tre gruppi, seguito da test post hoc Bonferroni per confronti multipli. Utilizzare un software statistico per eseguire l'analisi. Valori p pari o inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.
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Representative Results
Come mostrato nella Figura 2A, nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio mediante western blotting. La concentrazione sierica di CitH3 è aumentata significativamente dopo CLP, e questo aumento è stato bloccato dall'inibizione della formazione di NET attraverso la somministrazione di YW3-56, un inibitore della PAD10. La Figura 2B mostra le concentrazioni sieroCitH3 determinate da ELISA. A 24 ore dopo CLP, la concentrazione sierica di CitH3 era aumentata nei gruppi CLP rispetto al gruppo sham (p = 0,0008), e questo aumento di CitH3 era significativamente attenuato dalla Cl-amidina, un inibitore della PAD che limita la formazione di NET (p = 0,0028).
Figura 1: Raggruppamento sperimentale. I topi sono stati divisi casualmente nel gruppo sham, nel gruppo CLP, nel gruppo CLP + YW3-56 (A) e nel gruppo CLP + Cl-amidina (B). Il CLP è stato eseguito come descritto nel protocollo. YW-3-56 (5 mg/kg) o Cl-ammidina (40 mg/kg) è stato somministrato tramite iniezione peritoneale 1 ora dopo CLP. Il gruppo fittizio è stato sottoposto alle stesse procedure dei gruppi CLP, ad eccezione del CLP. Il sangue è stato raccolto in vari momenti e il siero è stato preparato e conservato a -80 ° C fino all'uso. YW3-56 e Cl-amidina sono entrambi inibitori della peptidil arginina deiminasi che limitano significativamente la formazione di trappole extracellulari dei neutrofili. Abbreviazioni: CitH3 = istone citrullinato H3; CLP = legatura cecale e puntura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La concentrazione sierica di CitH3 è risultata significativamente aumentata nel modello di sepsi indotta da CLP ed è stata alleviata dall'inibizione della PAD. (A) È stata eseguita la Western blotting per testare la concentrazione sierica di CitH3. Nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio. La concentrazione di CitH3 è risultata significativamente aumentata nei gruppi CLP e questo aumento è stato bloccato dal trattamento con YW3-56. (B) Le concentrazioni sieriche di CitH3 sono state misurate mediante ELISA. Quasi nessun CitH3 è stato rilevato nel gruppo fittizio. I gruppi CLP hanno mostrato marcati aumenti di CitH3, che è stato attenuato dalla somministrazione di Cl-amidina. YW3-56 e Cl-amidina sono entrambi inibitori della PAD che limitano significativamente la formazione di trappole extracellulari dei neutrofili. Abbreviazioni: CitH3 = istone citrullinato H3; CLP = legatura cecale e puntura; PAD = peptidil arginina deiminasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il CLP introduce agenti patogeni nell'addome per creare un modello preclinico di sepsi. Quando si esegue il CLP, è importante utilizzare condizioni sterili per eliminare l'interferenza dei batteri esogeni e utilizzare dosaggi accurati di anestetici16. I tre aspetti tecnici del CLP che influenzano la gravità e la replicabilità del modello di sepsi sono la percentuale del cieco legato, la dimensione dell'ago utilizzato per la puntura cecale e il volume di feci schiacciate nella cavità addominale. La legatura di circa il 75% del cieco provoca sepsi grave, la legatura del 50% provoca sepsi moderata e la legatura del 25% o meno provoca sepsi lieve17. Il numero di forature e la dimensione dell'ago determinano il tasso di mortalità18 e il miglior risultato si ottiene con la puntura passante. Una piccola quantità (una goccia) di feci è sufficiente a causare peritonite batterica e richiede attenzione quando si spremono le feci. Il CLP richiede circa 10 minuti se eseguito da un individuo esperto.
Il modello murino di sepsi indotta da CLP descritto in questo studio ha diverse limitazioni. In primo luogo, il topo può essere troppo piccolo per ottenere campioni di sangue sufficienti per l'analisi del sangue periferico e la misurazione delle citochine. In secondo luogo, il regolamento CLP non può essere eseguito negli animali appena nati. In terzo luogo, la variabilità si verifica ancora e i risultati riproducibili potrebbero non essere ottenuti. È importante assicurarsi che i chirurghi abbiano avuto una pratica adeguata nell'esecuzione del CLP prima di condurre test di ricerca.
Il CLP crea un modello clinicamente realistico di sepsi che imita il processo fisiopatologico e i profili delle citochine ed è stato ampiamente utilizzato nei roditori. La gravità del CLP può essere manipolata per soddisfare diversi scopi di studio regolando le dimensioni dell'ago e la percentuale del cieco legato. Secondo i nostri risultati ottenuti utilizzando il modello CLP, la rilevazione della concentrazione circolante di CitH3 consente la diagnosi precoce della sepsi nei topi. Il valore diagnostico della concentrazione sierica di CitH3 consente l'inizio tempestivo di trattamenti anti-sepsi che migliorano significativamente i risultati degli individui settici.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
Acknowledgments
Ringraziamo il professor Wang Wei e il dottor Liu Shuai per l'aiuto negli esperimenti. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del Young Research Funding of Xiangya Hospital, Central South University (n. 2019Q10), dalla National and Science Foundation della provincia di Hunan (n. 2020JJ4902) e dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82202394).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21G needle | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoclonal antibody | laboratory self developed | ||
| anti-CitH3 polyclonal antibody | Abcam | ab5103 | |
| anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 mice | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| depilatory cream | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| silk sutures (4-0 & 6-0) | |||
| surgical instruments | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
References
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