Summary
제시된 방법은 3차원(3D) 스캐폴드(예: 심장 판막 전단지)에서 생체 모방 섬유 구조를 엔지니어링하는 혁신적인 방법을 제공합니다. 3D 인쇄된 전도성 형상은 모양과 치수를 결정하는 데 사용되었습니다. 섬유 배향 및 특성은 각 층에 대해 개별적으로 조정가능하였다. 하나의 설정으로 여러 샘플을 제조 할 수 있습니다.
Abstract
전기 방사는 조정 가능한 특성을 가진 (마이크로) 섬유질 스캐폴드를 만들 수있는 가능성을 제공하기 때문에 심혈관 조직 공학에서 널리 사용되는 기술이되었습니다. 이 연구의 목적은 전도성 3D 인쇄 수집기를 사용하여 인간 심장 판막 전단지의 건축 섬유 특성을 모방 한 다층 스캐폴드를 만드는 것이 었습니다.
대동맥 밸브 커셉의 모델은 상용 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 만들어졌습니다. 전도성 폴리락트산은 3D 프린트된 리플릿 템플릿을 제작하는 데 사용되었습니다. 이 커셉 네거티브는 특별히 설계된 회전 전기 방사 맨드렐에 통합되었습니다. 폴리우레탄의 세 층이 수집기 위로 회전하여 인간 심장 판막의 섬유 배향을 모방했습니다. 표면 및 섬유 구조는 주사 전자 현미경 (SEM)으로 평가되었다. 형광 염료의 적용은 또한 다층 섬유 구조의 현미경 시각화를 허용했습니다. 스캐폴드의 생체역학적 특성을 평가하기 위해 인장 시험을 수행하였다.
전기방사 장비를 위한 필수 부품의 3D 프린팅은 저렴한 예산으로 단기간에 가능했다. 이 프로토콜에 따라 만들어진 대동맥 판막 커셉은 섬유 직경이 4.1 ± 1.6 μm인 3층으로 제작되었습니다. SEM 이미징은 섬유의 균일 한 분포를 보여주었습니다. 형광 현미경 검사는 서로 다르게 정렬 된 섬유를 가진 개별 층을 밝혀 냈으며, 각 층은 원하는 섬유 구성에 정확하게 도달했습니다. 제조된 스캐폴드는 특히 정렬 방향을 따라 높은 인장 강도를 보였다. 다른 컬렉터의 인쇄 파일은 보조 파일 1, 보조 파일 2, 보충 파일 3, 보조 파일 4 및 보조 파일 5로 사용할 수 있습니다.
고도로 전문화 된 설정 및 워크 플로우 프로토콜을 사용하면 여러 층에 걸쳐 복잡한 섬유 구조가있는 조직을 모방 할 수 있습니다. 3D 인쇄 컬렉터에서 직접 회전하면 낮은 생산 비용으로 3D 모양을 제조할 때 상당한 유연성을 얻을 수 있습니다.
Introduction
심혈관 질환은 서구 국가에서 사망의 주요 원인입니다 1. 이 분야에서 광범위한 연구가 수행되었지만 퇴행성 심장 판막 질환의 부담은 향후2 년 동안 더욱 증가 할 것으로 추정됩니다. 외과 적 또는 중재 적 심장 판막 교체는 치료 옵션으로 가능합니다. 이 시점에서 기계적 및 생체 보철 심장 판막을 사용할 수 있으며 둘 다 개별적인 단점이 있습니다. 기계식 밸브는 혈전성이며 평생 항응고가 필요합니다. 생물학적 판막은 항응고를 필요로하지 않지만, 리모델링 부족, 높은 석회화 속도 및 수반되는 분해를 보여줍니다3.
조직 조작된 심장 판막은 생체 내 리모델링을 허용하는 미세섬유성 스캐폴드를 체내에 도입함으로써 이러한 단점을 해결할 수 있을 것이다. 다양한 방법, 예를 들어, 전기방사(ESP), 탈세포화, 마이크로몰딩, 스프레이, 딥코트 및 3D-바이오프린팅이 이용가능하다. 이러한 방법은 특정 속성을 만들거나 저렴하고 빠르거나 대안이 부족하기 때문에 선택할 수 있습니다. 방법과 재료를 결합하여 더 복잡한 구조를 만들 수도 있습니다4. 예를 들어, ESP는 조직 공학에서 스캐폴드를 만드는 표준 기술이었으며, 다양한 재료의 조합과 섬유 직경, 섬유 방향 및 다공성의 조정을 허용합니다 4. 또한, 다양한 후처리 기술은 최적화된 조직 리모델링, 개선된 혈적합성, 및 전기방사된 스캐폴드 5,6,7의 조절가능한 생분해를 가능하게 한다.
기본 ESP는 정적 또는 회전 컬렉터를 사용하며, 이는 섬유 정렬 정도와 획득 된 섬유 직경8에 직접적인 영향을 미칩니다. 제조 제한으로 인해 클래식 ESP 회전 수집기는 회전 드럼, 디스크, 와이어 또는 금속 막대로 구성됩니다. 3D 프린팅의 도입은 전통적인 제조 기술에 의해 제한되지 않는보다 개인화 된 수집가 형상을 만들 수있게합니다. 이 개별화는 심장 판막 전단지와 같은 3D 구조물을 만드는 데 특히 유용합니다.
인간 심장 판막 전단지의 자연적인 삼층 (fibrosa, spongiosa, ventricularis) 구조는 심장 주기 9,10 동안 노출되는 기계적 힘과 전단 응력에 대한 조직의 반응입니다. 라미나 섬유사의 섬유는 원주적으로 배향되는 반면, 라미나 스폰지오사의 섬유는 무작위로 정렬되고 라미나 심실의 섬유는 방사상으로 정렬됩니다. 따라서 상응하는 섬유 배향을 갖는 삼중 층이 조직 공학 스캐폴드에서 이러한 밸브의 특성을 모방하도록 제안된다.
워크플로우 프로토콜은 3D 프린팅 및 전기방사를 사용하여 3층 3D 심장 판막 전단지를 제작하는 혁신적인 방법을 설명합니다. 또한 모든 레이어에서 정확한 섬유 방향을 보장하기 위해 품질 관리 단계가 제공됩니다.
Protocol
1. 준비 작업
- 3D 프린팅
참고: 다음 단계를 수행하려면 이 원고와 함께 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5로 제공된 "표준 삼각형 언어"(STL) 파일을 다운로드해야 합니다. 컬렉터 부품은 STL 파일로 제공됩니다. 연결 플랜지는 "제품 모델 데이터 교환을 위한 STandard"(STEP) 파일로 제공되어 개별 설정에 맞게 콜렉터를 조정할 수 있습니다. 또한, 중앙 금속 봉에 대한 기술 도면은 보충 파일 6으로 종래의 제조를 위해 제공된다.- 슬라이싱 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 비전도성 폴리락트산(PLA) 및 0.4mm 노즐용 활성 프린트 헤드를 구성합니다.
주: 슬라이싱 소프트웨어, 필라멘트 및 노즐 직경은 사용 가능한 3D 프린터에 따라 달라질 수 있습니다. - STL 파일 Specimen_mount_A (보충 파일 3) 및 Speciment_mount_B (보충 파일 4)을 슬라이스 소프트웨어에 업로드하십시오.
- 삼각형 서피스가 빌드 플레이트에 배치되도록 모델을 회전합니다.
- 모든 부품을 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 선택한 모델 곱하기를 선택합니다. 프롬프트 매수에 1을 입력하고 확인을 클릭합니다. 빌드 플레이트에 총 네 개의 모델을 놓습니다.
- 슬라이스 두께를 0.1mm, 벽 두께를 1mm, 채우기 밀도를 40%로 설정하고 지원 생성 상자의 선택을 취소합니다.
- 슬라이스 단추를 | 이동식에 저장하여 인쇄 파일을 USB 드라이브에 저장합니다.
- 비전도성 PLA를 프린터에 로드하고 인쇄 파일을 시작합니다.
- 인쇄가 완료되면 빌드 플레이트에서 모델을 제거하고 하단 모서리에서 뒤틀림을 확인합니다.
- 슬라이싱 소프트웨어에서 재료 매개변수를 유지하고 모델을 Collector_Flange(보충 파일 1 및 보충 파일 5) 및 Leaflet_Template(보충 파일 2)로 바꿉니다.
- 플랜지를 회전하여 평평한 원형 표면이 빌드 플레이트에 맞닿도록 합니다. 또한 전단지 템플릿을 회전하여 사각형 표면이 빌드 플레이트에 직접 배치되도록 합니다.
- 플랜지를 표시하고 1.1.4단계와 같이 모델을 곱합니다. 유형 1을 사용하여 빌드 플레이트에 플랜지 모델의 사본 1 개와 원본 1 개를 받습니다.
- 전단지 모델을 표시하고 8 을 곱하면 1.1.4에 설명된 단계에 따라 총 9개의 전단지 모델을 받게 됩니다.
- 슬라이스 두께를 0.1mm, 벽 두께를 1mm, 채우기 밀도를 80%로 설정하고 지원 생성 상자의 선택을 취소합니다.
- 슬라이스 단추를 | 이동식 파일에 저장하여 새 인쇄 파일을 USB 드라이브에 저장합니다.
- 전도성 PLA를 프린터에 로드하고 인쇄 프로세스를 시작합니다.
- 인쇄가 완료되면 빌드 플레이트에서 모델을 제거하십시오. 전단지 네거티브의 바닥에있는 개별 필라멘트 섬유를 와이어 커터로 조심스럽게 제거하십시오 (지지 구조가 사용되지 않았기 때문에).
- 슬라이싱 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 비전도성 폴리락트산(PLA) 및 0.4mm 노즐용 활성 프린트 헤드를 구성합니다.
- 방사 용액
주의: 테트라하이드로퓨란(THF)과 디메틸포름아미드(DMF)는 흡입하거나 피부에 닿지 않아야 하는 유해한 용매입니다. 손잡이에 강한 장갑과 보호 고글을 착용하는 것이 좋습니다. 그들을 다룰 때, 배기 후드 아래에서 작업하십시오.그들은 매우 휘발성이기 때문에.- 배기 후드 아래에 스케일을 놓고 200mL 스크류 캡 유리 병을 그 위에 놓습니다. 저울을 감당하십시오.
- 50mL의 DMF와 50mL의 THF를 유리 병에 붓는다. 용매의 중량을 주목하십시오.
- 병 안에 마그네틱 바를 놓고 병을 마그네틱 교반기에 놓고 전원을 켭니다.
- 표시된 중량에 0.15(= 15% w/v)를 곱하고 상응하는 양의 폴리우레탄(PU)을 용매 혼합물(DIN 1310)이 들어있는 유리 병으로 천천히 옮깁니다.
- 병을 닫고 실온에서 적어도 12시간 동안 교반하여 균질한 용액을 얻었다.
2. 전기 방사 설정
- 집회
참고: 제시된 컬렉터로 만든 리플릿 스캐폴드는 비교적 작기 때문에 직경이 큰 드럼 맨드렐(D: 110mm)을 선택적으로 사용하는 것이 좋습니다. 이를 통해 더 큰 다층 스캐폴드를 만들 수 있으며 현미경, 생체 적합성 및 생체 역학 평가에 도움이됩니다.- 3D 인쇄 부품과 6개의 M3 x 15 나사를 사용하여 컬렉터를 조립합니다.
- 세 개의 나사를 사용하여 금속 막대를 플랜지 중 하나에 고정하십시오.
- 금속 막대 사이에 한쪽 Specimen_mount_B 을 밉니다. 템플릿 공간이 플랜지의 반대 방향을 가리키는지 확인합니다.
- Specimen_mount_B의 세 슬롯을 심장 판막 전단지 템플릿으로 채 웁니다.
- Specimen_mount_A 위에 놓고 공간을 템플릿으로 채 웁니다.
- 다른 Specimen_mount_A을 밀어 넣고 템플릿으로 공간을 채 웁니다.
- 두 번째 Specimen_mount_B 을 맨 위에 올려 놓음으로써 템플릿을 수정하십시오.
- 두 번째 플랜지를 위에 놓고 M3 나사를 사용하여 고정하십시오.
참고: 전단지 템플릿이 모두 같은 방향(전단지의 직선 가장자리가 금속 막대와 평행)으로 향하고 있는지 확인하십시오. - 조립된 전단지 컬렉터를 전기방사 설정에 배치하고 플랜지를 모터 축(예: M6 나사 및 윙 너트)에 단단히 고정합니다(그림 1).
주의: 전도성 PLA는 일반 PLA보다 더 부서지기 쉽기 때문에 스냅을 피하기 위해 재료에 압력을 가하는 볼트를 고정할 때 1.4Nm의 토크 렌치를 사용하십시오. - 컬렉터에서 30cm 떨어진 곳에 바늘 홀더를 놓습니다.
- 바늘 홀더에 평평한 팁으로 14게이지(G) 바늘을 고정하고 컬렉터 축 높이에 고정합니다.
- 유연하고 용매 내성(예: 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)) 튜브를 바늘의 루어락 포트에 연결합니다.
참고: DMF와 THF는 많은 플라스틱을 녹입니다. 이러한 용매 (예 : 금속 및 유리 공구)로 작업 할 때 용제 내성 재료를 사용해야합니다. 플라스틱 공구가 필요한 경우 (예 : 주사기 또는 튜브), 용제 내성 재료를 사용해야합니다. - 폴리머 충전된 주사기의 추후 연결을 위해 튜브를 시린지 펌프로 안내한다.
- 전원 공급 장치(PSU) 연결
주의: 설치하는 동안 전원 공급 장치가 주 전원에서 분리되어 있는지 확인하십시오.- 두 개의 차폐된 고전압 케이블을 전원 공급 장치의 양극 및 음극에 연결합니다.
- 악어 클립을 사용하여 음극(-극)에 연결된 케이블을 14G 바늘에 연결합니다. 클립과 바늘 사이의 연결을 확인하십시오. 다음으로, 간섭을 피하기 위해 회전 영역 밖에서 실행되도록 고전압 케이블을 안내하십시오.
- 악어 클립과 두 번째 고전압 케이블을 사용하여 컬렉터를 양극(+ 극)에 연결합니다. 슬립 링이나 스트립 케이블을 사용하여 슬라이딩 접점을 사용하여 컬렉터의 플랜지에 접점을 만듭니다.
- 주사기의 제조
참고: 이 단계는 회전 프로세스가 시작되기 직전에 수행해야 합니다.- 20 mL 루어락 주사기를 단계 1.2에서 제조된 방사 용액으로 채운다.
- 주사기를 용제 내성 튜브에 연결하고 바늘 끝에 액적이 보일 때까지 용액을 튜브 시스템에 수동으로 밀어 넣습니다.
- 주사기를 주사기 펌프에 넣으십시오. 펌프를 켠 후 다음 매개 변수를 입력하십시오 : 직경 : 19.129 mm; 부피: 5 mL; 속도 3 mL / h.
3. 전기방사공정
- 모터 테스트 실행
참고: 3D 인쇄를 사용하여 컬렉터를 제조하면 컬렉터가 중심을 벗어난 움직임이 발생할 수 있습니다. 따라서 회전 속도는 낮지만 고전압이 없는 테스트 실행을 적극 권장합니다.- 컴퓨터의 아이콘을 두 번 클릭하여 모터 제어 소프트웨어를 엽니다.
- 연결 단추를 클릭하여 모터 컨트롤에 연결합니다 .
- 연결 후 프로파일 속도 작동 모드를 선택하고 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 작업 탭을 클릭하십시오.
- 빨간색 선으로 표시된 빠른 중지 단추 아래의 프로파일 속도 탭을 선택합니다. 다음 설정을 입력하십시오 : 목표 속도 : 200 rpm; 프로파일 가속 : 100; 프로파일 감속 : 200; 빠른 중지 : 5000.
참고: 회전 방향은 바늘 쪽에서 위쪽이어야 하며, "목표 속도" 필드의 기호를 "+"에서 "-"로 변경하여 조정할 수 있습니다. - 테스트 실행을 시작하고 컬렉터에 불균형이 있는지 확인합니다. 수집기가 원활하게 실행되면 프로토콜을 진행하십시오. 그렇지 않으면 모터를 중지하고 2.1.9단계에서 설명한 대로 콜렉터를 다시 조정하십시오.
- 스위치 켜기 활성화 버튼을 클릭하여 모터를 중지하고 대상 속도를 2,000rpm으로 변경합니다.
- 제조 공정
참고: 전기 방사는 환경 파라미터에 대한 의존도가 높은 프로세스입니다. 최적의 전기방사 결과는 21°C와 24°C 사이의 온도에서 15-20% 상대 습도 사이에서 얻어졌다.- 첫 번째 레이어
참고: 설정 단계 동안 PU의 건조된 액적이 바늘 끝에 형성되었을 수 있습니다. 필요한 경우 길고 비전도성 도구를 사용하여 액적을 제거하십시오.- 모터 제어 소프트웨어에서 작동 활성화 버튼을 클릭하여 모터를 켭니다.
- 고전압 전원 공급 장치를 켜고 양극과 음극 모두에 대한 전압을 조정하십시오 : 마이너스 폴 (바늘) : 18kV; 플러스 폴 (컬렉터) : 1.5kV.
- 시린지 펌프를 3 mL/h의 유속으로 가동하십시오.
- 타이머를 20분으로 설정합니다.
- 재단사 원뿔의 형성을위한 바늘 끝을 관찰하십시오. 바늘 끝에서 원뿔의 모양에 따라 안정적인 맞춤형 원뿔이 설정될 때까지 음극의 전압을 ±100V 단위로 조정하십시오.
주: 낙하가 걸려 있는 경우 전압이 너무 낮습니다. 그러나 불안정한 흐름은 전압이 너무 높게 설정되었음을 나타낼 수 있습니다. - cusp 템플릿이 섬유로 적절하게 덮일 때까지 20 분 동안 기다리십시오.
- 주사기 펌프를 끕니다.
- 전원 스위치를 뒤집어 PSU를 끕니다.
- 모터 제어 소프트웨어 에서 스위치 켜기 활성화 버튼을 클릭하여 모터를 중지합니다.
주의: 시스템에서 부품이 이동하는 부상을 방지하려면 콜렉터가 완전히 정지하여 테스트 챔버를 열 때까지 기다리십시오.
- 두 번째 레이어
- 모터 제어 소프트웨어에서 입력 필드 목표 속도를 10rpm으로 변경합니다.
- 3.2.1.1-3.2.1.9단계를 반복합니다.
- 세 번째 레이어
참고: 스캐폴드가 완전히 건조되기 전에 기계적 응력에 매우 민감합니다. 3.2.3.2-3.2.3.6단계를 수행할 때는 매우 주의해야 합니다. 이 단계에서 스캐폴드 / 섬유를 만지지 마십시오.스캐폴드가 쓸모 없게 될 수 있습니다.- 컬렉터 플랜지를 모터 축에 연결하는 나사를 조심스럽게 열고 전기방사 장치에서 리플릿 컬렉터(그림 2B)를 분리합니다.
- 메스를 사용하여 각 전단지 템플릿의 외부 윤곽선을 따라 전기방사된 섬유를 절단합니다(그림 2C).
- 컬렉터의 한쪽에 있는 플랜지를 분리합니다.
- 3D 인쇄 인서트를 당기고 리플릿 템플릿을 비전도 삼각형 홀더에서 분리합니다.
- 모든 전단지 템플릿을 90° 회전하고 컬렉터를 다시 어셈블합니다.
- 컬렉터를 전기 방사 설정에 삽입하고 단단히 고정하십시오.
- 다시 말하지만, 회전 프로세스를 계속하기 전에 불균형이 있는지 확인하십시오.
- 모터 제어 소프트웨어에서 입력 필드 목표 속도를 2,000rpm으로 변경합니다.
- 3.2.1.1-3.2.1.9단계를 반복합니다.
참고 : 전기 방사 공정을 마친 후에는 튜브가 막히지 않도록 튜브와 바늘을 순수한 DMF로 플러시하는 것이 좋습니다.
- 형광 염색 스캐폴드 (옵션)
참고 : 형광 염료는 기존의 형광 현미경으로 섬유를 볼 수있게하는 데 사용됩니다. 이는 방법을 구현하는 동안에만 필요하며 새 설정이 적용된 후의 품질 관리를 위해서만 필요합니다. 형광 염료의 사용은 확립 된 설정을 사용하여 스캐폴드를 제조 할 때 권장되지 않습니다.- 단계 1.2에서 제조된 방사용액을 별도의 병에 세 개의 등분으로 나눈다.
- 스케일을 사용하여, 중합체 용액의 매 그램 (0.1 wt%)에 대해 1 mg의 형광 염료를 측정한다. 세 가지 형광 염료 (즉, 플루오레세인, 텍사스 레드, 4',6-디아미디노-2-페닐인돌[DAPI])에 대해 반복한다.
- 방사 용액에 염료를 첨가하고, 병 뚜껑을 닫고, 균질화 될 때까지 2-3 시간 동안 또는 저어줍니다.
참고: 형광 염료가 퇴색하는 것을 방지하려면 자기 교반기 위에 불투명한 덮개를 배치하여 방사 용액을 가능한 한 빛으로부터 보호하십시오. 형광 염색된 스캐폴드를 위한 공정은 단계 3.2.1-3.2.3에 기재된 표준 공정과 매우 유사하다. - 단계 3.2.1에서, 표준 주사기를 제1 형광 염료를 함유하는 방사 용액으로 충전된 주사기로 교체한다.
- 3.2.2 단계에서 현재 사용되는 튜브 및 바늘을 새 튜브 또는 청소 된 튜브로 교체하십시오. 이어서, 초형광염료가 포함된 방사용액이 있는 주사기를 시린지 펌프에 넣는다.
- 단계 3.2.3에서 다시, 튜빙 및 바늘을 새로운 또는 세척된 것들로 교체하고, 주사기를 제3 형광 염료를 함유하는 방사 용액으로 채워진 주사기로 교체한다.
참고 : 제조 공정 중 지연을 피하려면 세 세트의 튜브와 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 대안적으로, 튜브 및 바늘은 형광 염료를 함유하는 방사 용액이 시스템에 남지 않을 때까지 층들의 생산 사이에 THF 및 DMF로 철저하게 플러싱될 수 있다.
- 첫 번째 레이어
4. 후처리 및 샘플 수집
- 후처리 스캐폴드
- 전기방사 장치에서 컬렉터를 분리합니다.
- 메스를 사용하여 3.2.3.2 단계에서 설명한 대로 각 템플릿을 베이스에서 자유롭게 자릅니다.
- 위에서 설명한 대로 컬렉터를 열고 템플릿을 트레이 위에 놓습니다.
- 트레이를 40°C에서 하룻밤 동안 건조 캐비닛에 놓는다.
- 샘플을 완전히 건조 한 후 메스를 사용하여 전단지 템플릿의 가장자리를 따라 조심스럽게 잘라 잉여 섬유를 제거하십시오.
- 그런 다음 템플릿의 전단지 스캐폴드를 조심스럽게 벗겨 내고 추가 처리를 위해 트레이에 놓습니다.
Representative Results
이 프로토콜은 심장 판막의 심혈관 조직 공학에 사용하기위한 삼중 층 전단지 스캐폴드의 개발을 목표로합니다. 그것은 네이티브 인간 심장 판막에서 세 층의 콜라겐 구성을 모방합니다. 각 층은 전체 직경이 4.1 ± 1.6μm인 섬유로 구성됩니다(그림 1).
그림 1: 섬유 특성. 섬유의 분석: 총 섬유 수; 직경 μm : 평균, 모드, 표준 편차, 최소 직경, 최대 직경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전단지 템플릿은 Ø 24mm 대동맥 밸브 보철물에 맞게 설계되었습니다(그림 2C). 건조 후, 전단지 스캐폴드는 3D 심장 판막 커셉의 모양을 유지했습니다 (그림 3A).
그림 2: 전기방사 설정. (A) 회전식 셋업에서 3D 프린팅된 컬렉터를 조립; (b) 3D 인쇄 가능한 컬렉터의 CAD 렌더링; (c) B에 도시된 심장 판막 전단지의 캐디티브 렌더링; 삼각형은 확대된 부분을 나타냅니다. 약어: CAD = 컴퓨터 지원 설계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
SEM 이미징은 정렬된 층과 정렬되지 않은 층을 평가하기 위해 사용되었다(TEMP F3512-21). 사진은 스캐폴드의 세 가지 다른 위치에서 100x, 500x 및 2,000x 배율로 촬영되었습니다. 정렬된 섬유 스캐폴드는 원주 방향으로 매끄러운 표면과 엄격한 배향으로 나타납니다(그림 3B). 섬유 배향에 대하여 2,000x 이미지의 시각적 분석은 섬유의 일차 정렬을 확인한다(도 3C). 정렬되지 않은 섬유 스캐폴드는 정렬된 섬유에 비해 유사하게 매끄러운 표면을 나타낸다. 섬유 방향은 무질서하며 섬유 사이의 많은 두드러진 교차점이 있습니다 (그림 3D). 후속 시각적 분석은 일차 방향이 보이지 않는 섬유의 정렬되지 않음을 확인합니다(그림 3E).
그림 3: 전기방사 전단지 및 SEM 이미징. (A) 일렉트로스펀 다층 전단지 및 3D 프린팅 전단지 수집기; (b) 정렬되지 않은 섬유의 SEM 이미지 (배율 1,000x); (c) 정렬되지 않은 섬유의 섬유 배향 분석; (d) 정렬된 섬유의 SEM 이미지(배율 1,000x); (e) 정렬된 섬유의 섬유 배향 분석. 스케일 바 = 10 mm (A), 100 μm (B, D). 약어 : SEM = 주사 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광 염색된 다층 스캐폴드의 이미징은 뚜렷한 섬유 배향을 갖는 세 개의 개별 층을 밝혀냈다(도 4D). 바닥층(그림 4A; 파란색)은 수평 방향으로 정렬된 섬유를 보여주며 섬유 간의 교차점은 거의 없습니다. 중간 층(그림 4B; 녹색)은 일차 섬유 방향이 없는 정렬되지 않은 섬유를 보여줍니다. 상부 층(도 4C; 적색)은 수직 방향으로 정렬된 섬유를 나타낸다. 상부 및 하부 층의 시각적 분석은 방사 공정 동안 컬렉터의 90° 회전에 따른 89°의 두 층 사이의 평균 각도를 나타낸다(그림 4E).
도 4: 다층 스캐폴드의 형광 현미경 검사. (A) 왼쪽 아래에서 오른쪽 상단으로 일차 배향을 갖는 첫 번째 층의 형광 이미지; (b) 정렬되지 않은 섬유 배향을 갖는 두 번째 층의 형광 이미지; (c) 오른쪽 아래에서 왼쪽 상단으로 일차 배향을 갖는 세 번째 층의 형광 이미지; (d) 하나의 스캐폴드에 결합된 세 층 모두의 형광 이미지; (e) 세 층 모두에 대한 섬유 배향 분석 (층 1: 파란색; 층 2: 녹색; 층 3: 적색); 배율 = 400x (A-D); 스케일 바 = 100 μm (A-D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두께 측정은 21개의 샘플(도 5A)에 대해 수행되었다(TEMP F3510-21). 모든 샘플은 동일한 파라미터를 적용하여 생성되었다. 온도와 습도는 각각 20.3 °C와 26.1 °C와 35 % 및 55 % 습도 사이에서 다를 수 있습니다. 결과는 분당 ∼2.65 μm의 두께에서 비교적 선형적인 증가를 보였다.
또 다른 실험은 매칭 파라미터 하에서 60분 동안 방사한 후 결과의 일관성을 보여주었다(도 5B). 습도와 온도는 각각 35 %와 50 % 습도와 20.3 °C ~ 26.1 °C 사이에서 다를 수 있습니다. 결과는 두께가 126 내지 181 μm 사이인 스캐폴드를 나타내었다. 평균 두께는 151.11 ± 13.17 μm이었다. 두께의 증가는 분당 평균 ~2.52 μm였다.
도 5: 두께 측정. (A) 회전하는 시간당 스캐폴드의 두께; n = 21; 상관 계수(r) = 0.653; p** = 0.00132; (b) 60 분 후 샘플의 두께; n = 13; 빨간색 선 : 평균. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
정렬된 섬유 스캐폴드 및 정렬되지 않은 섬유 스캐폴드에 대한 인장 시험은 원주 방향과 그것에 수직을 따라 두 방향으로 수행되었다. 각 그라우트는 15 개의 표본으로 구성되었습니다. 샘플을 DIN 53504:2017-03에 따라 평면 스캐폴드에서 꺼내었다. 두께는 각 샘플의 세 개의 서로 다른 지점에서 측정되었으며 평방 mm 당 최대 힘 값을 계산하는 데 사용되었습니다.
두께 값은 0.03 ~ 0.2 mm 사이입니다. 궁극적인 인장 강도의 비교는 정렬된 섬유 스캐폴드에 대한 배향 사이에 유의한 차이(p < 0.001)를 나타냈다(도 6A). 스캐폴드는 원주 방향을 따라 12.26 ± 2.59 N/mm2 의 최대 강도에 도달했습니다. 인장 강도는 수직 방향에서 3.86 ± 1.08 N/mm2 로 감소되었다.
정렬되지 않은 섬유 스캐폴드는 상이한 배향에 대한 궁극적인 인장 강도에서 차이를 나타내지 않는다(F1: 7.19 ± 1.75 N/mm2, F2: 7.54 ± 1.59 N/mm2; p = 0.60). 정렬된 섬유 스캐폴드에 대한 파단 신도의 비교 분석은 방향 사이의 확장성에서 유의한 차이(p < 0.001)를 나타냈다(도 6B). 확장성은 187.01 ± 원주 방향으로 39.37 %에 달했으며 수직 방향의 107.16 ± 30.04 %에 달했습니다.
대조적으로, 정렬되지 않은 섬유 매트에 대한 파단 신도는 양방향으로 균일한 확장성을 나타냈다 (F1: 269.74 ± 24.78 %; F2 : 285.01 ± 25.58 %; p = 0.69). 대표적인 응력-변형 곡선은 인장력이 가해지는 방향에 따라 재료의 거동에 큰 차이를 보인다. 정렬되지 않은 섬유 매트는 선형 탄성 거동을 보인 반면, 정렬 된 섬유 매트는 축 방향으로 비선형성을 보였다.
그림 6: 정렬된 섬유와 정렬되지 않은 섬유의 인장 시험. (A) 원주 및 축 방향으로 정렬된 섬유 매트 및 정렬되지 않은 섬유 매트에 대한 궁극적인 인장 강도; n=15; (B) 원주 및 축 방향으로 정렬되고 정렬되지 않은 섬유 매트에 대한 파단 신율; n=15; (C) 각각 축방향 및 원주 방향으로 당겨진 정렬된 스캐폴드와 정렬되지 않은 스캐폴드의 대표적인 응력-변형 곡선. (***p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 제조 메트릭 | |||||||||
| 이름 | 재료 | 분량 | 총 시간 | 총 중량 [g] | 비용 [kg 당 € ] | 총 비용 | |||
| 1 | Specimen_Mount_A | 일반 PLA | 2 | 18:19 | 159 | 51.33 € | 8.16 € | ||
| 2 | Specimen_Mount_B | 일반 PLA | 2 | 19:42 | 161 | 51.33 € | 8.26 € | ||
| 3 | 컬렉터 플랜지 | 전도성 PLA | 2 | 10:40 | 95 | 99.98 € | 9.50 € | ||
| 4 | Leaflet_Inlet | 전도성 PLA | 9 | 05:32 | 31 | 99.98 € | 3.10 € | ||
| 합계 | 29.02 € | ||||||||
표 1: 제조 메트릭. 수량, 제조 시간, 필요한 재료의 양 및 3D 인쇄 부품의 비용을 지정하는 표입니다. 약어: PLA = 폴리락트산.
보충 파일 1 : 적응 가능한 수집가 플랜지. 수집기 플랜지를 조정하고 인쇄하는 스텝 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 리플릿 템플릿. STL 파일을 사용하여 리플릿 템플릿을 인쇄합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : 표본 마운트 A. STL 파일을 인쇄하려면 시편 마운트 A. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4 : 표본 마운트 B. STL 파일을 인쇄하려면 시편 마운트 B. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: 수집기 플랜지. STL 파일을 인쇄하여 수집기 플랜지를 인쇄합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6 : 금속 막대 연결. 연결 금속 막대를 구성하는 기술 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
설명 된 프로토콜은 (심혈관) 조직 공학 분야에서 두 가지 혁신을 제시합니다 : 전기 방사를위한 완전히 3D 인쇄 팬텀의 저비용 제조와 적응 가능한 다층 심장 판막 전단지를 생산하기위한 다목적 수집기의 사용.
최근에, 3D 프린팅은 실험실 장비, 예를 들어, 생물반응기 또는 제조 및 테스트 셋업(11,12)의 생산을 위한 유용한 도구가 되었다. 따라서, 본 연구에서 제시한 전기방사 셋업을 단시간 내에 저렴한 예산으로 제조할 수 있었다(표 1). 이것은 3D 프린팅(13)을 사용하여 전기 방사 설정의 저비용 생산에 대한 이전의 발견과 일치합니다.
또한 저자가 아는 한, 전도성 3D 프린팅 소재를 사용하여 심장 판막 전단지용 전기방사 컬렉터를 만든 것은 이번이 처음입니다. 지금까지, 3D 프린팅된 컬렉터는 금속 레이저 소결(14 )에 의해 제조되거나 비전도성 폴리머 프린팅 및 도전성 코팅(15)을 사용한 후속 후처리를 사용하여 제작되었다. 이 새로운 접근 방식과는 달리, 이러한 절차는 더 비싸거나, 훨씬 더 오래 걸리거나, 더 많은 육체 노동이 필요하기 때문에 상당한 단점에 처해 있습니다.
전기 방사는 생성 된 섬유의 형태학에 영향을 미치는 다양한 변수에 달려 있습니다. 다른 상용 전기 방사 설정이 시중에서 판매되고 있지만, 많은 연구 그룹은 특정 요구 사항16에 부합하기 위해 고도로 개인화 된 설정을 사용합니다. 이 점을 고려하여 이 프로토콜에서 설명하는 값(전압, 거리 및 회전 속도)은 개별 설정에 맞게 조정해야 할 수 있으며 고정 값이 아닌 시작점으로 간주되어야 합니다. 또한, 환경 파라미터가 전기방사 결과(17,18)에 상당한 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 전기 방사 장비 내에서 적어도 온도와 습도를 제어하는 것이 좋습니다. 최적의 전기방사 결과는 21°C와 24°C 사이의 온도에서 15-20% 상대 습도 사이에서 얻어졌다. 이 프로토콜을 따르기 위해서는 약 300g 무게의 콜렉터를 2,000rpm의 회전 속도로 가속할 수 있는 모터, 1-3mL/h의 작은 부피 유량에 적합한 시린지 펌프, ±20kV 직류(DC)를 지원하는 이중 극 전원 공급 장치가 필수적입니다.
이전의 연구들과 일치하여, 형광 현미경(19)에 의해 전기방사된 스캐폴드의 섬유질 구조를 가시화할 수 있었다. 다양한 섬유 배향을 포함하는 스캐폴드의 다층 구조를 성공적으로 입증할 수 있었다. 특히 여러 층 또는 여러 재료로 작업 할 때 형광 염료의 도입은 엄격한 품질 관리를위한 표준 절차로 간주되어야합니다. 매개 변수 또는 워크플로 프로토콜의 변경 후 결과의 시각적 평가를 향상시킬 수 있습니다. 생체내 또는 시험관내 평가에 사용되는 스캐폴드에서의 염료의 적용은 권장될 수 없다. 이는 확립 된 분석 방법과의 간섭을 피하는 데 중요합니다.
자연 심장 판막 형태를 모방하는 것은 심장 판막 보철물로 사용되는 조직 조작 복제물을 생성하는 데 매우 중요합니다 (그림 4B). 특정 밸브 기하학이 생체내 리모델링(20)에 높은 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 이러한 맥락에서, 전기 방사를 위한 전단지 형상의 3D 프린팅은 반복이 쉽고 빠르게 구현되기 때문에 유리하다. 개인화 된 판막 기하학의 생산조차도 상상할 수 있으며 예를 들어 교육 목적으로 심장 판막 이상에 대한 개별적이고 개인화 된 3D 모델의 후속 개발이 가능합니다.
조직 공학 심장 판막 특성의 추가 개선은 여러 연구 그룹이 정의 된 섬유 방향을 가진 다층 스캐폴드를 개발하기 위해 노력했기 때문에 현재 연구 노력의 중심에 있습니다. Masoumi et al. 성형된 폴리글리세롤 세바케이트 층 및 전기방사된 폴리카프로락톤(PCL) 섬유 매트(21)로부터 제조된 복합 스캐폴드. 따라서, 삼중 층은 미세제작된 폴리글리세롤 세바케이트의 시트에 의해 분리된 두 개의 배향된 전기방사 층으로부터 생성될 수 있었다. 그러나 손에 든 스캐폴드와는 달리, 그들은 3D 모양도 아니었고 중간 층 (spongiosa)을 적절하게 모방하지도 않았습니다. 생체 영감을받은 조직 공학 심장 판막을 생산하는 또 다른 접근법은 Jana et al.22,23에 의해 추구되었습니다. 그들은 PCL 기반 전기 방사를 위해 알루미늄 수집기를 사용하여 지향 섬유가있는 삼중 층 스캐폴드를 성공적으로 생산했습니다. 다시 말하지만,이 스캐폴드는 2D 외관 만 가지고 있기 때문에 형태 학적 불완전 성을 보여 주었고 최종 스캐폴드는 스포크에 의해 충만 해집니다.
이 프로토콜은 3D, 삼중 층으로 된 심장 판막 전단지가 어떻게 생산되는지에 대한 자세한 정보를 제공하지만 실제 심장 판막 보철물을 만드는 데 필요한 몇 가지 단계가 더 있습니다. 여기에 설명 된 전단지에는 직경 24mm의 스텐트를 사용하는 것이 좋습니다. 사용된 스텐트에 상보적으로, 전단지는 스티칭을 위한 추가적인 지지 구조를 제공받을 수 있다. 최대한의 유연성을 허용하기 위해 여기에 표시된 전단지는 특정 스텐트 설계로 개별화되지 않습니다. 이것은 CAD 소프트웨어를 사용하여 템플릿을 변경하는 것만으로 수행 할 수 있습니다.
심장 판막 조직 공학에 사용되지만, 제시된 방법은 정형 외과24, 비뇨기과 25, 이비인후과26 및 기타의 전기 방사 설정에 쉽게 적용 할 수 있습니다. 정교한 및/또는 개별화된 3D 구조물의 생산은 다른 3D 인쇄 컬렉터의 구현에 의해 실현 가능하다. 컬렉터의 재질은 변경되었지만 전기 방사의 원리는 그대로 유지됩니다27. 따라서, 상이한 중합체의 사용은 이론적으로 가능하지만, 전기방사 파라미터의 조정이 필요할 수 있다.
전반적으로, 제시된 프로토콜은 다층 심장 판막 전단지를 제조하는 쉽고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 3D 프린팅의 적용은 컬렉터와 인서트의 빠른 적응과 수정을 허용합니다. 이것은 예를 들어, 금속 수집기의 복잡한 제조 공정 없이 환자 특이적 보철물의 생산을 허용한다. 동일한 조건에서 한 번에 여러 샘플을 만들 수 있습니다. 따라서 재료 파괴 테스트는 실제 밸브를 구축하기 위해 (거의) 동일한 것들이 남아 있다는 이점으로 샘플에 대해 수행 될 수 있습니다. 이 연구에서 인쇄 파일을 보충 파일로 포함시키는 것은 다층 심장 판막 스캐폴드의 발전을 지원하기위한 것입니다. 이 새로운 전기 방사 기술은 수정 된 수집가 및 기타 3D 인쇄 된 회전 템플릿이 구현하기 쉽기 때문에 재생 의학의 다른 분야에 대한 높은 잠재력을 가지고 있습니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation), 프로젝트 번호 MA 2186 / 14-1이 자금을 지원하는 혈관 의학의 임상의 과학자 프로그램 (PRIME)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BTC-FR2.5TN.D09 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Traction engine (Tensile tests) | |
| C5-E Motor Controller | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor controll unit | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelectronik GmbH | Power Supply Unit Anode | |
| CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA | iseg Spezialelektronik GmbH | Power Supply Unit Kathode | |
| Conductive Composite PLA | ProtoPasta | Conductive PLA | |
| Cura 4.7.1 | Ultimaker BV | Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2 | |
| DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | DAPI | |
| Disposable Scalpel No. 23 | FEATHER | Scalpel | |
| Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol | Carl Roth GmbH + Co. KG | Fluorescein | |
| Fume Hood as per DIN 12924 Class 2 | Köttermann GmbH | Fume Hood | |
| Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976 | Leica Microsystems GmbH | Software for Confocal Laser Scanning Microscope | |
| Luerlock Syringe 20 mL | BD Plastipak | Luerlock Syringe | |
| Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm | Unimed S.A. | Needle with plane tip | |
| Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm | Bohlender GmbH | F740-28 | Solvent resistant tubes |
| N,N-Dimethylformamide ≥99.8% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Dimethylformamide | |
| Pellethane 2363 80AE | Velox GmbH Hamburg | Polyurethane | |
| PLA | Ultimaker BV | PLA | |
| Plug&Drive Studio (1.0.4) | Nanotec Electronic GmbH & Co. KG | Motor operation software | |
| SEM Evo LS 10 | Zeiss MicroImaging GmbH | Scanning Electron Microscope | |
| SHT 31-D | Adafruit Industries | Temperature and Humidity Sensor | |
| SolidWorks 2020 CAD Software | Dassault Systèmes | Commercial CAD Software | |
| Sulforhodamine 101 50 mg | Sigma - Aldrich | S 7635 | Texas Red |
| Syringe Pump Model: Fusion 100 | Chemyx Inc. | Syringe Pump | |
| TCS SP8 inverted CEL BMi8 | Leica Microsystems GmbH | Confocal Laser Scanning Microscope | |
| testXpert V11.02 | ZwickRoell GmbH & Co. KG | Software Tensile Test | |
| Tetrahydrofuran ≥99.9% | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | Tetrahydrofuran | |
| Type 1511530000202 #980361 | Binder Labortechnik GmbH | Heating Cabinet | |
| Ultimaker 3 Extended | Ultimaker BV | 3D Printer |
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