Summary
本プロトコールは、マウスの腹部内大動脈の外側へのエラスターゼの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルのための標準化された外科的方法を記載する。
Abstract
腹部大動脈瘤(AAA)は、主に無症候性であるが、AAAの破裂は通常壊滅的な結果をもたらすため、潜在的に生命を脅かす可能性がある。現在、AAAのいくつかの異なる実験モデルがあり、それぞれがAAAの病因における異なる側面を強調している。エラスターゼ誘導AAAモデルは、2番目に多く使用されるげっ歯類AAAモデルである。このモデルは、大動脈の炎症領域へのブタ膵臓エラスターゼ(PPE)の直接注入または適用を含む。技術的な課題のため、今日のほとんどのエラスターゼ誘導AAAモデルは、PPEの管腔内注入ではなく外部適用で実施される。エラスターゼの浸潤は、内側層における弾性層層の分解を引き起こし、その結果、大動脈壁の完全性の喪失およびその後の腹部大動脈の拡張をもたらす。しかしながら、エラスターゼ誘導AAAモデルの1つの欠点は、手術の実施方法の必然的な変動である。具体的には、大動脈の内腎セグメントを単離する外科的技術、大動脈ラッピングおよびPPEインキュベーションに使用される材料、PPEの酵素活性、およびPPE適用の時間持続時間はすべて、最終的なAAA形成速度および動脈瘤径に影響を及ぼす重要な決定因子となり得る。特に、AAAに関するさまざまな研究からのこれらの要因の違いは、再現性の問題につながる可能性があります。本稿では、マウスの腹部内大動脈の外側へのPPEの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルの詳細な外科的プロセスを説明する。この手順に従うと、雄および雌マウスにおいて約80%の安定したAAA形成率が達成可能である。エラスターゼ誘導AAAモデルを用いたAAA研究の一貫性および再現性は、標準的な外科的処置を確立することによって有意に増強され得る。
Introduction
腹部大動脈瘤(AAA)は、血管径1の少なくとも50%の増加を伴う腹部大動脈の分節拡張として定義される。AAAは、破裂が介入2,3,4であっても非常に高い死亡率をもたらす可能性があるため、潜在的に致命的である。AAAは米国で年間約13,000人の死亡の原因となっていると報告されており、これは1,5人の死因の第10位となっています。
AAAの病因はまだ完全には理解されていない6,7,8。AAAの分子機構を調査し、潜在的な治療標的を試験するために、いくつかの実験的AAAモデルが確立されている9、10。AAAのげっ歯類モデルには、エラスターゼ、塩化カルシウム、アンジオテンシンIIおよび異種移植片モデルが含まれ、その中でエラスターゼ誘導AAAモデルは、2番目に多く使用されるモデル10、11、12、13、14、15、16、17である。このモデルは、大動脈の炎症領域へのブタ膵臓エラスターゼ(PPE)の直接注入または適用を含む。大動脈の内側層へのエラスターゼの浸透は、弾性層状の分解および炎症性細胞の浸潤を引き起こし、大動脈壁の完全性の喪失およびその後の腹部大動脈の拡張をもたらす7,18。エラスターゼ誘導AAAモデルは、1990年にAnidjarらによってラットを用いて最初に報告され、大動脈の単離された部分をエラスターゼ17で灌流した。2012年後半に、PPEの周到性適用を用いた改変モデルがBhamidipatiらによって報告された19。今日、エラスターゼ誘導AAAモデルのほとんどの手術は、バミディパティのグループに触発され、PPEの管腔内灌流ではなく外部適用で行われます。外部適用は、細かい外科的技能に対する要求が少ないが、AAAの発生率は比較的低く、管腔内灌流のそれよりも幾分小さいサイズ11,19。
AAA研究で広く使用されているが、エラスターゼ誘導AAAモデルには一定の限界がある。このモデルの1つの注意点は、手術の実施方法の必然的な変動であり、再現性の問題につながる可能性があります。例えば、大動脈の破腎セグメントがどのように単離されるか、およびセグメントのどの部分が異なる実験室間でPPE適用のために選択されるかに関して、外科的処置に相違が存在する可能性がある。PPEの酵素活性およびPPEインキュベーションの時間持続時間も変化し得る。しかし、これらはすべて、最終的なAAA形成速度および動脈瘤直径に影響を及ぼす重要な決定因子である。これらの重要な決定要因の変動は、このモデルを使用する異なるグループからのAAA研究のデータ比較を非常に困難にする。したがって、標準化された外科的処置は、様々な機関から同等の結果を得るためのツールとして必要とされている。
本稿では、マウスの腹部内大動脈の外側へのPPEの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルの標準化された外科的プロトコールについて説明する。このモデルを用いたマウスにおけるAAAの正常かつ堅牢な生成に不可欠な外科的材料および手順に関する詳細についても議論する。
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Protocol
動物プロトコルは、ミシガン大学機関動物ケアおよび使用委員会(PRO00010092)によって承認された。雄および雌のC57BL/6J野生型(WT)マウス、〜7週齢を、実験に使用した。
1. 動物の準備
- 手術の前後に標準的な固形飼料( 材料表を参照)をマウスに給餌する。
注:マウスの異なる系統および年齢を使用することができる。しかし、最大発生率を達成するためには、5.5〜12週齢の範囲の年齢が推奨される。 - 各マウスについて、麻酔開始の30分前に5mg / kgのカルプロフェンを皮下投与する。
- 30分後、100mg / kgのケタミンおよび5mg / kgのキシラジンを腹腔内注射 で 投与し、麻酔を誘発する。
2. 手術の準備
- 手術材料を準備する。
- ニトリル手袋を4 cm x 4 mmの短冊に切ります。綿のパッドを3 cm x 2 mmの断片に切ります。これらを、外科用はさみ、組織鉗子、およびハルステッド蚊止血器を含む他の手術器具でオートクレーブする( 材料表を参照)。
- マウスを滅菌吸収性ドレッシングパッド上の仰臥位に置きます。前足と後足を外科用テープで固定します。
- 綿先のアプリケーター( 材料表を参照)を使用して、中腹部と下腹部にヘアリムーバーローションをブラッシングし、手術用ガーゼでその領域を拭き取って髪を取り除きます。
- 70%アルコールとヨウ素系またはクロルヘキシジン系のスクラブを交互に塗布して、円運動で手術領域を少なくとも3回消毒する。乾燥させます。
3. 手術手順
- 腹腔にアクセスするには、次の手順を実行します。
- 皮膚切開前につま先ピンチ反応の欠如についてマウスをテストします。
- 外科用はさみを使用して、中腹部および下腹部の正中線に沿って皮膚に2.5cm縦切開を行う。
- 下にある筋肉を静かに引き上げ、腹腔にアクセスするためにアルバ線に沿って2.5cmの縦方向切開を行う。
- 腹部大動脈を露出させる。
- 濡れた綿先のアプリケーターを使用して、腸と胃をマウスの右側に動かします。
注:理想的には、これは大動脈の収縮部を露出させる。大動脈を見つけるのが難しい場合、右腎臓と右腎動脈は大動脈を識別することができます(右腎臓は左腎臓よりも解剖学的位置がわずかに低いため)。 - 鉗子を使用して、腹部大動脈および下大静脈(IVC)を覆う結合組織を静かに除去する。
注:腹部大動脈とIVCは同じ血管シース内に含まれています。完全な除去はこれら2つの血管を損傷するリスクを増加させるので、すべての結合組織を除去する必要はない。 - 鉗子を使用して、腹部大動脈の裏側とIVCを下層の筋肉から静かに解剖します。
注:鉗子の先端は、横方向にシースの裏側に入り、シースを基礎となる筋肉に接続する筋膜に穴を開ける必要があります。穴が開いたら、鉗子をゆっくりと離してサイズを広げます。 - 4 cm x 4 mm の手袋ストライプ (前述のように、ステップ 2.1.1) を腹部大動脈と IVC の裏側から挿入し、ストライプをまっすぐにします。縞模様を右腎動脈から約0.5cm離して置きます。
メモ: 周囲の筋膜が縞模様をねじらないように、穴が十分に大きいことを確認してください。 - ストライプの上に、腹部大動脈とIVCの裏側を通して3cm x 2mmの綿パッドを置き、綿パッドをまっすぐにします。
- 濡れた綿先のアプリケーターを使用して、腸と胃をマウスの右側に動かします。
- エラスターゼをインキュベートする。
- ピペットを使用して、30 μLのブタ膵臓エラスターゼ(総酵素活性1.8単位、 材料表を参照)を綿パッドの上の大動脈セグメントに滴下し、綿パッドを包み込み、大動脈とIVCの周りにストライプします。10 cm x 10 cmガーゼを滅菌した0.9%生理食塩水ですすぎ、腹部に置きます。
注:ガーゼは、過度のやり過ぎが下のエラスターゼを希釈する危険性があるため、部分的なすすぎのみが必要です。 - 30分後、鉗子でストライプと綿のパッドを取り除きます。
- ピペットを使用して、30 μLのブタ膵臓エラスターゼ(総酵素活性1.8単位、 材料表を参照)を綿パッドの上の大動脈セグメントに滴下し、綿パッドを包み込み、大動脈とIVCの周りにストライプします。10 cm x 10 cmガーゼを滅菌した0.9%生理食塩水ですすぎ、腹部に置きます。
- 以下の手順に従って腹腔を閉じます。
- 大動脈および腹腔を500μLの滅菌0.9%生理食塩水で灌漑する。10 cm x 10 cmのガーゼを使用して、残りの生理食塩水を吸収します。
- ランニング6-0非吸収性モノフィラメント縫合糸で筋肉層を再近似する。
- 3-4中断された6-0非吸収性モノフィラメント縫合糸で皮膚を閉じる。
4. 術後ケア
- 術後1日目に5mg / kgのカルプロフェンを皮下投与する。
- 術後10日目に皮膚縫合糸を除去する。
5. 腹部大動脈瘤径の測定
- 術後14日目にCO2 過剰摂取によりマウスを安楽死させる。これは、最大拡張の時点を表します。
- ステップ3.1の説明に従って腹腔にアクセスします。
- 左心室を通る循環に0.9%生理食塩水10mLを注入して血管灌流を行う。
- ステップ3.1-3.2で説明されているように腹部大動脈の背部部分を露出させる。周囲の結合組織を慎重に除去し、腹部大動脈をIVCから分離する。
- ノギスで腹部大動脈の直径を測定します。
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Representative Results
12匹の雌および11匹の雄を含む合計23匹の7週齢の野生型(WT)マウスを、提示されたプロトコールに従って操作した。生存率は100%であった(外科的死亡率は除く)。腹部大動脈の最大径はノギスにより測定した。
AAAは、50%の血管径増加を伴う腹部大動脈を拡張することと定義した。したがって、腹部大動脈の最大径の50%の増加が、AAA誘導を成功させるためのカットオフポイントとして選択された。この基準に基づくと、術後14日目のAAAの発生率は雌動物で91.7%であり、手術を受けた12匹中11匹がAAAを発症した。一方、雄動物の発生率は72.7%であり、手術を受けた11匹中8匹がAAAを発症した(図1A)。AAAを発症した19匹の動物のうち、雌および雄では、非手術対照と比較して、それぞれ腹部大動脈の最大径が1.7倍および1.6倍増加している(図1B)。術後14日目の非手術群および手術群からの大動脈の代表的な画像を 図1Cに示す。
図1:手術を受けたマウスにおけるAAAの特性評価。 すべての測定は術後14日目に行われます。(a)手術を受けたマウスにおけるAAAの発生率。(b)非手術群(雌と雄の両方でn = 4)および手術群(雌でn = 12;雄でn = 11)の両方のマウスにおける大動脈の最大径。データはSEM±平均です。*p <0.05です。(C)非手術群および手術群の両方からのマウスにおける大動脈の代表的な画像。スケール バー = 2 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
エラスターゼ誘導AAAモデルは、1990年にラットを用いてAnidjarらによって最初に報告された17。様々な修正版が過去30年間に導入され、外科的技術19,20,21,22の大幅な改善が伴った。何百もの研究機関が、AAA研究で2番目に多く使用されているげっ歯類実験モデルとしてエラスターゼ誘導AAAモデルを使用しています12。異なるグループがこのモデルの手術をわずかに異なる方法で行うことは当然のことです。その結果、このモデルの1つの注意点は、手術の実施方法の必然的な変動であり、このモデルを使用する異なるグループのデータの比較を非常に困難にする。バリエーションには、大動脈のインフラレナルセグメントがどのように露出されるか、大動脈を覆う筋膜層がどの程度広範囲に洗浄されるか、潜伏期間がどれくらい長いか、ならびに大動脈ラッピングおよびエラスターゼインキュベーションに使用される材料ならびにラッピング材料に添加されるエラスターゼの量が含まれるが、これらに限定されない。しかし、これらはすべて、AAAの最終的な発生率と直径に影響を与える重要な決定要因です。これらの変動によって引き起こされる再現性の問題を解決するためには、標準化された外科的処置が必要である。ここでは、マウスの腹部内大動脈の外側へのPPEの直接適用によるエラスターゼ誘導AAAモデルについて、標準化された外科的プロトコールを提示する。
AAAの一貫した誘導率とは別に、このプロトコルは低コストと短い動作時間の利点を持っています。このプロトコールで使用される手術材料はすべて、低コストで容易に入手することができる。このプロトコルの平均操作時間は50分であり、30分のPPEインキュベーションを含む。これらの利点は、多くの動物研究のより容易な実施を可能にし、より実質的な統計的検出力および再現性に寄与する。
腹部大動脈の曝露は、このプロトコルにおいて最も重要なステップである。エラスターゼが大動脈の内側層に浸透する可能性が高くなるように、腹部大動脈およびIVCを囲む血管鞘内の結合組織を除去することが不可欠である。しかし、これらの結合組織を完全に除去することは時間がかかり、根底にある大動脈およびIVCを損傷するリスクがある。これは、ほとんどの外科的死亡率が引き起こされるステップです。IVCまたは大動脈が損傷した場合、ほとんどの動物は手術後の継続的な出血が原因で手術を生き延びても次の48時間生存できません。このため、大動脈を最大限に露出させることと、大きな血管を傷つけないこととの間の微妙なバランスを熟考する必要があります。血管鞘に少量の結合組織を残すことは、AAAの発生に影響を与えない一方で、周術期の死亡率を有意に減少させる。したがって、腹部大動脈への曝露のために大動脈およびIVCを覆う結合組織を完全に除去することは推奨されない。それでも、隣接する結合組織からの腹部大動脈およびIVC郭清中には細心の注意を払う必要がある。
解剖学的には、腹部大動脈およびIVCは、薄い筋膜層 を介して 密接に結合し、同じ血管鞘内に一緒に含まれる。静脈血栓症などのいくつかの実験モデルは、隣接するIVCから大動脈を分離することを必要とするかもしれない。しかしながら、エラスターゼ誘導AAAモデル23ではそうする必要はない。大動脈がIVCの真上になるように血管鞘を時計回りに回転させることを好む人もいれば、エラスターゼを大動脈に直接塗布することができます。下の綿パッドはエラスターゼで飽和しており、大動脈はIVCとの解剖学的関係に関係なくエラスターゼに継続的にさらされるため、これは不要である。大動脈とIVCの裏側は、鉗子 を介して 基礎となる筋肉から適切に分離することが推奨される。このステップで解剖が十分に広範でない場合、ストライプおよびコットンパッド上の周囲の筋膜および筋肉によって張力が生成され、その結果、それらのねじれおよびそれに続くエラスターゼの非効率的な吸光度が生じる。
このプロトコルの1つの制限は、誘導されたAAAの最終的な形状である。大動脈に落とされると、いくつかのエラスターゼが綿のパッドで包まれていない大動脈の他の部分に流れることは避けられません。さらに、解剖によって生じる近くの出血は、少量であっても、30分間の潜伏期間中に綿パッドから他の大動脈セグメントにエラスターゼを洗い流すことができる。これらは、大動脈の他のセグメントに浸透するエラスターゼをもたらし、したがって、綿パッドによって包まれたセグメントに限定されない内側層の破壊および腹部大動脈の拡張を引き起こす。その結果、局所拡張によって引き起こされる紡錘形動脈瘤を呈する代わりに、いくつかの動物は腹部大動脈の長い部分の一般的な拡張を示す。しかしながら、大動脈の連続的な拡張を有するこれらの動物における最大大動脈径は、対照と比較した場合、依然として50%以上の増加を示す。一方、腹部大動脈の連続的な拡張と局所拡張を示す動物間で最大大動脈径の差は観察されず、動脈瘤の形状はAAA誘導の成功の指標でも、この場合のプロトコルの実際のAAAサイズでもないことが示唆された。
このプロトコルの別の制限は、この方法をより大きな動物に適用することです。局所エラスターゼ誘導AAAモデルは、ラットなどの他の小動物に容易に適用されるべきである。しかし、エラスターゼだけでは、ブタや霊長類などの大型動物が一貫したAAA表現型を誘導するには不十分かもしれません。例えば、Marinovらは、ブタにおけるエラスターゼ灌流単独では、エラスチン破壊を含むいくつかの組織学的変化を引き起こす可能性があるが、一貫した動脈瘤を誘導することはできないと報告した24。Shannon Aらは、エラスターゼによって誘導されるインフラレナルAAAのブタモデルを報告した。しかし、バルーン血管形成術、灌流、局所エラスターゼ、および大動脈25のかなりの耐久性を考えると、BAPN(コラーゲン架橋を防止するリジルオキシダーゼ阻害剤)を含む食事の組み合わせが必要です。したがって、標準化されたエラスターゼ誘導AAAプロトコルを大型動物に適用することは、マウスと大型動物との間の大動脈のサイズおよび耐久性の違い、技術的課題、および潜在的に高いコストのために、依然として非常に困難であると思われる。
要約すると、いくつかの制限にもかかわらず、AAAは、この標準化されたプロトコールにおいて、雄および雌マウスの両方において一貫して誘導され得る。エラスターゼ誘導AAAモデルを用いたAAA研究の一貫性と再現性は、この標準的な外科的処置を確立することによって有意に高まることが期待される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
ミシガン大学の実験動物医学ユニットには、動物の給餌と繁殖に関する彼らの助けに感謝します。この研究は、J. Zhangに対するNIH RO1 HL1 HL153710、J. ZhangへのNIH RO1 HL1 HL109946、Y.E. ChenへのRO1 HL134569、およびG. Zhaoへの米国心臓協会の助成金20POST35110064によって支持されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 non-absorbable monofilament suture | Pro Advantage | P420697 | |
| Carprofen | Zoetis Inc. | NDC: 54771-8507 | |
| Chow Diet | LabDiet | 3005659-220 | PicoLab 5L0D |
| Cotton Applicator | Dynarex | 4303 | |
| Cotton Pad | Rael | UPC: 810027130969 | |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software Inc. | Version 8.4.3 | |
| Grarfe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Halsted Mosquito Hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Ketamine | Par Pharmaceutical | NDC: 42023-0115-10 | |
| Nitrile gloves | Fisherbrand | 19-130-1597 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Porcine pancreatic elastase | Sigma-Aldrich | E1250-100MG | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| Sterile 0.9% saline solution | Baxter | 2B1324X | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-110-20 |
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