Summary
여기서 우리는 Wharton의 젤리 중간엽 줄기세포에서 줄기세포의 분리된 엑소좀을 도파민 로딩에 의해 제형을 얻는 것을 목표로 했습니다. 엑소좀 분리 및 특성 분석, 결과 엑소좀에 대한 약물 로딩, 개발된 제형의 세포독성 활성이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다.
Abstract
크기가 40nm에서 200nm 사이인 엑소좀은 세포외 소포체의 가장 작은 하위 그룹을 구성합니다. 세포에서 분비되는 이러한 생체 활성 소포는 세포 간 화물 및 통신에 적극적인 역할을 합니다. 엑소좀은 주로 혈장, 뇌척수액, 소변, 타액, 양수, 초유, 모유, 관절액, 정액, 흉산 등의 체액에서 발견됩니다. 엑소좀의 크기를 고려할 때 혈액뇌장벽(BBB)을 통과할 수 있기 때문에 중추신경계 질환에 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 생각됩니다. 따라서 본 연구는 와튼의 젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)에서 분리한 엑소좀에 도파민을 캡슐화하여 엑소좀 기반 나노캐리어 시스템을 개발하는 것을 목표로 했다. 특성화 과정을 통과한 엑소좀은 도파민으로 배양되었습니다. 도파민이 함유된 엑소좀은 배양이 끝날 때 재특성화되었습니다. 도파민이 함유된 엑소좀은 약물 방출 및 세포 독성 분석에서 조사되었습니다. 그 결과, 도파민이 엑소좀 내에 성공적으로 캡슐화될 수 있으며, 도파민이 함유된 엑소좀이 섬유아세포 생존력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.
Introduction
엑소좀은 중요한 특징을 가진 생체 활성 소포체로, 크기는 40nm에서 200nm까지 다양합니다. 엑소좀은 세포막에서 유래하며 엔도솜의 방출로 인해 형성된다1. 이러한 구조는 세포 간 통신기 역할을 하며 이웃 세포와 상호 작용하여 활성 분자의 전달을 촉진합니다. 엑소좀은 다양한 출처에서 분리할 수 있습니다. 여기에는 혈장, 소변, 뇌척수액, 타액과 같은 체액과 체외 조건에서 배양된 세포주가 포함됩니다. 엑소좀은 지질, 단백질, 핵산과 같은 생체 거대분자를 함유하고 있기 때문에 신경 손상을 제거하는 데 중요한 역할을 합니다2. 신경계의 지지세포인 글리아(Glia)3는 엑소좀(exosome)4을 통해 단백질과 마이크로 RNA를 뉴런의 축삭돌기로 전달한다.
신경 전도의 특징인 미엘린 수초를 형성하는 지질도 엑소좀 4,5를 통해 희소돌기아교세포에서 방출됩니다. 엑소좀은 또한 시냅스 가소성, 신경 스트레스 반응, 세포 간 통신 및 뇌의 신경 발생과 같은 과정에도 관여합니다 6,7. 엑소좀은 나노 차원을 가지고 있기 때문에 BBB를 통과할 수 있습니다. 간질액에서 뇌척수액으로 이 막을 통과한 후 뇌척수액으로 전이되는 특별한 경로가 있다8. 엑소좀은 표면 특성으로 인해 약물 전달 시스템으로서 표적 세포와 효율적으로 상호 작용하고 로드된 약물을 능동적으로 전달할 수 있습니다.
엑소좀 표면에 다양한 접착 단백질(테트라스파닌 및 인테그린)이 발현되기 때문에 이러한 세포외 소포체는 숙주 세포막과 쉽게 상호 작용하고 융합할 수 있습니다9. 엑소좀은 BBB를 침투할 수 있는 능력과 표면 특성으로 인해 특히 중추신경계 질환 치료에 약물 전달 시스템으로 사용될 수 있다고 생각됩니다. 중간엽줄기세포(MSC) 유래 엑소좀은 동종 세포 치료제에 비해 면역 거부 반응 위험이 낮으며, 이러한 점에서 무세포 치료 응용 분야의 중요한 구성 요소가 될 수 있습니다10.
도파민은 파킨슨병(PD)의 특징인 뇌 결핍 분자로, 나날이 악화되고 있다11,12,13. PD는 중뇌의 흑질(substantia nigra)에서 도파민 뉴런의 퇴화 및 운동 뉴런 기능의 손실과 관련이 있는 것으로 알려져있다 14,15. 도파민성 뉴런의 사멸은 신경전달물질인 도파민이 뇌선조체에 공급되는 것을 막는다. 그 결과 PD 특이적 증상이 나타난다16. 파킨슨병의 증상은 서운동증, 자세 불안정, 경직, 특히 안정시 떨림12,13이다. 파킨슨병은 2세기 전에 처음 기술되었지만, 이 질병의 병리와 원인을 이해하기 위한 연구는 여전히 진행 중이며, 현재 파킨슨병이 복잡한 전신 질환이라는 것이 받아들여지고 있다17. 도파민 결핍이 발생할 것으로 예측되며, 뉴런의 80% 이상이 퇴화될 때 임상적 PD 증상이 관찰된다18. 질병 치료에서 불완전한 도파민 보충은 운동 증상을 줄이기 위해 선호됩니다. 생체 내 연구에 따르면 뇌에 도파민을 직접 주입하면 동물의 증상이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다19. L-DOPA(L-3,4-디히드록시페닐알라닌)와 같은 도파민 전구체와 도파민 수용체 약물은 인간에서 뇌에 도파민을 직접 주입하는 것이 불가능하고 시스템에 들어가는 도파민이 BBB20을 통과할 수 없기 때문에 임상에서 사용됩니다. 이러한 유형의 약물은 시간이 지남에 따라 효과를 잃습니다. 그러나 파킨슨병에 대한 치료법은 아직 없습니다. 따라서 질병의 병태생리를 밝히고 파킨슨병이 환자에게 미치는 영향을 줄이기 위한 새로운 치료 전략과 치료 방식을 개발할 필요성이 매우 높습니다.
엑소좀 기반 연구는 최근 신경계 질환의 치료적 접근과 병리학에 대한 정보를 수집해 주목받고 있다. MSC 유래 엑소좀은 신경 손상의 염증을 줄이고 신경 재생에 기여하는 것으로 나타났습니다21,22,23. 또한, MSC 유래 엑소좀 분비체는 특히 도파민성 뉴런에 대한 신경 영양 및 신경 보호 효과를 보여줌으로써 세포 사멸을 감소시키는 것으로 보고되었습니다24,25. 최근 엑소좀을 치료제 전달 시스템으로 사용하는 플랫폼에 대한 연구가 집중적으로 가속화되고 있습니다. 수많은 연구에서 관련 약물을 엑소좀에 쉽게 캡슐화하고 표적 세포, 조직 및 장기에 안전하게 전달할 수 있는 것으로 관찰되었습니다26,27. 배양, 동결/해동 주기, 초음파 처리 및 압출과 같은 다양한 방법을 엑소좀에 약물을 로딩하는 데 사용할 수 있습니다28.
엑소좀 또는 엑소좀 유사 소포와의 배양은 친유성 소분자가 이러한 전달 시스템28,29,30에 수동적으로 캡슐화될 수 있도록 합니다. 특히 커큐민 31, 카탈라아제 30, 독소루비신32, 파클리탁셀33 등 다양한 분자가 엑소좀에 효과적으로 로딩됐다. 항산화 활성을 가진 카탈라아제 함유 엑소좀은 뇌의 뉴런과 미세아교세포에 효율적으로 축적되어 강력한 신경보호 활성을 나타내는 것이 관찰되었습니다30. 동일한 연구에서, 로딩 효율을 높이기 위해 복합체에 첨가 된 사포닌은 배양 중 약물 로딩 비율을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다30,34. 그러나 엑소좀에 약물을 로딩하는 기준을 확립하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
본 논문은 WJ-MSC에서 분리한 엑소좀에 도파민을 캡슐화하여 나노캐리어 시스템을 개발하는 방법을 설명합니다. WJ-MSC의 배양, 엑소좀의 분리 및 특성 분석, 약물 로딩 실험, 다양한 기법을 이용한 도파민 로딩 엑소좀의 특성 분석, in vitro 세포독성 분석 등 모든 단계를 상세히 설명합니다.
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Protocol
알림: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 장비와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. Wharton's jelly 중간엽 줄기세포의 배양 및 동결 보존
- -80°C 냉동고에서 WJ-MSC(ATCC에서)를 꺼냅니다. 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM-F12 배지가 들어 있는 플라스크에 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 를 함유 한 인큐베이터에서 배양합니다.
- 배양 배지는 2일마다 교체합니다. 세포가 80% 합류점에 도달하면 세포를 통과시킵니다. 통과할 세포를 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.
알림: 트립신을 첨가하기 전에 PBS로 세척하면 플라스크 표면에서 세포를 쉽게 분리할 수 있습니다. - PBS를 제거하고 플라스크에 트립신-EDTA 용액 5mL를 추가합니다. 플라스크를 37 ° C에서 5 분 동안 5 % CO2 가 들어있는 인큐베이터에서 배양합니다.
- 상층액을 튜브에 모으고 1,500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 피펫팅을 통해 1mL의 DMEM-F12 + 10% FBS를 튜브에 추가합니다.
- 세포를 더 큰 플라스크로 옮기고 충분한 엑소좀이 얻어질 때까지 DMEM-F12 + 10% FBS를 첨가하여 배양을 계속합니다35.
참고: 배양된 세포는 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 100만/mL의 밀도로 동결하고 -80°C에서 보관합니다.
2. Wharton's Jelly 중간엽 줄기세포에서 엑소좀 생산
참고: 엑소좀은 배양된 WJ-MSC에서 분리됩니다. 엑소좀 분리는 세포가 플라스크 표면을 덮고 약 80% 밀도에 도달할 때 수행됩니다.
- 플라스크에서 10% FBS가 포함된 상층액 배지를 제거하고 5mL의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS로 헹군 후 무혈청 DMEM-F12 배지를 세포에 추가합니다. 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 48시간 동안 플라스크를 배양합니다. 배양 후 무혈청 배지를 튜브에 모아 -20°C에서 보관합니다.
참고: 2.1단계에서 180mL의 무혈청 배지를 수집하여 -20°C에서 보관합니다. 해동 후, 아래에 설명된 대로 배치 원심분리 공정이 시작됩니다. - 엑소좀의 분리
- 수집된 무혈청 배지를 300 x g 에서 +4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 빼내어 다른 튜브로 옮깁니다.
- 수집된 상층액을 2,000× g 에서 +4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 빼내어 다른 튜브로 옮깁니다.
- 수집된 상층액을 10,000× g 에서 +4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 빼내어 다른 튜브로 옮깁니다.
- 수집된 상층액을 초원심분리기 튜브와 초원심분리기로 110,000× g 에서 130분 동안 이송합니다. 상층액을 천천히 제거하고 펠릿에 PBS 1mL를 추가합니다.
- 펠릿과 초원심분리기를 110,000× g 에서 +4°C에서 70분 동안 소용돌이칩니다36(그림 1). 상층액을 천천히 제거하고 펠릿에 PBS 1mL를 추가합니다.
참고: 초원심분리 단계가 완료된 후 얻은 엑소좀은 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 얻은 펠릿은 이제 특성화 준비가 되었습니다.
그림 1: 엑소좀 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 엑소좀의 특성 분석
- 나노 입자 추적 분석(NTA)
참고: 나노 입자 추적 분석은 분리된 엑소좀의 크기와 농도를 결정하기 위해 수행됩니다. 1x PBS 용액에 사용되는 정제는 pH 7.3-7.5 범위에 있어야 합니다. 1x PBS 용액에는 10mM 인산염 완충액, 137mM 염화나트륨 및 2.7mM 염화칼륨이 포함되어 있습니다. 용액은 증류수 100mL에 PBS 정제 1개를 첨가하여 제조됩니다. 이 준비된 용액은 오토클레이브에 의해 멸균됩니다.- 엑소좀 10μL에 PBS 990μL를 첨가하여 엑소좀을 100배 희석합니다. 희석된 현탁액을 일회용 주사기에 넣습니다.
- NTA 장치를 켜고 컴퓨터를 연결합니다. 소프트웨어를 엽니다.
- 주사기의 샘플을 장치의 카세트 섹션에 있는 튜브에 주입합니다. 장치의 카세트 커버를 닫습니다.
- 소프트웨어가 열리면 분석 시작 버튼을 클릭합니다. 를 눌러 얻은 결과를 저장합니다 기록 버튼을 누릅니다.
- 동적 광산란 분석
참고: 제타 전위 및 크기 측정을 위해 분리된 엑소좀도 NTA 분석과 동일한 방식으로 희석됩니다.- 엑소좀 20μL에 PBS 980μL를 추가합니다.
- 제타 사이징 장치와 연결된 컴퓨터를 엽니다. 소프트웨어를 엽니다.
- 3.2.1단계의 서스펜션을 일회용 큐벳에 추가합니다. 장치의 덮개를 열고 큐벳을 카세트에 넣은 다음 덮개를 닫습니다.
- 장치의 소프트웨어에서 큐벳 유형을 선택합니다. 제타 전위 및 차원 분석을 위해 분석 시작 버튼을 클릭합니다.
참고: 분석은 치수 분석과 제타 전위에 대해 별도로 수행됩니다.
4. 엑소좀에 도파민 로딩
NOTE: WJ-MSC 엑소좀의 특성 분석이 완료된 후, 약물 전달 시스템으로 도파민이 함유된 엑소좀을 수득했습니다. 엑소좀에 약물을 로딩하는 것은 배양 방법을 사용하여 수행됩니다.
- 2.2.5단계의 엑소좀 현탁액에 PBS 3mL를 추가합니다. 0.22μm 필터를 사용하여 여과하여 희석된 현탁액을 멸균합니다. 멸균된 엑소좀 현탁액 500μL를 다른 튜브로 옮깁니다.
- 증류수로 도파민 용액(0.5mg/mL)을 준비합니다. 엑소좀이 들어 있는 튜브에 도파민 용액 500μL를 넣습니다.
- 4.2단계에서 현탁액에 사포닌을 추가합니다. 준비된 엑소좀-도파민 현탁액을 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.
알림: 사포닌 농도는 총 용액의 0.002%를 초과해서는 안 됩니다. - 현탁액을 90,000× g 에서 70분 동안 초원심분리하여 배지에서 유리 도파민과 사포닌을 제거합니다. 분리된 엑소좀은 추가 분석을 위해 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다37.
참고: 준비된 도파민 용액의 안정성을 위해 0.02% 아스코르브산을 첨가하십시오.
5. 도파민이 함유된 엑소좀의 특성 분석
- 나노 입자 추적 분석(NTA)
참고: 나노 입자 추적 분석은 분리된 엑소좀의 크기와 농도를 결정하기 위해 수행됩니다.- 3.1.1-3.1.4단계에 따라 엑소좀을 희석하고 NTA를 수행합니다.
- 동적 광산란 분석
참고: 제타 전위 및 크기 측정을 위해 분리된 엑소좀도 NTA 분석과 유사하게 희석됩니다.- 3.2.1-3.2.4단계에 따라 엑소좀을 희석하고 동적 광산란 분석을 수행합니다.
참고: 각 용액(사포닌, 도파민, 엑소좀-도파민)의 크기 및 제타 전위는 별도로 분석됩니다.
- 3.2.1-3.2.4단계에 따라 엑소좀을 희석하고 동적 광산란 분석을 수행합니다.
6. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)
참고: 엑소좀에 로드된 도파민의 양은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법으로 측정됩니다. 얻어진 제형 내에서 도파민의 존재를 감지하기 위해 엑소좀은 특수 공정에 의해 폭발합니다.
- 제형을 75°C 히터에 넣어 증발시킵니다. 아세토니트릴(50:50 비율)을 서스펜션과 와류에 추가합니다. 용액을 10분 동안 초음파 처리합니다.
- 용액을 10,000× g에서 10분 동안 원심분리합니다. 0.22μm 필터를 통해 상층액을 여과합니다.
- 30°C에서 1mL/분의 유속으로 C18 컬럼을 사용하여 모든 분석물을 분석합니다(이동상 H2O/아세토니트릴). 230nm에서 흡광도를 측정한다38.
7. 약물 로딩 용량(DL) 측정 및 체외 약물 방출 역학
- 약물 적재 용량(DL)
참고: 엑소좀에 로드된 도파민의 양은 UV-Vis 분광광광도계를 사용하여 정량화됩니다. 흡광도는 280nm에서 판독됩니다. 합성 중에 수집된 상청액은 무부하 약물의 양을 측정하는 데 사용됩니다. 상층액의 도파민 농도는 도파민에 대한 표준 보정 곡선을 통해 결정됩니다.- 도파민 1mg/mL의 원액을 준비합니다. 증류수를 사용하여 원액에서 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5mg/mL의 농도를 준비합니다.
참고: 준비된 도파민 용액의 안정성을 위해 0.02% 아스코르브산을 첨가하십시오. - UV 분광 광도계에서 280nm에서 각 도파민 희석의 흡광도를 측정하여 표준 검량선을 생성합니다.
- 280nm에서 상층액의 흡광도를 측정합니다.
- Eq (1)39를 사용하여 도파민의 약물 로딩 용량을 계산합니다.
DL (%) =
100 (1)
참고: 분석은 세 번에 걸쳐 수행됩니다.
- 도파민 1mg/mL의 원액을 준비합니다. 증류수를 사용하여 원액에서 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5mg/mL의 농도를 준비합니다.
- In vitro 약물 방출 역학
참고: 도파민이 함유된 엑소좀의 약물 방출 역학은 투석막을 사용하여 수행됩니다. PBS, pH 7.4는 생리학적 미세환경을 시뮬레이션하기 위한 방출 매체로 사용됩니다.- 도파민이 함유된 엑소좀 1mL를 투석막에 추가합니다. 멤브레인을 비커에 넣습니다. PBS 15mL를 비커에 추가합니다.
- 0.5시간, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 동안 비커에 1mL의 방출 배지를 샘플링합니다. 각 시점에서 샘플의 부피를 새 PBS로 교체합니다. UV-Vis 분광계를 사용하여 280nm에서 지정된 간격으로 채취한 샘플을 분석합니다.
- 식 (2)40을 사용하여 결과를 계산합니다.
릴리스(%) =
100(2)
참고: 체외 약물 방출 역학을 측정하기 위해 보정 곡선이 준비되었습니다. 도파민 용액은 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 및 5.0mg/mL 농도로 제조됩니다. 각 농도의 UV 흡광도 값은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 280nm에서 측정됩니다.
100 (1)
100(2)8. 시험관 내 세포 독성 시험
- 섬유아세포의 활성화와 배양
- -80°C 냉동실에서 섬유아세포를 제거합니다. DMEM-F12 + 10% FBS가 들어 있는 플라스크에 세포를 심습니다.
- 37 ° C에서 5 % CO 2 를 함유 한 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 배양 배지는 2일마다 교체합니다.
- 세포가 80% 합류점에 도달할 때까지 세포를 통과시킵니다. 1.3-1.5단계를 따릅니다. 1,500 × g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 DMEM-F12 + 10% FBS 1mL를 첨가하고 96웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포를 시드합니다.
- DMEM-F12 배지 + 10 % FBS를 첨가하고 5 % CO2 가 함유 된 인큐베이터에서 37 ° C에서 18 시간 동안 세포를 배양합니다. 배양이 끝날 때 우물의 배지를 변경하십시오.
- 도파민이 함유된 엑소좀 현탁액을 준비합니다. 도파민이 함유된 엑소좀 제형을 배지로 희석하여 100μL/mL, 250μL/mL, 500μL/mL, 1,000μL/mL의 농도를 얻습니다.
- 준비된 농도를 96웰 플레이트의 각 웰 내에 있는 세포에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5%CO241을 함유하는 인큐베이터에서 18시간 동안 배양합니다.
- MTT 세포 생존율 분석
참고: 배양이 끝나면 세포의 생존율 비율은 MTT 테스트에 의해 결정됩니다.- PBS로 MTT 용액(5mg/mL)을 준비합니다. 각 웰에 10μL의 MTT 용액을 추가합니다. 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
- 배양이 끝나면 각 웰에 100μL의 DMSO를 추가합니다. 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 570nm42,43에서 ELISA 리더의 흡광도 값을 측정합니다.
참고: MTT 생존력 테스트는 세 번에 걸쳐 수행됩니다.
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Representative Results
엑소좀 분리 및 특성 분석
Wharton 젤리 줄기 세포는 배양액이 충분한 밀도에 도달하면 무혈청 배지에서 48시간 동안 배양 및 배양됩니다. 배양 종료 후 상층액은 -20°C에서 보관됩니다. 수집된 상층액은 PBS로 희석되고 초원심분리를 거칩니다(그림 1). 얻어진 용액은 NTA 및 DLS 분석으로 분석됩니다. 엑소좀은 0.22μm 필터를 통과하여 멸균됩니다. 얻어진 엑소좀의 평균 크기는 98nm로 확인되었습니다(동영상 1). 원심분리 막바지에 약 100억 개의 엑소좀 입자가 수득되었습니다. NTA 및 DLS 분석에서 밝혀진 나노 입자의 수는 서로 일치합니다. 또한 WJ-MSC에서 유래한 엑소좀의 제타 전위는 -15.7mV로 측정되었습니다(그림 2 및 그림 3).
동영상 1: 와튼 젤리 유래 엑소좀의 나노 입자 추적 분석. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
엑소좀에 도파민 주입
NTA 분석에서 계산한 바와 같이, Wharton의 젤리에서 분리된 샘플 500μL에는 약 15억 개의 나노 입자가 있었습니다. 도파민 용액(5mg/mL)을 엑소좀 500μL와 혼합하고, 현탁액을 37°C에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 얻어진 용액은 NTA 및 DLS 분석으로 특성화되었습니다. NTA 결과에 따르면 용액의 평균 입자 크기는 110nm인 것으로 나타났습니다. 엑소좀과 도파민이 함유된 엑소좀의 입자 크기를 비교한 결과, 도파민이 함유된 엑소좀의 크기가 크게 증가한 것으로 나타났습니다. NTA와 DLS 분석에서 밝혀진 나노 입자의 수는 서로 일치했습니다. 또한 도파민이 함유된 엑소좀의 제타 전위는 -17.6Mv로 측정되었습니다(그림 2 및 그림 3).
동영상 2: 도파민이 함유된 엑소좀의 나노 입자 추적 분석. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 견본 | 제타 전위 |
| 엑소좀 | 1.1 ± -15.7 mV |
| 사포닌 | -12 mV ± 0.7 |
| 도파민 | -14.4 mV ± 1.3 |
| 도파민이 가득한 엑소좀 | -17.6 mV ± 0.8 |
표 1: 모든 용액의 제타 전위.
DSL 분석, 도파민, 사포닌, 도파민이 함유된 엑소좀 용액의 제타 사이저 및 제타 전위 표는 표 1에 나와 있습니다.
그림 2: 엑소좀의 나노 입자 추적 분석. (A) 엑소좀; (B) 도파민이 함유된 엑소좀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Zetasizer 분석 . (A) 엑소좀, (B) 도파민이 함유된 엑소좀, (C) 사포닌, (D) 도파민. 약어: d = 크기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
용액 내 도파민의 존재는 HPLC 분석에 의해 결정되었다. 도파민이 함유된 엑소좀을 초원심분리하고 여과하여 유리 도파민을 제거했습니다. 배양 말기에 엑소좀에 도파민을 적재하는 데 성공하면, 엑소좀이 파열된 후 도파민을 직접 측정하여 검출할 수 있습니다. 이를 위해 도파민이 함유된 엑소좀 현탁액을 증기로 가열하고 아세토니트릴을 첨가하여 현탁액을 초음파 처리했습니다. 흡광도는 230nm에서 측정하여 파괴된 엑소좀에서 방출되는 도파민의 양을 평가했습니다.
그림 4: HPLC 분석에 의해 결정된 제형의 도파민 존재. 모든 분석은 30°C에서 1mL/분의 유속으로H2O/아세토니트릴의 이동상을 갖는 C-18 컬럼을 사용하여 수행되었습니다. 흡광도는 도파민의 용리를 모니터링하기 위해 230nm에서 측정됩니다. (A) 도파민, (B) 사포닌, (C) 도파민이 함유된 엑소좀. 약어: HPLC = 고성능 액체 크로마토그래피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HPLC 분석 결과, 도파민의 피크는 6.45분에 관찰되었습니다. 사포닌의 존재는 엑소좀 단편화 후에도 검출되었습니다(그림 4).
약물 로딩 용량 및 in vitro 약물 방출 역학
도파민 로딩 용량은 UV 분광 광도계 측정 및 Eq (1) 및 Eq (2)를 사용하여 계산되었습니다. 적재 능력 비율은 10.89 ± 0.33으로 나타났습니다. 누적 약물 방출 프로파일은 그림 5에 나와 있습니다. 8시간 동안 약물 방출 역학을 모니터링한 결과, 캡슐화된 도파민의 74.8%가 처음 8시간 이내에 엑소좀에서 방출되는 것으로 나타났습니다(그림 5).
그림 5: 누적 약물 방출 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시험관 내 세포 독성 시험
섬유아세포에서 도파민이 함유된 엑소좀과 유리 엑소좀의 세포독성을 조사했습니다. 섬유아세포를 다양한 농도의 제형(100μL/mL, 250μL/mL, 500μL/mL 및 1,000μL/mL)에 노출시키고 18시간 동안 배양했습니다. 도파민이 함유된 엑소좀은 주목할 만한 세포독성 효과를 나타내지 않았지만, 도파민의 캡슐화를 증가시키기 위해 제형에 사포닌을 첨가하면 섬유아세포 생존율이 감소했습니다(p < 0.05, 그림 6). 섬유아세포를 최대 500μL/mL 농도의 도파민이 함유된 엑소좀으로 처리했을 때 세포 생존율이 증가했습니다. 18시간 배양이 끝날 때 세포 생존율은 MTT 테스트에 의해 결정되었습니다(그림 7). 결과의 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 수행하여 평가하였다.
그림 6: 세포로 제형을 배양한 후의 현미경 이미지(10x). (A) 도파민, (B) 사포닌, (C) 도파민 로딩 엑소좀 100 μL/mL, (D) 도파민 로딩 엑소좀 250 μL/mL, (E) 도파민 로딩 엑소좀 500 μL/mL, (F) 도파민 로딩 엑소좀 1,000 μL/mL 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 도파민, 사포닌 및 도파민이 함유된 엑소좀의 농도가 서로 다른 세포에서 18시간 동안 배양된 세포에서 MTT 생존도 테스트 결과의 통계 분석. (A) 세포독성 결과, (B,C) 통계 분석. 약어: D = 도파민; S = 사포닌; Exo-DA1 = 도파민 함유 엑소좀 100μL/mL; Exo-DA2 = 도파민 함유 엑소좀 250μL/mL; Exo-DA 3 도파민 함유 엑소좀 500 μL/mL; Exo-DA 4 = 도파민이 함유된 엑소좀 1,000μL/mL; MTT = 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
또한 유리 엑소좀의 세포독성 효과도 유사한 농도의 섬유아세포에 대해 조사되었습니다(그림 8). 실험 전에 엑소좀을 PBS로 희석하여 mL당 6천만 개의 입자로 만들었습니다. 그런 다음 10μL, 25μL, 50μL, 100μL의 엑소좀 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가했습니다.
그림 8: 다양한 농도의 엑소좀으로 18시간 동안 배양된 세포에서 MTT 생존도 테스트 결과의 통계적 분석. (A) 세포독성 결과, (B,C) 통계 분석. 약어: EXO = 엑소좀; MTT = 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
섬유아세포 생존율은 도파민이 함유된 엑소좀이 500μL, 유리 엑소좀이 25μL/mL일 때 다른 농도에 비해 높은 것으로 나타났습니다. 그러나 어떤 농도에서도 유의미한 세포 독성이 관찰되지 않았습니다.
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Discussion
엑소좀은 크기가 40-200nm인 작은 막 소포체로, MSC1과 같은 대부분의 세포 유형에서 분비됩니다. 세포 간 통신을 가능하게 하는 엑소좀은 세포내이입(endocytosis), 식세포작용(phagocytosis), 마이크로피노사이토시스(micropinocytosis), 지질 매개 내재화(lipid-mediated internalization), 융합(fusion) 33,44 등 다양한 방식으로 세포에 들어갈 수 있습니다. 다른 나노캐리어 시스템과 비교했을 때, 엑소좀 표면에서 발견되는 지질과 콜레스테롤은 친수성 분자와 소수성 분자를 모두 운반할 수 있는 능력을 부여하며, 콜레스테롤 말단의 수소 결합으로 단단한 포장이 가능합니다45.
본 연구에서는 MSC 유래 엑소좀의 분리, 약물 로딩 실험, 세포독성 분석을 수행하였다. 엑소좀은 세포 간 화물 및 통신과 같은 중요한 기능 외에도 신경 발생, 특히 뇌에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다 6,7. 또한, MSC 유래 엑소좀은 내약성이 비교적 우수하고, 고유한 치료 특성을 가지고 있으며, 높은 안정성과 귀환 능력을 보여줍니다46,47. 최근에는 신경 손상으로 인한 질환에 대한 치료법이 없기 때문에 엑소좀 응용 등 나노 단위의 치료 방법에 대한 연구가 신경퇴행성 질환의 대체 치료법으로 주목받고 있습니다. 또한 엑소좀은 BBB를 통과할 수 있어 약물 운반체 시스템으로서 탁월한 플랫폼이 됩니다.
엑소좀 분리에는 여러 가지 방법이 있지만, 여기서는 가장 효과적인 방법 중 하나로 인정받는 초원심분리기 분리법을 사용했습니다. 이번 연구에서 공여세포로 선정된 WJ-MSC는 면역원성 잠재력이 낮은 것으로 알려져 있으며47 임상시험에서 엑소좀의 공급원으로 사용되고 있다(48). 그런 다음 얻어진 엑소좀을 도파민 용액으로 배양하고, 그 동안 용액에 사포닌을 첨가하여 약물 로딩의 성공률을 높였습니다. 배양이 끝날 때, 유리 도파민과 사포닌을 배지에서 제거하였다. 사포닌은 엑소좀의 막에 결합된 콜레스테롤을 선택적으로 제거하고 엑소좀 지질 이중층에 기공을 만들어 도파민 분자의 진입을 촉진하는 것으로 기대됩니다. 그 결과, 엑소좀의 크기가 약간 증가한 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 도파민 부하 때문일 것입니다.
제타 전위는 입자 사이의 더 큰 정전기 반발력과 응집 경향을 보여줍니다. 얻어진 제형의 제타 전위는 이전 연구49의 결과와 양립할 수 있었다. 배양 기간이 끝날 때 수행된 HPLC 분석에서 엑소좀의 단편화 후 도파민의 존재가 검출되었습니다. 위에서 언급했듯이 사포닌은 도파민의 캡슐화를 촉진합니다. 약물 로딩 용량은 흡광도 값39에 기초한 UV-vis 분광광도계에 의해 측정되었다. 약물 로딩을 위한 배양 방법은 간단하고 다른 방법에 비해 비용이 적게 들지만, 이 방법에서는 로딩 효율이 낮다(26). 이 연구에서 적재 용량은 약 11%였습니다. 사포닌(Saponin)은 세포질막(50)에 효과적인 투과제이며, 도파민으로 엑소좀의 로딩 용량을 증가시키는 것으로 보인다.
향후 연구에서는 엑소좀 약물 로딩 효율을 향상시키기 위해 초음파 처리 방법을 선호하는 것이 더 효과적일 수 있다38. 누적 약물 방출 프로파일은 많은 양의 도파민이 8 시간의 잠복기가 끝날 때 방출되었음을 밝혔습니다. 시험관 내 방출 연구의 처음 5시간 동안 폭발성 방출이 관찰되었습니다. 엑소좀 제형의 방출 프로파일은 약물 특성, 이중층 유동성 및 분자량과 같은 많은 매개변수에 따라 달라지기 때문에 많은 연구에서 시간당 방출되는 약물의 양에 차이가 관찰될 수 있다51. 또한, 본 연구에서 섬유아세포에 대한 제형의 세포독성 효과는 관찰되지 않았다. 그러나 엑소좀에 도파민 로딩을 증가시키기 위해 첨가된 사포닌의 독성 효과는 섬유아세포 세포에서 검출되었습니다. 이러한 데이터에 따르면, 엑소좀의 내인성은 리포좀, 마이크로스피어, 마이크로에멀젼 및 기타 합성 약물 전달 시스템과 비교할 때 자연스럽고 독특한 이점입니다52. 현재 방법의 단점을 줄이기 위해 다양한 transfection 시약, electroporation 기술 또는 내인성 도파민 생산 세포, 바람직하게는 유전자 변형 MSC를 엑소좀의 공급원으로 사용할 수 있습니다.
엑소좀 분리는 이 프로토콜로 수행되었습니다. 그러나 격리 단계는 매우 길고 어려운 프로세스입니다. 세포 배양에서 수집된 상층액이 무혈청 배지에 있는지 확인하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한 현재까지 엑소좀의 양은 단백질 농도와 관련이 있습니다. 그러나 엑소좀 입자의 수를 계산하고 적용하면 임상 연구의 정확도를 높이는 데 도움이 될 수 있다고 제안합니다. 분리된 엑소좀의 약물 로딩에 사용되는 배양 방법은 약물 로딩 용량 측면에서 낮은 것으로 나타났습니다. 약물 로딩 용량이 높은 초음파 처리 방법은보다 효과적인 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
이러한 결과는 WJ-MSC 유래 엑소좀이 도파민 전달을 위한 강력한 운반체임을 보여주었습니다. BBB를 통과하는 능력과 면역 조절 특성과 함께 파킨슨병 또는 기타 중추신경계 질환에 대한 표적 치료제는 약물 운반 엑소좀을 사용하여 개발할 수 있습니다. 그러나 연구는 생체 내에서 수행되어야 하며 임상 시험으로 뒷받침되어야 합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 주로 Yıldız Technical University Scientific Research Projects(TSA-2021-4713)에서 제공한 연구 자금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
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