Summary
هنا ، نصف بروتوكولا للحصول على مستخلص السم الخام من شقائق النعمان البحرية والكشف عن نشاطه الانحلالي والفوسفوليباز.
Abstract
يتضمن تكوين سم شقائق النعمان البحرية جزيئات متعددة الببتيد وغير البروتينات. تتمتع مكونات التحلل الخلوي بإمكانات عالية في مجال التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي لتصميم أدوات جزيئية جديدة. يقع سم شقائق النعمان البحرية في الخلايا الغدية من الأديم الخارجي والهياكل دون الخلوية التي تسمى الأكياس الخيطية ، وكلاهما موزع في جميع أنحاء جسم شقائق النعمان في البحر. هذه الخاصية تنطوي على تحديات لأنه يجب تحليل الخلايا والكيس الخيطي لإطلاق مكونات السم مع جزيئات أخرى غير سامة. لذلك ، أولا ، يتم اشتقاق السم من مستخلص خام (خليط من جزيئات مختلفة ومتنوعة وحطام الأنسجة). الخطوة التالية هي الكشف عن الببتيدات المتعددة ذات الأنشطة الحيوية المحددة. هنا ، نصف استراتيجية فعالة للحصول على مستخلص خام شقائق النعمان البحرية والفحص الحيوي لتحديد وجود السيتوليسين. تتضمن الخطوة الأولى تقنيات غير مكلفة ومباشرة (دورة التحريك والتجميد والذوبان) لإطلاق السيتوليسينات. حصلنا على أعلى نشاط تحلل الخلايا والبروتين (~ 500 ملغ من البروتين من 20 غرام من الوزن الجاف). بعد ذلك ، تم تحليل تعقيد الببتيد المتعدد للمستخلص بواسطة SDS-PAGE gel للكشف عن البروتينات ذات الأوزان الجزيئية بين 10 kDa و 250 kDa. في فحص الانحلال ، استخدمنا خلايا الدم الحمراء للأغنام وحددنا HU50 (11.1 ± 0.3 ميكروغرام / مل). في المقابل ، تم تحديد وجود الفوسفوليباز في المستخلص الخام باستخدام صفار البيض كركيزة في وسط صلب مع الأغاروز. بشكل عام ، تستخدم هذه الدراسة بروتوكولا فعالا وغير مكلف لإعداد المستخلص الخام وتطبق مقايسات حيوية قابلة للتكرار لتحديد السيتوليسين ، والجزيئات ذات الاهتمامات التكنولوجية الحيوية والطبية الحيوية.
Introduction
الحيوانات البحرية هي مصدر غني للمركبات النشطة بيولوجيا. في العقود الأخيرة ، اجتذب تكوين سم شقائق النعمان البحرية اهتماما علميا لأنه يضم مجموعة متنوعة من الببتيدات المتعددة مع الانحلالية ، السامة للخلايا ، الأنزيمية (الفوسفوليباز ، البروتياز ، الكيتيناز) ، والنشاط السام للأعصاب والتأثيرات المثبطة على النشاط البروتيني1. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الببتيدات المتعددة هي مصادر محتملة لتطوير الأدوات الجزيئية في التكنولوجيا الحيوية والاستخدام العلاجي 2,3.
هناك عدد قليل من التقارير حول سم شقائق النعمان البحرية ومكوناته الجزيئية بسبب تعقيد الحصول على السم ، وحتى العزل ، وتوصيف السموم. تضمنت طرق الاستخراج المستخدمة في التقارير التحلل وإفراغ محتويات الخلايا ذات الصلة وغير المرتبطة بإنتاج السم1.
ومن الخصائص الخاصة في جميع cnidarians عدم وجود نظام لإنتاج وإطلاق السم مركزي في منطقة تشريحية واحدة. بدلا من ذلك ، فإن الأكياس الخيطية هي هياكل تحافظ على السم 4,5. أنواع أخرى من الخلايا ، تسمى خلايا غدة البشرة ، تفرز أيضا السموم ويتم توزيعها أيضا في جميع أنحاء الجسم من شقائق النعمان البحرية6.
التحدي الأول والأكثر أهمية في الحصول على السم هو توليد مستخلص مع التلاعب الكافي في العمليات اللاحقة ، دون تعطيل أو تدهور البروتينات اللابيلية. بعد ذلك ، يجب تحليل الخلايا ، والمكونات - في هذه الحالة ، يجب استخراج الببتيدات المتعددة بكفاءة وسرعة ، وتجنب التحلل البروتيني والتحلل المائي مع القضاء على المكونات الخلوية الأخرى7.
تستخدم طرق مختلفة للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية. بعضها ينطوي على التضحية بالكائن الحي بينما يسمح البعض الآخر بإبقائه على قيد الحياة. تسمح الطرق التي تنطوي على استخدام جسم الكائن الحي بالكامل بإطلاق معظم السموم من السم8 ، مقارنة بالطرق التي تبقي الكائنات الحية على قيد الحياة ، والتي تستخرج فقط بعض مكونات السم9. يتطلب تحضير المستخلص تقييم وجود وفعالية مادة ذات أهمية من خلال فحص حيوي محدد ، والذي يتضمن استراتيجيات لمراقبة الآثار الدوائية عن طريق الطرق في الجسم الحي أو في المختبر 10.
يحتوي سم شقائق النعمان البحرية على بولي ببتيدات محللة للخلايا ، وسموم تشكل المسام (PFTs) 11 ، وفوسفوليباز12 ؛ هذه الجزيئات هي نماذج في دراسة التفاعل بين البروتين والدهون ، والأدوات الجزيئية في علاج السرطان ، وأجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على المسام النانوية3. يتم تصنيف PFTs شقائق النعمان البحرية وفقا لحجمها أو وزنها الجزيئي ، من 5 kDa إلى 80 kDa. إن 20 kDa PFT ، الأكثر دراسة والمعروفة باسم الأكتينوبورين11 ، له أهمية خاصة لإمكاناته الطبية الحيوية في تطوير أدوات جزيئية للتطبيقات المحتملة مثل أجهزة الاستشعار الحيوية المضادة للسرطان ومضادات الميكروبات والمسام النانوية. وهناك سيتوليسين آخر، بما في ذلك الفوسفوليباز، وتحديدا الفوسفوليباز A2 (PLA2)13، يطلق حمضا دهنيا مستحقا ويتحلل الدهون الفوسفاتية، مما يزعزع استقرار غشاء الخلية. بسبب آلية العمل هذه ، يعد PLA2 بأن يكون نموذجا أساسيا للدراسة والتطبيقات في الأمراض الالتهابية. يمكن أن يكون بمثابة نموذج لدراسات سلوك الدهون في غشاء الخلية14.
هنا ، نصف بروتوكولا فعالا للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية Anthopleura dowii Verrill ، 1869 ، والكشف عن الهيموليسين والفوسفوليباز. كلاهما سموم ذات صلة يمكن استخدامها كقالب لتصميم أدوات جزيئية جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم جمع شقائق النعمان البحرية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الوطنية لتربية الأحياء المائية ومصايد الأسماك والأغذية التابعة للحكومة الفيدرالية للمكسيك (رقم التصريح PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا التابعة لمعهد التكنولوجيا الحيوية ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك على جميع التجارب على شقائق النعمان البحرية. تم شراء عينة دم الأغنام من مركز التدريس العملي والبحوث في الإنتاج الحيواني وصحة الحيوان (CEPIPSA ، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك).
1. جمع الكائنات الحية
- جمع شقائق النعمان البحرية A. dowii.
ملاحظة: هنا، تم جمع الكائنات الحية خلال فترات المد المنخفض في منطقة المد والجزر قبالة ساحل إنسينادا باجا، كاليفورنيا، المكسيك (الشكل 1A، B). - نقل الكائنات الحية إلى المختبر في حاويات بها مياه البحر (الشكل 1 ج).
- في المختبر ، قم بتنظيف الكائنات الحية بالماء المقطر باليد لإزالة جزيئات الركيزة الكبيرة الملتصقة بالجسم.
- قم بتجميد الكائنات الحية على الفور عند -80 درجة مئوية في الفريزر الفائق لمدة 72 ساعة.
- ضع الكائنات الحية في أكواب خاصة للتجفيف بالتجميد ، مع ظروف التجفيد من -20 درجة مئوية ، 0.015 رطل لكل بوصة مربعة ، لمدة 48 ساعة.
- تخزين الكائنات الحية المجمدة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. ترطيب الأنسجة
- إعادة تشكيل 20 جم من الوزن الجاف للكائنات الحية المجففة بالتجميد مع 60 مل (1/3 واط / ف) من 50 مللي متر من العازل فوسفات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.5 ، وقرص كوكتيل مثبط واحد (جدول المواد).
- في التحريك المغناطيسي ، حرك العينة باستمرار عند ~ 800 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية ، لمدة 12 ساعة.
3. الافراج عن السموم
- للحث على تحلل الخلايا وتصريف الكيس الخيطي ، قم بتجميد العينة عند -20 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ، ثم ضع الحاوية في الماء في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تذوب بنسبة تصل إلى 90٪. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
ملاحظة: العينة لا تذوب بنسبة 100٪. من الأهمية بمكان الحفاظ على العينة عند ~ 4 درجات مئوية لمنع تدهور البروتين. - راقب الكيسة الخيطية التي تم تفريغها تحت المجهر البؤري. خذ 10 ميكرولتر من العينة على شريحة وضع غطاء فوقها. راقب تحت المجهر البؤري عند تكبير 100x و 60x. هنا صبغة لم تكن ضرورية.
- معالجة الصور التي تم التقاطها في المجهر البؤري في برنامج ImageJ (الإصدار 1.53c، واين راسباندر، المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية، https://imagej.nih.gov/ij).
- إذا كان النبيب داخل الكيسة الخيطية غير لفائف وكان في الخارج ، يتم تفريغ الأكياس الخيطية. ثم تابع الخطوة التالية. خلاف ذلك ، قم بإجراء دورة تجميد ذوبان مرة واحدة فقط.
- لتوضيح المستخلص ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 25400 × g لمدة 40 دقيقة ، 4 درجات مئوية ، واستعاد السوبرنات ، وقم بطرده المركزي مرة أخرى. كرر هذه الخطوة 3-4 مرات.
- استعادة supernatant والتخلص من الكرية. يحتوي المستخلص الفائق أو الخام على مكونات السم (السموم) وجزيئات الخلايا الأخرى ، مثل الدهون والكربوهيدرات والأحماض النووية.
4. كمية البروتين الكلي
- تحديد تركيز البروتين من المستخلص الخام باستخدام مجموعة مقايسة برادفورد اللونية التجارية15 (جدول المواد).
- تمييع كاشف الصبغة (جزء واحد من الصبغة مع أربعة أجزاء من الماء المقطر).
- تحضير محلول زلال مصل البقر (BSA) Fraction V (جدول المواد) بتركيز 1 مجم / مل في المخزن المؤقت للفوسفات (50 mM فوسفات الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 7.5).
- قم بإعداد الحلول المدرجة في الجدول 1 في ثلاثة أضعاف.
- امزج بقوة كل محلول في شاكر لمدة 4 ثوان.
- احتضان العينات لمدة 5 دقائق في RT ، دون اهتزاز.
- قياس الامتصاص (AU) عند 595 نانومتر.
- ارسم متوسطات امتصاص BSA للعينة (AU مقابل تركيز البروتين)، وأوجد معادلة الرسم البياني (المعادلة 1).
المعادلة 1
حيث y هو الامتصاص ، m هو ميل الخط ، x هو تركيز البروتين ، و b هو اعتراض y. لحساب تركيز مستخلص النفط الخام، حل ل x على النحو التالي:
المعادلة 2
المعادلة 1
المعادلة 2
5. تحديد تعقيد سم الببتيد المتعدد
- قم بتجميع الحاوية الزجاجية للرحلان الكهربائي الهلامي العمودي وفقا للدليل.
- تحضير مزيج الأكريلاميد (30 ٪): 29.2 غرام من الأكريلاميد ، 0.8 غرام من ثنائي الأكريلاميد ، الحجم النهائي من 100 مل. قم بتصفية المحلول باستخدام غشاء 0.45 ميكرومتر. تخزين الحل في زجاجة مظلمة في 4 درجة مئوية. ثم ، قم بإعداد الخليط لهلام الحل (الجدول 2).
- يتكون جل SDS-PAGE من هلام حل وهلام تكديس. تحضير المواد الهلامية وفقا لأحجام المحلول المحددة في الجدول 2. أثناء التحضير ، تأكد من الحفاظ على كل مزيج عند 4 درجات مئوية لتقليل وقت البلمرة.
ملاحظة: يختلف حجم كل خليط تبعا للعلامة التجارية للمعدات المستخدمة؛ لهذا البروتوكول ، تتوافق الأحجام مع إعداد هلام أكريلاميد بنسبة 15٪ ، بسماكة 0.75 مم ، لغرفة الرحلان الكهربائي الرأسي (جدول المواد). - بعد أن يتبلمر الأكريلاميد ، ~ 10 دقائق ، أضف خليط هلام التراص.
- تحضير الخليط لهلام التراص ، وإضافته على الفور إلى الألواح الزجاجية ، ووضع مشط لتشكيل الآبار لتحميل العينات.
- بمجرد أن يتبلمر هلام التراص (~ 15 دقيقة) ، قم بإزالة المشط ووضع الحاوية الزجاجية في غرفة للرحلان الكهربائي الرأسي.
- ضع 200 مل من المخزن المؤقت للقطب الكهربائي (0.25 M Tris ، 0.192 M glycine ، 0.1٪ SDS) في غرفة الرحلان الكهربائي.
- تحليل المستخلص الخام: امزج 30 ميكروغرام من المستخلص الخام مع 5 ميكرولتر من مخزن البروتين العازل لتحميل البروتين (25٪ جلسرين ، 15٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم ، 25٪ 2-ميركابتوإيثانول ، 0.125 mM Tris pH 7 ، بروموفينول أزرق 0.1 مجم / مل) لتشويه البروتينات. يجب أن يكون الحجم النهائي <50 ميكرولتر.
- سخن على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وبارد، وجهاز طرد مركزي لمدة 3 ثوان عند 1400 × جم.
- قم بتحميل العينات في آبار هلام التراص. قم بتحميل سلم الوزن الجزيئي القياسي.
- قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند 25 مللي أمبير ثابت لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة.
- قم بإزالة الحاويات الزجاجية من غرفة الرحلان الكهربائي للمضي قدما في تلطيخ بروتينات الهلام.
6. تلطيخ البروتين
- شطف الجل في 50 مل من الماء المقطر لإزالة الحطام من القطب العازل.
- تخلص من الماء.
- لتجنب انتشار بروتينات الجل ، أضف محلول التثبيت (60 مل من الإيثانول ، و 20 مل من حمض الخليك ، و 20 مل من الماء المقطر ، الحجم النهائي 100 مل). احتضن في RT لمدة 40 دقيقة مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة. صب الحل.
- أضف محلول الربط المتقاطع للبروتين (15 مل من الإيثانول ، 0.25 مل من الجلوتارالدهيد ، 50 مل من الماء المقطر ، الحجم النهائي 65.25 مل) ، واحتضنه لمدة 30 دقيقة في RT مع الاهتزاز عند 80 دورة في الدقيقة. قم بإزالة الحل.
- اغسل الجل ب 100 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة الماء. كرر هذا الإجراء أربع مرات.
- قم بإجراء تلطيخ البروتين باستخدام 50 مل من محلول Coomassie الأزرق اللامع R-250 المصفى (40٪ ميثانول ، 10٪ حمض الخليك ، 50٪ ماء مقطر ، صبغة 0.1٪ ، الحجم النهائي 100 مل) ، مع التحريك عند 60 دورة في الدقيقة في مذبذب دوار مختبري في RT لمدة 15 دقيقة.
- استعادة الحل ، والتي يمكن استخدامها لتلطيخ المواد الهلامية الأخرى.
- للقضاء على الصبغة الزائدة ، أضف محلول إزالة البقع (40 مل من الميثانول ، 10 مل من حمض الخليك ، 50 مل من الماء المقطر). استمر في التحريك (80 دورة في الدقيقة) في RT حتى تتصور الأشرطة (البروتينات الملطخة).
- احتفظ بالجل في 50 مل من الماء المقطر وامسح الصورة ضوئيا في نظام توثيق Gel.
7. تحضير محلول خلايا الدم الحمراء
- استخراج 1 مل من الدم من الوريد الوداجي للأغنام.
- قم بإزالة الإبرة من المحقنة وقم بتصريف الدم على الفور في أنبوب يحتوي على 50 مل من محلول Alsever (0.002 M حمض الستريك ، 0.07 M NaCl ، 0.1 M سكر العنب ، و 0.027 M سترات الصوديوم كمضاد للتخثر ، درجة الحموضة 7.4).
- عكس الحل ببطء ثلاث مرات.
- يحفظ في 4 درجات مئوية لنقله إلى المختبر.
- جهاز طرد مركزي عند 804 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
- أعد تعليق الكريات في 30 مل من محلول Alsever. أضف المحلول عن طريق تحريكه على طول الجدران الداخلية للأنبوب ، وباستخدام ماصة بلاستيكية باستور ، أعد تعليق الخلايا ببطء. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 804 × g لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. كرر هذا الإجراء حتى يتم توضيح supernatant.
- أضف 15 مل من محلول Alsever ؛ أعد تعليق الكريات ببطء باستخدام ماصة بلاستيكية باستور.
- الحفاظ على الحجم النهائي لمحلول Alsever لتحقيق تركيز 2 × 106 خلايا / مل ، تقريبا. ثم استخدم غرفة نيوباور أو مقياس الدم لحساب الخلايا.
ملاحظة: عد كريات الدم الحمراء في شريحة مقياس الدم (Neubauer المحسن). الشريحة عبارة عن شريحة 30 مم × 70 مم × 4 مم. يحتوي المركز على لوحين فضيين (الشكل 2A) (شبكة علوية واحدة وشبكة سفلية) ، كل منهما 3 مم × 3 مم ، وقناتين على جانبي الشبكة. توجد خلايا العد في مربعات الزاوية والوسط (المربعات الحمراء في الشكل 2B). يجب أن يكون التركيز الأمثل للخلايا للعد في ترتيب 106 خلايا. تبلغ مساحة الصندوق المركزي 0.1 سم2 ، وهو ما يعادل 0.0001 مل. - ضع غطاء فوق الشريحة.
- ضع 10 ميكرولتر من العينة بين الشريحة والغطاء وانتظر حتى يتم صرف العينة.
- في المجهر الضوئي (التكبير 60x)، قم بإجراء العد في المربع المربع الأول. عد فقط الخلايا الموجودة في الشبكة المركزية وتلك التي تلمس الهامش العلوي أو الأيسر للمربع.
- أوجد تركيز الخلية باستخدام المعادلة التالية:
المعادلة 3
إذا كانت العينة مركزة للغاية وكان التخفيف مطلوبا ، فاستخدم المعادلة التالية:
المعادلة 4
ملاحظة: عند أخذ محلول كريات الدم الحمراء لاختبار انحلال الدم ، قم بتجانس المحلول ببطء باستخدام ماصة باستور البلاستيكية. - نفذ الخطوات في ثلاثة أضعاف لتقليل الخطأ.
المعادلة 3
المعادلة 48. فحص انحلال الدم
- تحضير مخاليط الحل (في ثلاثة أضعاف) المشار إليها في الجدول 3 في لوحات مخروطية 96 بئرا.
ملاحظة: اخلطي كريات الدم الحمراء ببطء للحفاظ على تعليق متجانس. - احتضن لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، دون أن تهتز.
- جهاز طرد مركزي في لوحة في 804 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- استرجع السوبرناتانت في طبق آخر من 96 بئرا بقاع مسطح.
- إذا كان المستخلص الخام يحتوي على السيتوليسين ، فإن كريات الدم الحمراء سوف تتحلل وتطلق الهيموغلوبين. اقرأ الامتصاص عند 415 نانومتر.
- احسب النسبة المئوية لانحلال الدم، باستخدام المعادلة التالية:
٪ انحلال الدم = ((المخزن المؤقت للمستخلص الخام-AAlsever) / (AH2O-AAlsever)) × 100
ملاحظة: المستخلص الخام ، المخزن المؤقت AAlsever ، و AH2O يتوافق مع امتصاص كريات الدم الحمراء مع المستخلص الخام ، وامتصاص محلول Alsever ، وامتصاص الماء المقطر ، على التوالي. - قم بإجراء اختبار انحلال الدم قبل وبعد كل دورة تجميد وذوبان مع 50 ميكروغرام من البروتين الكلي من المستخلص الخام.
- تحديد عدد دورات التجميد والذوبان المطلوبة للوصول إلى نشاط انحلالي 100٪.
- حساب كمية المستخلص الذي ينتج انحلال الدم في 50 ٪ من كريات الدم الحمراء (HU50) ؛ اتبع نفس البروتوكول الموصوف في الجدول 3 ، وقم بزيادة كمية مستخلص شقائق النعمان البحرية الخام ، وصمم المخطط باستخدام تعديلات سيجمية باستخدام برنامج مناسب (على سبيل المثال ، الأصل ، جدول المواد).
9. فحص الفوسفوليباز
- اغسل بيضة دجاج واحدة مع 1٪ SDS في الماء المقطر.
- افصل صفار البيض عن بياض البيض في ظل ظروف معقمة.
- قم بإعداد 50 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.86٪ ، وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. ثم ، قم بإعداد المحلول A: أضف 12 مل من صفار البيض و 36 مل من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.86٪.
- تحضير الحل B: مزيج 300 ملغ من الأغاروز في 50 مل من المخزن المؤقت (50 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 7.5) ، تصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. سخني المحلول في الميكروويف حتى الغليان. تبرد في الماء الدافئ لتصل إلى 43-45 درجة مئوية.
- تحضير الحل C: تحضير 10 mM CaCl2 وتصفيته بمرشح 0.22 ميكرومتر.
- تحضير الحل D: 10 ملغ من الرودامين 6G في 1 مل من الماء المقطر.
- في ظل الظروف المعقمة (غطاء التدفق الرقائقي) ، أضف 500 ميكرولتر من المحاليل A و C إلى المحلول B و 100 ميكرولتر من المحلول D ، واخلط ، صب 25 مل في كل طبق بتري (90 × 15 مم).
- انتظر حتى يتصلب المحلول تحت ظروف معقمة (30 دقيقة).
- اصنع آبارا (قطرها ~ 2-3 مم) بأنبوب رفيع.
- أضف ما مجموعه 20 ميكرولتر من الفوسفات العازل (التحكم السلبي) في بئر واحد و 20 ميكرولتر من الفوسفوليباز المحدد (التحكم الإيجابي) في بئر آخر.
- ضع كميات مختلفة من بروتين المستخلص الخام ، 5 ، 15 ، 25 ، 35 ، 45 ميكروغرام ، في الآبار المتبقية ، كل منها في حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر.
- انتظر حتى يمتص الأجار جميع العينات (30 دقيقة).
- تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة.
- إذا تشكلت هالة حول البئر ، فهذا يشير إلى نشاط الفوسفوليباز. قياس الهالة التي تشكلت مع الفرجار vernier.
ملاحظة: قم بإجراء التجربة في ثلاث خطوات (خطوات من 9.1-9.14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأظهرت النتائج التمثيلية للبروتوكول المستخدم للحصول على المستخلص الخام من شقائق النعمان البحرية أن الجمع بين تقنيتين (الإثارة ودورات التجميد والذوبان) أدى إلى تصريف فعال للأكياس الخيطية، وكانت الكمية الإجمالية للبروتين 500 ملغ (8 ملغم/مل) (الشكل 3).
يمكن ملاحظة تعقيد البروتين في المستخلص الخام من 10 كيلو دال وأكبر من 250 كيلو دالتون من خلال الرحلان الكهربائي SDS-PAGE. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن cytolysins في منطقة الوزن الجزيئي من 15 kDa و 20 kDa ، وهي مجموعة من الأوزان الجزيئية التي قد تتوافق مع الفوسفوليباز13 أو الأكتينوبورين3 (الشكل 4).
زاد النشاط الانحلالي للمستخلص قبل وأثناء دورات التجميد والذوبان حتى تم الوصول إلى انحلال الدم بنسبة 100٪ مع 50 ميكروغرام من إجمالي بروتين المستخلص الخام في الدورتين الأخيرتين. الكمية اللازمة لتحلل 50٪ من كريات الدم الحمراء للأغنام (HU50) هي 11.1 ± 0.3 ميكروغرام / مل (الشكل 5). تم الكشف عن نشاط الفوسفوليباز عن طريق تكوين هالات واضحة في مناطق صفيحة الأجار ، حيث تم تطبيق عينة المستخلص الخام. تظهر النتائج وجود نشاط فوسفوليباز من 15 ميكروغرام من البروتين الكلي. ويزداد قطر الهالة بطريقة تعتمد على الجرعة، أي إذا زادت كمية المستخلص الخام، يزداد قطر الهالة (الشكل 6 ألف والجدول 4).
الشكل 1: جمع شقائق النعمان البحرية. (أ) منطقة المد والجزر في إل ساوزال، باجا كاليفورنيا نورتي، المكسيك. (ب) شقائق النعمان البحرية التي تم جمعها. (ج) أنثوبليروا داوالثاني فيريل، 1869. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: شريحة مقياس الدم. (أ) في مركز الشريحة ، هناك لوحان فضيان. (ب) يتم حساب الخلايا في المربعات ذات المحيط الأحمر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إفرازات الكيسة الخيطية. الكيسة الخيطية (A) قبل و (B) بعد المحفزات. في B ، يتعرض نبيب الكيس الخيطي ويشير إلى إطلاق السموم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المظهر الكهربائي لمستخلص شقائق النعمان البحرية. تم تحليل مستخلص شقائق النعمان البحرية الخام بواسطة SDS-PAGE 15٪ من هلام البولي أكريلاميد وأظهر البروتين من 10 كيلو دالتون إلى 250 كيلو دالتون من الوزن الجزيئي. حارة 1: سلم البروتين ، حارة 2: البحر شقائق النعمان السم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: فحص انحلال الدم في كريات الدم الحمراء من الأغنام. تم الكشف عن إطلاق الهيموغلوبين عند 415 نانومتر. تم فحص كمية مختلفة من البروتين لتحديد HU50 ، تساوي 11.1 ± 0.3 ميكروغرام / مل. تم إجراء فحوصات انحلال الدم في ثلاثة أضعاف. تمثل الأشرطة الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: فحص الفوسفوليباز. تم فحص كميات مختلفة من البروتين الكلي في الأغاروز مع صفار البيض في وجود Ca2 +. يمكن ملاحظة نشاط الفوسفوليباز حول كل بئر مثل الهالة. الضوابط: العازلة للفوسفات (Fosf.) و PLA2 من ثعبان (F.A). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أنبوب | ماء مقطر | جيش صرب البوسنه | صبغة (ميكرولتر) | المجلد النهائي | |
| (ميكرولتر) | (ميكروغرام) | (ميكرولتر) | (ميكرولتر) | ||
| 1 | 800 | - | - | 200 | 1000 |
| 2 | 799 | 1 | 1 | 200 | 1000 |
| 3 | 797 | 3 | 3 | 200 | 1000 |
| 4 | 795 | 5 | 5 | 200 | 1000 |
| 5 | 793 | 7 | 7 | 200 | 1000 |
| 6 | 790 | 10 | 10 | 200 | 1000 |
| مستخلص الخام (ميكرولتر) | |||||
| 7 | 798-790 | من 2 الى 10 | 200 | 1000 | |
الجدول 1: قياس كمية البروتين بواسطة فحص برادفورد.
| حل | حل الجل | هلام التراص |
| الماء المقطر | 1.1 مل | 1.4 مل |
| مزيج الأكريلاميد (30٪) | 2.5 مل | 0.33 مل |
| تريس (1.5 م ، الرقم الهيدروجيني 8.8) ، ضبط الرقم الهيدروجيني مع HCl. | 1.3 مل | |
| تريس (0.5 م ، الرقم الهيدروجيني 6.8) ، ضبط درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك. | 0.25 مل | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) 10٪ (ث / ف) | 0.5 مل | 0.1 مل |
| بيرسلفات الأمونيوم (APS) (10٪) | 0.5 مل | 0.1 مل |
| N,N,Nˈ,Nˈ-رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) | 0.005 مل | 0.005 مل |
الجدول 2: حلول لإعداد هلام الرحلان الكهربائي SDS-PAGE من الأكريلاميد بنسبة 15٪.
| حسنا | حل الخادم (μL) | ماء مقطر | مستخلص خام | محلول كريات الدم الحمراء (ميكرولتر) | المجلد النهائي | الامتصاص المتوقع |
| (ميكرولتر) | (ميكرولتر) | (ميكرولتر) | (415 نانومتر) | |||
| 1 | 180 | - | - | 20 | 200 | ≤0.1 |
| 2 | - | 180 | - | 20 | 200 | ≤1.0 |
| 3 | 177–170 | - | 3–10 | 20 | 200 | 0.1–1.0 |
الجدول 3: فحص انحلال الدم لمعايرة كريات الدم الحمراء.
| عينة | قطر الهالة (مم) |
| 15 ميكروغرام من F.A | 0 |
| 30 ميكرولتر من الحفرة. | 6.3 ± 0.5 |
| 5 ميكروغرام | 0 |
| 15 ميكروغرام | 2.3 ± 0.5 |
| 25 ميكروغرام | 3.5 ± 0.5 |
| 35 ميكروغرام | 4.1 ± 1 |
| 45 ميكروغرام | 4.6 ± 0.8 |
الجدول 4: قطر الهالات بكميات مختلفة من البروتين من المستخلص الخام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أدى ارتفاع الطلب على المركبات الجديدة ذات التطبيقات في مختلف مجالات العلوم والصناعة إلى دراسة السم. يمثل السم مصدرا غنيا بالجزيئات التي تعمل كقالب لتوليد أدوات جزيئية جديدة. ومع ذلك ، فإن تعقيد هذه السموم يتطلب تنفيذ والجمع بين الأساليب المختلفة للحصول عليها ودراستها.
هنا ، نعرض طريقة للحصول على وتحليل سم شقائق النعمان البحرية Anthopleura dowii ، Verrill 1869 ، والتي يمكن استخدامها لاستكشاف سم أنواع شقائق النعمان البحرية الأخرى بدءا من العينات المجففة بالتجميد ، ثم الاستخلاص الخام obtention. سمحت خطوة التجفيد بالحفاظ على الكائنات الحية حتى الاستخدام ولاستخدام جزء من العينة وفقا لاحتياجات التجربة ، مما يسمح بالتطبيق الفعال للكائنات الحية ، وتجنب جمع أعداد كبيرة منها ، والحفاظ على استقرار البروتين 7,16. يعد تحضير المستخلص الخام مع السموم من الكائنات الحية الطازجة أكثر فعالية من تلك المعزولة عن الكائنات الحية المجمدة. ومع ذلك ، فإن بروتينات المستخلص الخام تحافظ على وظيفتها لمزيد من الوقت عند تجميدها عند -20 درجة مئوية17. كما أن تجفيد الكائنات الحية له آثار أخلاقية بيولوجية لأن هذا يسمح بالتحسين الأمثل في استخدام العينة ويتجنب جمع المزيد من الكائنات الحية.
تسمح طريقة التجميد والذوبان بالعمل مع الجسم الكامل للكائن الحي ، مع ميزة توزيع cnida في جميع أنحاء الجسم. ومع ذلك ، من الضروري تجميد الدورة وإذابتها بكفاءة (لفترات طويلة وغيرها من التقنيات) للحصول على المزيد من السم. في تقارير أخرى ، يتم استخراج السم عبر دورات زمنية قصيرة ، مما يقلل من كمية وتنوع السموم في المستخلص الخام18,19.
إن اختبار برادفورد المستخدم لتحديد إجمالي كمية البروتين التي تم الحصول عليها في المستخلص الخام هو طريقة قابلة للتكرار وغير مكلفة وبسيطة متوافقة مع شروط المستخلص الخام15. إجمالي البروتين الذي تم الحصول عليه هنا أعلى من الكمية المبلغ عنها سابقا20,21,22. يعتمد تنوع ووفرة السموم في الاستخراج على أنواع الكائنات الحية وجمعها.
الرحلان الكهربائي الهلامي بواسطة SDS-PAGE هو تقنية فعالة تستخدم لتحليل تعقيد المستخلص الخام. ومع ذلك ، فإن التثبيت الجيد للبروتينات التي تحتوي على glutaraldehyde مهم عند تحليل البروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض والوفرة المنخفضة التي قد تنتشر من الجل أثناء عملية التلطيخ23.
إحدى مزايا وجود مستخلص ذو تعقيد عال من الببتيد هو إمكانية إجراء دراسة بروتينية كاملة. إذا خضع هذا المستخلص لعمليات تنقية ، فمن الممكن تحديد عدد أكبر من السموم ذات الاهتمامات التكنولوجية الحيوية والبيئية والطبية الحيوية24.
في دراسة السم ، يكون من الصعب عموما تحديد جزيء أو مجموعة من الببتيدات المتعددة ذات الوظيفة المحددة. لذلك ، من الضروري أن يكون لديك مقايسات حيوية قابلة للتكرار ومحددة وسريعة وغير مكلفة. مقايسات الانحلال والفوسفوليباز هي الأكثر استخداما لدراسة السيتوليزين في السموم. نظرا لأن الأكتينوبورين لديه تقارب كبير مع سفينغومايلين ، فمن الأفضل استخدام كريات الدم الحمراء مع كمية عالية من هذه الدهون في أغشيتها حيث سيتم استخدام عينات أقل بهذه الطريقة. بهذا المعنى ، كريات الدم الحمراء للأغنام هي خلايا ذات نسبة عالية من السفينجومايلين في غشائها25. يتم تحليل فحص انحلال الدم ، والكشف عن وجود الهيموغلوبين عند امتصاص 415 نانومتر. تشير هذه المقايسة الحيوية فقط إلى أن وجود cytolysins يمكن أن يعمل على كريات الدم الحمراء. ومع ذلك ، لا يمكن تحديد نوع السيتوليسين الذي يسبب انحلال الدم. لهذا السبب ، نوصي بإجراء فحوصات تكميلية.
على الرغم من أن فحص أغاروز صفار البيض يسمح بتحديد وجود أنواع مختلفة من الفوسفوليباز اعتمادا على لون الهالة ، إلا أنه لا يمكننا التمييز بين الفوسفوليباز المختلفة للمستخلص الخام من A.dowii. الاحتمال هو تنوع الفوسفوليباز العالي الذي تنتجه A. dowii26. بالنسبة للدراسات المستقبلية ، نقترح إجراء هذا الفحص باستخدام تدرج تركيز المستخلص الخام ، ربما باستخدام نانوغرام البروتين.
على الرغم من وجود جزيئات في النظام البيئي البحري ذات إمكانات عالية في المجالات الطبية والتكنولوجيا الحيوية والصناعية ، إلا أنه لا يزال هناك الكثير لتحليله والتحقيق فيه في سم cnidarians.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة منافسة فيما يتعلق بنشر هذه الورقة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) ، مع رقم منحة IT200819. يعترف المؤلفون لتوم موسلمان ، Rock Paper Editing ، LLC ، للتحقق من قواعد اللغة الإنجليزية لهذه المخطوطة ؛ والمساعدة التقنية المقدمة من سامانتا خيمينيز (CICESE، إنسينادا)، وخوان مانويل باربوسا كاستيلو (معهد العلوم الاجتماعية، بعثة الأمم المتحدة في أفغانستان). كما نشكر الدكتور أوغستو سيزار ليزارازو تشابارو (CEPIPSA) على حصوله على دم الأغنام. ونشكر بصفة خاصة الدكتور خوسيه سانيغر بيزا، من معهد المحاسبين القانونيين المعتمدين - بعثة الأمم المتحدة لتقديم المساعدة إلى أفغانستان، على التسهيلات التي وفرها في مختبره لتسجيل الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430766 | |
| 2-Bromophenol blue | Sigma | B75808 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| Acetic Acid Glacial | J.T. Baker | 9515-03 | |
| Acrylamide | Promega | V3115 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| Bisacrylamide | Promega | V3143 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Sigma | A3059-100G | |
| Bradford Protein Assays | Bio-Rad | 5000006 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Cell culture plates 96 well, V-bottom | Corning | 3894 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge tubes | Corning | CLS430829 | |
| ChemiDoc MP system | Bio-Rad | 1708280 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clear flat.bottom 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Bio-Rad | #1610406 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610400 | |
| Dextrose | J.T. Baker | 1916-01 | |
| Ductless Enclosure | Labconco | Vertical | https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c |
| Gel Doc EZ | Bio Rad. | Gel Documentation System | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-4L | |
| Hemocytometer | Marienfeld | 650030 | |
| ImageJ (Software) | NIH, USA | Version 1.53c | |
| Incubator 211 | Labnet | I5211 DS | |
| Methanol | J.T. Baker | 9049-03 | |
| Mini-PROTEAN tetra cell | Bio-Rad | 1658000EDU | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3824-01 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4.H2O | J.T. Baker | 3818-05 | |
| Origin software | version 9 | To design the plot with sigmoidal adjustments | |
| Petridish | Falcon | 351007 | |
| Pipetman kit | Gilson | F167380 | |
| Precast mini gel | BioRad | 1658004 | |
| Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26620 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 252433 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Sodium citrate dihydrate | JT Baker | 3646-01 | |
| Spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | G10S UV-VIS | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 77-86-1 | |
| Volt Power Supply | Hoefer | PS300B |
References
- Frazão, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview. Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).
- Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses. The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).
- Ramírez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodríguez-Almazán, C. Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools. Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).
- Fautin, D. G. Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon. Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).
- Moran, Y., et al. Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution. Marine Biotechnology. 15 (3), New York, N.Y. 329-339 (2013).
- Moran, Y., et al. Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).
- Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).
- Bulati, M., et al. Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines. BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).
- Orts, D. J. B., et al. Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum. Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).
- Hader, D., Erzinger, G. Bioassays: Advanced Methods and Applications. , Elsevier Science. (2017).
- Anderluh, G., Macek, P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).
- Nevalainen, T. J., et al.
- Razpotnik, A., et al. A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification. The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).
- Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -H., Magrioti, V., Kokotos, G. Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention. Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kwon, Y. -C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
- Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).
- Morales-Landa, J. L., et al. Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea. Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).
- Sánchez-Rodríguez, J., Cruz-Vazquez, K. Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860). Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).
- de Oliveira, J. S., et al. Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization. Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).
- Norton, R. S., et al. Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).
- Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system. Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).
- Dion, A. S., Pomenti, A. A. Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement. Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry. The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).
- Nelson, G. J. Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells. Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).
- Ramírez-Carreto, S., et al. Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869. Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).
