Summary
システム構成、光アライメント、サンプル調製、実験手順など、手術マージン分析のために術中に組織学的画像を提供できる高速でオープントップの紫外線光音響顕微鏡を実証します。
Abstract
外科的マージン分析(SMA)は、腫瘍切除手術におけるがん組織の完全な切除を確認するために不可欠な手順であり、陽性の外科的マージンによる反復手術を避けるために術中診断ツールを必要とする。近年、266nmの波長におけるDNA/RNAの高い固有光吸収を利用して、標識のない高解像度の組織像を提供する紫外線光音響顕微鏡(UV-PAM)が開発され、SMAの術中ツールとして大きな期待が寄せられています。SMA用UV-PAMの開発を可能にするために、ここでは、従来の光学顕微鏡と同様に操作できる高速でオープントップのUV-PAMシステムを紹介します。UV-PAMシステムは、1軸ガルバノメータミラースキャンにより、1.2μmの高横方向分解能と55kHzのAラインレートの高速イメージング速度を提供します。さらに、UV-PAM画像が追加のトレーニングなしで病理学者が簡単に解釈できるように、元のグレースケールUV-PAM画像は、標準的なヘマトキシリンおよびエオジン染色画像を模倣するディープラーニングアルゴリズムによって仮想的に染色され、トレーニングフリーの組織学的分析を可能にします。マウス脳スライスイメージングは、オープントップUV-PAMシステムの高性能を実証するために行われ、SMAアプリケーションにとって大きな可能性を示しています。
Introduction
顕微鏡下で組織標本を検査する必要がある外科的マージン分析(SMA)は、切除手術1においてすべての癌細胞が患者の体内から除去されるかどうかを判断するために不可欠な手順である。したがって、組織学的画像を迅速に提供できる顕微鏡は、SMAが癌細胞の不完全な除去によって引き起こされる反復手術を避けるために極めて重要である。しかし、明視野光学顕微鏡に基づく現在のゴールドスタンダード法によれば、切除した組織はホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、薄いスライス(4〜7μm)に切片化し、次いでイメージング前にヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)によって染色する必要があり、これは時間がかかり(3〜7日)面倒である2,3.凍結切片は、組織を迅速に凍結、スライス、染色することによってSMAの迅速な代替手段であり、20〜30分で組織学的画像を提供することができます4。しかし、組織学的特徴はしばしば歪んでおり、巧みな訓練が必要であり、これは複数のタイプの器官への技術の適用性を妨げる5。
SMAのために、組織処理のステップなしで、または数ステップの細胞画像を提供することができる光学顕微鏡技術が開発されている。しかし、それぞれが異なる問題に苦しんでいます。例えば、光干渉断層撮影6 および共焦点反射顕微鏡7 は、その低い固有散乱コントラストのために低い特異性に苦しむ。紫外線表面励起8 およびライトシート顕微鏡9 を用いた顕微鏡は、SMAに対して高解像度および高コントラストの画像を提供することができるが、毒性および揮発性の染色手順は、通常、手術室では実行できず、ターンアラウンドタイムを延長する。多光子顕微鏡10 および刺激ラマン顕微鏡11 は、SMAについて豊富な情報を提供することができる。しかし、非線形効果を生成するために使用される必要な超高速レーザーのコストが高いため、その幅広い適用性が妨げられています。
近年、固有光吸収を利用して、高解像度の組織学的画像12を提供するためにラベルフリーの紫外線光音響顕微鏡(UV-PAM)が開発されている。UV-PAMでは、励起UV光の光子エネルギー(例えば、266nm)は、まず細胞核13 内のDNA/RNAに吸収され、次いで熱に変換され、熱弾性膨張14を介して弾性波放射を誘導する。発生した音響波を検出することにより、音響信号の最大振幅投影 を介して 細胞核の2次元(2D)UV-PAM画像を得ることができ、SMAの組織学的情報を提供する。UV-PAMの臨床応用を可能にするために、ガルバノミラースキャンに基づく高速UV-PAMが開発され、脳生検サンプル(5mm x 5mm)の組織学的画像を18分以内に提供し、時間に敏感なアプリケーションにおいて大きな可能性を示しています15。厚い組織画像化のためのUV-PAMの可能性をさらに検証するために、防水一軸微小電気機械システムスキャナを備えた反射モードUV-PAMシステムを提案し、ヒト結腸および肝臓組織の術中組織病理学的検査を実証することに成功した16。元のUV-PAM画像はグレースケールで、ゴールドスタンダードのH&E染色画像はピンクと紫の色であるため、病理学者がUV-PAM画像を直接解釈することは困難です。この問題に対処するために、グレースケールのUV-PAM画像をほぼリアルタイムで仮想H&E染色画像に転送し、病理学者が追加のトレーニングなしで画像を理解できるようにするディープラーニングアルゴリズムが提案されました17。
本研究は、従来の光学顕微鏡と同様に操作可能な高速でオープントップのUV-PAMシステムを報告し、オリジナルのグレースケール組織学的画像とディープラーニングアルゴリズムによって支援された仮想染色画像の両方を提供する。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)マウス脳スライスをUV-PAMシステムによって画像化し、当社の仮想染色UV-PAMと標準的なH&E染色画像との類似性を実証し、SMAアプリケーションの可能性を示しています。
Protocol
この研究で実施されたすべての動物実験は、香港科技大学の動物倫理委員会によって承認されています。
1. オープントップUV-PAMシステム(図1)
- 光学照明
- 励起源としてQスイッチダイオード励起固体レーザ(波長266nm)を使用してください。
- 2つの凸レンズを使用してレーザービームを展開し、最初の凸レンズの焦点の近くにピンホールを配置して空間フィルタリングを実行します。
- 1Dガルバノミラー(1D GM)を使用してレーザービームを上方に反射します。
- 対物レンズを使用してレーザービームを集束させ、リング状の超音波探触子(UT)の中心を通過してからサンプルにしっかりと焦点を合わせます。
- 超音波検出
- リング状の集束UTを使用して超音波を検出します。UTアクティブエリアの内径と外径は、それぞれ3mmと6mmです。焦点距離: 6.3 ミリメートル;中心周波数: 40 MHz;-6 dB 帯域幅: 84%。
- UTをラボ製の水槽に固定し、下部に光学的に透明な窓があり、薄い石英のカバースリップで覆われてUV光が通過できるようにします。UT のアクティブ領域が上を向いていることを確認します。UTの横方向の位置を制御するための2軸手動ステージに水タンクを取り付けます。
- UVレーザーをオンにし、UTの位置を調整して、レーザービームがUTの中心から通過できるようにします。UVレーザーをオフにします。次いで、水タンクを脱イオン水で満たし、UTを完全に浸漬する。
- UTの出力を2つのアンプに接続し(合計ゲイン = 56dB)、2番目のアンプの出力をデータ・アクイジション・カード(DAQ)に接続します。
- xy電動ステージに接続されたz軸手動ステージにサンプルホルダーを取り付けます。サンプルホルダーには、UV光を通過できる空の穴があります。穴を囲む両面テープを4枚取り付けます。
- システムアライメント
- 黒いテープをスライドガラスに取り付け、黒いテープを下に向けてサンプルホルダーの穴を覆うようにスライドガラスを置きます。スライドガラスを押して、サンプルホルダーに固定されていることを確認します。その後、サンプルホルダーを下げて、スライドガラスを水に浸した。
- リング状のUTとアンプを取り外し、UTをパルサー/レシーバーに接続し、パルサー/レシーバーの出力をオシロスコープに接続します。パルサー/レシーバーをパルスエコーモードで操作します。パルス振幅とパルサー/レシーバーのゲインをそれぞれ6dBと20dBに設定します。
- パルサー/レシーバーを有効にし、サンプルホルダーのz位置を調整して、超音波信号が最大となる音響焦点面の位置を見つけます。
- パルサー/レシーバーを送信モードに変更し、ゲインを60dBに設定します。レーザー出力を有効にします。対物レンズのZ位置を調整して、オシロスコープで測定されるPA信号を最大化します。
- リング状のUTの横方向の位置を調整して、生成されたPA信号を対称かつ最大にし、光学的および音響的病巣が側方平面内で同一位置合わせされることを表す。次に、サンプルホルダのZ位置を調整して、PA信号を最大化します。
- 手順1.4.3と1.4.4を繰り返して、PA信号の対称性と振幅の両方を最適化します。PA信号が最適化されたときの時間遅延(すなわち、PA波がUTに到達するのにかかる時間)をオシロスコープに記録します。
- サンプルホルダーを動かして、黒いテープのさまざまな位置を画像化します。黒いテープの各位置から生成されるPA信号がステップ1.4.5で測定されたものと同じ時間遅延を持つように、サンプルホルダの平坦度を調整します。
- レーザーをオフにし、UTを2つのアンプに接続します。
2. サンプル調製
- FFPEマウス脳スライス
- 麻酔の過剰摂取でマウスを犠牲にする。次いで、参考文献18に記載のプロトコールに従ってマウス脳を採取する。
- 収穫した脳を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定する。
- 段階的なアルコールによる脱水、キシレンによるクリア、および参考文献19に記載されているようにパラフィンによる埋め込みによって固定された脳を処理する。
メモ: サンプルをヒュームフードで処理します。 - ミクロトームを用いて、埋め込まれた脳を薄いスライス(厚さ5μm)にスライスする。サンプルスライスを石英スライドの上に置きます。スライドを60°Cのオーブンで1時間乾燥させる。
- パラフィンがUV励起で高度に吸収されるため、高いバックグラウンド信号を避けるためにパラフィンを除去する透明化剤( 材料表を参照)を使用して切片を脱パラフィン化する。
メモ: サンプルをヒュームフードで処理します。
- 新鮮なマウスの脳スライス
- 麻酔の過剰摂取でマウスを犠牲にする。次いで、参考文献18に記載されたプロトコールに従ってマウス脳を採取する。
- マウス脳をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、血液を除去した。
- 脳サンプルのスライス(厚さ約5mm)を手で切断し、PBSでサンプルを洗浄して断面上の血液を除去した。
3. 実験手順
- サンプルの配置
- UV透過膜(ポリエチレン、厚さ約10μm)を備えたラボ製のサンプルタンクを用意します。膜に水滴を加え、生物学的サンプルをサンプルタンクの上に置き、水を覆います。FFPEスライスサンプルの場合は、テープを使用してスライドガラスをメンブレンに固定します。
- 試料含有試料タンクを試料ホルダ上に置き、試料ホルダの空孔を覆うようにする。
- UVレーザーを外部トリガーモードに設定します。ラボで作成したLabVIEWプログラム( 材料表を参照)を使用して、スキャンパラメータを次のように設定します。
- レーザーの繰り返しレートを 55 kHz に設定します。GMドライバの 信号typeを 三角形 に設定し、駆動電圧 範囲 を0.018Vに設定します(±0.018V、スケールファクタ:1V/°を表す)。 GMnum を 22 に設定し、 dy を 2 に設定して、22 回のレーザー トリガーごとに GM がスキャン期間の 4 分の 1 を終了し、y 軸モーターが 0.3125 μm のステップ サイズを移動するようにします。 dx を 192 に設定して、y 軸モーターがプリセット位置 (例えば、5 mm) に達すると、x 軸モーターが 30 μm のステップ サイズで移動するようにします。
メモ: 最小増分ステップサイズは、X 軸モーターと Y 軸モーターの両方で 0.15625 μm に設定されます。したがって、dy = 2 の場合、ステップ サイズは 0.15625 x 2 = 0.3125 μm に等しく、dx = 192 のとき、ステップ サイズは 0.15625 x 192 = 30 μm になります。5 x 5 mm2の全領域をスキャンするには、x軸モーターが5000 μm / 30 μm = 167回移動するため、167枚のサブ画像をステッチして画像全体を取得します。UV-PAMシステムのスキャン軌道については、 図2 を参照してください。
- レーザーの繰り返しレートを 55 kHz に設定します。GMドライバの 信号typeを 三角形 に設定し、駆動電圧 範囲 を0.018Vに設定します(±0.018V、スケールファクタ:1V/°を表す)。 GMnum を 22 に設定し、 dy を 2 に設定して、22 回のレーザー トリガーごとに GM がスキャン期間の 4 分の 1 を終了し、y 軸モーターが 0.3125 μm のステップ サイズを移動するようにします。 dx を 192 に設定して、y 軸モーターがプリセット位置 (例えば、5 mm) に達すると、x 軸モーターが 30 μm のステップ サイズで移動するようにします。
- x軸モーターとY軸モーターの移動ステップ数(xn = 10、 yn = 1000)を設定して、小さな領域でトライアルスキャンを開始します。z軸手動ステージを調整して、サンプルを焦点面に配置して、最大のPA信号を取得します。
- x軸モーターとy軸モーターの両方を目的の開始点に移動し、 xn 値と yn 値を設定してスキャン領域を設定し、画像取得プログラムを起動します( 材料表を参照)。
- 画像取得後、レーザーをオフにし、サンプルホルダーを取り外し、生物学的サンプルを保管します。
- 新鮮な生物学的組織の場合、サンプルを10%中性緩衝ホルマリンで保存する。
- FFPEマウス脳スライスについて、参考文献20 に記載されたプロトコルに従ってH&Eで染色し、対応するH&E染色画像を得る。
- 収集されたPA信号を使用して、ラボで構築された画像処理アルゴリズムを使用して最大振幅投影画像を再構築します( 材料表を参照)。
Representative Results
図1 は、高速UV-PAMシステムの概略を示しています。このセットアップでは、光励起および超音波検出経路はサンプルの同じ側および下にあり、反射モードおよびオープントップシステムを形成する。したがって、ユーザーフレンドリーで、厚いサンプルのイメージングに適しています。
図2 は、イメージング中のUV-PAMシステムのスキャン軌道を示しています。各セクションのサブ画像(例えば、5mm x 30μmの面積)は、最初に散乱補間アルゴリズムを用いて生成され、次いで、カスタム画像処理アルゴリズムを用いて全てのサブ画像をステッチすることによって、画像全体(例えば、5mm x 5mmの面積)が得られる( 材料表を参照)。
図3Aおよび図3Bは、FFPEマウス脳スライスのUV-PAMおよびH&E画像を示しており、どちらも視野が5 x 5mm2である。画像処理アルゴリズムは、材料表に記載されているリンクを介してGithubからアクセスできます。画像取得時間は18分未満であったが、図3C−Fは、個々の細胞核が明確に分解され得る図3Aのマークされた領域のズームイン画像を示す。さらに重要なことに、対応する細胞核は標準的なH&E染色画像(図3G-J)に見出すことができ、現在の細胞イメージングシステムの高精度を示しています。グレースケールのUV-PAM画像を仮想H&E染色画像に転写するために、深層学習アルゴリズム17(材料表を参照)が適用されたが、これは8000 x 8000ピクセルの画像に30秒未満かかるであろう。対応するズームイン画像を図3K-Nに示す。仮想的に染色されたUV-PAM画像は、H&E染色画像とほぼ同じ構造情報を提供し、現在のUV-PAMシステムの臨床翻訳に有望であることを示しています。
図1: 高速オープントップUV-PAMシステムの概略図(A) セットアップユーティリティ。(b)2軸手動ステージに取り付けられた試料ホルダと水槽の写真。(c)試料ホルダの孔を覆う水槽及び試料槽に固定されたリング状の超音波振動子の写真。(d)試料ホルダーに載せられるであろうメンブレンと試料を備えた試料タンクの写真。紫外線: 紫外線;DAQ:データ集録カード;GM:ガルバノメーターミラー。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:イメージング中のUV-PAMシステムのスキャン軌道。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:深層学習ベースの仮想染色によるUV-PAMイメージングの実験結果。(a)FFPEマウス脳スライスのUV-PAM画像。(B)同じスライスの標準的なH&E染色画像。スケールバー: 1 mm. (C-F) A のマークされた領域のズームイン画像。(ジージー)Bのマークされた領域の対応するH&E染色画像。(K-N)深層学習アルゴリズムを用いた仮想的に染色された画像に対応する。スケール バー: 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
要約すると、組織学的イメージングのために高速でオープントップのUV-PAMシステムが実証されています。システム構成、光アライメント、サンプル調製、および実験手順に関する詳細な手順を示します。画像取得プログラムは、材料表に記載されているリンクを介してGithubからアクセスできます。本系の横方向分解能は〜1.2μmであり、これは最近の刊行物21において実験的に測定されている。マウス脳スライスを画像化して、本システムが脳生検の典型的なサイズである5 x 5 mm2の領域について18分以内に組織学的画像を得ることができることを実証した22。元の画像はグレースケールですが、ディープラーニングアルゴリズムによって可能になるデジタル仮想染色ツールの助けを借りて、現在のシステムはさらにほぼリアルタイムで仮想染色画像を提供することができ、病理学者が画像を解釈するための容易な適応を保証します。ラベルフリー画像技術として、本UV-PAMシステムは、未処理の新鮮な組織サンプルの組織学的画像を提供することもできる。より多くの例(凍結切片および新鮮な組織サンプルを含む)は、以前の刊行物17において実証されている。実験結果は、SMAアプリケーションにおける現在の深層学習支援UV-PAMシステムの高い可能性を示しています。
UV-PAMシステムの利点の1つは、システムが反射モードで実装され、厚い組織のイメージングを可能にすることです。また、オープントップUV-PAMシステムにより、従来の光学顕微鏡と同様の操作を有する走査窓(試料タンクの膜)に試料を配置することができる。したがって、このシステムは、サンプルが2つの膜11、14によって挟まれることを必要とする他のシステムよりもユーザーフレンドリーである。また、本UV-PAMシステムは、高繰り返し速度UVレーザを用いた1D GMを用いることにより、多焦点励起23を用いたシステムに比べて、より高い費用対効果で高い撮像速度を達成することができる。
現在、撮像速度は、主にレーザーと光子バジェットの繰り返し速度によって制限されている。高い繰り返し率と高いパルスエネルギーを有するレーザにより、撮像時間をさらに短縮することができる。このシステムのもう1つの制限は、サンプルが焦点を合わせているかどうかをユーザーが視覚化するためのリアルタイム画像を表示するのではなく、最大PA信号を見つけることによってのみ、サンプルを対物レンズの焦点面に大まかに調整できることです。ほぼリアルタイムの画像を表示するには、2D GMを適用できます。
プロトコルには2つの重要なステップがあります:(a)光学的および音響的病巣の共焦点要件は、高い検出感度を達成するために最適化されるべきである。(b)同様の高い検出感度を維持するために、x軸上のGMの走査範囲をリング状UTの音響焦点よりも小さくすべきである(現在のセットアップでは、走査範囲は〜30μm±15μm)。そうしないと、複数のサブ画像をつなぎ合わせて画像全体を取得すると、エッジの周りの明らかなケラレ効果が発生します。
Disclosures
T. T. W. W. および V. T. C. T. T. は PhoMedics Limited に金銭的利害関係を有しているが、この作業は支持されなかった。著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、香港イノベーション・アンド・テクノロジー委員会(ITS/036/19)からの財政的支援に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
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