Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Геномное профилирование транскрипционно-ДНК-связывающих взаимодействий в Candida albicans: комплексный метод CUT&RUN и рабочий процесс анализа данных

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63655
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 1,2,4, 3, 1,4, 1,4
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced
* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает экспериментальный метод и рабочий процесс анализа данных для расщепления под мишенями и высвобождения с использованием нуклеазы (CUT & RUN) в грибковом патогене человека Candida albicans.

Abstract

Регуляторные факторы транскрипции контролируют многие важные биологические процессы, включая клеточную дифференцировку, реакции на возмущения окружающей среды и стрессы, а также взаимодействия хозяин-патоген. Определение общегеномного связывания регуляторных факторов транскрипции с ДНК имеет важное значение для понимания функции факторов транскрипции в этих часто сложных биологических процессах. Расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT &RUN) - это современный метод общегеномного картирования белково-ДНК-связывающих взаимодействий in vivo , который является привлекательной альтернативой традиционному и широко используемому иммунопреципитации хроматина с последующим методом секвенирования (ChIP-seq). CUT&RUN поддается экспериментальной установке с более высокой пропускной способностью и имеет значительно более высокий динамический диапазон с более низкими затратами на секвенирование на выборку, чем ChIP-seq. Здесь описан комплексный протокол CUT&RUN и сопутствующий рабочий процесс анализа данных, предназначенный для общегеномного анализа взаимодействий транскрипционного фактора и ДНК-связывания в грибковом патогене человека Candida albicans . Этот подробный протокол включает в себя все необходимые экспериментальные процедуры, от эпитопной маркировки генов, кодирующих фактор транскрипции, до подготовки библиотеки к секвенированию; кроме того, он включает в себя настраиваемый вычислительный рабочий процесс для анализа данных CUT&RUN.

Introduction

Candida albicans является клинически значимым, полиморфным грибковым патогеном человека, который существует в различных режимах роста, таких как планктонный (свободно плавающий) режим роста и как сообщества плотно прилипших клеток, защищенных внеклеточным матриксом, известным как режим биопленки роста 1,2,3. Подобно другим процессам развития и клеточным процессам, развитие биопленки является важным признаком вирулентности C. albicans, который, как известно, контролируется на уровне транскрипции регуляторными факторами транскрипции (TF), которые связываются с ДНК специфическим для последовательности образом4. В последнее время регуляторы хроматина и модификаторы гистонов также стали важными регуляторами образования биопленки C. albicans 5 и морфогенеза6 путем опосредования доступности ДНК. Для понимания сложной биологии этого важного грибкового патогена ценны эффективные методы определения общегеномной локализации специфических ТФ при различных процессах развития и клеточных процессах.

Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq) является широко используемым методом исследования белково-ДНК-взаимодействий в C. albicans 5,6 и в значительной степени заменила более классическое иммунопреципитацию хроматина с последующим методом микрочипа (ChIP-чип)9. Однако как методы ChIP-seq, так и методы ChIP-чипа требуют большого количества входных клеток10, что может быть осложняющим фактором при исследовании TF в контексте конкретных образцов и режимов роста, таких как биопленки, собранные у пациентов или животных моделей инфекции. Кроме того, анализ иммунопреципитации хроматина (ChIP) часто дает значительное количество фонового сигнала по всему геному, требуя высокого уровня обогащения для интересующей мишени, чтобы достаточно отделить сигнал от шума. В то время как анализ ChIP-чипа сегодня в значительной степени устарел, глубина секвенирования, необходимая для ChIP-seq, делает этот анализ непомерно дорогим для многих исследователей, особенно тех, кто изучает несколько TF и / или хроматин-ассоциированных белков.

Расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы (CUT&RUN) является привлекательной альтернативой ChIP-seq. Он был разработан лабораторией Henikoff в 2017 году, чтобы обойти ограничения эндогенного расщепления ChIP-seq и хроматина с последующим секвенированием ChEC-seq11,12, еще одним методом идентификации белково-ДНК-взаимодействий на уровне всего генома, обеспечивая при этом картирование TF и хроматин-ассоциированных белков с высоким разрешением и хроматин-ассоциированных белков13 . CUT&RUN полагается на целенаправленное переваривание хроматина в пермеабилизированных ядрах с использованием привязанных микрококковых нуклеаз с последующим секвенированием переваренных фрагментов ДНК 9,10. Поскольку фрагменты ДНК специально генерируются в локусах, которые связаны интересующим белком, а не генерируются по всему геному путем случайной фрагментации, как в анализах ChIP, подход CUT & RUN приводит к значительному снижению фоновых сигналов и, таким образом, требует 1/10 глубины секвенирования по сравнению с ChIP-seq11,13, 14. Эти улучшения в конечном итоге приводят к значительному сокращению затрат на секвенирование и сокращению общего числа входных ячеек, необходимых в качестве исходного материала для каждого образца.

Здесь описан надежный протокол CUT&RUN, который был адаптирован и оптимизирован для определения общегеномной локализации ТФ в клетках C. albicans , выделенных из биопленок и планктонных культур. Также представлен конвейер тщательного анализа данных, который позволяет обрабатывать и анализировать полученные данные о последовательностях и требует от пользователей минимального опыта в кодировании или биоинформатике. Вкратце, этот протокол описывает эпитопную маркировку TF-кодирующих генов, сбор биопленки и планктонных клеток, выделение интактных пермеабилизированных ядер, инкубацию с первичными антителами против специфического белка или белка, помеченного эпитопом, представляющего интерес, привязку химерных белков A/G-микрококковой нуклеазы (pAG-MNase) к первичным антителам, восстановление геномной ДНК после переваривания хроматина и подготовку геномных библиотек ДНК для секвенирования.

За экспериментальным протоколом CUT&RUN следует специально построенный конвейер анализа данных, который принимает необработанные показания секвенирования ДНК в формате FASTQ и реализует все необходимые этапы обработки, чтобы предоставить полный список значительно обогащенных локусов, связанных интересующим TF (нацеленных на первичное антитело). Обратите внимание, что несколько шагов описанного протокола подготовки библиотеки были специально адаптированы и оптимизированы для анализа CUT&RUN TF (в отличие от нуклеосом). В то время как данные, представленные в этой рукописи, были сгенерированы с использованием TF-специфических адаптаций коммерческого набора CUT & RUN, эти протоколы также были проверены с использованием компонентов из отдельных источников (т. Е. Фермента pAG-MNase и магнитных шариков очистки ДНК) и внутренних буферов, которые могут значительно снизить экспериментальные затраты. Комплексные протоколы экспериментов и анализа данных подробно описаны ниже в пошаговом формате. Все реагенты и критическое оборудование, а также рецепты буферов и сред перечислены в Таблице материалов и Дополнительном файле 1 соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Эпитопная маркировка штаммов C. albicans

  1. Загрузите интересующий ген вместе с его последовательностями размером 1 кб вверх и вниз по течению из базы данных генома Candida в инструмент проектирования праймеров (см. Таблицу материалов). Разработайте направляющую РНК (гРНК), выделив 50 bp вверх и вниз по течению от стоп-кодона, и щелкните инструмент выбора гРНК справа. Выберите Руководство по проектированию и анализу. Используйте геном Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) и NGG (SpCas9, 3' сторона) протопространственного смежного мотива (PAM) для параметров направляющих и нажмите кнопку Готово. На рисунке 1 описан рабочий процесс для эпитопной маркировки интересующего гена C. albicans улучшенным зеленым флуоресцентным белком (eGFP).
    1. На следующей странице подтвердите целевую область для проектирования гРНК и нажмите зеленую кнопку. Сортировка gRNAs по целевому показателю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент проектирования букварей вычисляет целевые и нецелевые оценки для количественной оценки специфичности гРНК. Идеальный гид имеет счет в створ >60, нецелевой балл ~ 33 и перекрывает стоп-кодон. Это обеспечивает высокую специфичность гРНК при абляции гРНК-таргетинга после интеграции GFP. ГРНК с нецелевым баллом ~50 указывает на аллельную вариацию; таким образом, только один аллель будет распознан гРНК.
    2. Добавьте последовательности (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') и (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') к концам 5' и 3' соответственно целевой последовательности 20 bp гРНК, создавая праймер/олигонуклеотид 60 bp. В качестве альтернативы скопируйте последовательность 20 bp в калькулятор гРНК, предоставленный Nguyen et al.15. Закажите 60 bp пользовательский гРНК олигонуклеотид.
    3. Усиливайте «универсальный фрагмент А» 100 мМ AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') и 100 мМ AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') и «уникальный фрагмент B» с помощью пользовательского олигонуклеотида 60 bp gRNA (100 мМ) из шага 1.1.2. и 100 мМ AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGGGTTTAAACACCG-3') с использованием pADH110 (идентификатор плазмидного репозитория ID# 90982) и pADH139 (идентификатор плазмидного репозитория ID# 90987), соответственно, в качестве шаблонной ДНК. Используйте условия ПЦР-реакции и циклирования, приведенные в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pADH139 специфичен для штаммов, которые несут гетерологичный маркер Candida maltosa LEU2 . При использовании штамма с единственной копией гена C. albicans LEU2 замените pADH119 (идентификатор репозитория плазмиды 90985) вместо pADH139.
    4. Подтвердите успешную амплификацию, проверив 5 мкл ПЦР на 1% агарозном геле. Ищите ~1 кб ампликонов фрагментов A и B.
    5. Смешайте по 1 мкл каждого из фрагментов А и В и смешайте их вместе, используя условия реакции ПЦР и циклирования, приведенные в таблице 2 , для создания полноразмерного фрагмента С.
    6. Добавьте 0,5 мкл 100 мМ AHO1237 (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') и 0,5 мкл 100 мМ AHO1453 (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') к каждой реакции ПЦР, хорошо перемешайте путем пипетирования и выполните условия цикла, перечисленные в таблице 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании pADH119 вместо pADH139 замените AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTAAAATTTTAGACTGTTTC-3') вместо AHO1453.
    7. Подтвердите правильность сшивания и амплификации фрагмента С, проверив 5 мкл ПЦР на 1% агарозном геле. Найдите ампликон ~2 кб. Храните фрагмент C при -20 °C до готовности к использованию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если сшивание и амплификация приводят к множественным, неспецифическим полосам или размазыванию, выполните ПЦР-очистку фрагментов А и В и повторите действие шага 1.1.5.
  2. Добавьте весь оптимизированный для CTG мономерный eGFP с последовательностью линкера (RIPLING)16 (pCE1, репозиторий плазмид ID# 174434) непосредственно перед стоп-кодоном интересующего гена с помощью инструмента проектирования праймера, создав C-концевой трансляционный синтез. Используйте эту конструкцию для разработки олигонуклеотидов для амплификации донорской ДНК (дДНК) из pCE1.
    1. Спроектируйте прямой олигонуклеотид с гомологией 18-22 bp для последовательности линкера и гомологией >50 bp для 3'-конца открытой рамки считывания (ORF).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гомология 18-22 bp создает температуру отжига для усиления между 55 °C и 58 °C. Если полноразмерный олигонуклеотид образует праймерные димеры, соответствующим образом скорректируйте гомологию к последовательности линкера /GFP или геному.
    2. Создайте обратный олигонуклеотид с гомологией 18-22 bp к 3'-концу GFP и гомологией >50 bp к нисходящей некодирующей последовательности ORF, подлежащей тегированию.
    3. Упорядочить эти олигонуклеотиды и амплифицировать дДНК, используя условия циклического цикла ПЦР при приземлении в таблице 4.
  3. Разработать два набора колониальных ПЦР (cPCR) олигонуклеотидов для подтверждения интеграции GFP путем усиления по всем фланговым сайтам интеграции. Сначала выберите олигонуклеотид прямой дДНК с помощью инструмента проектирования грунтовки и нажмите кнопку Primer справа.
    1. Нажмите Создать праймеры | | мастера Tm Param и подтвердить, что алгоритм установлен на SantaLucia 1998. Щелкните Использовать выделение , чтобы ввести координаты прямого олигонуклеотида, разработанного в 1.2.1, в качестве целевой последовательности.
    2. Установите оптимальную температуру грунтовки на 55 °C и максимальный размер ампликона на 900 bp и нажмите кнопку «Создать грунтовки» в правом верхнем углу.
    3. Выберите пару олигонуклеотидов с наименьшим штрафным баллом и убедитесь, что праймеры усиливаются по всей 5-футовой интеграционной площадке. Убедитесь, что прямой праймер cPCR находится перед прямой последовательностью праймера dDNA, а обратный праймер cPCR полностью находится в теге eGFP или последовательности компоновщика.
    4. Повторите шаги 1.3-1.3.3. с обратным олигонуклеотидом дДНК для создания второго набора олигонуклеотидов cPCR, которые усиливаются через 3' сайт интеграции. Убедитесь, что прямой праймер cPCR полностью находится в пределах метки eGFP или последовательности компоновщика, а обратный праймер cPCR ниже по потоку обратной последовательности праймера dDNA.
    5. Упорядочивают эти олигонуклеотиды.
  4. Переварите 2 500 нг pADH140, который содержит Cas9 (плазмидное хранилище ID# 90988), с ферментом рестрикции для каждого гена, который должен быть помечен GFP. Установите общий объем каждого пищеварения на уровне 15 мкл; отрегулируйте объем воды соответствующим образом в зависимости от концентрации плазмиды pADH140. Используют условия пищеварения, указанные в таблице 5. Храните переваренную плазмиду при -20 °C до готовности к использованию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При преобразовании штамма с единственной копией гена C. albicans LEU2 вместо гетерологичного маркера C. maltosa LEU2 заменить pADH137 (репозиторий плазмиды ID# 90986) вместо pADH140.
  5. Денатура 12 мкл ДНК сперматозоидов лосося 10 мг/мл для каждого гена, который будет помечен GFP при 99 °C в течение 10 мин и быстро остынет до ≤4 °C. Хранить при температуре -20 °C до готовности к использованию.
  6. Нанесите гемизиготный нурсеотрицин-чувствительный штамм C. albicans LEU2 на пластины дрожжевой пептон декстрозы (YPD) и инкубируйте при 30 °C в течение двух дней.
  7. Выберите одну колонию и переведите ее в 4 мл жидкого YPD. Инкубировать в течение 12-16 ч при 30 °С с встряхиванием при 250 об/мин.
  8. Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD600) ночной (12-16 ч) культуры в спектрофотометре с помощью одноразовой кюветы (1 мл, длина пути 1 см).
  9. Разбавьте культуру на ночь в колбу Эрленмейера до OD600 0,1 в YPD. Учитывайте 5 мл на реакцию и включайте дополнительные 5 мл для последующей проверки OD600 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем культуры зависит от количества трансформационных реакций.
  10. Инкубируют разбавленную культуру на ночь в встряхивающемся инкубаторе при 30 °C с встряхиванием при 250 об/мин до тех пор, пока она не достигнет OD600 0,5-0,8.
  11. Центрифуга по 4 000 × г при комнатной температуре в течение 5 мин; удалить и выбросить супернатант.
  12. Повторно суспендируйте гранулу ячейки в 1 мл стерильной воды с помощью мягкого смешивания пипетки с наконечниками фильтра и переложите в стерильную микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл.
  13. Гранулировать ячейки центрифугированием при 4000 × г при комнатной температуре в течение 1 мин; удалить и выбросить супернатант. Повторно суспендировать в 1 мл стерильной воды и повторить в общей сложности две промывки.
  14. Повторно суспендировать гранулу в 1/100-й объема, используемой на этапе 1.10. Например, если использовалось 15 мл, повторно суспендировать гранулу в 150 мкл стерильной воды.
  15. В отдельной пробирке для каждой реакции трансформации смешивают 50 мкл фрагмента С, 50 мкл дДНК, 2 500 нг переваренного ферментом рестрикции pADH140 и 10 мкл денатурированной ДНК сперматозоидов лосося.
  16. Добавьте 50 мкл клеточной суспензии со стадии 1.14 и перемешайте путем пипетирования.
  17. Сделайте запас пластинчатой смеси (Дополнительный файл 1) для n + 1 преобразований.
  18. Добавьте 1 мл пластинчатой смеси в смесь клетка/ДНК и перемешайте путем инвертирования 5 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постучите по нижней части трубок во время инвертирования, чтобы выбить оставшуюся жидкость.
  19. Поместите смесь в инкубатор при температуре 30 °C в сутки (12-16 ч) без встряхивания.
  20. Тепловые удары по клеткам в течение 15 мин при 44 °С на водяной бане.
  21. Центрифугировать микрофьюжные трубки объемом 1,5 мл при 5000 × г при комнатной температуре в течение 2 мин.
  22. Удалите смесь PLATE вакуумной аспирацией с помощью стерильных наконечников пипетки, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить гранулу клетки.
  23. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 1 мл YPD, гранулы центрифугированием при 4000 × г при комнатной температуре в течение 1 мин, а также удаляют и выбрасывают супернатант. Повторите для второй промывки, повторно суспендируйте гранулу ячейки в 1 мл YPD и переложите суспензию в 10 мл круглодонной одноразовой культуральной трубки, содержащей дополнительный 1 мл YPD (конечный объем 2 мл). Восстанавливайте ячейки при 30 °C с встряхиванием при 250 об/мин в течение 5 ч.
  24. Центрифугировать пробирки по 4000 × г при комнатной температуре в течение 5 мин; удалить и выбросить супернатант.
  25. Повторно суспендировать клеточную гранулу в 100 мкл стерильной воды и пластину на YPD, дополненную 200 мкг/мл нурсеотрицина (NAT200). Инкубировать при 30 °C в течение 2-3 дней.
  26. Aliquot 100 мкл 20 мМ NaOH в скважины 96-луночной ПЦР-пластины, причем каждая скважина соответствует отдельной колонии, которая выросла на пластинах NAT200. Используя стерильную зубочистку или наконечник пипетки, выберите отдельные преобразованные колонии, нанесите их на новую пластину NAT200 и закрутите оставшиеся клетки в колодец с 20 мМ NaOH. Повторите для оставшихся колоний, чтобы создать клеточный лизат, используемый в качестве шаблона ДНК для реакции cPCR.
  27. Запечатайте пластину ПЦР и инкубируйте в течение 10 мин при 99 °C в термоциклере с нагретой крышкой.
  28. Настройте две реакции cPCR с олигонуклеотидами, разработанными на этапах 1.3-1.3.5. При необходимости увеличьте количество реакций. Проводят реакцию ПЦР с клеточным лизатом, приготовленным на стадии 1.26, следуя условиям циклирования и реакционными смесями ПЦР из таблицы 6. Запускают по 10-20 мкл из каждой лунки на 1% агарозный гель. Ищите колонии с усилением двух наборов праймеров cPCR, указывающих на правильно включенную GFP dDNA.
  29. Рестрик колонии, которые включали GFP на синтетических полных (SC) средах, в которых отсутствовал лейцин. Инкубировать в инкубаторе при температуре 30 °C в течение 2-3 дней. Выберите отдельные колонии и нанесите на пластины YPD и YPD с добавлением пластин нурсеотрицина (NAT400) по 400 мкг/мл. Определите колонии, которые не могут расти на пластинах NAT400 через 24 часа, как те, которые успешно потеряли компоненты CRISPR.
  30. Убедитесь, что тег GFP сохранен, повторив шаги 1.25-1.28 с использованием ячеек из патч-пластины YPD. Если присутствуют правильные полосы, инокулируют в 4 мл YPD и растут в течение ночи (12-16 ч), как описано в шаге 1.7.
  31. Смешайте ночную культуру нового штамма, помеченного GFP, со стерилизованным фильтром 50% глицерином в соотношении 1:1 в стерильной криотрубе. Хранить при температуре -80 °C и при необходимости наносить на пластины YPD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется валидировать штаммы, помеченные GFP, путем подтверждения ядерной локализации меченого TF с помощью флуоресцентной микроскопии и подтверждения фенотипа дикого типа в соответствующем фенотипическом анализе.

2. Пробоподготовка культур биопленки

  1. Streak C. albicans GFP-меченый штамм(ы) на агаровые пластины YPD и инкубируют при 30 °C в течение 2-3 дней. Используя одну изолированную колонию из агаровой пластины, инокулируют в 4 мл жидкой среды YPD. Инкубировать при температуре 30 °C с встряхиванием в течение ночи (12-16 ч). Определите OD600 ночных культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать три биологические реплики на образец для экспериментов CUT&RUN.
  2. Привить стерильную 12-луночную необработанную пластину клеточной культуры ночной культурой к конечной среде OD600 0,5 (эквивалентно 2 × 107 клеткам/мл) в Среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 до конечного объема 2 мл. Инкубировать в течение 90 мин при 37 °C в микропластинчатом инкубаторе с встряхиванием при 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать одну 12-луночную пластину клеточной культуры на штамм с одной хорошо неинокализованной в качестве среды для контроля загрязнения. Этот протокол был успешно применен с использованием всего лишь 1/10-й части одной 12-луночной клеточной культуральной пластины (или всего 5 миллионов клеток). Использование большего количества клеток увеличивает общий выход ДНК, что обычно приводит к высококачественным библиотекам секвенирования.
  3. Удалите неприклеенные клетки путем аспирации с помощью стерильных наконечников пипеток, прикрепленных с помощью гибкой пластиковой трубки к вакуумному улавливающему устройству. Промыть прилипшие клетки один раз 2 мл стерильного 1x фосфат-буферного физиологического раствора (PBS). Добавить в скважины 2 мл свежей среды RPMI-1640 и инкубировать в течение 24 ч при 37 °C с встряхиванием при 250 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение наконечников пипетки между скважинами различных деформаций и/или условий. Не соскребайте дно колодца наконечником во время аспирации.
  4. В конце 24-часовой инкубации собирают и объединяют жидкость и биопленочный материал из каждой из 11 инокулированных лунок в одну стерильную коническую трубку объемом 50 мл. Повторите по мере необходимости с независимыми пулами, если одновременно обрабатывается более одного штамма или условия роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соскоблите днища и края каждой скважины с помощью наконечника фильтра пипетки, чтобы выбить ячейки, которые остаются прилипшими к поверхности. Используйте пипетку для гомогенизации биопленок.
  5. Образцы гранул методом центрифугирования при 4000 × г при комнатной температуре в течение 5 мин. Декантируйте как можно больше супернатанта, заботясь о том, чтобы свести к минимуму разрушение гранулы. Заморозьте гранулу в жидком азоте и храните при -80 °C сразу после сбора или продолжайте непосредственно до стадии 4 (выделение ядер).

3. Пробоподготовка планктонных культур

  1. Streak C. albicans GFP-меченый штамм(ы) на агаровые пластины YPD и инкубируют при 30 °C в течение 2-3 дней. Используя одну изолированную колонию из агаровой пластины, инокулируют в 4 мл жидкой среды YPD. Инкубировать при температуре 30 °C с встряхиванием в течение ночи (12-16 ч). Определите OD600 ночных культур.
  2. Культуры обратно разбавляют на ночь до OD600 0,1 в 50 мл жидкой среды RPMI-1640 и инкубируют при 30 °C с встряхиванием при 225 об/мин в течение 2-5 ч, пока OD600 не составит от 0,5 до 0,8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны пройти по крайней мере два удвоения перед сбором. Условия, используемые для планктонных культур, могут быть скорректированы по мере необходимости.
  3. Гранулирование образцов центрифугированием при 4000 × г при комнатной температуре в течение 5 мин. Декантируйте как можно больше супернатанта, заботясь о том, чтобы свести к минимуму разрушение гранулы. Заморозьте гранулу в жидком азоте и храните при -80 °C сразу после сбора или продолжайте непосредственно до стадии 4 (выделение ядер).

4. Выделение ядер

ПРИМЕЧАНИЕ: В день эксперимента приготовьте свежий буфер Фиколла, добавьте 2-меркаптоэтанол и ингибитор протеазы к аликвоте (аликвотам) буфера ресуспенсии и добавьте ингибитор протеазы к аликвоте (аликвотам) буфера SPC (см. Дополнительный файл 1). Чтобы повторно суспендировать гранулы, осторожно пипетку, используя либо 200 мкл, либо 1 мл наконечников пипетки, чтобы избежать повреждения клеток или ядер. Перед началом выделения ядер включите тепловой блок, чтобы разогреть его до 30 °C. Все наконечники и трубки пипетки для остальной части этого протокола должны быть сертифицированы без ДНК / РНК и ДНКазы / РНКазы, и использование наконечников фильтра рекомендуется для всех последующих этапов пипетки.

  1. Повторное суспендирование гранул в 1 мл буфера ресуспенсии комнатной температуры и перенос в стерильную микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл. Гранулы по 2000 × г при комнатной температуре в течение 2 мин в настольной центрифуге и удаляют супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите супернатант, используя наконечник пипетки объемом 200 мкл или 1 мл, заботясь о том, чтобы свести к минимуму разрушение гранул.
  2. Повторное суспендирование гранул в 200 мкл буфера ресуспенсии комнатной температуры. Из повторно суспендированной гранулы переложите аликвоту объемом 5 мкл в новую ПЦР-трубку и храните ее при 4 °C для последующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта аликвота будет использоваться в качестве контроля на последующем этапе контроля качества для оценки качества изолированных ядер.
  3. Гранулы по 2000 × г в течение 2 мин и удаляют и выбрасывают супернатант с помощью пипетки. Повторите этап промывки дважды, используя 200 мкл буфера повторной суспензии.
  4. Центрифугу при 2000 × г при комнатной температуре в течение 2 мин и удаляют супернатант. Добавьте 300 мкл буфера ресуспенсии и 10 мкл раствора литиказы (50 мг/мл, см. Таблицу материалов). Инкубировать в течение 30 мин при 30 °C в тепловом блоке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы вместо теплового блока можно также использовать водяную баню, нагретую до 30 °C. Условия сферопластирования, используемые здесь, были оптимизированы, чтобы быть эффективными как для дрожжевых, так и для гифальных клеток C. albicans. Рекомендуется оптимизировать условия сферопластирования при применении этого протокола к клеткам C. albicans с мутациями, которые влияют на целостность клеточной стенки или другие клеточные морфологии. Во время этого 30-минутного этапа инкубации у пользователя есть возможность завершить шаг 5 (Активация бусины Concanavalin A) заранее, чтобы сэкономить время.
    1. КРИТИЧЕСКИЙ ЭТАП: После 30-минутной стадии инкубации переведите аликвоту объемом 5 мкл в новую трубку ПЦР. К 5 мкл изолированных ядер и 5 мкл аликвоты интактных клеток, хранящихся при 4 °C со стадии 4.2, добавляют 1 мкл калькофтор белого (флуоресцентный краситель клеточной стенки) и 1 мкл SYTO 13 (окрашивание нуклеиновой кислоты). Инкубировать при 30 °C в темноте в течение 30 мин.
    2. Визуально проверьте целостность и чистоту изолированных ядер с помощью флуоресцентного микроскопа. Ищите изолированные ядра, которые показывают заметно окрашенные интактные ядра (с использованием фильтра возбуждения 488-509 нм) и убедитесь, что нет окрашивания клеточной стенки белым красителем калькофтора (с использованием фильтра возбуждения 390-420 нм). В неповрежденных контрольных клетках ищите заметное окрашивание клеточной стенки белым красителем калькофтора (с использованием фильтра возбуждения 390-420 нм) и окрашенными интактными ядрами (с использованием фильтра возбуждения 488-509 нм).
  5. Центрифуга при 2000 × г при 4 °C в течение 5 мин и удаляют надосадочное вещество. Повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл ледяного буфера ресуспенсии с помощью 1 мл наконечников фильтра, аккуратно пипеткой вверх и вниз 5 раз. Центрифугу при 2000 × г при 4 °C в течение 5 мин и удалите супернатант с помощью пипетки 1 мл. Повторно суспендируйте гранулы 1 мл свежеприготовленного ледяного буфера Ficoll.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите образцы и буферы на льду с этой точки вперед.
  6. Центрифугируйте образцы при 5000 × г при 4 °C в течение 10 мин и удалите супернатант. Повторно суспендировать гранулу в 500 мкл ледяного буфера SPC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента обращайтесь с ядрами чрезвычайно осторожно, чтобы избежать их повреждения.
  7. Центрифугируйте образцы при 5000 × г при 4 °C в течение 10 мин и удалите как можно больше супернатанта, не нарушая гранулу. Поместите трубки, содержащие гранулированные ядра, на лед и перейдите к шагу 5. Если этап 5 уже был завершен раньше времени на этапе 4.4, перейдите к этапу 6 или заморозьте гранулы в жидком азоте и храните их при -80 °C сразу после сбора.

5. Конканавалин Активация бусин

ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг. С этого момента у пользователей есть возможность продолжить работу с протоколом, используя коммерчески доступный комплект CUT&RUN или исходные ключевые компоненты по отдельности и подготовить буферы самостоятельно. При использовании коммерческого комплекта все буферы и реагенты, используемые ниже, включаются в комплект, если не указано иное. Индивидуальные каталожные номера для самостоятельного поиска реагентов также приведены в Таблице материалов. Охладите все буферы на льду перед использованием. После завершения шага 5 рекомендуется немедленно перейти к шагу 6. Избегайте многократного замораживания изолированных ядер, поскольку известно, что это увеличивает повреждение ДНК и может привести к результатам низкого качества.

  1. Аккуратно повторно суспендируйте бусины конканавалина А (ConA) с помощью пипетки. Передавайте 22 мкл суспензии conA на образец для обработки в одной микрофьюжной пробирке объемом 1,5 мл. Поместите трубку на магнитную стойку до тех пор, пока шариковая суспензия не станет прозрачной; удалить и выбросить супернатант с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении CUT&RUN в общей сложности 10 образцов, например, переложите 220 мкл суспензии шарика ConA в микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл.
  2. Извлеките трубку, содержащую шарики ConA, из магнитной стойки и немедленно добавьте 200 мкл ледяного буфера активации бусин и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Поместите трубку на магнитную стойку до тех пор, пока шариковая суспензия не станет прозрачной; удалить и выбросить супернатант с помощью пипетки. Повторите этот шаг в общей сложности для двух стирок.
  3. Повторно суспендируйте шарики в 22 мкл ледяного буфера активации бусин на образец ядер, подлежащих обработке. Держите бусины на льду до тех пор, пока это не понадобится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пропускная способность последующих этапов зависит от количества и емкости доступных стоек с магнитной трубкой. Обработка 32 образцов в двух 16-луночных трубчатых стойках является управляемым числом для большинства пользователей этого протокола. Тем не менее, более высокая пропускная способность возможна для более опытных пользователей или если доступны роботизированные системы обработки жидкостей.

6. Связывание ядер с активированными шариками

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием охладите все буферы на льду. Все буферы, дополненные ингибиторами протеазы, должны быть приготовлены свежими в день эксперимента. На последующих этапах рекомендуется использовать ленточные трубки по 0,2 мл.

  1. Повторно суспендируют гранулированные ядра со стадии 4 в 100 мкл ледяного буфера SPC и переносят на новую 8-трубочную полосу объемом 0,2 мл. Добавьте 20 мкл активированных шариков к каждому образцу и аккуратно перемешайте. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин без перемешивания.
  2. Поместите трубки на магнитную стойку до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной; удалить и выбросить супернатант с помощью пипетки. Извлеките трубки из магнитной стойки и добавьте 200 мкл ледяного промывочного буфера к каждому образцу. Повторно суспендируйте бусины, аккуратно пипеткой вверх и вниз 5 раз. Перенесите 100 мкл аликвот из каждого образца в новую 8-пробирную полосу 0,2 мл.
    1. КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ: Разделите каждую выборку CUT&RUN на две отдельные аликвоты. Используйте одну из аликвот для отрицательного контрольного антитела (например, IgG-отрицательное контрольное антитело), а другую для целевого антитела против интересующего белка (например, анти-GFP антитела).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оба образца необходимы для вычислительного конвейера для точной идентификации сигналов обогащения, специфичных для интересующего TF. Также может быть выполнен дополнительный контроль с использованием антител против GFP с непомеченным штаммом. Этот контроль показал результаты, сопоставимые с использованием антител IgG в штамме, помеченном GFP. Поэтому для простоты рекомендуется использовать стандартный контроль IgG для всех экспериментов.

7. Первичное связывание антител

ПРИМЕЧАНИЕ: белок слияния pAG-MNase хорошо связывается с антителами IgG17 кролика, козы, осла, морской свинки и мыши. Как правило, большинство коммерческих антител, сертифицированных ChIP-seq, совместимы с процедурами CUT&RUN. Количество используемого первичного антитела зависит от эффективности антитела, и титрование антитела (например, 1:50, 1:100, 1:200 и 1:400 окончательное разведение) может потребоваться, если интересующее антитело ранее не тестировалось в экспериментах ChIP или CUT&RUN. Охладите все буферы на льду перед использованием. Все буферы, используемые для этапов связывания антител, должны быть приготовлены свежими в день эксперимента.

  1. Поместите трубки на магнитную стойку и подождите, пока суспензия полностью очистится; удалить и выбросить супернатант с помощью пипетки. Добавьте 50 мкл буфера антител и аккуратно перемешайте путем пипетирования.
  2. Добавьте 3 мкл анти-GFP поликлонального антитела (или 0,5 мкг при использовании непроверенного антитела). Инкубировать пробирки на нутационном смесителе при 4 °C в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые протоколы CUT&RUN сообщают о повышении урожайности путем добавления вторичного антитела до добавления pAG-MNase14; однако при использовании этого добавленного шага не было отмечено каких-либо существенных улучшений, и, таким образом, он не включен в этот протокол.
  3. Кратковременно центрифугируйте трубки при 100 × г при комнатной температуре в течение 5 с, поместите трубки на магнитную стойку и, как только суспензия очистится, удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки. Пока трубки, содержащие бусины, все еще находятся на магнитной стойке, добавьте 200 мкл ледяного буфера пермеабилизации клеток непосредственно на бусины. Удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторите в общей сложности две промывки с помощью ледяного буфера пермеабилизации клеток.
  4. Добавьте 50 мкл ледяного буфера проницаемости клеток в каждую трубку и аккуратно перемешайте путем пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бусины часто агрегируются в этот момент, но могут быть легко диспергированы путем осторожного смешивания с использованием пипетки 200 мкл.

8. Связывание pAG-MNase с антителами

  1. Добавьте 2,5 мкл pAG-Mnase (20x бульон) к каждому образцу и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Поместите образцы (слегка приподнятые под углом ~45°) на нутатор при 4 °C. Включите нутатор и высиживайте образцы в течение 1 ч.
  2. Кратковременно центрифугируйте ленточные трубки при 100 × г при комнатной температуре в течение 5 с, поместите трубки на магнитную стойку и, как только суспензия очистится, удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение. Переносящееся антитело, остающееся в колпачке или боковых сторонах пробирок после этого этапа, значительно увеличит количество фонового сигнала.
  3. Пока трубки, содержащие бусины, все еще находятся на магнитной стойке, добавьте 200 мкл ледяного буфера проницаемости клеток, дайте суспензии очиститься, а также удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторите этот шаг в общей сложности для двух промывок с буфером пермеабилизации клеток.
  4. Добавьте 100 мкл ледяного буфера пермеабилизации клеток к образцам и аккуратно пипетку вверх и вниз 5 раз.

9. Целенаправленное переваривание и высвобождение хроматина

  1. Инкубируйте пробирки, содержащие образец (образцы), во влажной ледяной ванне в течение 5 минут. Добавьте 3 мкл 100 мМ CaCl2 в каждый образец с помощью многоканальной пипетки. Аккуратно пипетку вверх и вниз 5 раз, сразу же верните трубки во влажную ледяную ванну и высиживайте в течение 30 минут.
  2. Добавьте 66 мкл стоп-буфера к каждому образцу и осторожно вихрь перемешайте. Инкубировать образцы в течение 10 мин при 37 °C в сухой ванне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять 1,5 пг гетерологической ДНК E. coli spike-in на образец в стоп-буфер. Добавление 1,5 пг ДНК e. coli приводит к 1000-10000 нанесенных на карту пиковых считываний для 1-10 миллионов отображенных экспериментальных чтений14. Пиковая ДНК используется для калибровки глубины секвенирования и особенно важна для сравнения образцов в серии. Добавление шиповой кишечной палочки настоятельно рекомендуется, но не является необходимым. Коммерческий комплект CUT&RUN включает в себя ДНК E. coli spike-in, но его также можно приобрести отдельно.
  3. Поместите трубки на магнитную стойку и перенесите 160 мкл супернатанта в микрофрагменную трубку объемом 1,5 мл. Передайте 80 мкл образца в новую микрофрагменную трубку объемом 2 мл и храните при -20 °C в случае необходимости резервного образца. Перейдите к шагу 10 с образцом объемом 80 мкл.

10. Очистка собранных образцов ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте шарики для очистки ДНК при комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием. Пречилл 100% изопропанол на льду. При смешивании образцов пипетку вверх и вниз 10 раз.

  1. Вихревые шарики для очистки ДНК для гомогенизации суспензии шарика. Добавьте 50 мкл (~0,6x объем образца) повторно суспендированных шариков к каждому образцу. Пипетку смешивают и инкубируют образцы на нутаторе в течение 5 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение бусин очистки ДНК к используемому образцу имеет решающее значение. Использование 0,6-кратного объема раствора гранулы очистки ДНК относительно образца позволяет магнитным шарикам связываться с большими фрагментами ДНК, высвобождаемыми из поврежденных ядер. Обогащенные CUT&RUN фрагменты ДНК намного меньше, чем эти большие фрагменты ДНК, и, таким образом, сохраняются в супернатанте на этом этапе.
  2. Поместите трубки на магнитную стойку и перенесите 130 мкл супернатанта, содержащего ДНК, в 8-трубочную полосу объемом 0,2 мл. Добавьте к образцу (образцам) дополнительные 30 мкл бусин для очистки ДНК (общий объем составляет 160 мкл).
  3. Добавьте 170 мкл (~1x объем образца) ледяного 100% изопропанола, хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз 10 раз, и инкубируйте на льду в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы 100% ледяной изопропанол использовался на этом этапе для очистки ШАРИКОВ ДНК для эффективного захвата небольших фрагментов, обогащенных CUT&RUN.
  4. Поместите трубки на магнитную стойку, и как только суспензия очистится, аккуратно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки.
  5. Пока трубки находятся на магнитной стойке, добавьте в трубки 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола комнатной температуры и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с. Осторожно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторите этот шаг в общей сложности две промывки с 80% этанолом.
  6. Быстро вращайте трубки со скоростью 100 × г, поместите трубки обратно на магнитную стойку и удалите остаток этанола с помощью пипетки после очистки суспензии. Высушите шарики на воздухе в течение 5 минут, пока трубки остаются на магнитной стойке с открытой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 5 минут времени сушки, так как это может значительно снизить конечный выход ДНК.
  7. Извлеките трубки из магнитной стойки и элюируйте ДНК из шариков, добавив 17 мкл 0,1x Tris-EDTA (TE) при рН 8. Хорошо перемешать и инкубировать пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Поместите трубки на магнитную стойку до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной. После того, как суспензия очистится, осторожно переложите 15 мкл супернатанта в стерильную ПЦР-трубку 0,2 мл.
  9. Измерьте концентрацию собранной ДНК с помощью флуорометра в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, концентрация собранной ДНК составляет ~1 нг/мкл. Иногда концентрация собранной ДНК слишком низка для количественной оценки с помощью флуорометра. Это не показатель неудачного эксперимента. Приступайте к подготовке библиотеки независимо от концентрации собранной ДНК.
  10. Перейдите к шагу 11 или храните образцы при температуре -20 °C до готовности.

11. Подготовка библиотеки к секвенированию

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги используют коммерчески доступный комплект для подготовки библиотеки. При выполнении шагов с использованием Ligation Master Mix минимизируйте прикосновение к трубкам и всегда держите их на льду.

  1. Используя 0,1x TE при рН 8, доведите общий объем ДНК CUT&RUN до 50 мкл. Составьте мастер-микс из 3 мкл end Prep Enzyme Mix и 7 мкл end Prep Reaction Buffer на образец. Добавьте 10 мкл мастер-микса в ДНК CUT&RUN и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 5 раз.
  2. Выполните быстрое вращение на 100 × г, чтобы собрать всю жидкость со сторон трубки. Поместите трубки в термоциклер с нагретой крышкой, установленной на ≥75 °C, и выполните условия цикла, указанные в таблице 7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от исходных входных концентраций ДНК, собранных на этапе 10, следуйте требуемому разбавлению адаптера из таблицы 8.
  3. Добавьте 2,5 мкл адаптера на образец и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы адаптер был добавлен к образцу и тщательно перемешан перед добавлением мастер-микса лигирования.
  4. Сделайте мастер-микс из 30 мкл Ligation Master Mix и 1 мкл Ligation Enhancer. Добавьте 31 мкл мастер-микса к образцу (образцам). Тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз.
  5. Инкубировать при 20 °C в течение 15 мин в термоциклере со снятой нагретой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы образцы хранились на льду и передавались в термоциклер только после того, как термоциклер достиг 20 °C.
  6. Выполните быстрое вращение при 100 × г, чтобы собрать всю жидкость со стороны трубки, добавьте 3 мкл фермента эксцизии урацила и инкубируйте трубки в термоциклере при 37 °C в течение 15 мин с нагретой крышкой, установленной на ≥47 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасный остановочный пункт; хранить образцы при температуре -20 °C или переходить непосредственно к шагу 11.7. Если вы продолжаете непосредственно этап 11.7, инкубируйте шарики очистки ДНК при комнатной температуре в течение 30 мин перед использованием.
  7. Добавьте 154,4 мкл (~1,6x объем образца) шариков очистки ДНК в реакцию лигирования адаптера с этапа 11.6. Пипетку смешивают и инкубируют образцы в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Поместите трубки на магнитную стойку и, как только суспензия очистится, аккуратно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки.
  9. Добавьте в пробирки 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола комнатной температуры и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с. Осторожно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки и повторите этот шаг в общей сложности две промывки с 80% этанолом.
  10. Вращайте трубки ненадолго при 100 × г. Поместите трубки обратно на магнитную стойку и удалите остаток этанола с помощью пипетки. Высушите шарики на воздухе в течение 5 минут, пока трубки остаются на магнитной стойке с открытой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 5 минут времени сушки, так как это может значительно снизить конечный выход ДНК.
  11. Извлеките трубки из магнитной стойки и элюируйте ДНК из шариков, добавив 17 мкл 0,1x TE при рН 8. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  12. Поместите трубки на магнитную стойку до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной. После того, как суспензия очистится, осторожно переложите 15 мкл супернатанта в стерильную ПЦР-трубку 0,2 мл.
  13. Сделайте мастер-микс из 25 мкл ДНК-полимеразной мастер-смеси и 5 мкл универсального амплификационного праймера прямой библиотеки (10 мкМ) на образец.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте один дополнительный образец мастер-микса для учета потерь при пипетке.
  14. Добавьте 30 мкл мастер-микса к 15 мкл образца ДНК, лигированного адаптером. Добавьте 5 мкл обратного однозначно индексированного библиотечного усилителя праймера (10 мкМ) к каждому образцу, чтобы довести конечный объем до 50 мкл. Тщательно перемешайте, дозируя вверх и вниз 10 раз. Выполнение условий циклирования ПЦР в таблице 9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте бусины для очистки ДНК при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием.
  15. Вихрь бусин очистки ДНК для повторного суспендирования. Добавьте 35 мкл (~ 0,7-кратный объем образца) повторно суспендированных шариков к образцам ДНК, амплифицированным ПЦР. Перемешайте и инкубируйте образцы на питателе в течение 5 мин при комнатной температуре.
  16. Поместите трубки на магнитную стойку и, как только суспензия очистится, перенесите супернатант, содержащий ДНК, в новую 8-луночную ленточную трубку ПЦР объемом 0,2 мл.
  17. Добавьте 119 мкл (~ 1,4-кратный объем образца) шариков к образцу и перемешайте, пипетируя вверх и вниз 5 раз. Инкубировать образцы на нутаторе в течение 5 мин при комнатной температуре.
  18. Поместите трубки на магнитную стойку и, как только суспензия очистится, аккуратно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки.
  19. Добавьте в пробирки 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола комнатной температуры и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с. Осторожно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки; повторите этот этап в общей сложности две промывки с 80% этанолом.
  20. Вращайте трубки ненадолго при 100 × г. Поместите трубки обратно на магнитную стойку и удалите остаток этанола с помощью пипетки. Высушите шарики на воздухе в течение 5 минут, пока трубки остаются на магнитной стойке с открытой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 5 минут времени сушки, так как это может значительно снизить конечный выход ДНК.
  21. Извлеките трубки из магнитной стойки и элюируйте ДНК из шариков, добавив 14 мкл 0,1x TE при рН 8. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  22. Поместите трубки на магнитную стойку до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной. После того, как суспензия очистится, осторожно переложите 13 мкл супернатанта в стерильную ПЦР-трубку 0,2 мл.
  23. Приготовьте свежий 1x Tris-borate-EDTA (TBE) и вставьте готовый, коммерческий 10% акриламид TBE гель в гель-электрофорезный аппарат, заполненный 1x TBE.
  24. В первую лунку добавьте 2 мкл низкодиапазонной лестницы ДНК. Смешайте 3 мкл 6-кратного нагрузочного красителя с 13 мкл образца, предварительно собранного на стадии 11.22. Осторожно добавьте 15 мкл в каждую лунку геля. Запускайте гель в течение 90 мин при 70 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оставлять одну лунку в геле пустой между каждым образцом, так как это снижает вероятность перекрестного загрязнения образца. Опытные пользователи могут счесть целесообразным использовать все скважины, тщательно избегая перекрестного загрязнения, особенно при обработке большого количества образцов.
  25. Снимите гелевую повязку с гелевой коробки. Откройте гелевую отливку в соответствии с инструкциями производителя, аккуратно извлеките гель из гелевой отливки и поместите его в лоток для удержания геля, содержащий 100 мл 1x TBE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно аккуратно удалите гель из гелевой повязки, чтобы избежать разрыва геля, так как он тонкий и хрупкий. Очень важно предварительно использовать перчатки и гель с 1x TBE при работе с гелем. Лоток для удержания геля должен быть немного больше размера геля (примерно 0,5 дюйма с каждой стороны). Пластиковые крышки, поставляемые с 96-луночными ящиками для хранения ПЦР-трубок, являются удобными лотками для хранения стандартных размеров мини-геля.
  26. Добавьте 10 мкл гелевого пятна нуклеиновой кислоты в лоток и аккуратно закрутите. Накрыть фольгой для защиты от света и статически инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин.
  27. Дважды промойте гель 100 мл деионизированной водопроводной воды. Изобразите гель под синей подсветкой с помощью янтарной крышки фильтра (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешные библиотеки показывают мазок между 100 и 500 bp. Также будет видный ~ 125 адаптер димерной полосы. Наличие переходных димеров не является показателем низкого качества библиотеки. Такое количество димеров адаптера неизбежно для экспериментов CUT&RUN, выполняемых на TF с низким содержанием, и является следствием низкого количества входного материала, используемого для подготовки этих библиотек. Не используйте ультрафиолетовый свет, который может повредить ДНК.
  28. Как показано на рисунке 2, для каждой библиотеки отрежьте гель немного выше ~125 bp заметной димерной полосы адаптера (избегая прикосновения к димерной полосе адаптера) и ниже отметки лестницы 400 bp.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать диапазона димеров адаптера ~125. Даже небольшое количество димеров адаптера значительно снизит качество библиотеки.
  29. Проколите дно трубки объемом 0,65 мл с помощью иглы весом 22 г и поместите проколотую трубку внутрь стерильной микрофьюжной трубки объемом 2 мл. Переложите ломтик геля в проколотую трубку внутри микрофьюжной трубки объемом 2 мл.
  30. Центрифугируйте микрофрагменную трубку объемом 2 мл, содержащую проколотую трубку объемом 0,65 мл и образец при 10 000 × г при комнатной температуре в течение 2 мин, чтобы собрать гелевую суспензию внутри микрофьюжной трубки объемом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проколотая трубка теперь должна быть пустой и может быть выброшена. Если в проколотой трубке все еще остается гель, поместите проколотую трубку обратно внутрь микрофьюжной трубки объемом 2 мл и снова центрифугируйте при 10 000 × г при комнатной температуре еще на 2 мин.
  31. К гелевой суспензии внутри микрофьюжной пробирки объемом 2 мл добавляют 300 мкл ледяного геля с элюированием Buffer и перемешивают на нутризаторе при комнатной температуре не менее 3 ч или на ночь (12-16 ч).
  32. Переложите всю жидкую и гелевую суспензию в фильтрующую колонну размером 0,22 мкм. Центрифуга по 10 000 × г при комнатной температуре в течение 1 мин; собранный объем должен быть ~300 мкл.
  33. Добавьте 450 мкл (~ 1,5-кратный объем образца) бусин для очистки ДНК, инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут на нутаторе, а затем поместите образец на магнитную стойку, пока суспензия не станет прозрачной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте бусины для очистки ДНК при комнатной температуре в течение 30 минут перед использованием.
  34. Удалите и выбросьте 500 мкл супернатанта, убедившись, что они не разрушают бусины.
  35. Извлеките образец из магнитной стойки и перемешайте шарики, пипеткой вверх и вниз 5 раз. Перенесите 200 мкл образца в новую пробирку для полосы ПЦР.
  36. Поместите ленточную трубку на магнитную стойку, и как только суспензия очистится, аккуратно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки.
  37. Добавьте в пробирки 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола комнатной температуры и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с. Осторожно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки; Повторите этот шаг в общей сложности две промывки с 80% этанолом.
  38. Вращайте трубки ненадолго при 100 × г. Поместите трубки обратно на магнитную стойку и удалите остаток этанола с помощью пипетки. Высушите шарики на воздухе до 5 минут, пока трубки остаются на магнитной стойке с открытой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 5 минут времени сушки, так как это может значительно снизить конечный выход ДНК.
  39. Извлеките трубки из магнитной стойки и элюируйте ДНК из шариков, добавив 17 мкл 0,1x TE при рН 8. Хорошо перемешать и инкубировать пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре.
  40. Поместите трубки на магнитную стойку до тех пор, пока суспензия не станет прозрачной. После того, как суспензия очистится, осторожно переложите 15 мкл супернатанта в стерильную ПЦР-трубку 0,2 мл.
  41. Измерьте конечное количество библиотеки с помощью флуорометра; используйте эту окончательную библиотеку для виртуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До 48 библиотек могут быть объединены и секвенированы вместе в одну полосу с помощью платформы секвенирования, которая обеспечивает не менее 300 миллионов 40 бит/с или более парных считываний.

12. Анализ последовательности CUT&RUN

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе представлен вычислительный протокол, используемый для анализа данных последовательности CUT&RUN. Протокол начинается с настройки вычислительной виртуальной среды и проводит пользователей через выполнение команд на их локальном компьютере. Этот протокол будет работать на всех вычислительных ресурсах, таких как локальные машины, виртуальные облачные серверы и высокопроизводительные вычислительные кластеры. Со всеми данными CUT&RUN, представленными в этом документе, можно ознакомиться на сайте NCBI GEO под номером присоединения GSE193803.

  1. Загрузите исходный код анализа CUT&RUN с https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс будет работать лучше всего на системе MacOS или Linux OS. Пользователи Windows могут запускать рабочий процесс с помощью GitBash (см. Таблицу материалов).
    1. Непосредственно загрузите код со страницы GitHub, нажав на зеленую кнопку Code | Скачать ZIP опцию. Распакуйте папку в нужное место на локальном компьютере.
  2. Установите среду Conda (см. Таблицу материалов) и запустите ее только один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий процесс использует среду инструментов командной строки Conda для установки всего необходимого программного обеспечения и средств.
  3. После установки Conda (запуска только один раз) создайте виртуальную среду с помощью дополнительного файла 2 , снабженного следующей командой:
    conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
  4. Активируйте виртуальную среду каждый раз, когда этот рабочий процесс должен выполняться, используя:
    conda activate
  5. Организуйте входные необработанные файлы FASTQ в одну папку, в идеале одну папку для каждого эксперимента CUT&RUN.

13. Генерация файла генома для выравнивания

  1. Сгенерируйте файл генома для выравнивания (запустите только один раз для каждого файла генома). Создайте папку для сохранения всех файлов генома C. albicans , таких как:
    мкдир ca_genome_files

14. Загрузка сборки генома C. albicans 21

  1. Загрузите сборку генома C. albicans 21 из базы данных генома Candida с помощью инструментов wget или curl (см. Таблицу материалов)18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка C . albicans 21 была использована здесь для сравнения результатов CUT&RUN с ранее опубликованными результатами ChIP-чипа, которые были согласованы со Сборкой 21. Пользователи могут загружать другие версии сборок и выполнять аналогичные команды для создания соответствующих файлов генома для своих потребностей в выравнивании.

15. Создание индексной базы данных Bowtie 2 (имя базы данных: ca21)

  1. Используйте следующее:
    галстук-бабочка2-сборка C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    галстук-бабочка2-осмотр -s ca21

16. Запустите конвейер анализа CUT&RUN

  1. Прочитайте раздел справки, чтобы ознакомиться с параметрами конвейера.
    bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. Выполните cut_n_run_pipeline.sh файл с соответствующими параметрами

  1. Выполните скрипт:
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующие параметры с подробным описанием в строках 19-36 кода описаны на странице GitHub https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh.

18. Организация выходных файлов

  1. Объедините значимые пики из всех реплик, вызываемых MACS2, расположенных в /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 с помощью функции слияния BedTools19.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o последний,средний,первый,средний,средний,средний,средний,средний > /путь/к/merged_output.bed
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации и передовой практики по оценке перекрывающихся пиков в реплицированных образцах просьба обратиться к Landt et al.20 и Boyd et al.21.

19. Удаление совпадений с заблокированными геномными областями с помощью функции вычитания BedTools

  1. Используйте следующее: вычтитеBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    ПРИМЕЧАНИЕ: Области, включенные в черный список в геноме C. albicans , представлены в виде файла .bed в дополнительном файле 3. Список состоит в основном из сильно повторяющихся элементов последовательности и областей, таких как теломерные повторы и центромеры, которые обычно дают ложноположительные результаты в наборах данных C. albicans CUT & RUN, ChIP-seq и ChIP-чипа. Следовательно, рекомендуется удалить области, включенные в черный список. Однако для определенных белковых мишеней исключение этих локусов может быть неуместным или нежелательным. Пользователи могут пропустить этот шаг, чтобы сохранить сигналы, содержащиеся в этих областях черного списка, или создать свои собственные области, включенные в черный список.

20. Объединение файлов BigWig из реплик с помощью функции UCSC bigWigMerge22

  1. Используйте следующее: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. Преобразуйте выходные данные BedGraph из bigWigMerge в BigWig с помощью функции UCSC bedGraphToBigWig.
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот надежный протокол CUT&RUN был адаптирован и оптимизирован для исследования общегеномной локализации специфических ТФ в биопленках C. albicans и планктонных культурах (см. Рисунок 2 для обзора экспериментального подхода). Тщательный конвейер анализа данных также включен для облегчения анализа полученных данных секвенирования CUT&RUN и требует от пользователей минимального опыта в кодировании или биоинформатике (см. Рисунок 3 для обзора конвейера анализа). В отличие от методов ChIP-чипа и ChIP-seq, CUT&RUN осуществляется с использованием интактных, пермеабилизированных ядер, полученных из значительно уменьшенного числа входных ячеек, без сшивания формальдегида. Выделение интактных ядер из сферопластов C. albicans является критическим шагом в протоколе. Эффективное сферопластирование путем переваривания клеточной стенки C. albicans с использованием литиказы может быть сложной задачей, поскольку условия реакции ферментативного пищеварения должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. Таким образом, чтобы обеспечить успешный эксперимент CUT&RUN с высококачественными результатами секвенирования, включен ранний этап контроля качества, а наличие интактных ядер проверяется с помощью стандартного флуоресцентного микроскопа.

Пищеварение клеточной стенки и ядерная целостность регулярно оцениваются путем визуализации как контрольных интактных клеток, так и изолированных ядер, окрашенных флуоресцентной клеточной стенкой и пятнами нуклеиновых кислот. В отличие от изолированных интактных ядер, где окрашивание клеточной стенки не наблюдается, и ядра, и клеточные стенки флуоресцентно мечено мечены в интактных контрольных клетках (рисунок 4А). Наконец, перед секвенированием распределение размеров фрагментов библиотек CUT&RUN оценивается с помощью инструмента капиллярного электрофореза. Этот шаг контроля качества является надежным показателем при оценке качества библиотек CUT&RUN. Как видно из следа электрофореза на верхней панели рисунка 4B, успешные библиотеки, созданные для экспериментов, исследующих TF, показывают высокое обогащение для фрагментов менее 280 bp. След электрофореза на нижней панели рисунка 4B представляет результаты неудачного эксперимента CUT&RUN.

Здесь пик в ~ 2000 bp возник в основном из непереваренной ДНК, выпущенной из ядер, сильно поврежденных или сломанных во время эксперимента CUT&RUN. Оценка распределения размеров фрагментов конечных библиотек пула также рекомендуется для подтверждения полного удаления загрязняющих димеров адаптера (рисунок 4C). Как правило, 5-10 миллионов парных считываний (~ 40 базовых длин чтения) на библиотеку обеспечивают достаточную глубину секвенирования для большинства экспериментов TF CUT&RUN в C. albicans. Альтернативные длины чтения секвенирования, сопряженные или односторонние, могут использоваться для секвенирования библиотек CUT&RUN. Например, сопряженное чтение длиной от 25 до 150 бит в секунду не должно влиять на качество результатов. Односторонние считывания, превышающие или равные 150 битам в секунду, также должны работать для экспериментов TF CUT&RUN. Однако сопутствующий конвейер анализа данных должен быть изменен для размещения односторонних операций чтения.

Этот протокол CUT&RUN и сопутствующий конвейер анализа данных были проверены путем исследования двух TF, Ndt80 и Efg1, которые контролируют образование биопленки C. albicans . Как показано на рисунке 4D, Ndt80 связан в межгенных областях (выделенных черными полосами, указывающими на значительно обогащенные локусы ChIP-чипа Ndt80) вверх по течению от EFG1 ORF. Ранее было показано, что эта межгенная область выше по течению EFG1 высоко обогащена для связывания Ndt80 во время формирования биопленки ChIP-чипом4. Тем не менее, эксперименты CUT&RUN выявили значительно больше пиков в этом регионе, чем эксперименты с ChIP-чипами (10 пиков против 4 пиков). Мотивы связывания ДНК Ndt80 обогащаются во всех локусах, связанных с Ndt80, идентифицированных CUT&RUN (дополнительный рисунок 1), что указывает на то, что дополнительные пики, идентифицированные этой методологией, вероятно, являются добросовестными сайтами, связанными с Ndt80. Систематический сравнительный анализ показал, что представленный протокол CUT&RUN успешно идентифицировал большинство ранее известных событий связывания для Ndt80 и Efg1 во время формирования биопленки4 (рисунок 5).

Кроме того, многие новые события связывания TF, которые не были зафиксированы в ранее опубликованных экспериментах с ChIP-чипом, были идентифицированы с помощью CUT&RUN (рисунок 5). В целом, как Ndt80, так и Efg1 связаны с перекрытием локусов с ранее опубликованными данными ChIP-чипа и локусами, идентифицированными только с помощью метода CUT&RUN (перекрытия между этими данными CUT&RUN и ранее опубликованными данными ChIP-чипа для Ndt80 и Efg1 обобщены на диаграммах Венна на рисунке 5). Кроме того, доля считываний в пределах значительно называемых пиков (оценки FRiP) была последовательно выше в образцах, помеченных GFP, чем в их контрольных образцах IgG (см. Дополнительный рисунок 2). Таким образом, эти результаты показывают, что протокол CUT&RUN, описанный здесь, является надежным методом, оптимизированным для исследования связывающих взаимодействий TF-ДНК C. albicans из образцов с низким содержанием.

Figure 1
Рисунок 1: Эпитопная маркировка C. albicans TF. (A) Идентифицировать интересующий ген TF (NDT80 в данном случае) и выбрать гРНК для нацеливания на разрезание Cas9 (представленного оранжевой формой) на 3'-конце ORF. (B) Оптимизированный для клады Candida eGFP с гомологией >50 bp вверх и вниз по течению от места разреза обеспечит dDNA для восстановления DSB. (C) Использовать колониальную ПЦР для скрининга отдельных колоний для подтверждения предполагаемой интеграции. Грунтовки обозначены красными стрелками, а ампликоны обозначены пунктирными полями. Этот рисунок был создан с использованием BioRender.com. Сокращения: TF = транскрипционный фактор; гРНК = направляющая РНК; ORF = открытый кадр считывания; eGFP = усиленный зеленый флуоресцентный белок; DSB = двухцепочечный разрыв; США = вверх по течению; DS = нисходящий поток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Схематический обзор экспериментального протокола CUT&RUN. Клетки C. albicans, собранные из биопленки или условий планктонной культуры, проникают для выделения интактных ядер. Бусины ConA активируются, и интактные ядра затем связываются с активированными бусинами ConA. Интересующее антитело добавляют к связанным с шариками ядрам и инкубируют при 4 °C. Далее добавляют pAG-MNase и позволяют связываться с целевым антителом. После добавленияCaCl2 активируется pAG-MNase, и целенаправленное переваривание хроматина продолжается до добавления хелатирующего реагента к инактивации pAG-MNase. Комплекс антител, связанный с pAG-MNase, диффундирует из пермеабилизированных ядер, и полученная ДНК извлекается и очищается. Библиотеки секвенирования готовятся из фрагментов ДНК, обогащенных CUT&RUN, и полученные библиотеки затем запускаются на 10% геле PAGE для разделения и удаления загрязняющих димеров адаптера перед секвенированием. Этот рисунок был создан с использованием BioRender.com. Сокращения: CUT&RUN = расщепление под мишенями и высвобождение с помощью нуклеазы; ConA = конканавалин А; PAGE = электрофорез полиакриламидного геля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схематический обзор конвейера анализа данных CUT&RUN. Рабочий процесс начинается с проверки качества необработанных файлов FASTQ с помощью FastQC с последующей обрезкой для удаления адаптеров виртуализации. Обрезанные показания затем выравниваются по эталонному геному, а выровненные показания фильтруются на основе их размера, чтобы обогатить сигналы связывания размером с TF (20 bp ≤ выровненное чтение ≤ 120 bp). Выбранные по размеру показания затем калибруются по показаниям Escherichia coli , а калиброванные показания используются для вызова пиков с помощью MACS2. Символ <> является визуальным представлением, указывающим на то, что количество считываний C. albicans было откалибровано с использованием счетчиков считывания E. coli для каждого образца. Сокращения: CUT&RUN = расщепление под мишенями и высвобождение с помощью нуклеазы; TF = транскрипционный фактор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Этапы контроля качества, критически важные для успешных экспериментов CUT&RUN. (A) Клетки окрашиваются флуоресцентными пятнами клеточной стенки (синий) и нуклеиновыми кислотами (зеленый) до и после выделения ядер и визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа. (B) Библиотеки CUT&RUN TF анализируются с помощью инструмента капиллярного электрофореза. Успешные библиотеки CUT&RUN TF (обозначенные зеленой галочкой) обогащаются короткими фрагментами размером менее 200 бит в секунду. Субоптимальные библиотеки CUT&RUN TF (обозначенные красным «X») показывают обогащение для больших фрагментов ДНК. (C) 48 библиотек CUT&RUN объединяются вместе и анализируются с помощью инструмента капиллярного электрофореза. Высококачественные объединенные библиотеки (обозначенные зеленой галочкой) свободны от димеров адаптера (полоса 1), в то время как низкокачественные объединенные библиотеки (обозначенные красной буквой «X») сохраняют небольшое количество димеров адаптера (полоса 2). (D) Репрезентативные треки IGV из наборов данных CUT&RUN (включая контроль Ndt80 IgG, нижний трек), показывающие значительное обогащение для связывания Ndt80 (верхний трек) в межгенной области вверх по течению EFG1 ORF (Orf19.610). Черные полосы представляют собой значительно обогащенные пики связывания Ndt80, выявленные ранее опубликованными экспериментами ChIP-чипа4. Синие полосы представляют собой значительно обогащенные пики связывания Ndt80, выявленные в экспериментах CUT&RUN, представленных здесь. Шкала стержней = 50 мкм (А). Сокращения: CUT&RUN = расщепление под мишенями и высвобождение с помощью нуклеазы; TF = транскрипционный фактор; GFP = зеленый флуоресцентный белок; ORF = открытый кадр чтения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Оценка обогащенных Ndt80 и Efg1 пиков, идентифицированных с использованием представленного протокола CUT&RUN и конвейера анализа данных о биопленках Candida albicans . Диаграммы Венна в верхней строке иллюстрируют степень перекрытия между сайтами связывания Ndt80 и Efg1, идентифицированными с помощью CUT&RUN с ранее опубликованными данными ChIP-чипа4. Сигналы CUT&RUN для всех событий привязки для Ndt80 и Efg1 отображаются в нижней строке в виде цветных тепловых карт (красный = высокий пиковый сигнал; синий = низкий/непиковый сигнал; цветная полоса указывает на сигнал IgG, вычитаемый из сигнала GFP); На тепловых картах отображается 1 000 областей bp вверх по течению (-1,0 kb) и вниз по течению (+1,0 kb). Интенсивность сигнала (т.е. обогащение) в виде графика профиля показана над тепловыми картами. Три биологические реплики для Ndt80 и Efg1 были оценены для визуализации обогащения CUT&RUN. Сокращения: ChIP = иммунопреципитация хроматина; CUT&RUN = расщепление под мишенями и высвобождение с помощью нуклеазы; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Реакционная смесь ПЦР и условия циклического цикла ПЦР для амплификации универсальных фрагментов А и уникальных В. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Реакционная смесь ПЦР и условия цикла ПЦР для сшивания фрагментов А и В для создания полноразмерного фрагмента С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 3: Условия цикла ПЦР для амплификации полноразмерного С-фрагмента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 4: Смесь реакций ПЦР и условия циклического цикла ПЦР для амплиации метки GFP донорской ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 5: Смесь реакций переваривания плазмид и условия реакции для реакций плазмидного пищеварения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 6: Реакционная смесь ПЦР и условия циклического цикла ПЦР для колониальной ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 7: Условия цикличности ПЦР для этапа окончательного ремонта библиотеки в рамках подготовки к секвенированию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 8: Рекомендации по разбавлению адаптеров для входной ДНК для подготовки библиотек секвенирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 9: Условия цикла ПЦР для амплификации ДНК, лигированной адаптером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: Обогащение мотива ДНК-связывающей последовательности Ndt80. Кумулятивные оценки обогащения мотивов Ndt80 для локусов, связанных с Ndt80, идентифицированных в данных биопленки ChIP-чипа (темно-синяя пунктирная линия) или данных CUT&RUN (светло-синяя пунктирная линия) по сравнению со случайными межгенными локусами (красная пунктирная линия). Левая ось Y указывает процент от общего числа локусов для каждого набора данных, содержащего соответствующую кумулятивную оценку мотива по оси X. Пунктирные линии указывают на значимость обогащения балла мотива (-log10 P-значение, правая ось Y) в каждой точке по оси X, относительно случайных межгенных контрольных локусов. Кумулятивные оценки мотивов и P-значения были определены с помощью MochiView23 (см. Таблицу материалов). Все локусы, связанные с Ndt80, были отобраны в виде окон 500 bp, центрированных под каждым пиком связывания Ndt80 в наборах данных ChIP-чипа и CUT&RUN, и сравнивались со случайно выбранными межгенными локусами 500 bp для контроля различий в длине. Сокращения: ChIP = иммунопреципитация хроматина; ChIP-чип = иммунопреципитация хроматина с последующим микрочипом; CUT&RUN = расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Доля считываний в пределах пиковой оценки на выборку. Штриховый график с оценкой FRiP для каждой реплики. Оценки FRiP рассчитываются как количество сопоставленных считываний в пределах пика, деленное на общее количество сопоставленных считываний в выборке CUT&RUN. Различные цвета полос представляют отдельные биологические реплицированные образцы, как указано вдоль оси X. Как и ожидалось, оценки FRiP положительных образцов GFP неизменно выше, чем у отрицательных образцов IgG. Все образцы показывают приемлемые пороговые значения FRiP (>1%), в соответствии с рекомендациями, установленными Landt et al.20. Сокращения: FRiP = доля считывания в пределах пика; CUT&RUN = расщепление под мишенями и высвобождение с использованием нуклеазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Рецепты для всех используемых буферов и растворов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Биоинформационные инструменты, необходимые для конвейера анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Рекомендуемые области блокировки в геноме C. albicans . Этот список локусов, включенных в черный список, в основном содержит очень повторяющиеся элементы последовательности и области, такие как теломерные повторы и центромеры, которые исторически давали ложноположительные результаты в предыдущих экспериментах по связыванию генома. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол представляет собой комплексный экспериментальный и вычислительный конвейер для общегеномной локализации регуляторных TF в C. albicans. Он разработан, чтобы быть очень доступным для всех, кто имеет стандартную подготовку в области микробиологии и молекулярной биологии. Используя высокий динамический диапазон и низкие требования к входным образцам анализа CUT&RUN и включая оптимизацию для локализации взаимодействий связывания TF-ДНК в биопленке C. albicans и планктонных культурах, этот протокол представляет собой мощную и недорогую альтернативу традиционным подходам ChIP-seq. По сравнению с ChIP-seq, CUT&RUN дает значительно более высокую чувствительность, с более высокой долей считывания секвенирования, сопоставленных с связанными пиками, более поддается высокой пропускной способности, требует значительно более низкого числа входных ячеек, не требует использования токсичных сшивающих агентов и требует в десять раз меньше секвенирования считывания на образец для получения высококачественных результатов 13,14,17, 23,24. Чтобы еще больше снизить стоимость одного образца этого протокола, рецепты буферов и сред включены вместе с подробным списком реагентов, чтобы облегчить внутреннюю подготовку всех необходимых буферов и сред, а также массовый источник основных реагентов. Поскольку образование биопленки C. albicans, фенотипическое переключение и комменсализм регулируются сложными переплетенными транскрипционными сетями26, этот надежный, поверхностный и экономически эффективный протокол CUT&RUN обеспечивает мощный новый инструмент для понимания этих и многих других клеточных процессов в этом важном грибковом патогене человека.

TF не так многочисленны, как гистоны или другие хроматин-ассоциированные белки, что создает уникальную проблему для исследования связывающих взаимодействий TF-ДНК через CUT & RUN. Для решения этой проблемы были внесены критические корректировки и оптимизации в стандартный экспериментальный протокол CUT&RUN13. Поскольку большинство успешных экспериментов CUT&RUN, нацеленных на TF, дают небольшое количество ДНК, которое слишком разбавлено для количественной оценки и часто обогащается фрагментами размером менее 150 bp13,23, условия реакции подготовки библиотеки также были оптимизированы в пользу этих меньших фрагментов27. Даже на этом этапе оптимизации полученные ПЦР-амплифицированные библиотеки содержат значительную долю адаптерных димеров, которые не полностью удаляются с помощью методов выбора размера ДНК на магнитной основе шариков. Для решения этой проблемы был включен этап выбора размера геля PAGE для создания окончательных библиотек, готовых к секвенированию, которые в значительной степени лишены димеров адаптера. Это критический шаг протокола, так как удаление димеров адаптера при сохранении меньших фрагментов CUT&RUN, полученных из TF, имеет важное значение для получения высококачественных результатов.

Кроме того, подробный вычислительный конвейер фильтрует данные секвенирования, чтобы сосредоточиться на меньших считываниях, полученных из взаимодействий связывания TF-ДНК в анализе CUT&RUN. Из-за этих TF-специфических корректировок этот протокол не рекомендуется для профилирования больших хроматин-ассоциированных комплексов, таких как нуклеосомы. Хотя теоретически возможно адаптировать протокол для этой цели, следуя стандартному протоколу подготовки библиотеки, включенному в коммерчески доступный комплект подготовки библиотек, пользователю необходимо будет скорректировать выбор размера постсеквенирования, включенный в вычислительный конвейер. В частности, в разделе фильтрации размеров в cut_n_run_pipeline.sh файла кода пользователям необходимо будет заменить текущее значение «14400» (120 bp * 120 bp) квадратом желаемой длины фрагмента, чтобы позволить конвейеру анализа анализировать результаты секвенирования, генерируемые для других типов связывающих взаимодействий хроматин-ДНК.

Еще один ключевой шаг в успешном эксперименте CUT&RUN включает в себя выбор оптимальных параметров анализа данных постсеквенирования. Хотя большая часть вычислительного конвейера спроектирована таким образом, чтобы быть стандартизированной и применимой к изучению любого нормативного TF, представляющего интерес для C. albicans, есть два важных соображения, которые пользователь должен оценить при запуске конвейера. Первое соображение заключается в том, следует ли включать или удалять дубликаты считывания из данных виртуализации до идентификации связанных целевых сайтов. Поскольку TF с низким содержанием обычно дают данные секвенирования, содержащие значительный процент считываний, полученных в результате дублирования ПЦР на этапе амплификации библиотеки, удаление дубликатов ПЦР может оказать значительное негативное влияние на результаты. Однако при большом количестве ТФ или хроматин-ассоциированных белков дубликаты ПЦР обычно представляют собой меньшую часть от общего числа считываний и часто удаляются для подавления фонового шума в данных. В конечном счете, это решение о сохранении или удалении дубликатов ПЦР зависит от интересующего ТФ и глубины полученных данных секвенирования. Таким образом, конвейер автоматически генерирует независимые выходные файлы для данных, полученных с дублированием чтения ПЦР или без него, поэтому пользователь может решить, какие выходные файлы дают наилучшие результаты для каждого эксперимента.

Второе соображение заключается в том, следует ли выявлять и удалять проблемные локусы, которые дают значительное, но очень изменчивое обогащение как в экспериментальных (антитело против интересующего белка), так и в отрицательных контрольных (IgG) образцах. Алгоритм пикового вызова использует MACS2 для идентификации значительно обогащенных локусов как в экспериментальных, так и в контрольных образцах и исключает те, которые появляются в обоих. Хотя этот подход обычно устраняет большинство проблемных локусов, некоторые из них иногда появляются как значительные пики в определенных экспериментах, хотя предыдущий опыт показывает, что они вряд ли являются истинными положительными местами обогащения TF. Таким образом, предусмотрен необязательный этап фильтрации для удаления этих проблемных локусов, называемых «заблокированными» локусами. Список локусов, включенных в черный список, в основном содержит очень повторяющиеся элементы последовательности и области, такие как теломерные повторы и центромеры, которые исторически давали ложноположительные результаты в предыдущих анализах связывания всего генома. Это очень консервативный список локусов, назначенных как проблемные с высокой степенью достоверности. Однако каждый пользователь должен оценить, подходит ли этот фильтр для его эксперимента (экспериментов) в каждом конкретном случае. Потенциальной альтернативой отрицательному контролю IgG было бы выполнение CUT&RUN против ядерно-локализованного белка, который не связывает ДНК. Было показано, что этот подход является идеальным элементом управления для экспериментов ChIP28, и аналогичный подход стоит рассмотреть для CUT&RUN.

CUT&RUN стал популярным выбором для исследования белково-ДНК-взаимодействий у высших эукариот и модельных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Здесь он был успешно адаптирован для исследования общегеномных взаимодействий связывания TF-ДНК в клинически значимом грибковом патогене C. albicans. Этот протокол предоставляет подробные методы для всех необходимых экспериментальных и вычислительных процедур, от разработки штаммов, которые выражают метки эпитопных TF, до вычислительного анализа полученных данных секвенирования CUT & RUN. В целом, этот протокол и сопутствующий конвейер анализа данных создают надежные профили связывания TF-ДНК, даже при использовании сложных многоморфных популяций клеток, выделенных из образцов биопленки с низким содержанием, и обеспечивают превосходное качество данных при более низких общих затратах, чем методологии ChIP-seq.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Кларисса Нобиле является соучредителем BioSynesis, Inc., компании, занимающейся диагностикой и терапией инфекций биопленки.

Acknowledgments

Мы благодарим всех бывших и нынешних членов лабораторий Nobile и Hernday за отзывы о рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (NIH) Национального института общих медицинских наук (NIGMS) под номером R35GM124594 и семьей Камангаров в виде наделенной кафедры C.J.N. Эта работа также была поддержана Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний NIH (NIAID) с присвоением номера R15AI137975 A.D.H.C.L.E. была поддержана стипендией Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований NIH (NIDCR) F31DE028488. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не отражает точку зрения спонсоров. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования; в сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи; или в решении опубликовать результаты.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Millipore Sigma SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes VWR 490003-190
1 M CaCl2 Fisher Scientific 50-152-341
1 M PIPES Fisher Scientific AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates Corning 351143
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich 60-24-2
2% Digitonin Fisher Scientific CHR103MI
50 mL conical tubes VWR 89039-658
5x phusion HF buffer Fisher Scientific F530S Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar Criterion C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads Beckman Coulter A63880
Agilent Bioanalyzer Agilent G2939BA Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific VWR 89133-910
Bacto peptone BD Biosciences 211677
Benchling primer design tool Benchling https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine Fisher Scientific AAJ77507AB
Calcofluor white stain Sigma-Aldrich 18909-100ML-F
Candida Genome Database http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads Polysciences  86057-3
Conda software https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit Epicypher 14-1048 Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) New England Biolabs N0447S
Dextrose (D-glucose) Fisher Scientific D163
Difco D-mannitol  BD Biosciences 217020
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x) Fisher Scientific R0611
DreamTaq green DNA polymerase Fisher Scientific EP0713 Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer Fisher Scientific EP0713 Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA Epicypher 18-1401
ELMI Microplate incubator ELMI TRMS-04 Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof VWR 89125-170
FastDigest MssI Fisher Scientific FD1344 Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer Fisher Scientific FD1344 Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400 Fisher BioReagents BP525-25
Fluorescence microscope User-dependent
Gel electrophoresis apparatus User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder Fisher Scientific FERSM1192
GitBash workflow https://gitforwindows.org/
GitHub source code https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5 Boston BioProducts BBH-75-K
High-speed centrifuge User-dependent
Isopropanol Sigma-Aldrich PX1830-4
Lens paper VWR 52846-001
Ligation Enhancer Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate MP Biomedicals 215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody Takara 632592 User-dependent
MACS2 https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes Epicypher 10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes Fisher Scientific MR02
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer BioTek EPOCH2TC Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS Sigma-Aldrich M3183
NaCl VWR 470302-522
NaOH Fisher Scientific S318-500
NCBI GEO https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1) New England Biolabs E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit New England Biolabs E7645S Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT) Goldbio N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well Fisher Scientific EC62755BOX
Nutating mixer VWR 82007-202
Nutrient broth Criterion C6471
pADH110 Addgene 90982 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119 Addgene 90985 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137 Addgene 90986 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139 Addgene 90987 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140 Addgene 90988 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase Epicypher 15-1016 or 15-1116 50 rxn or 250 rxn
pCE1 Addgene 174434 Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid Fisher Scientific FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase Fisher Scientific F530S Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350 VWR 10791-816
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit Invitrogen Q33230
Qubit fluorometer Life Technologies Q33216 Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody Epicypher 13-0042
RNase A Sigma-Aldrich 10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets Sigma-Aldrich 5056489001
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Shaking incubator Eppendorf M12820004 User-dependent
Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters Fisher Scientific 07-200-385
Sterile inoculating loops VWR 30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain Fisher Scientific S11494
SYTO 13 nucleic acid stain Fisher Scientific S7575 Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler User-dependent
ThermoMixer C Eppendorf 5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Sigma-Aldrich 252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution Invitrogen 15632011
USER Enzyme Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer VWR 10153-834
wget tool http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
Yeast extract Criterion C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme) Fisher Scientific NC0439194

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  2. Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).
  3. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).
  4. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  5. Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches. Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).
  6. Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch. Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species. eLife. 10, 64682 (2021).
  8. Lohse, M. B., Johnson, A. D. Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).
  9. Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. Genetics and molecular biology in Candida albicans. Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).
  10. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).
  11. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
  12. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
  13. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
  14. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  15. Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans. American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).
  16. Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response. Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).
  17. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
  18. Skrzypek, M. S., et al. The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  21. Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors. BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).
  22. Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets. Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).
  23. Homann, O. R., Johnson, A. D. MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis. BMC Biology. 8, 49 (2010).
  24. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).
  25. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
  26. Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).
  27. Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. CUT&RUNTools: a flexible pipeline for CUT&RUN processing and footprint analysis. Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).
  28. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).

Tags

Биология Выпуск 182 Candida albicans CUT&RUN факторы транскрипции методы связывания всего генома транскрипционная регуляция
Геномное профилирование транскрипционно-ДНК-связывающих взаимодействий в <em>Candida albicans</em>: комплексный метод CUT&amp;RUN и рабочий процесс анализа данных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A.,… More

Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Paropkari, A. D., Ennis, C. L., Sindi, S. S., Nobile, C. J., Hernday, A. D. Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (182), e63655, doi:10.3791/63655 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter