Candida albicans'ta Transkripsiyon Faktörü-DNA Bağlanma Etkileşimlerinin Genom Çapında Profillenmesi: Kapsamlı Bir CUT&RUN Yöntemi ve Veri Analizi İş Akışı

Summary

Bu protokol, insan mantar patojeni Candida albicans'ta nükleaz (CUT&RUN) kullanarak hedefler altında bölünme ve salınım için deneysel bir yöntem ve veri analizi iş akışını açıklamaktadır.

Abstract

Düzenleyici transkripsiyon faktörleri, hücresel farklılaşma, çevresel pertürbasyonlara ve streslere verilen tepkiler ve konakçı-patojen etkileşimleri dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik süreci kontrol eder. Düzenleyici transkripsiyon faktörlerinin DNA'ya genom çapında bağlanmasının belirlenmesi, bu genellikle karmaşık biyolojik süreçlerde transkripsiyon faktörlerinin işlevini anlamak için esastır. Hedefler altında bölünme ve nükleaz (CUT&RUN) kullanılarak salınım, geleneksel ve yaygın olarak kullanılan kromatin immünopresipitasyonuna ve ardından dizileme (ChIP-seq) yöntemine çekici bir alternatif olan in vivo protein-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında haritalanması için modern bir yöntemdir. CUT&RUN, daha yüksek verimli bir deneysel kuruluma uygundur ve ChIP-seq'ten daha düşük numune başına sıralama maliyetleri ile önemli ölçüde daha yüksek bir dinamik aralığa sahiptir. Burada, insan mantar patojeni Candida albicans'taki transkripsiyon faktörü-DNA bağlanma etkileşimlerinin genom çapında analizi için uyarlanmış kapsamlı bir CUT&RUN protokolü ve beraberindeki veri analizi iş akışı açıklanmaktadır. Bu ayrıntılı protokol, transkripsiyon faktörü kodlayan genlerin epitop etiketlemesinden, dizileme için kütüphane hazırlığına kadar gerekli tüm deneysel prosedürleri içerir; Ayrıca, CUT&RUN veri analizi için özelleştirilmiş bir hesaplama iş akışı içerir.

Introduction

Candida albicans, planktonik (serbest yüzen) büyüme modu ve biyofilm büyüme modu ^1,2,3 olarak bilinen hücre dışı bir matris tarafından korunan sıkıca yapışmış hücrelerin toplulukları gibi çeşitli^{farklı büyüme} modlarında bulunan klinik olarak alakalı^, polimorfik bir insan mantar patojenidir. Diğer gelişimsel ve hücresel süreçlere benzer şekilde, biyofilm gelişimi, DNA'ya diziye özgü bir şekilde bağlanan düzenleyici transkripsiyon faktörleri (TF'ler) tarafından transkripsiyonel düzeyde kontrol edildiği bilinen önemli bir C. albicans virülans özelliğidir⁴. Son zamanlarda, kromatin düzenleyicileri ve histon değiştiriciler, DNA erişilebilirliğine aracılık ederek C. albicans biyofilm oluşumu⁵ ve morfogenez^6'nın önemli düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır. Bu önemli mantar patojeninin karmaşık biyolojisini anlamak için, farklı gelişimsel ve hücresel süreçler sırasında spesifik TF'lerin genom çapında lokalizasyonunu belirlemek için etkili yöntemler değerlidir.

Kromatin immünopresipitasyonu ve ardından dizileme (ChIP-seq), C. albicans ^5,6'da protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve büyük ölçüde daha klasik kromatin immünopresipitasyonunun yerini mikroarray (ChIP-çip)⁹ yönteminin almıştır. Bununla birlikte, hem ChIP-seq hem de ChIP-çip yöntemleri, hastalardan toplanan biyofilmler veya hayvan enfeksiyon modelleri gibi belirli örnekler ve büyüme modları bağlamında TF'leri araştırırken karmaşık bir faktör olabilecek çok sayıda giriş hücresi¹⁰ gerektirir. Ek olarak, kromatin immünopresipitasyon (ChIP) testi genellikle genom boyunca önemli miktarda arka plan sinyali verir ve ilgilenilen hedefin sinyali gürültüden yeterince ayırması için yüksek düzeyde zenginleştirme gerektirir. ChIP-çip testi bugün büyük ölçüde modası geçmiş olsa da, ChIP-seq için gerekli sıralama derinlikleri, bu tahlili birçok araştırmacı için, özellikle de birden fazla TF ve / veya kromatin ile ilişkili proteinleri inceleyenler için yasaklayıcı bir şekilde pahalı hale getirmektedir.

Hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT&RUN) kullanarak serbest bırakma, ChIP-seq'e cazip bir alternatiftir. 2017 yılında Henikoff laboratuvarı tarafından ChIP-seq ve kromatin endojen bölünmesinin sınırlamalarını aşmak için geliştirildi ve ardından protein-DNA etkileşimlerini genom çapında bir düzeyde tanımlamak için başka bir yöntem olan ChEC-seq ^11,12'yi diziledi, aynı zamanda TF'lerin ve kromatinle ilişkili proteinlerin yüksek çözünürlüklü, genom çapında haritalanmasını sağladı¹³ . CUT&RUN, bağlı mikrokokal nükleazlar kullanılarak geçirgenleştirilmiş çekirdekler içindeki kromatinin hedeflenen sindirimine ve ardından sindirilen DNA fragmanlarının dizilimine dayanır ^9,10. DNA fragmanları, ChIP tahlillerinde olduğu gibi rastgele parçalanma yoluyla genom boyunca üretilmek yerine, özellikle ilgili bir protein tarafından bağlanan lokuslarda üretildiğinden, CUT&RUN yaklaşımı büyük ölçüde azaltılmış arka plan sinyalleri ile sonuçlanır ve bu nedenle, ChIP-seq 11,13'e kıyasla dizileme derinliğinin 1 / ^10'unu gerektirir^{. 14}. Bu iyileştirmeler nihayetinde sıralama maliyetlerinde önemli azalmalara ve her numune için başlangıç malzemesi olarak ihtiyaç duyulan toplam giriş hücresi sayısında azalmaya yol açmaktadır.

Burada, biyofilmlerden ve planktonik kültürlerden izole edilen C. albicans hücrelerinde TF'lerin genom çapında lokalizasyonunu belirlemek için uyarlanmış ve optimize edilmiş sağlam bir CUT&RUN protokolü tanımlanmıştır. Elde edilen dizi verilerinin işlenmesini ve analizini sağlayan ve kullanıcıların kodlama veya biyoinformatik konusunda minimum uzmanlığa sahip olmalarını gerektiren kapsamlı bir veri analizi boru hattı da sunulmaktadır. Kısaca, bu protokol TF kodlayan genlerin epitop etiketlemesini, biyofilm ve planktonik hücrelerin toplanmasını, bozulmamış geçirgen çekirdeklerin izolasyonunu, spesifik protein veya epitop etiketli ilgili proteine karşı birincil antikorlarla inkübasyonu, kimerik A / G-mikrokokal nükleaz (pAG-MNaz) füzyon proteinlerinin birincil antikorlara bağlanmasını, kromatin sindiriminden sonra genomik DNA geri kazanımını ve dizileme için genomik DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını açıklamaktadır.

Deneysel CUT&RUN protokolünü, ham DNA dizileme okumalarını FASTQ formatında alan ve ilgilenilen TF (birincil antikor tarafından hedeflenen) tarafından bağlanan önemli ölçüde zenginleştirilmiş lokusların tam bir listesini sağlamak için gerekli tüm işleme adımlarını uygulayan, amaca yönelik bir veri analizi boru hattı izler. Açıklanan kütüphane hazırlama protokolünün birden fazla adımının, TF'lerin CUT&RUN analizi için özel olarak uyarlandığını ve optimize edildiğini unutmayın (nükleozomların aksine). Bu makalede sunulan veriler, ticari bir CUT&RUN kitinin TF'ye özgü uyarlamaları kullanılarak üretilirken, bu protokoller ayrıca bireysel kaynaklı bileşenler (yani, pAG-MNaz enzimi ve manyetik DNA saflaştırma boncukları) ve deneysel maliyeti önemli ölçüde azaltabilen şirket içi hazırlanmış tamponlar kullanılarak doğrulanmıştır. Kapsamlı deneysel ve veri analizi protokolleri aşağıda adım adım formatta ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Tüm reaktifler ve kritik ekipmanların yanı sıra tampon ve ortam tarifleri sırasıyla Malzeme Tablosu ve Ek Dosya 1'de listelenmiştir.

Protocol

1. C. albicans suşlarının epitop etiketlemesi

1. İlgilenilen geni, 1 kb yukarı akış ve aşağı akış yan dizileriyle birlikte, Candida Genom Veritabanından primer tasarım aracına yükleyin ( bkz. Durdurma kodonundan yukarı ve aşağı yönde 50 bp vurgulayarak bir kılavuz RNA (gRNA) tasarlayın ve sağdaki gRNA seçim aracına tıklayın. Tasarım ve Analiz Kılavuzları'nı seçin. Kılavuz parametreleri için Ca22 (Candida albicans SC5314 Assembly 22 (diploid)) genomunu ve bir NGG (SpCas9, 3' taraf) protospacer bitişik motifi (PAM) kullanın ve Son'a tıklayın. Şekil 1 , gelişmiş yeşil floresan proteini (eGFP) ile ilgilenen bir C. albicans genini epitop etiketleme iş akışını açıklamaktadır.
   1. Sonraki sayfada, gRNA tasarımı için hedef bölgeyi onaylayın ve yeşil düğmeye basın. gRNA'ları Hedef Puana göre sıralayın.
      NOT: Astar tasarım aracı, gRNA'ların özgüllüğünü ölçmek için hedef içi ve hedef dışı puanları hesaplar. İdeal bir rehber, >60 hedef puanına, ~ 33 hedef dışı puana sahiptir ve durdurma kodonu ile örtüşür. Bu, GFP entegrasyonundan sonra gRNA hedeflemesini aplate ederken yüksek gRNA özgüllüğü sağlar. Hedef dışı skoru ~ 50 olan bir gRNA, allelik varyasyonu gösterir; Böylece, gRNA tarafından sadece bir alel tanınacaktır.
   2. Dizileri (5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3') ve (5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3') sırasıyla 20 bp gRNA hedef dizisinin 5' ve 3' uçlarına ekleyerek 60 bp primer/oligonükleotid oluşturun. Alternatif olarak, 20 bp dizisini Nguyen ve ^ark.15 tarafından sağlanan gRNA hesap makinesine kopyalayın. 60 bp özel gRNA oligonükleotid sipariş edin.
   3. "Evrensel A parçasını" 100 mM AHO1096 (5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3') ve 100 mM AHO1098 (5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3') ve "benzersiz B parçası" ile adım 1.1.2'den itibaren özel 60 bp gRNA oligonükleotid (100 mM) ile güçlendirin. ve şablon DNA olarak sırasıyla pADH110 (plazmid deposu ID# 90982) ve pADH139 (plazmid deposu ID# 90987) kullanılarak 100 mM AHO1097 (5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3'). Tablo 1'de verilen PCR reaksiyonu ve döngü koşullarını kullanın.
      NOT: pADH139, heterolog Candida maltosa LEU2 işaretleyicisini taşıyan suşlara özgüdür. C. albicans LEU2 geninin tek bir kopyasına sahip bir suş kullanıyorsanız, pADH139 yerine pADH119 (plazmid deposu ID # 90985) kullanın.
   4. PCR'nin 5 μL'sini % 1'lik bir agaroz jeli üzerinde kontrol ederek başarılı amplifikasyonu onaylayın. ~1 kb A ve B parça amplikonları arayın.
   5. A ve B parçalarının her birini 1 μL karıştırın ve tam uzunlukta bir C parçası oluşturmak için Tablo 2'de sağlanan PCR reaksiyonunu ve döngü koşullarını kullanarak bunları bir araya getirin.
   6. Her PCR reaksiyonuna 100 mM AHO1237'nin 0,5 μL'sini (5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3') ve 100 mM AHO1453'ün 0,5 μL'sini (5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3') ekleyin, pipetleme ile iyice karıştırın ve Tablo 3'te listelenen döngü koşullarını tamamlayın.
      NOT: pADH139 yerine pADH119 kullanılıyorsa, AHO1453 yerine AHO1238 (5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3') kullanın.
   7. % 1'lik bir agaroz jeli üzerinde PCR'nin 5 μL'sini kontrol ederek C fragmanının uygun şekilde dikildiğini ve amplifikasyonunu onaylayın. ~2 kb amplikon arayın. C parçasını kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.
      NOT: Dikiş ve amplifikasyon çoklu, spesifik olmayan bantlara veya yaymaya neden oluyorsa, A ve B parçalarının PCR temizliğini gerçekleştirin ve adım 1.1.5'ten itibaren tekrarlayın.
2. CTG için optimize edilmiş monomerik eGFP'nin tamamını, bağlayıcı dizisi (RIPLING)¹⁶ (pCE1, plazmid deposu ID# 174434) ile birlikte, primer tasarım aracını kullanarak ilgilenilen genin durdurma kodonunun hemen yukarı akışını ekleyin ve bir C-terminali translasyonel füzyonu oluşturun. Bu yapıyı, pCE1'den donör DNA'sını (dDNA) yükseltmek için oligonükleotidleri tasarlamak için kullanın.
   1. Bağlayıcı dizisine 18-22 bp homoloji ve açık okuma çerçevesinin (ORF) 3' ucuna >50 bp homoloji ile ileri oligonükleotid tasarlayın.
      NOT: 18-22 bp homolojisi, 55 °C ile 58 °C arasında amplifikasyon için bir tavlama sıcaklığı oluşturur. Tam uzunlukta oligonükleotid primer dimerler oluşturuyorsa, homolojiyi bağlayıcı dizisine / GFP'ye veya genoma göre ayarlayın.
   2. GFP'nin 3' ucuna 18-22 bp homolojisi ve etiketlenecek ORF'nin aşağı akış kodlamama dizisine >50 bp homolojisi ile ters oligonükleotid oluşturun.
   3. Bu oligonükleotidleri sipariş edin ve Tablo 4'te sağlanan touchdown PCR döngü koşullarını kullanarak dDNA'yı yükseltin.
3. Yandaki entegrasyon bölgeleri boyunca yükselterek GFP'nin entegrasyonunu doğrulamak için iki koloni PCR (cPCR) oligonükleotid seti tasarlayın. İlk olarak, astar tasarım aracını kullanarak ileri dDNA oligonükleotidini seçin ve sağdaki Primer düğmesine tıklayın.
   1. Primer | Oluştur'a tıklayın Sihirbaz | Tm Param ve algoritmanın SantaLucia 1998 olarak ayarlandığını onaylayın. Hedef dizi olarak 1.2.1'de tasarlanan ileri oligonükleotidin koordinatlarını girmek için Seçimi Kullan'ı tıklatın.
   2. En uygun astar sıcaklığını 55 °C'ye ve maksimum amplikon boyutunu 900 bp'ye ayarlayın ve sağ üstteki Primer Oluştur düğmesine tıklayın.
   3. En düşük ceza puanına sahip oligonükleotid çiftini seçin ve primerlerin 5' entegrasyon sahası boyunca yükseldiğini onaylayın. İleri cPCR astarı, ileri dDNA primer dizisinin yukarı akımında ve ters cPCR astarının tamamen eGFP etiketi veya bağlayıcı dizisi içinde olduğundan emin olun.
   4. 1.3-1.3.3 arasındaki adımları yineleyin. 3' entegrasyon bölgesi boyunca çoğalan ikinci cPCR oligonükleotid setini oluşturmak için ters dDNA oligonükleotid ile. İleri cPCR astarının tamamen eGFP etiketi veya bağlayıcı dizisi içinde ve ters dDNA primer dizisinin aşağı yönünde ters cPCR astarı içinde olduğundan emin olun.
   5. Bu oligonükleotidleri sipariş edin.
4. Cas9 (plazmid deposu ID # 90988) içeren 2.500 ng pADH140'ı, GFP etiketli olacak her gen için kısıtlama enzimi ile sindirin. Her bir sindirimin toplam hacmini 15 μL'ye ayarlayın; pADH140 plazmid konsantrasyonuna göre su hacmini buna göre ayarlayın. Tablo 5'te belirtilen sindirim koşullarını kullanın. Sindirilen plazmidi kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.
   NOT: Bir suşu heterolog C. maltosa LEU2 belirteci yerine C. albicans LEU2 geninin tek bir kopyasıyla dönüştürüyorsanız, pADH140 yerine pADH137 (plazmid deposu ID# 90986) kullanın.
5. 10 dakika boyunca 99 ° C'de GFP etiketli olacak ve hızla ≤4 ° C'ye soğuyacak her gen için 10 mg / mL somon sperm DNA'sının 12 μL'sini denatüre edin. Kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklayın.
6. C. albicans LEU2 hemizigous nourseothricin'e duyarlı suşu maya pepton dekstroz (YPD) plakalarına sürün çizin ve iki gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
7. Tek bir koloni seçin ve 4 mL sıvı YPD'ye aktarın. 250 rpm'de sallama ile 30 ° C'de 12-16 saat boyunca inkübe edin.
8. Tek kullanımlık bir küvet (1 mL, 1 cm yol uzunluğu) kullanarak bir spektrofotometrede gece (12-16 saat) kültürünün 600 nm (OD₆₀₀) optik yoğunluğunu ölçün.
9. Gece kültürünü, YPD'de 0,1'lik bir OD_600'e kadar bir Erlenmeyer şişesine seyreltin. Reaksiyon başına 5 mL'yi hesaba katın ve OD_600'ü daha sonra kontrol etmek için ek 5 mL ekleyin.
   NOT: Kültürün hacmi, dönüşüm reaksiyonlarının sayısına bağlıdır.
10. Seyreltilmiş gece kültürünü, 30 ° C'de sallanan bir inkübatörde, 0.5-0.8'lik bir OD 600'e ulaşana kadar₂₅₀ rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
11. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 4.000 × g'da santrifüj; süpernatanı çıkarın ve atın.
12. Filtre uçlarıyla nazik pipet karıştırma yoluyla hücre peletini 1 mL steril suda yeniden askıya alın ve steril 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın.
13. Oda sıcaklığında 4.000 × g'da 1 dakika santrifüj yaparak hücreleri peletleyin; süpernatanı çıkarın ve atın. 1 mL steril suda tekrar askıya alın ve toplam iki yıkama için tekrarlayın.
14. Pelet, adım 1.10'da kullanılan hacmin 1 /^100'ünde yeniden askıya alın. Örneğin, 15 mL kullanılmışsa, peleti 150 μL steril suda yeniden askıya alın.
15. Her transformasyon reaksiyonu için ayrı bir tüpte, 50 μL C fragmanı, 50 μL dDNA, 2.500 ng kısıtlama enzimi sindirilmiş pADH140 ve 10 μL denatüre somon sperm DNA'sını karıştırın.
16. Adım 1.14'ten 50 μL hücre bulamacı ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
17. n + 1 dönüşümleri için plaka karışımının (Ek Dosya 1) bir stoğunu yapın.
18. Hücre / DNA karışımına 1 mL plaka karışımı ekleyin ve 5 kez ters çevirerek karıştırın.
    NOT: Kalan sıvıyı yerinden çıkarmak için ters çevirirken tüplerin alt kısımlarına dokunun.
19. Karışımı çalkalanmadan gece boyunca (12-16 saat) 30 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin.
20. Bir su banyosunda hücreleri 44 ° C'de 15 dakika boyunca ısıl şoka sokun.
21. 1,5 mL mikrofüj tüplerini oda sıcaklığında 5.000 × g'da 2 dakika santrifüj yapın.
22. Steril pipet uçları kullanarak vakum aspirasyonu ile PLATE karışımını çıkarın, hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
23. Hücre peletini 1 mL YPD'de, peleti oda sıcaklığında 4.000 × g'da santrifüjleme ile 1 dakika boyunca yeniden askıya alın ve süpernatanı çıkarın ve atın. İkinci bir yıkama için tekrarlayın, hücre peletini 1 mL YPD'de yeniden askıya alın ve süspansiyonu, ek 1 mL YPD (2 mL son hacim) içeren 10 mL yuvarlak tabanlı, tek kullanımlık bir kültür tüpüne aktarın. Hücreleri 30 ° C'de 5 saat boyunca 250 rpm'de sallayarak kurtarın.
24. Tüpleri oda sıcaklığında 4.000 × g'da 5 dakika santrifüj yapın; süpernatanı çıkarın ve atın.
25. Hücre peletini 100 μL steril su ve plaka içinde 200 μg / mL nourseothricin (NAT200) ile desteklenmiş olarak YPD üzerinde yeniden askıya alın. 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
26. Aliquot 100 μL 20 mM NaOH, 96 kuyucuklu bir PCR plakasının kuyularına girer ve her kuyu NAT200 plakalarında yetişen bireysel bir koloniye karşılık gelir. Steril bir kürdan veya pipet ucu kullanarak, bireysel dönüştürülmüş kolonileri seçin, bunları yeni bir NAT200 plakasına yamalayın ve kalan hücreleri 20 mM NaOH ile bir kuyuya çevirin. cPCR reaksiyonu için DNA şablonu olarak kullanılan hücre lizatını oluşturmak için kalan koloniler için tekrarlayın.
27. PCR plakasını kapatın ve ısıtmalı kapaklı bir termosikler içinde 99 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
28. Adım 1.3-1.3.5'te tasarlanan oligonükleotidlerle iki cPCR reaksiyonu ayarlayın. Gerektiğinde reaksiyon sayısını artırın. Tablo 6'daki döngü koşullarını ve PCR reaksiyon karışımlarını takiben adım 1.26'da hazırlanan hücre lizatı ile PCR reaksiyonunu gerçekleştirin. % 1'lik bir agaroz jeli üzerinde her kuyucuktan 10-20 μL çalıştırın. GFP dDNA'nın düzgün bir şekilde dahil edildiğini gösteren iki cPCR primer setinin amplifikasyonu ile kolonileri arayın.
29. GFP'yi lösin içermeyen sentetik tam (SC) ortam üzerine dahil eden restreak kolonileri. 2-3 gün boyunca 30 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Tek tek kolonileri seçin ve 400 μg / mL nourseothricin (NAT400) plakalarla desteklenmiş YPD ve YPD üzerine yama yapın. 24 saat sonra NAT400 plakalarında büyüyemeyen kolonileri, CRISPR bileşenlerini başarıyla kaybetmiş olanlar olarak tanımlayın.
30. GFP etiketinin, YPD yama plakasındaki hücreleri kullanarak 1.25-1.28 arasındaki adımları tekrarlayarak korunduğunu onaylayın. Doğru bantlar mevcutsa, 4 mL YYP'ye aşılayın ve adım 1.7'de açıklandığı gibi gece boyunca (12-16 saat) büyür.
31. Yeni GFP etiketli suşun gece kültürünü, steril bir kriyotüp içinde 1: 1 oranında filtre sterilize edilmiş% 50 gliserol ile karıştırın. -80 °C'de saklayın ve gerektiğinde YPD plakalarına dayandırın.
    NOT: GFP etiketli suşların, etiketli TF'nin floresan mikroskopisi yoluyla nükleer lokalizasyonunu doğrulayarak ve uygun bir fenotipik tahlilde vahşi tip bir fenotipi doğrulayarak doğrulanması önerilir.

2. Biyofilm kültürlerinin numune hazırlanması

1. Streak C. albicans GFP etiketli suşları YPD agar plakalarına yerleştirir ve 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe eder. Agar plakasından izole edilmiş tek bir koloni kullanarak, 4 mL YPD sıvı ortamına aşılayın. Gece boyunca sallanarak (12-16 saat) 30 ° C'de inkübe edin. Gece kültür(ler)inin OD_600'ünü belirleyin.
   NOT: CUT&RUN deneyleri için numune başına üç biyolojik replikasyon kullanılması önerilir.
2. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-₁₆₄₀ ortamında 2 mL'lik son bir hacme kadar steril bir 12 iyi işlenmemiş hücre kültürü plakasını gece kültürüyle 0.5'lik son bir OD 600'e (2 × 10⁷ hücre / mL'ye eşdeğer) aşılayın. 250 rpm'de sallanan bir mikroplaka inkübatöründe 37 ° C'de 90 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Suş başına bir adet 12 delikli hücre kültürü plakası kullanılması ve bir kuyunun orta-tek başına kontaminasyon kontrolü olarak aşılanmamış olması önerilir. Bu protokol, 12 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının 1 /^10'u kadar az (veya 5 milyon hücreye kadar) kullanılarak başarıyla uygulanmıştır. Daha fazla sayıda hücre kullanmak, toplam DNA verimini arttırır, bu da tipik olarak yüksek kaliteli dizileme kütüphaneleri ile sonuçlanır.
3. Yapışmamış hücreleri, esnek plastik boru ile vakum tutucu aparatına tutturulmuş steril pipet uçlarını kullanarak aspirasyonla çıkarın. Yapıştırılan hücreleri bir kez 2 mL steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Kuyucuklara 2 mL taze RPMI-1640 ortamı ekleyin ve 250 rpm'de sallayarak 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
   NOT: Pipet uçlarını farklı gerinim ve/veya koşullardaki kuyucuklar arasında değiştirin. Aspire ederken kuyunun dibini ucuyla kazımayın.
4. 24 saatlik inkübasyonun sonunda, 11 aşılanmış kuyunun her birinden sıvı ve biyofilm malzemesini toplayın ve tek, steril 50 mL konik bir tüp halinde toplayın. Aynı anda birden fazla gerinim veya büyüme durumunu işliyorsanız bağımsız havuzlarla gerektiği kadar tekrarlayın.
   NOT: Yüzeye yapışmış halde kalan hücreleri yerinden çıkarmak için her bir kuyucuğun tabanlarını ve kenarlarını bir pipet filtresi ucuyla kazıyın. Biyofilmleri homojenize etmek için pipeti kullanın.
5. Oda sıcaklığında 4.000 × g'da 5 dakika santrifüj edilerek pelet numuneleri. Peletin bozulmasını en aza indirmeye özen göstererek, süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu dekantlayın. Peleti sıvı azotta çıtçıtlayın ve toplandıktan hemen sonra -80 ° C'de saklayın veya doğrudan adım 4'e (çekirdeklerin izolasyonu) devam edin.

3. Planktonik kültürlerin örnek hazırlanması

1. Streak C. albicans GFP etiketli suşları YPD agar plakalarına yerleştirir ve 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe eder. Agar plakasından izole edilmiş tek bir koloni kullanarak, 4 mL YPD sıvı ortamına aşılayın. Gece boyunca sallanarak (12-16 saat) 30 ° C'de inkübe edin. Gece kültür(ler)inin OD_600'ünü belirleyin.
2. Gece kültürleri 50 mL RPMI-1640 sıvı ortamda 0,1 OD 600'e kadar geri seyreltin ve OD₆₀₀ 0,5 ila 0,8 arasında olana kadar 2-5 saat boyunca 225 rpm'de çalkalayarak₃₀ ° C'de inkübe edin.
   NOT: Hücreler hasat edilmeden önce en az iki katına çıkmalıdır. Planktonik kültürler için kullanılan koşullar gerektiğinde ayarlanabilir.
3. Numuneleri oda sıcaklığında 4.000 × g'da 5 dakika santrifüj yaparak toplayın. Peletin bozulmasını en aza indirmeye özen göstererek, süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu dekantlayın. Peleti sıvı azotta çıtçıtlayın ve toplandıktan hemen sonra -80 ° C'de saklayın veya doğrudan adım 4'e (çekirdeklerin izolasyonu) devam edin.

4. Çekirdeklerin izolasyonu

NOT: Deney gününde, taze Ficoll Buffer hazırlayın, Resuspension Buffer'ın alikotlarına 2-merkaptoetanol ve proteaz inhibitörü ekleyin ve SPC Tamponunun alikot (lar)ına proteaz inhibitörü ekleyin (bakınız Ek Dosya 1). Peletleri yeniden askıya almak için, hücrelere veya çekirdeğe zarar vermemek için 200 μL veya 1 mL pipet uçlarını kullanarak nazikçe pipet uygulayın. Çekirdek izolasyonuna başlamadan önce, 30 ° C'ye önceden ısıtmak için ısı bloğunu açın. Bu protokolün geri kalanı için tüm pipet uçları ve tüpleri DNA/RNA ve DNaz/RNaz içermeyen sertifikalara sahip olmalıdır ve sonraki tüm pipetleme adımları için filtre uçlarının kullanılması önerilir.

1. Pelet(ler)i 1 mL oda sıcaklığında Resuspension Buffer'da yeniden askıya alın ve steril 1,5 mL mikrofüj tüpüne aktarın. 2.000 × g'da pelet oda sıcaklığında 2 dakika boyunca masa üstü bir santrifüjde ve süpernatanı çıkarın.
   NOT: 200 μL veya 1 mL pipet ucu kullanarak süpernatantı çıkarın ve peletlerin bozulmasını en aza indirmeye özen gösterin.
2. Pelet(ler)i 200 μL oda sıcaklığında Resuspension Buffer içinde yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan peletten, 5 μL'lik bir alikotu yeni bir PCR tüpüne aktarın ve daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.
   NOT: Bu aliquot, izole edilmiş çekirdeklerin kalitesini değerlendirmek için sonraki bir kalite kontrol adımı sırasında kontrol olarak kullanılacaktır.
3. 2.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet ve bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve atın. 200 μL Resuspension Buffer kullanarak yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
4. Oda sıcaklığında 2.000 × g'da 2 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. 300 μL Resuspension Buffer ve 10 μL litikaz çözeltisi ekleyin (50 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız). Bir ısı bloğunda 30 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Alternatif olarak, ısı bloğu yerine 30 °C'ye ısıtılmış bir su banyosu da kullanılabilir. Burada kullanılan sferoplast koşullar, C. albicans'ın hem maya hem de hifal hücreleri için etkili olacak şekilde optimize edilmiştir. Bu protokolü hücre duvarı bütünlüğünü veya diğer hücresel morfolojileri etkileyen mutasyonlarla C. albicans hücrelerine uygularken sferoplast koşullarının optimize edilmesi önerilir. Bu 30 dakikalık inkübasyon adımı sırasında, kullanıcı zamandan tasarruf etmek için adım 5'i (Concanavalin A Boncuk Aktivasyonu) önceden tamamlama seçeneğine sahiptir.
   1. KRİTİK ADIM: 30 dakikalık inkübasyon adımından sonra, 5 μL'lik bir alikotu yeni bir PCR tüpüne aktarın. İzole edilmiş çekirdeklerin 5 μL'sine ve adım 4.2'den itibaren 4 ° C'de depolanan bozulmamış hücrelerin 5 μL alikotuna, 1 μL kalkoflor beyazı (floresan hücre duvar boyası) ve 1 μL SYTO 13 (nükleik asit boyası) ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta 30 ° C'de inkübe edin.
   2. Bir floresan mikroskobu kullanarak izole edilmiş çekirdeklerin bütünlüğünü ve saflığını görsel olarak inceleyin. Belirgin şekilde lekelenmiş bozulmamış çekirdekleri gösteren izole çekirdekleri arayın (488-509 nm uyarma filtresi kullanarak) ve calcofluor beyaz boya (390-420 nm uyarma filtresi kullanarak) ile hücre duvarı boyaması olmadığından emin olun. Bozulmamış kontrol hücrelerinde, kalkoflor beyaz boya (390-420 nm uyarma filtresi kullanarak) ve lekelenmiş bozulmamış çekirdekler (488-509 nm uyarma filtresi kullanarak) ile belirgin hücre duvarı boyamasını arayın.
5. 5 dakika boyunca 4 °C'de 2.000 × g'da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 500 μL buz gibi soğuk Resüsitasyon Tamponunda 1 mL filtre uçları kullanarak 5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetle dinleyerek yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca 4 °C'de 2.000 × g'da santrifüj yapın ve süpernatantı 1 mL'lik bir pipet kullanarak çıkarın. Peleti 1 mL taze yapılmış buz gibi soğuk Ficoll Buffer ile yeniden askıya alın.
   NOT: Numuneleri ve tamponları bu noktadan itibaren buz üzerinde tutun.
6. Numuneleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 5.000 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 500 μL buz gibi soğuk SPC Tamponunda yeniden askıya alın.
   NOT: Bu noktadan itibaren, zarar görmemek için çekirdekleri son derece nazik bir şekilde tutun.
7. Numuneleri 10 dakika boyunca 4 ° C'de 5.000 × g'da santrifüj yapın ve peleti bozmadan süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarın. Peletlenmiş çekirdekleri içeren tüpleri buzun üzerine yerleştirin ve adım 5'e geçin. Adım 5, adım 4.4'te vaktinden önce tamamlanmışsa, adım 6'ya geçin veya peletleri sıvı azot içinde anında dondurun ve toplandıktan hemen sonra -80 ° C'de saklayın.

5. Concanavalin Bir boncuk aktivasyonu

NOT: Bu kritik bir adımdır. Bu noktadan itibaren, kullanıcılar ticari olarak temin edilebilen bir CUT&RUN kiti veya kaynak anahtar bileşenleri kullanarak protokole devam etme ve arabellekleri şirket içinde hazırlama seçeneğine sahiptir. Ticari kiti kullanıyorsanız, aşağıda kullanılan tüm tamponlar ve reaktifler, aksi belirtilmedikçe kitin içine dahil edilir. Reaktifleri bağımsız olarak tedarik etmek için bireysel katalog numaraları da Malzeme Tablosunda verilmiştir. Kullanmadan önce tüm tamponları buz üzerinde soğutun. Adım 5 tamamlandıktan sonra, hemen adım 6'ya geçmeniz önerilir. DNA hasarını arttırdığı ve düşük kaliteli sonuçlara yol açabileceği bilindiğinden, izole çekirdeklerin çoklu donarak çözülmesinden kaçının.

1. Bir pipet kullanarak konkanavalin A (ConA) boncuklarını nazikçe yeniden askıya alın. Tek bir 1,5 mL mikrofüj tüpünde işlenmek üzere numune başına 22 μL ConA boncuk süspansiyonu aktarın. Boncuk bulamacı temizlenene kadar tüpü manyetik bir rafa yerleştirin; süpernatantı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın.
   NOT: Örneğin, toplam 10 numune için CUT&RUN gerçekleştirirken, ConA boncuk süspansiyonunun 220 μL'sini 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın.
2. ConA boncuklarını içeren tüpü manyetik raftan çıkarın ve hemen 200 μL buz gibi soğuk Boncuk Aktivasyon Tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak yavaşça karıştırın. Boncuk bulamacı temizlenene kadar tüpü manyetik rafa yerleştirin; süpernatantı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın. Toplam iki yıkama için bu adımı yineleyin.
3. Boncukları, işlenecek çekirdek örneği başına 22 μL buz gibi soğuk Boncuk Aktivasyon Tamponunda yeniden askıya alın. Boncukları ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun.
   NOT: Sonraki adımların verimi, mevcut manyetik tüp raflarının sayısına ve kapasitesine bağlıdır. İki adet 16 delikli tüp rafında 32 numunenin işlenmesi, bu protokolün çoğu kullanıcısı için yönetilebilir bir sayıdır. Bununla birlikte, daha deneyimli kullanıcılar için veya robotik sıvı taşıma sistemleri mevcutsa daha yüksek verim mümkündür.

6. Çekirdekleri aktif boncuklara bağlama

NOT: Kullanmadan önce tüm tamponları buz üzerinde soğutun. Proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş tüm tamponlar, deney gününde taze olarak hazırlanmalıdır. Sonraki adımlarda 0.2 mL şerit tüplerin kullanılması önerilir.

1. Pelet edilmiş çekirdekleri 100 μL buz gibi soğuk SPC Tamponunda adım 4'ten yeniden askıya alın ve yeni bir 8 tüplü 0,2 mL şeride aktarın. Her numuneye 20 μL aktif boncuk ekleyin ve karıştırmak için hafifçe pipet ekleyin. Ajitasyon olmadan 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
2. Bulamaç temizlenene kadar tüpleri manyetik rafa yerleştirin; süpernatantı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve her numuneye 200 μL buz gibi soğuk Yıkama Tamponu ekleyin. Boncukları 5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Her numuneden 100 μL alikotları yeni bir 8 tüplü 0,2 mL şeride aktarın.
   1. KRİTİK ADIM: Her CUT&RUN örneğini iki ayrı aliquot'a bölün. Alikotlardan birini negatif kontrol antikoru (örneğin, IgG negatif kontrol antikoru) ve diğerini ilgili proteine karşı hedef antikor için kullanın (örneğin, anti-GFP antikoru).
      NOT: Her iki örnek de hesaplama işlem hattının ilgilenilen TF'ye özgü zenginleştirme sinyallerini doğru bir şekilde tanımlaması için gereklidir. Etiketlenmemiş bir suşu olan anti-GFP antikorları kullanılarak ek bir kontrol de yapılabilir. Bu kontrol, GFP etiketli bir suşta IgG antikorlarının kullanımıyla karşılaştırılabilir sonuçlar göstermiştir. Bu nedenle, basitlik için, tüm deneyler için standart IgG kontrolünün kullanılması önerilir.

7. Primer antikor bağlanması

NOT: pAG-MNaz füzyon proteini tavşan, keçi, eşek, kobay ve fare IgG antikorlarına iyi bağlanır¹⁷. Genel olarak, çoğu ticari ChIP-seq sertifikalı ticari antikorlar CUT&RUN prosedürleri ile uyumludur. Kullanılan birincil antikor miktarı, antikorun etkinliğine bağlıdır ve ilgili antikor daha önce ChIP veya CUT&RUN deneylerinde test edilmemişse, antikorun titrasyonu (örneğin, 1:50, 1:100, 1:200 ve 1:400 nihai seyreltme) gerekli olabilir. Kullanmadan önce tüm tamponları buz üzerinde soğutun. Antikor bağlama adımları için kullanılan tüm tamponlar deney günü taze olarak hazırlanmalıdır.

1. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve bulamaç tamamen temizlenene kadar bekleyin; süpernatantı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın. 50 μL Antikor Tamponu ekleyin ve pipetleme ile nazikçe karıştırın.
2. Anti-GFP poliklonal antikorundan 3 μL (veya test edilmemiş bir antikor kullanılıyorsa 0.5 μg) ekleyin. Tüpleri bir somun karıştırıcı üzerinde 2 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: Bazı CUT&RUN protokolleri, pAG-MNaz ilavesi^14'ten önce ikincil bir antikor eklenerek verimin arttığını bildirmektedir; ancak, bu eklenen adım kullanılarak önemli bir iyileşme gözlenmemiştir ve bu nedenle bu protokole dahil edilmemiştir.
3. Tüpleri 5 sn boyunca oda sıcaklığında 100 × g'da kısaca santrifüj edin, tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve atın. Boncukları içeren tüpler hala manyetik raf üzerindeyken, doğrudan boncukların üzerine 200 μL buz gibi soğuk Hücre Geçirgenlik Tamponu ekleyin. Bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve atın. Buz gibi soğuk Hücre Geçirgenlik Tamponu ile toplam iki yıkama için tekrarlayın.
4. Her tüpe 50 μL buz gibi soğuk Hücre Geçirgenlik Tamponu ekleyin ve pipetleme ile nazikçe karıştırın.
   NOT: Boncuklar genellikle bu noktada toplanır, ancak 200 μL'lik bir pipet kullanılarak nazikçe karıştırılarak kolayca dağıtılabilir.

8. pAG-MNaz'ın antikora bağlanması

1. Her numuneye 2,5 μL pAG-Mnase (20x stok) ekleyin ve pipetleme ile nazikçe karıştırın. Numuneleri (~ 45 ° açıyla hafifçe yükseltilmiş) 4 ° C'de bir nutator üzerine yerleştirin. Nutatoru açın ve numuneleri 1 saat boyunca inkübe edin.
2. Şerit tüplerini 5 s oda sıcaklığında 100 × g'da kısaca santrifüj edin, tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve atın.
   NOT: Bu adım çok önemlidir. Bu adımdan sonra tüplerin kapağında veya yanlarında kalan taşıma antikoru, arka plan sinyalinin miktarını önemli ölçüde artıracaktır.
3. Boncukları içeren tüpler hala manyetik raftayken, 200 μL buz gibi soğuk Hücre Geçirgenlik Tamponu ekleyin, bulamacın temizlenmesine izin verin ve bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın ve atın. Hücre Geçirgenliği Arabelleği ile toplam iki yıkama için bu adımı tekrarlayın.
4. Numunelere 100 μL buz gibi soğuk Hücre Geçirgenlik Tamponu ekleyin ve 5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipet uygulayın.

9. Hedeflenen kromatin sindirimi ve salınımı

1. Numuneleri içeren tüpleri ıslak bir buz banyosunda 5 dakika boyunca inkübe edin. Çok kanallı pipet kullanarak her numuneye 3 μL 100 mM CaCl₂ ekleyin. Yavaşça 5 kez yukarı ve aşağı pipet yapın, tüpleri hemen ıslak buz banyosuna geri döndürün ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
2. Her numuneye 66 μL Stop Buffer ekleyin ve karıştırmak için yavaşça vorteks yapın. Numuneleri kuru bir banyoda 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Stop Buffer'daki numune başına 1.5 pg heterolog E. coli spike-in DNA'sının eklenmesi önerilir. 1.5 pg E. coli spike-in DNA'sının eklenmesi, 1-10 milyon haritalanmış deneysel okuma¹⁴ için 1.000-10.000 haritalanmış başak okuması ile sonuçlanır. Başak DNA, dizileme derinliğini kalibre etmek için kullanılır ve özellikle bir serideki örnekleri karşılaştırmak için önemlidir. Spike-in E. coli ilavesi şiddetle tavsiye edilir, ancak gerekli değildir. Ticari CUT&RUN kiti E. coli spike-in DNA'sını içerir, ancak ayrı olarak da satın alınabilir.
3. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve süpernatantın 160 μL'sini 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Numunenin 80 μL'sini yeni bir 2 mL mikrofüj tüpüne aktarın ve yedek bir numuneye ihtiyaç duyulması durumunda -20 °C'de saklayın. 80 μL numune ile adım 10'a geçin.

10. Toplanan DNA örneklerinin temizlenmesi

NOT: DNA Saflaştırma Boncuklarını kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Buz üzerinde% 100 izopropanol önleyin. Numuneleri karıştırırken, pipet 10 kez yukarı ve aşağı doğru hareket eder.

1. Boncuk süspansiyonunu homojenize etmek için Vortex DNA Saflaştırma Boncukları. Her numuneye 50 μL (~0,6x numune hacmi) yeniden askıya alınmış boncuk ekleyin. Pipetle karıştırın ve numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir nutator üzerinde inkübe edin.
   NOT: DNA saflaştırma boncuklarının kullanılan numuneye oranı kritiktir. Numuneye göre 0.6x hacimli DNA Saflaştırma Boncuk çözeltisinin kullanılması, manyetik boncukların hasarlı çekirdeklerden salınan büyük DNA parçalarına bağlanmasını sağlar. CUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA fragmanları bu büyük DNA fragmanlarından çok daha küçüktür ve bu nedenle bu adımda süpernatantta tutulur.
2. Tüpleri manyetik bir rafa yerleştirin ve DNA'yı içeren süpernatantın 130 μL'sini 0.2 mL 8 tüplü bir şeride aktarın. Numune (ler) e 30 μL DNA Saflaştırma Boncukları ekleyin (toplam hacim 160 μL'dir).
3. 170 μL (~1x numune hacmi) buz soğuk% 100 izopropanol ekleyin, 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: DNA saflaştırma boncuklarının CUT&RUN ile zenginleştirilmiş küçük parçaları verimli bir şekilde yakalaması için bu adım için% 100 buz gibi soğuk izopropanol kullanılması kritik öneme sahiptir.
4. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
5. Tüpler manyetik raftayken, tüplere 200 μL taze hazırlanmış, oda sıcaklığında% 80 etanol ekleyin ve 30 s boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın. % 80 etanol ile toplam iki yıkama için bu adımı tekrarlayın.
6. Tüpleri 100 × g'da hızla döndürün, tüpleri manyetik rafa geri yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra bir pipet kullanarak artık etanolleri çıkarın. Tüpler manyetik rafta kapak açıkken kalırken boncukları 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
   NOT: 5 dakikalık kuruma süresini aşmayın, çünkü bu nihai DNA verimini önemli ölçüde azaltabilir.
7. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve pH 8'de 17 μL 0.1x Tris-EDTA (TE) ekleyerek DNA'yı boncuklardan uzaklaştırın. İyice karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
8. Bulamaç temizlenene kadar tüpleri manyetik rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantın 15 μL'sini steril bir 0.2 mL PCR tüpüne dikkatlice aktarın.
9. Toplanan DNA'nın konsantrasyonunu, üreticinin protokolünü izleyerek bir florometre kullanarak ölçün.
   NOT: Tipik olarak, toplanan DNA'nın konsantrasyonu ~ 1 ng / μL'dir. Bazen, toplanan DNA'nın konsantrasyonu bir florometre kullanılarak ölçülemeyecek kadar düşüktür. Bu, başarısız bir deneyin göstergesi değildir. Toplanan DNA'nın konsantrasyonundan bağımsız olarak kütüphane hazırlığına devam edin.
10. Adım 11'e ilerleyin veya hazır olana kadar numuneleri -20 °C'de saklayın.

11. Sıralama için kütüphane hazırlığı

NOT: Aşağıdaki adımlarda, piyasada satılan bir kitaplık hazırlık kiti kullanılmaktadır. Ligation Master Mix'i kullanarak adımları gerçekleştirirken, tüplere dokunmayı en aza indirin ve her zaman buz üzerinde tutun.

1. pH 8'de 0,1x TE kullanarak, CUT&RUN DNA'nın toplam hacmini 50 μL'ye yükseltin. numune başına 3 μL Son Hazırlık Enzim Karışımı ve 7 μL Son Hazırlık Reaksiyon Tamponundan oluşan bir ana karışım yapın. CUT&RUN DNA'ya 10 μL master mix ekleyin ve 5 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
2. Tüpün kenarlarındaki tüm sıvıyı toplamak için 100 × g'da hızlı bir dönüş yapın. Tüpleri, ısıtılmış kapağı ≥75 ° C'ye ayarlanmış bir termosikler içine yerleştirin ve Tablo 7'deki bisiklet koşullarını çalıştırın.
   NOT: Adım 10'dan toplanan başlangıç girişi DNA konsantrasyonlarına bağlı olarak, Tablo 8'den gerekli adaptör seyreltmesini izleyin.
3. Numune başına 2,5 μL Adaptör ekleyin ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
   NOT: Adaptörün numuneye eklenmesi ve ligasyon ana karışımı eklenmeden önce iyice karıştırılması çok önemlidir.
4. 30 μL Ligasyon Master Mix ve 1 μL Ligasyon Arttırıcıdan oluşan bir ana karışım yapın. Ana karışımın 31 μL'sini numunelere ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek iyice karıştırın.
5. Isıtmalı kapağı kapalı bir termosiklerde 15 dakika boyunca 20 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Numunelerin buz üzerinde tutulması ve termosiklere ancak termosikler 20 ° C'ye ulaştıktan sonra aktarılması çok önemlidir.
6. Tüpün kenarlarındaki tüm sıvıyı toplamak için 100 × g'da hızlı bir dönüş yapın, 3 μL Urasil Eksizyon Enzimi ekleyin ve ısıtılmış kapak ≥47 ° C'ye ayarlanmış olarak 15 dakika boyunca termosikler içindeki tüpleri 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Bu güvenli bir durma noktasıdır; numuneleri -20 °C'de saklayın veya doğrudan adım 11.7'ye devam edin. Doğrudan adım 11.7'ye devam ederseniz, DNA Saflaştırma Boncuklarını kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Adım 11.6'dan itibaren Adaptör Ligasyon reaksiyonuna DNA Saflaştırma Boncuklarının 154.4 μL'sini (~1.6x numune hacmi) ekleyin. Pipetle karıştırın ve numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
8. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
9. Tüplere 200 μL taze hazırlanmış, oda sıcaklığında% 80 etanol ekleyin ve 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın ve bu adımı% 80 etanol ile toplam iki yıkama için tekrarlayın.
10. Tüpleri kısaca 100 × g'da döndürün. Tüpleri manyetik rafa geri yerleştirin ve bir pipet kullanarak kalan etanolleri çıkarın. Tüpler manyetik rafta kapak açıkken kalırken boncukları 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
    NOT: 5 dakikalık kuruma süresini aşmayın, çünkü bu nihai DNA verimini önemli ölçüde azaltabilir.
11. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve pH 8'de 17 μL 0.1x TE ekleyerek DNA'yı boncuklardan süzün. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
12. Bulamaç temizlenene kadar tüpleri manyetik rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantın 15 μL'sini steril bir 0.2 mL PCR tüpüne dikkatlice aktarın.
13. Numune başına 25 μL DNA Polimeraz Ana Karışımı ve 5 μL Evrensel İleri Kütüphane Amplifikasyon Astarı (10 μM) ana karışımını yapın.
    NOT: Pipetleme kayıplarını hesaba katmak için fazladan bir ana karışım örneği hazırlayın.
14. Ana karışımın 30 μL'sini, 15 μL'lik Adaptör bağlı DNA örneğine ekleyin. Son hacmi toplam 50 μL'ye getirmek için her numuneye 5 μL Ters Benzersiz İndekslenmiş Kütüphane Amplifikasyon Astarı (10 μM) ekleyin. Tablo 9'daki PCR bisiklet koşullarını gerçekleştirin.
    NOT: DNA Saflaştırma Boncuklarını kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
15. DNA Saflaştırma Boncuklarını yeniden askıya almak için vorteks. PCR takviyeli DNA örneklerine yeniden askıya alınmış boncukların 35 μL (~ 0.7x numune hacmi) ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir nutator üzerinde karıştırın ve inkübe edin.
16. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, DNA'yı içeren süpernatantı yeni bir 0.2 mL 8 delikli PCR şerit tüpüne aktarın.
17. Numuneye 119 μL (~1,4x numune hacmi) boncuk ekleyin ve 5 kez yukarı ve aşağı pipetle çekerek karıştırın. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir nutator üzerinde inkübe edin.
18. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
19. Tüplere 200 μL taze hazırlanmış, oda sıcaklığında% 80 etanol ekleyin ve 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın; % 80 etanol ile toplam iki yıkama için adımı tekrarlayın.
20. Tüpleri kısaca 100 × g'da döndürün. Tüpleri manyetik rafa geri yerleştirin ve bir pipet kullanarak kalan etanolleri çıkarın. Tüpler manyetik rafta kapak açıkken kalırken boncukları 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
    NOT: 5 dakikalık kuruma süresini aşmayın, çünkü bu nihai DNA verimini önemli ölçüde azaltabilir.
21. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve pH 8'de 14 μL 0.1x TE ekleyerek DNA'yı boncuklardan süzün. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
22. Bulamaç temizlenene kadar tüpleri manyetik rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantın 13 μL'sini steril bir 0.2 mL PCR tüpüne dikkatlice aktarın.
23. Taze 1x Tris-borat-EDTA (TBE) hazırlayın ve 1x TBE ile doldurulmuş jel elektroforez aparatına önceden hazırlanmış, ticari% 10 akrilamid TBE jeli yerleştirin.
24. İlk kuyuda, 2 μL Düşük aralıklı DNA merdiveni ekleyin. 3 μL 6x yükleme boyasını, daha önce adım 11.22'den toplanan numunenin 13 μL'si ile karıştırın. Jelin her bir oluğuna dikkatlice 15 μL ekleyin. Jeli 70 V'ta 90 dakika çalıştırın.
    NOT: Her numune arasında jelde bir kuyucuğun boş bırakılması önerilir, çünkü bu, numunenin çapraz kontaminasyon olasılığını azaltır. Deneyimli kullanıcılar, özellikle çok sayıda numuneyi işlerken, çapraz kontaminasyondan dikkatli bir şekilde kaçınırken, tüm kuyucukları kullanmayı uygun bulabilirler.
25. Jel dökümünü jel kutusundan çıkarın. Jel dökümünü üreticinin talimatlarına göre açın, jeli jel dökümünden yavaşça çıkarın ve 100 mL 1x TBE içeren bir jel tutma tepsisine yerleştirin.
    NOT: İnce ve kırılgan olduğu için jelin yırtılmasını önlemek için jeli jel dökümünden nazikçe çıkardığınızdan emin olun. Eldivenleri ve jeli tutarken 1x TBE'li jeli önceden ıslatmak çok önemlidir. Jel tutma tepsisi, jelin boyutundan biraz daha büyük olmalıdır (her iki tarafta yaklaşık 0,5 inç). 96 delikli PCR tüp saklama kutuları ile birlikte verilen plastik kapaklar, standart mini jel boyutları için uygun tutma tepsileridir.
26. Tepsiye 10 μL nükleik asit jel lekesi ekleyin ve yavaşça döndürün. Işıktan korumak için folyo ile örtün ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında statik olarak inkübe edin.
27. Jeli 100 mL deiyonize musluk suyu ile iki kez durulayın. Sarı filtre kapağı kullanarak jeli mavi ışık aydınlatması altında görüntüleyin (Şekil 2).
    NOT: Başarılı kütüphaneler 100 ila 500 bp arasında bir yayma gösterir. Ayrıca belirgin bir ~ 125 adaptör dimer bandı da olacak. Adaptör dimerlerinin varlığı, düşük kütüphane kalitesinin bir göstergesi değildir. Bu miktarda adaptör dimerleri, düşük bolluktaki TF'ler üzerinde gerçekleştirilen CUT&RUN deneyleri için kaçınılmazdır ve bu kütüphaneleri hazırlamak için kullanılan düşük miktarda giriş malzemesinin bir sonucudur. DNA'ya zarar verebilecek ultraviyole ışık kullanmayın.
28. Şekil 2'de gösterildiği gibi, her kütüphane için, jeli ~ 125 bp belirgin adaptör dimer bandının biraz üstünde (adaptör dimer bandına dokunmaktan kaçındığınızdan emin olun) ve 400 bp merdiven işaretinin altında kesin.
    NOT: ~125 adaptör dimer bandından kaçınmak çok önemlidir. Küçük miktarlarda adaptör dimerleri bile kütüphane kalitesini önemli ölçüde azaltacaktır.
29. 22 G'lik bir iğne kullanarak 0,65 mL'lik bir tüpün tabanını delin ve delinmiş tüpü steril bir 2 mL mikrofüj tüpünün içine yerleştirin. Jel dilimini 2 mL mikrofüj tüpünün içindeki delinmiş tüpe aktarın.
30. 0,65 mL delinmiş tüpü içeren 2 mL mikrofüj tüpünü santrifüj edin ve 2 mL mikrofüj tüpünün içindeki jel bulamacını toplamak için oda sıcaklığında 10.000 × g'da 2 dakika numune alın.
    NOT: Delinmiş tüp şimdi boş olmalı ve atılabilmelidir. Delinmiş tüpün içinde hala herhangi bir jel kalmışsa, delinmiş tüpü 2 mL mikrofüj tüpünün içine geri yerleştirin ve 2 dakika daha oda sıcaklığında 10.000 × g'de tekrar santrifüj yapın.
31. 2 mL mikrofüj tüpünün içindeki jel bulamacına, 300 μL buz gibi soğuk jel elüsyon Tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir nutator üzerinde en az 3 saat veya gece boyunca (12-16 saat) karıştırın.
32. Tüm sıvı ve jel bulamacı 0,22 μm'lik bir filtre kolonuna aktarın. 10.000 × g'da oda sıcaklığında 1 dakika santrifüj; toplanan hacim ~ 300 μL olmalıdır.
33. 450 μL (~ 1.5x numune hacmi) DNA Saflaştırma Boncukları ekleyin, bir nutator üzerinde 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve ardından bulamaç temizlenene kadar numuneyi manyetik rafa yerleştirin.
    NOT: DNA Saflaştırma Boncuklarını kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
34. Boncukları bozmadığınızdan emin olarak süpernatanın 500 μL'sini çıkarın ve atın.
35. Numuneyi manyetik raftan çıkarın ve boncukları 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Numunenin 200 μL'sini yeni bir PCR şerit tüpüne aktarın.
36. Şerit tüpünü manyetik rafa yerleştirin ve bulamaç temizlendikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
37. Tüplere 200 μL taze hazırlanmış, oda sıcaklığında% 80 etanol ekleyin ve 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın; % 80 etanol ile toplam iki yıkama için bu adımı tekrarlayın.
38. Tüpleri kısaca 100 × g'da döndürün. Tüpleri manyetik rafa geri yerleştirin ve bir pipet kullanarak kalan etanolleri çıkarın. Tüpler manyetik rafta kapak açıkken kalırken boncukları 5 dakikaya kadar hava ile kurulayın.
    NOT: 5 dakikalık kuruma süresini aşmayın, çünkü bu nihai DNA verimini önemli ölçüde azaltabilir.
39. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve pH 8'de 17 μL 0.1x TE ekleyerek DNA'yı boncuklardan süzün. İyice karıştırın ve tüpleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
40. Bulamaç temizlenene kadar tüpleri manyetik rafa yerleştirin. Bulamaç temizlendikten sonra, süpernatantın 15 μL'sini steril bir 0.2 mL PCR tüpüne dikkatlice aktarın.
41. Florometreyi kullanarak son kütüphane miktarını ölçün; sıralama için bu son kitaplığı kullanın.
    NOT: En fazla 48 kütüphane, en az 300 milyon 40 bp veya daha uzun çift uçlu okumalar sağlayan bir sıralama platformu kullanılarak tek bir şeritte bir araya getirilebilir ve sıralanabilir.

12. CUT&RUN dizi analizi

NOT: Bu bölümde, CUT&RUN dizi verilerini çözümlemek için kullanılan hesaplama protokolü sunulmaktadır. Protokol, hesaplamalı sanal ortamın kurulmasıyla başlar ve kullanıcılara yerel makinelerinde komutları yürütme konusunda yol gösterir. Bu protokol, yerel makineler, sanal bulut sunucuları ve yüksek performanslı bilgi işlem kümeleri gibi tüm hesaplama kaynaklarında çalışır. Bu makalede sunulan tüm CUT&RUN verilerine NCBI GEO'da GSE193803 katılım numarası altında erişilebilir.

1. CUT&RUN analizinin kaynak kodunu https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis'dan indirin.
   NOT: İş akışı en iyi MacOS veya Linux işletim sistemi sisteminde çalışır. Windows kullanıcıları iş akışını GitBash kullanarak çalıştırabilir ( bkz.
   1. Yeşil Kod düğmesine tıklayarak kodu GitHub sayfasından doğrudan indirin | ZIP seçeneğini indirin . Klasörü yerel makinede ilgili bir konuma açın.
2. Conda ortamını yükleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve yalnızca bir kez çalıştırın.
   NOT: Bu iş akışı, gerekli tüm yazılım ve araçları yüklemek için Conda komut satırı araç ortamını kullanır.
3. Conda yüklendikten sonra (yalnızca bir kez çalıştırın), aşağıdaki komutla sağlanan Ek Dosya 2'yi kullanarak sanal bir ortam oluşturun:
   conda create --name --file Supplementary_File_2.txt
4. Bu iş akışının aşağıdakileri kullanarak her yürütüleceği zaman sanal ortamı etkinleştirin:
   conda activate
5. Giriş ham FASTQ dosyalarını tek bir klasörde, ideal olarak CUT&RUN denemesi başına bir klasörde düzenleyin.

13. Hizalama için genom dosyasının oluşturulması

1. Hizalama için genom dosyası oluşturun (her genom dosyası için yalnızca bir kez çalıştırın). Tüm C. albicans genom dosyalarını kaydetmek için bir klasör oluşturun, örneğin:
   mkdir ca_genome_files

14. C. albicans genom derlemesinin indirilmesi 21

1. C. albicans genom derlemesi 21'i Candida Genom Veritabanı'ndan wget veya curl araçlarını kullanarak indirin (bkz.
   NOT: C. albicans assembly 21 burada CUT&RUN sonuçlarını, Assembly 21 ile hizalanmış daha önce yayınlanmış ChIP-chip sonuçlarıyla karşılaştırmak için kullanılmıştır. Kullanıcılar diğer derleme sürümlerini indirebilir ve hizalama ihtiyaçları için ilgili genom dosyalarını oluşturmak üzere benzer komutları çalıştırabilir.

15. Bir Bowtie 2 indeks veritabanı oluşturun (veritabanı adı: ca21)

1. Aşağıdakileri kullanın:
   bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
   bowtie2-inspect -s ca21

16. CUT&RUN analiz işlem hattını çalıştırın

1. İşlem hattının parametreleri hakkında bilgi edinmek için yardım bölümünü okuyun.
   bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. cut_n_run_pipeline.sh dosyasını ilgili parametrelerle yürütün

1. Komut dosyasını yürütün:
   bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
   NOT: Kodun 19-36. satırlarında ayrıntılı açıklamalar içeren ilgili parametreler, https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh GitHub sayfasında açıklanmıştır.

18. Çıktı dosyalarını düzenleyin

1. BedTools birleştirme işlevi^19'u kullanarak /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 konumunda bulunan MACS2 tarafından çağrılan tüm çoğaltmalardan önemli tepe noktalarını birleştirin.
   cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files sıralama -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o son, ortalama, ilk, ortalama, ortalama, ortalama > /yol/merged_output.bed
   NOT: Çoğaltılan örneklerde çakışan piklerin değerlendirilmesine ilişkin ek bilgi ve en iyi uygulamalar için lütfen Landt ve ark.20 ve Boyd ve ^ark.21'e bakın.

19. BedTools çıkarma işlevini kullanarak engellenen genomik bölgelerle eşleşmeleri kaldırın

1. Aşağıdakileri kullanın: subtractBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/ Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
   NOT: C. albicans genomundaki engellenen bölgeler, Ek Dosya 3'te bir .bed dosyası olarak sağlanır. Liste temel olarak C. albicans CUT&RUN, ChIP-seq ve ChIP-chip veri kümelerinde yaygın olarak yanlış pozitif sonuçlar veren telomerik tekrarlar ve sentromerler gibi yüksek oranda tekrarlayan dizi elemanlarından ve bölgelerinden oluşur. Bu nedenle, engellenen bölgelerin kaldırılması önerilir. Bununla birlikte, bazı protein hedefleri için, bu lokusları dışlamak uygun olmayabilir veya istenmeyen olabilir. Kullanıcılar, engellenen bu bölgelerde bulunan sinyalleri korumak veya kendi engellenenler listesindeki bölgeleri oluşturmak için bu adımı atlayabilir.

20. UCSC bigWigMerge işlevini kullanarak çoğaltmalardan BigWig dosyalarını birleştirin²²

1. Aşağıdakileri kullanın: bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig /all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
2. UCSC bedGraphToBigWig işlevini kullanarak BedGraph çıktısını bigWigMerge'den BigWig'e dönüştürün.
   bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

Representative Results

Bu sağlam CUT&RUN protokolü, C. albicans biyofilmlerinde ve planktonik kültürlerde spesifik TF'lerin genom çapında lokalizasyonunu araştırmak için uyarlanmış ve optimize edilmiştir (deneysel yaklaşıma genel bir bakış için Şekil 2'ye bakınız). Elde edilen CUT&RUN sıralama verilerinin analizini kolaylaştırmak için kapsamlı bir veri analizi işlem hattı da dahil edilmiştir ve kullanıcıların kodlama veya biyoinformatik konusunda minimum uzmanlığa sahip olmalarını gerektirir (analiz işlem hattına genel bir bakış için Şekil 3'e bakın). ChIP-çip ve ChIP-seq yöntemlerinin aksine, CUT&RUN, formaldehit çapraz bağlaması olmadan, önemli ölçüde azaltılmış sayıda giriş hücresinden hazırlanan sağlam, geçirgen çekirdekler kullanılarak gerçekleştirilir. Bozulmamış çekirdekleri C. albicans sferoplastlarından izole etmek, protokolde kritik bir adımdır. Lizikazı kullanarak C. albicans hücre duvarının sindirimi yoluyla verimli sferoplast, enzimatik sindirim reaksiyon koşullarının her hücre tipi için optimize edilmesi gerektiğinden zor olabilir. Bu nedenle, yüksek kaliteli dizileme sonuçlarıyla başarılı bir CUT&RUN deneyi sağlamak için, erken bir kalite kontrol adımı dahil edilir ve bozulmamış çekirdeklerin varlığı standart bir floresan mikroskobu kullanılarak doğrulanır.

Hücre duvarı sindirimi ve nükleer bütünlük, hem kontrol bozulmamış hücreleri hem de floresan hücre duvarı ve nükleik asit lekeleri ile boyanmış izole çekirdekleri görselleştirerek düzenli olarak değerlendirilir. Hücre duvarı boyamasının gözlenmediği izole edilmiş sağlam çekirdeklerin aksine, hem çekirdekler hem de hücre duvarları bozulmamış kontrol hücrelerinde floresan olarak etiketlenir (Şekil 4A). Son olarak, sıralamadan önce, CUT&RUN kütüphanelerinin parça boyutu dağılımı kılcal elektroforez cihazı kullanılarak değerlendirilir. Bu kalite kontrol adımı, CUT&RUN kütüphanelerinin kalitesini değerlendirmede güvenilir bir ölçüttür. Şekil 4B'nin üst panelindeki elektroforez izinde görüldüğü gibi, TF'leri araştıran deneyler için üretilen başarılı kütüphaneler, 280 bp'den küçük parçalar için yüksek zenginleştirme göstermektedir. Şekil 4B'nin alt panelindeki elektroforez izi, başarısız bir CUT&RUN deneyinin sonuçlarını temsil eder.

Burada, ~ 2.000 bp'deki zirve, esas olarak CUT & RUN deneyi sırasında yoğun şekilde hasar görmüş veya kırılan çekirdeklerden salınan sindirilmemiş DNA'dan kaynaklanmıştır. Kirletici adaptör dimerlerinin tamamen çıkarıldığını doğrulamak için havuza alınmış son kütüphanelerin parça boyutu dağılımının değerlendirilmesi de önerilir (Şekil 4C). Tipik olarak, kütüphane başına 5-10 milyon çift uçlu okuma (~ 40 temel okuma uzunluğu), C. albicans'taki çoğu TF CUT&RUN deneyi için yeterli sıralama derinliği sağlar. CUT&RUN kitaplıklarını sıralamak için çift uçlu veya tek uçlu alternatif sıralama okuma uzunlukları kullanılabilir. Örneğin, 25 ila 150 bp arasındaki çift uçlu okuma uzunlukları sonuçların kalitesini etkilememelidir. 150 bp'ye eşit veya daha büyük tek uçlu okumalar TF CUT&RUN denemeleri için de çalışmalıdır. Ancak, beraberindeki veri analizi işlem hattının tek uçlu okumalara uyum sağlayacak şekilde değiştirilmesi gerekir.

Bu CUT&RUN protokolü ve beraberindeki veri analizi boru hattı, C. albicans biyofilm oluşumunu kontrol eden iki TF, Ndt80 ve Efg1 araştırılarak doğrulandı. Şekil 4D'de gösterildiği gibi, Ndt80, EFG1 ORF'nin yukarı yönündeki intergenik bölgelere (önemli ölçüde zenginleştirilmiş Ndt80 ChIP-çip lokuslarını gösteren siyah çubuklarla vurgulanır) bağlanır. EFG1'in bu intergenik bölge yukarı akışının daha önce ChIP-chip⁴ tarafından biyofilm oluşumu sırasında Ndt80 bağlanması için oldukça zenginleştirilmiş olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, CUT&RUN deneyleri, bu bölgede ChIP çip deneylerinden önemli ölçüde daha fazla tepe noktası tespit etti (10 zirveye karşı 4 zirve). Ndt80 DNA bağlama motifleri, CUT&RUN tarafından tanımlanan tüm Ndt80'e bağlı lokuslarda zenginleştirilmiştir (Ek Şekil 1), bu metodoloji tarafından tanımlanan ek zirvelerin muhtemelen iyi niyetli Ndt80'e bağlı bölgeler olduğunu göstermektedir. Sistematik bir karşılaştırmalı analiz, sunulan bu CUT&RUN protokolünün, biyofilm oluşumu⁴ sırasında Ndt80 ve Efg1 için daha önce bilinen bağlanma olaylarının çoğunu başarıyla tanımladığını göstermiştir (Şekil 5).

Ayrıca, daha önce yayınlanan ChIP-çip deneylerinde yakalanmayan birçok yeni TF bağlama olayı CUT&RUN kullanılarak tanımlanmıştır (Şekil 5). Genel olarak, hem Ndt80 hem de Efg1, daha önce yayınlanmış ChIP çip verileriyle örtüşen lokuslara ve yalnızca CUT&RUN yöntemi kullanılarak tanımlanan lokuslara bağlıdır (bu CUT&RUN verileri ile Ndt80 ve Efg1 için daha önce yayınlanmış ChIP-çip verileri arasındaki örtüşmeler Şekil 5'teki Venn diyagramlarında özetlenmiştir). Ayrıca, önemli ölçüde pikler (FRiP skorları) olarak adlandırılan okumaların fraksiyonu, GFP etiketli örneklerde, kontrol IgG örneklerinden daha sürekli olarak daha yüksekti (Ek Şekil 2'ye bakınız). Özetle, bu sonuçlar burada açıklanan CUT&RUN protokolünün, düşük bolluktaki örneklerden C. albicans TF-DNA bağlanma etkileşimlerini araştırmak için optimize edilmiş sağlam bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Resim 1: C. albicans TF'lerinin epitop etiketlemesi. (A) İlgilenilen bir TF genini tanımlayın (bu durumda NDT80 ) ve ORF'nin 3' ucundaki Cas9'un (turuncu şekille temsil edilen) kesilmesini hedeflemek için bir gRNA seçin. (B) Kesim bölgesinden yukarı ve aşağı yönde >50 bp homolojiye sahip Candida klade için optimize edilmiş eGFP, DSB'yi onarmak için dDNA'yı sağlayacaktır. (C) Amaçlanan entegrasyonu onaylamak için bireysel kolonileri taramak için koloni PCR'sini kullanın. Astarlar kırmızı oklarla gösterilir ve amplikler kesikli kutularla gösterilir. Bu rakam BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Kısaltmalar: TF = transkripsiyon faktörü; gRNA = kılavuz RNA; ORF = açık okuma çerçevesi; eGFP = gelişmiş yeşil floresan proteini; DSB = çift sarmallı kopma; ABD = yukarı akış; DS = aşağı akış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CUT&RUN deneysel protokolüne şematik genel bakış. C. biyofilm veya planktonik kültür koşullarından toplanan albicans hücreleri, sağlam çekirdekleri izole etmek için geçirgenleştirilir. ConA boncukları aktive edilir ve bozulmamış çekirdekler daha sonra aktive edilmiş ConA boncuklarına bağlanır. İlgilenilen antikor, boncuk bağlı çekirdeklere eklenir ve 4 ° C'de inkübe edilir. Daha sonra, pAG-MNaz eklenir ve hedef antikora bağlanmasına izin verilir. CaCl_2'nin eklenmesinden sonra, pAG-MNaz aktive edilir ve hedeflenen kromatin sindirimi, pAG-MNaz'ı inaktive etmek için şelatlama reaktifinin eklenmesine kadar devam eder. pAG-MNaz'a bağlı antikor kompleksinin geçirgenleştirilmiş çekirdeklerden dışarı yayılmasına izin verilir ve elde edilen DNA ekstrakte edilir ve temizlenir. Dizileme kütüphaneleri CUT & RUN ile zenginleştirilmiş DNA parçalarından hazırlanır ve elde edilen kütüphaneler daha sonra dizilemeden önce kirletici adaptör dimerlerini ayırmak ve çıkarmak için% 10'luk bir PAGE jel üzerinde çalıştırılır. Bu rakam BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Kısaltmalar: CUT&RUN = hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma; ConA = concanavalin A; PAGE = poliakrilamid jel elektroforezi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CUT&RUN veri analizi işlem hattına şematik genel bakış. İş akışı, FastQC kullanarak ham FASTQ dosyaları üzerinde kalite kontrolleri gerçekleştirerek başlar ve ardından sıralama bağdaştırıcılarını kaldırmak için kırpma yapar. Kırpılmış okumalar daha sonra referans genomuna hizalanır ve hizalanmış okumalar, TF boyutlu bağlama sinyalleri için zenginleştirilmek üzere boyutlarına göre filtrelenir (20 bp ≤ hizalanmış okuma ≤ 120 bp). Boyut olarak seçilen okumalar daha sonra ani Escherichia coli okumalarına karşı kalibre edilir ve kalibre edilmiş okumalar MACS2 kullanılarak tepe noktalarını çağırmak için kullanılır. <> sembolü, C. albicans okuma sayımlarının her numune için E. coli okuma sayıları kullanılarak kalibre edildiğini gösteren görsel bir temsildir. Kısaltmalar: CUT&RUN = hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma; TF = transkripsiyon faktörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Başarılı CUT&RUN deneyleri için kritik kalite kontrol adımları . (A) Hücreler, çekirdek izolasyonundan önce ve sonra floresan hücre duvarı (mavi) ve nükleik asit (yeşil) lekeleri ile boyanır ve floresan mikroskop kullanılarak görselleştirilir. (B) CUT&RUN TF kütüphaneleri kılcal elektroforez cihazı kullanılarak analiz edilir. Başarılı CUT&RUN TF kütüphaneleri (yeşil onay işareti ile gösterilir) 200 bp'den küçük kısa parçalar için zenginleştirilmiştir. Optimal olmayan CUT&RUN TF kütüphaneleri (kırmızı "X" ile gösterilir) büyük DNA fragmanları için zenginleştirme gösterir. (C) 48 CUT&RUN kütüphanesi bir araya getirilir ve kılcal elektroforez cihazı kullanılarak analiz edilir. Yüksek kaliteli, havuza alınmış kitaplıklar (yeşil onay işaretiyle gösterilir) bağdaştırıcı dimerleri (şerit 1) içermezken, düşük kaliteli havuza alınmış kitaplıklar (kırmızı "X" ile gösterilir) az miktarda bağdaştırıcı dimerini (şerit 2) korur. (D) EFRG ORF'nin ( Orf19.610 ) yukarı akan intergenik bölgesinde Ndt80 bağlaması (üst kanal) için önemli bir zenginleştirme gösteren CUT&RUN veri kümelerinden (Ndt80 IgG kontrolü, alt iz dahil) temsili IGV izleri. Siyah çubuklar, daha önce yayınlanmış ChIP-çip deneyleri⁴ tarafından tanımlanan önemli ölçüde zenginleştirilmiş Ndt80 bağlanma zirvelerini temsil eder. Mavi çubuklar, burada sunulan CUT&RUN deneylerinde tanımlanan önemli ölçüde zenginleştirilmiş Ndt80 bağlanma zirvelerini temsil eder. Ölçek çubukları = 50 μm (A). Kısaltmalar: CUT&RUN = hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma; TF = transkripsiyon faktörü; GFP = yeşil floresan protein; ORF = açık okuma çerçevesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Sunulan CUT&RUN protokolü ve Candida albicans biyofilmleri üzerindeki veri analizi boru hattı kullanılarak tanımlanan Ndt80 ve Efg1 zenginleştirilmiş piklerin değerlendirilmesi. Üst satırdaki Venn diyagramları, daha önce yayınlanmış ChIP-çip verileri⁴ ile CUT&RUN aracılığıyla tanımlanan Ndt80 ve Efg1 bağlama siteleri arasındaki örtüşme derecesini göstermektedir. Ndt80 ve Efg1 için tüm bağlama olayları için CUT&RUN sinyalleri alt satırda renkli ısı haritaları olarak gösterilir (kırmızı = yüksek tepe sinyali; mavi = düşük / tepe sinyali yok; renkli çubuk GFP sinyalinden çıkarılan IgG sinyalini gösterir); Isı haritalarında 1.000 bp yukarı akış (-1,0 kb) ve aşağı akış (+1,0 kb) bölgesi görüntülenir. Bir profil grafiği olarak sinyal yoğunluğu (yani zenginleştirme), ısı haritalarının üzerinde gösterilir. CUT&RUN zenginleştirmesini görselleştirmek için Ndt80 ve Efg1 için üç biyolojik replika değerlendirildi. Kısaltmalar: ChIP = kromatin immünopresipitasyonu; CUT&RUN = hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Evrensel A ve benzersiz B parçalarını yükseltmek için PCR reaksiyon karışımı ve PCR döngü koşulları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: PCR reaksiyon karışımı ve PCR döngü koşulları, tam uzunlukta C fragmanı oluşturmak için A ve B parçalarını dikmek için. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 3: PCR'den PCR'ye döngü koşulları, tam uzunluktaki C parçasını yükseltir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: Donör DNA GFP etiketini yükseltmek için PCR reaksiyon karışımı ve PCR döngü koşulları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 5: Plazmid sindirim reaksiyonu karışımı ve plazmid sindirim reaksiyonları için reaksiyon koşulları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 6: Koloni PCR için PCR reaksiyon karışımı ve PCR döngü koşulları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 7: Sıralamaya hazırlık aşamasında kütüphanenin son onarım adımı için PCR bisiklet koşulları. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 8: Dizileme kütüphanelerini hazırlamak için giriş DNA'sı için adaptör seyreltme önerileri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 9: PCR'den PCR'ye döngü koşulları, adaptöre bağlı DNA'yı yükseltir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Ndt80 DNA bağlanma dizisi motif zenginleştirme. Biyofilm ChIP-çip verilerinde (koyu mavi noktalı çizgi) veya CUT & RUN verilerinde (açık mavi noktalı çizgi) tanımlanan Ndt80'e bağlı lokuslar için kümülatif Ndt80 motif zenginleştirme skorları, rastgele intergenik lokuslara (kırmızı noktalı çizgi) kıyasla karşılaştırılmıştır. Sol taraftaki Y ekseni, X ekseninde karşılık gelen kümülatif motif puanını içeren her veri kümesi için toplam lokus yüzdesini gösterir. Kesikli çizgiler, X ekseni üzerindeki her noktada motif puanı zenginleştirmenin (-log10 P-değeri, sağ Y ekseni) rastgele intergenik kontrol lokuslarına göre önemini gösterir. Kümülatif motif puanları ve P-değerleri MochiView²³ kullanılarak belirlenmiştir (bkz. Tüm Ndt80'e bağlı lokuslar, ChIP çipi ve CUT & RUN veri kümeleri içinde Ndt80 bağlanmasının her zirvesinin altında ortalanmış 500 bp pencereler olarak örneklendi ve uzunluktaki farklılıkları kontrol etmek için rastgele seçilen 500 bp intergenik lokuslarla karşılaştırıldı. Kısaltmalar: ChIP = kromatin immünopresipitasyonu; ChIP-çip = kromatin immünopresipitasyonu ve ardından mikrodizi; CUT&RUN = hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Örnek başına bir tepe puanı içindeki okumaların oranı. Her çoğaltma için FRiP puanını gösteren çubuk grafiği. FRiP puanları, bir tepe noktasındaki eşlenen okuma sayısının, bir CUT&RUN örneğindeki toplam eşlenen okuma sayısına bölünmesiyle hesaplanır. Farklı çubuk renkleri, X ekseni boyunca belirtildiği gibi bireysel biyolojik replikasyon örneklerini temsil eder. Beklendiği gibi, pozitif GFP örneklerinin FRiP skorları, negatif IgG örneklerinden sürekli olarak daha yüksektir. Tüm örnekler, Landt ve ^ark.20 tarafından belirlenen önerilere göre kabul edilebilir FRiP eşiklerini (% >1) göstermektedir. Kısaltmalar: FRiP = bir tepe noktası içindeki okumaların kesri; CUT&RUN = hedeflerin altında bölünme ve nükleaz kullanılarak serbest bırakma. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: Kullanılan tüm tamponlar ve çözeltiler için tarifler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Veri analizi işlem hattı için gerekli biyoinformatik araçlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: C. albicans genomunda önerilen engellenen bölgeler. Bloke edilmiş lokusların bu listesi öncelikle yüksek oranda tekrarlayan dizi elemanlarını ve önceki genom çapında bağlanma deneylerinde tarihsel olarak yanlış pozitif sonuçlar veren telomerik tekrarlar ve sentromerler gibi bölgeleri içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Bu protokol, C. albicans'taki düzenleyici TF'lerin genom çapında lokalizasyonu için kapsamlı bir deneysel ve hesaplamalı boru hattı sunmaktadır. Standart mikrobiyoloji ve moleküler biyoloji eğitimi alan herkes için oldukça erişilebilir olacak şekilde tasarlanmıştır. CUT&RUN testinin yüksek dinamik aralığından ve düşük numune girdisi gereksinimlerinden yararlanarak ve C. albicans biyofilm ve planktonik kültürlerde TF-DNA bağlanma etkileşimlerinin lokalizasyonu için optimizasyonlar içererek, bu protokol geleneksel ChIP-seq yaklaşımlarına güçlü ve düşük maliyetli bir alternatif sunar. ChIP-seq ile karşılaştırıldığında, CUT&RUN önemli ölçüde daha yüksek hassasiyet sağlar, bağlı piklerle eşlenen sıralama okumalarının daha yüksek bir oranıyla, yüksek verime daha uygundur, önemli ölçüde daha düşük giriş hücresi sayıları gerektirir, toksik çapraz bağlama ajanlarının kullanılmasını gerektirmez ve yüksek kaliteli sonuçlar üretmek için numune başına on kat daha az sıralama okuması gerektirir^{13,14,17, 23,24}. Bu protokolün numune başına maliyetini daha da azaltmak için, tampon ve ortam tarifleri, gerekli tüm tamponların ve ortamların şirket içinde hazırlanmasını ve temel reaktiflerin toplu olarak tedarik edilmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı bir reaktif listesiyle birlikte dahil edilmiştir. C. albicans biyofilm oluşumu, fenotipik anahtarlama ve kommensalizmin tümü karmaşık iç içe geçmiş transkripsiyonel ağlar^tarafından düzenlendiğinden, bu sağlam, kolay ve uygun maliyetli CUT & RUN protokolü, bu önemli insan mantar patojenindeki bu ve diğer birçok hücresel süreci anlamak için güçlü ve yeni bir araç sağlar.

TF'ler, histonlar veya diğer kromatinle ilişkili proteinler kadar bol değildir, bu da CUT & RUN aracılığıyla TF-DNA bağlanma etkileşimlerini araştırmak için benzersiz bir zorluk yaratır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, standart CUT&RUN deneysel protokolü^13'te kritik ayarlamalar ve optimizasyonlar yapıldı. TF'leri hedef alan en başarılı CUT&RUN deneyleri, ölçülemeyecek kadar seyreltilmiş ve genellikle 150 bp^13,23'ten küçük parçalar için zenginleştirilmiş az miktarda DNA verdiğinden^, kütüphane hazırlama reaksiyon koşulları da bu küçük parçaları destekleyecek şekilde optimize edilmiştir ²⁷. Bu optimizasyon adımında bile, ortaya çıkan PCR ile güçlendirilmiş kütüphaneler, manyetik boncuk tabanlı DNA boyutu seçim yöntemleri kullanılarak tamamen çıkarılmayan adaptör dimerlerinin önemli bir bölümünü içerir. Bu sorunu gidermek için, büyük ölçüde bağdaştırıcı dimerlerinden yoksun olan son sıralamaya hazır kitaplıklar oluşturmak üzere bir PAGE jel boyutu seçimi adımı eklenmiştir. Bu, protokolün kritik bir adımıdır, çünkü daha küçük TF türevi CUT&RUN parçalarını korurken adaptör dimerlerini çıkarmak, yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için gereklidir.

Ayrıca, ayrıntılı hesaplama işlem hattı, CUT&RUN tahlilindeki TF-DNA bağlama etkileşimlerinden elde edilen daha küçük okumalara odaklanmak için sıralama verilerini filtreler. Bu TF'ye özgü ayarlamalar nedeniyle, bu protokol nükleozomlar gibi kromatinle ilişkili büyük komplekslerin profilini çıkarmak için önerilmez. Ticari olarak temin edilebilen kütüphane hazırlık kitine dahil edilen standart kütüphane hazırlama protokolünü izleyerek protokolü bu amaç için uyarlamak teorik olarak mümkün olsa da, kullanıcının hesaplama işlem hattında bulunan sıralama sonrası boyut seçimini ayarlaması gerekir. Özellikle, kod dosyası cut_n_run_pipeline.sh boyut filtreleme bölümünde, analiz işlem hattının diğer kromatin-DNA bağlanma etkileşimleri için oluşturulan dizileme sonuçlarını analiz etmesini sağlamak için kullanıcıların "14400" (120 bp * 120 bp) geçerli değerini istenen parça uzunluğunun karesiyle değiştirmeleri gerekir.

Başarılı bir CUT&RUN denemesindeki bir diğer önemli adım, en uygun sıralama sonrası veri analizi parametrelerini seçmeyi içerir. Hesaplamalı işlem hattının çoğu, C. albicans'ı ilgilendiren herhangi bir düzenleyici TF'nin incelenmesi için standartlaştırılmış ve uygulanabilir olacak şekilde tasarlanmış olsa da, kullanıcının işlem hattını çalıştırırken değerlendirmesi gereken iki önemli husus vardır. İlk husus, bağlı hedef sitelerin tanımlanmasından önce sıralama verilerinden yinelenen okumaların dahil edilip edilmeyeceği veya kaldırılıp kaldırılmayacağıdır. Düşük bolluktaki TF'ler tipik olarak, kitaplık yükseltme adımı sırasında PCR çoğaltmasından türetilen okumaların önemli bir yüzdesini içeren sıralama verileri vereceğinden, PCR kopyalarının kaldırılması sonuçlar üzerinde önemli ölçüde olumsuz bir etkiye sahip olabilir. Bununla birlikte, oldukça bol miktarda TF veya kromatin ile ilişkili proteinlerle, PCR kopyaları tipik olarak toplam okuma sayısının daha küçük bir bölümünü temsil eder ve verilerdeki arka plan gürültüsünü bastırmak için sıklıkla kaldırılır. Nihayetinde, PCR kopyalarını tutma veya kaldırma kararı, ilgilenilen TF'ye ve elde edilen sıralama verilerinin derinliğine bağlıdır. Böylece, işlem hattı, PCR yinelenen okumaları olan veya olmayan veriler için otomatik olarak bağımsız çıktı dosyaları oluşturur, böylece kullanıcı her deney için hangi çıktı dosyalarının en iyi sonuçları vereceğine karar verebilir.

İkinci husus, hem deneysel (ilgilenilen proteine karşı antikor) hem de negatif kontrol (IgG) örneklerinde önemli, ancak oldukça değişken zenginleştirme sağlayan sorunlu lokusların tanımlanıp çıkarılmayacağıdır. Tepe noktası çağırma algoritması, hem deneysel hem de kontrol örneklerinde önemli ölçüde zenginleştirilmiş lokusları tanımlamak için MACS2'yi kullanır ve her ikisinde de görünenleri hariç tutar. Bu yaklaşım tipik olarak en sorunlu lokusları ortadan kaldırırken, önceki deneyimler TF zenginleştirmenin gerçek pozitif bölgeleri olma ihtimalinin düşük olduğunu gösterse de, bazıları bazen belirli deneylerde önemli zirveler olarak ortaya çıkar. Böylece, "engellenen" lokuslar olarak adlandırılan bu sorunlu lokusları kaldırmak için isteğe bağlı bir filtreleme adımı sağlanır. Bloke edilmiş lokusların listesi öncelikle yüksek oranda tekrarlayan dizi elemanları ve telomerik tekrarlar ve sentromerler gibi önceki genom çapında bağlanma testlerinde tarihsel olarak yanlış pozitif sonuçlar veren bölgeleri içerir. Bu, yüksek güvenle sorunlu olarak atanan çok muhafazakar bir lokus listesidir. Ancak, her kullanıcı bu filtrenin denemeleri için uygun olup olmadığını duruma göre değerlendirmelidir. IgG negatif kontrolüne potansiyel bir alternatif, DNA'ya bağlanmayan nükleer lokalize bir proteine karşı CUT & RUN yapmak olacaktır. Bu yaklaşımın ChIP deneyleri²⁸ için ideal bir kontrol olduğu gösterilmiştir ve benzer bir yaklaşım CUT&RUN için de dikkate değerdir.

CUT&RUN, yüksek ökaryotlarda protein-DNA etkileşimlerini araştırmak ve model maya Saccharomyces cerevisiae'yi araştırmak için popüler bir seçenek haline gelmiştir. Burada, klinik olarak ilişkili mantar patojeni C. albicans'ta genom çapında TF-DNA bağlanma etkileşimlerini araştırmak için başarıyla uyarlanmıştır. Bu protokol, epitop etiketli TF'leri ifade eden suşların mühendisliğinden, elde edilen CUT&RUN sıralama verilerinin hesaplamalı analizine kadar gerekli tüm deneysel ve hesaplama prosedürleri için ayrıntılı yöntemler sağlar. Genel olarak, bu protokol ve beraberindeki veri analizi boru hattı, düşük bolluktaki biyofilm örneklerinden izole edilen hücrelerin karmaşık multimorfik popülasyonlarını kullanırken bile sağlam TF-DNA bağlanma profilleri üretir ve ChIP-seq metodolojilerinden daha düşük bir genel maliyetle üstün veri kalitesi sağlar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Millipore Sigma	SLGPM33RS
0.65 mL low-adhesion tubes	VWR	490003-190
1 M CaCl2	Fisher Scientific	50-152-341
1 M PIPES	Fisher Scientific	AAJ61224AK
12-well untreated cell culture plates	Corning	351143
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	60-24-2
2% Digitonin	Fisher Scientific	CHR103MI
50 mL conical tubes	VWR	89039-658
5x phusion HF buffer	Fisher Scientific	F530S	Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as "DNA polymerase buffer"
Agar	Criterion	C5001
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter	A63880
Agilent Bioanalyzer	Agilent	G2939BA	Referred to in the text as "capillary electrophoresis instrument"; user-dependepent
Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific	VWR	89133-910
Bacto peptone	BD Biosciences	211677
Benchling primer design tool	Benchling		https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as "the primer design tool"
Betaine	Fisher Scientific	AAJ77507AB
Calcofluor white stain	Sigma-Aldrich	18909-100ML-F
Candida Genome Database			http://www.candidagenome.org/
Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads	Polysciences	86057-3
Conda software			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN kit	Epicypher	14-1048	Referred to in the text as "the CUT&RUN kit"
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)	New England Biolabs	N0447S
Dextrose (D-glucose)	Fisher Scientific	D163
Difco D-mannitol	BD Biosciences	217020
Disposable cuvettes	Fisher Scientific	14-955-127
Disposable transfer pipets	Fisher Scientific	13-711-20
DNA Gel Loading Dye (6x)	Fisher Scientific	R0611
DreamTaq green DNA polymerase	Fisher Scientific	EP0713	Referred to in the text as "cPCR DNA polymerase"
DreamTaq green DNA polymerase buffer	Fisher Scientific	EP0713	Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as "cPCR DNA polymerase buffer"
E. coli spike-in DNA	Epicypher	18-1401
ELMI Microplate incubator	ELMI	TRMS-04	Referred to in the text as "microplate incubator"
End Prep Enzyme Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
End Prep Reaction Buffer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Ethanol 200 proof	VWR	89125-170
FastDigest MssI	Fisher Scientific	FD1344	Referred to in the text as "restriction enzyme"
FastDigest MssI Buffer	Fisher Scientific	FD1344	Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as "restriction enzyme buffer"
Ficoll 400	Fisher BioReagents	BP525-25
Fluorescence microscope			User-dependent
Gel electrophoresis apparatus			User-dependent
GeneRuler low range DNA ladder	Fisher Scientific	FERSM1192
GitBash workflow			https://gitforwindows.org/
GitHub source code			https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5	Boston BioProducts	BBH-75-K
High-speed centrifuge			User-dependent
Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1830-4
Lens paper	VWR	52846-001
Ligation Enhancer			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit
Lithium acetate dihydrate	MP Biomedicals	215525683
Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody	Takara	632592	User-dependent
MACS2			https://pypi.org/project/MACS2/
Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes	Epicypher	10-0008
Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes	Fisher Scientific	MR02
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Microcentrifuge tubes 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Microplate and cuvette spectrophotometer	BioTek	EPOCH2TC	Referred to in the text as "spectrophotometer"; user-dependent
MochiView			http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
NaCl	VWR	470302-522
NaOH	Fisher Scientific	S318-500
NCBI GEO			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Adaptor for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Adapter"
NEBNext Index X Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer"
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)	New England Biolabs	E7335S
NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit	New England Biolabs	E7645S	Referred to in the text as "library prep kit"
NEBNext Universal PCR Primer for Illumina			Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as "Universal Forward Library Amplification Primer"
Nourseothricin sulfate (NAT)	Goldbio	N-500-2
Novex TBE Gels, 10%, 15 well	Fisher Scientific	EC62755BOX
Nutating mixer	VWR	82007-202
Nutrient broth	Criterion	C6471
pADH110	Addgene	90982	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90982"
pADH119	Addgene	90985	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90985"
pADH137	Addgene	90986	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90986"
pADH139	Addgene	90987	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90987"
pADH140	Addgene	90988	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 90988"
pAG-MNase	Epicypher	15-1016 or 15-1116	50 rxn or 250 rxn
pCE1	Addgene	174434	Referred to in the text as "plasmid repository ID# 174434"
Petri dishes with clear lid	Fisher Scientific	FB0875712
Phusion high fidelity DNA polymerase	Fisher Scientific	F530S	Referred to in the text as "DNA polymerase"
Polyethylene glycol (PEG) 3350	VWR	10791-816
Potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	P285-500
Qubit 1x dsDNA HS assay kit	Invitrogen	Q33230
Qubit fluorometer	Life Technologies	Q33216	Referred to in the text as "fluorometer"; user-dependent
Rabbit IgG negative control antibody	Epicypher	13-0042
RNase A	Sigma-Aldrich	10109169001
Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets	Sigma-Aldrich	5056489001
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R6504
Shaking incubator	Eppendorf	M12820004	User-dependent
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
Spin-X centrifuge tube filters	Fisher Scientific	07-200-385
Sterile inoculating loops	VWR	30002-094
SYBR Gold nucleic acid gel stain	Fisher Scientific	S11494
SYTO 13 nucleic acid stain	Fisher Scientific	S7575	Referred to in the text as "nucleic acid gel stain"
Thermocycler			User-dependent
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000023
Tris (hydroxymethyl) aminomethane	Sigma-Aldrich	252859-100G
Ultra II Ligation Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Ligation Master Mix"
Ultra II Q5 Master Mix			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "High Fidelity DNA Polymerase Master Mix "
UltraPure salmon sperm DNA solution	Invitrogen	15632011
USER Enzyme			Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as "Uracil Excision Enzyme"
Vortex mixer	VWR	10153-834
wget tool			http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz
Yeast extract	Criterion	C7341
Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)	Fisher Scientific	NC0439194