Summary
Detta protokoll beskriver metoden för att genetiskt ablate retinal pigmentepitel (RPE) med hjälp av en transgen zebrafiskmodell. Att anpassa protokollet för att införliva signalvägsmodulering med hjälp av farmakologiska föreningar är utförligt detaljerat. En MATLAB-plattform för kvantifiering av RPE-regenerering baserat på pigmentering har utvecklats och presenteras och diskuteras.
Abstract
Retinal pigmentepitelet (RPE) finns på baksidan av ögat och utför funktioner som är väsentliga för att upprätthålla hälsan och integriteten hos intilliggande retinala och vaskulära vävnader. För närvarande har den begränsade reparativa kapaciteten hos däggdjurs RPE, som är begränsad till små skador, hindrat framsteg mot att förstå RPE-regenerativa processer in vivo . Här tillhandahålls en detaljerad metod för att underlätta studien av in vivo RPE-reparation med zebrafisken, en ryggradsdjursmodell som kan robust vävnadsregenerering. Detta protokoll beskriver ett transgent nitroreduktas/metronidazol (NTR/MTZ)-medierat skadeparadigm (rpe65a:nfsB-eGFP), vilket resulterar i ablation av de centrala två tredjedelarna av RPE efter 24 timmars behandling med MTZ, med efterföljande vävnadsåterhämtning. Fokus läggs på RPE-ablationer i larvzebrafiskar och metoder för att testa effekterna av farmakologiska föreningar på RPE-regenerering beskrivs också. Generering och validering av RpEGEN, ett MATLAB-skript skapat för att automatisera kvantifiering av RPE-regenerering baserat på pigmentering, diskuteras också. Utöver aktiva RPE-reparationsmekanismer kan detta protokoll utvidgas till studier av RPE-degenerering och skaderespons samt effekterna av RPE-skador på intilliggande retinala och vaskulära vävnader, bland andra cellulära och molekylära processer. Detta zebrafisksystem har ett betydande löfte om att identifiera gener, nätverk och processer som driver RPE-regenerering och RPE-sjukdomsrelaterade mekanismer, med det långsiktiga målet att tillämpa denna kunskap på däggdjurssystem och i slutändan mot terapeutisk utveckling.
Introduction
Metoden som beskrivs här beskriver ett protokoll för att genetiskt ablate retinal pigmentepitel (RPE) med hjälp av larvzebrafisk. RPE sträcker sig över ögats baksida och ligger mellan de stratifierade skikten i den neurala näthinnan och skiktet av vaskulatur som utgör koroiden. Trofiskt stöd, absorption av fototoxiskt ljus och underhåll av visuella cykelproteiner är bara några av de kritiska funktioner som RPE utför som är väsentliga för att upprätthålla hälsan och integriteten hos dessa intilliggande vävnader1. Skador på däggdjurs RPE kan repareras när lesionerna är små2; Skador som drabbas av större skador eller progressiv degenerativ sjukdom är dock irreversibla. Hos människor leder RPE-degenerativa sjukdomar (t.ex. åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och Stargardts sjukdom) till permanent synförlust och, med få behandlingsalternativ tillgängliga, minskad patientlivskvalitet. Den begränsade förmågan för däggdjurs RPE att självreparera har skapat en kunskapslucka inom RPE-regenerativa processer. Med tanke på zebrafiskens robusta regenerativa kapacitet över många olika vävnadstyper utvecklades detta protokoll för att upprätta ett in vivo ryggradsdjurssystem för att underlätta studier om inneboende regenererande RPE och avslöja mekanismer som driver det svaret. Med hjälp av ablationsparadigmet som beskrivs här har den kanoniska Wnt-signalvägen3, mTOR-vägen4 och immunrelaterade svar5 identifierats som kritiska mediatorer för RPE-regenerering, sannolikt med överlappande funktioner.
I detta genetiska ablationsparadigm uttrycker Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafiskar den bakteriehärledda nitroreduktasgenen (NTR/nfsB)6 smält samman med eGFP under kontroll av RPE-förstärkarelementet, rpe65a7. Ablation uppnås genom tillsats av prodrug, metronidazol (MTZ), till systemvattenhus zebrafisk. Intracellulär aktivering av MTZ genom nitroreduktas resulterar i DNA-tvärbindning och apoptos i NTR/nfsB-uttryckande celler 8,9. Denna teknik har använts i stor utsträckning i zebrafisk för att ablatera celler i näthinnan 10,11,12,13 och andra vävnader 8. Tillsammans möjliggör dessa element riktat uttryck (rpe65a) av en inducerbar cellablationsmetodik (NTR / MTZ) 8,9 och en fluorescerande markör (eGFP) för visualisering.
Andra intressanta in vivo-modeller finns också som kan användas för att studera RPE14: s regenerativa potential. Dessa är breda och inkluderar RPE-till-näthinnan-transdifferentiering efter retinektomi hos amfibier, där RPE-celler som förlorats till retinal återväxt ersätts15,16; RPE-restaurering efter skada i "superläkning" MRL / MpJ-mus17; och exogen stimulering av RPE-proliferation i en råttmodell av bland annat spontan RPE och retinal degeneration18. In vitro-modeller, såsom vuxna humana RPE-stamceller (RPESC)19 har också utvecklats. Dessa modeller är alla värdefulla verktyg som arbetar för att avslöja de cellulära processerna relaterade till RPE-regenerering (t.ex. spridning, differentiering etc.); Zebrafisken är dock unik i sin kapacitet för inneboende RPE-reparation efter ablation.
Medan metoden här är skriven för att fokusera på att förstå mekanismerna som driver RPE-regenerering, kan Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) - linjen och detta genetiska ablationsprotokoll användas för att studera andra cellulära processer som RPE-apoptos, RPE-degeneration och effekten av RPE-skada på intilliggande retinala och vaskulära vävnader. Ablationsprotokollet kan också modifieras för att inkludera farmakologisk manipulation, vilket är en bekväm preliminär strategi för att screena signalvägar av intresse. Till exempel har blockering av den kanoniska Wnt-vägen med hjälp av Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20 visat sig försämra RPE-regenerering3. Detta upprepades här för att vägleda användare genom ett farmakologiskt manipulationsexperiment och fungera som proof-of-concept för att validera ett MATLAB-skript (RpEGEN) skapat för att kvantifiera RPE-regenerering baserat på återvinning av pigmentering. Liksom det transgena linje- och ablationsprotokollet är RpEGEN-skripten anpassningsbara och kan användas för att kvantifiera andra markörer / cellulära processer inom RPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här är förenliga med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Pittsburgh.
1. Beredning före insamling av zebrafiskembryo
- Ställ in embryoinkubatorn på 28,5 °C.
- Bereda en 25x stamlösning av melanogeneshämmaren, N-fenylthiourea (PTU)21,22. Denna stamlösning skalas från ett vanligt recept22 och 1x är lika med 0,003% vikt per volym (% w / v) (t.ex. 0,003 g PTU-pulver till 100 ml flytande lösningsmedel).
- För att göra en stor 25x PTU-stamlösning, tillsätt 0,75 g PTU-pulver till 1 liter renat avjoniserat vatten (nedan kallatdH2O) och blanda noggrant vid rumstemperatur (~ 25 ° C) med en omrörningsstång och omrörningsplatta. Förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader skyddad från ljus.
OBS: Det är svårt att få PTU att gå in i vattenlösning och förlängd omrörning över natten kan vara nödvändig.
VARNING: PTU är farligt och försiktighet bör vidtas för att förhindra intag, inandning och/eller kontakt med hud eller ögon. PTU-pulver och alla PTU-flytande derivat som beskrivs här kan behöva kasseras som kemiskt avfall beroende på statliga och institutionella bestämmelser. Bekräftelse av lämpliga metoder för bortskaffande av PTU-avfall, om sådana finns, rekommenderas före användning. - För att göra en 1,5x PTU-arbetslösning (nedan kallad 1,5x PTU), tillsätt 60 ml 25x PTU-stamlösning till 940 ml zebrafiskhusvatten (nedan kallat systemvatten). Optimala vattenkvalitetsparametrar för zebrafiskar har beskrivits23 och vattenanläggningar bör ha standardiserade vattenövervakningsförfaranden. Förvara 1,5x PTU vid 28,5 ° C i 1-2 veckor skyddad från ljus.
OBS: Detta protokoll utförs rutinmässigt med hjälp av de PTU-koncentrationer, lösningsmedel och lagringsparametrar som beskrivs i steg 1.2. Som en försiktighetsåtgärd bör embryon/larver observeras var 1-2:e dag under PTU för att validera effekten och bekräfta ihållande depigmentering. Upplösning och/eller lagringsförhållanden bör optimeras om minskning av PTU-lösligheten/effekten misstänks.
- För att göra en stor 25x PTU-stamlösning, tillsätt 0,75 g PTU-pulver till 1 liter renat avjoniserat vatten (nedan kallatdH2O) och blanda noggrant vid rumstemperatur (~ 25 ° C) med en omrörningsstång och omrörningsplatta. Förvaras vid 4 °C i upp till 3 månader skyddad från ljus.
- Bered en stamlösning av 0,05 % viktprocent metylenblått, en svamptillväxthämmare, genom tillsats av 0,05 g metylenblått pulver till 100 mldH2O. Blanda noggrant med en omrörningsstång och omrörningsplatta. Förvara vid 4 °C.
- Förbered pipetter för embryo/larvmanipulation (t.ex. att flytta embryon/larver mellan petriskålar, separera larver under fluorescensscreening, samla avlivade larver i mikrocentrifugrör för fixering etc.) genom att skära ner den avsmalnande änden av en Pasteurpipett av glas med hjälp av en diamantspetspenna. Etsa runt pipettens omkrets med diamantpennan och dra försiktigt eller knäpp av änden för att göra en ren paus.
OBS: Pipettens mun ska vara slät och tillräckligt bred för att enkelt ta upp ett embryo som fortfarande är inne i korionen utan att skjuvning. Använd en lampdragöverföringspipett som ett alternativ. Beredda pipetter kan också användas för att avlägsna vätska under vattenförändringar (snarare än att hälla) för att minimera embryo / larvförlust. - Förbered en 4% paraformaldehydlösning (PFA) i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (t.ex. tillsätt 10 ml 16% PFA till 4 ml 10x PBS och 26 mldH2O). Förvaras vid 4 °C i upp till 4 veckor skyddad mot ljus.
VARNING: Paraformaldehyd är en farlig kemikalie och bör hanteras i en kemisk dragskåpa och kasseras på rätt sätt. Försiktighet bör iakttas och personlig skyddsutrustning (PPE) bör bäras för att förhindra intag, inandning och / eller kontakt med huden eller ögonen.
2. Insamling och underhåll av zebrafiskembryon före genetisk ablation (0-5 dagar efter befruktning)
- Behåll vuxna zebrafiskar som beskrivits tidigare 3,4,5. Eftermiddagen / kvällen före embryoinsamling, separera vuxna zebrafiskar i avelstankar för gytning.
- Följande morgon (0 dagar efter befruktning (dpf)), samla embryon i petriskålar med en diameter på 10 cm i systemvatten och ta bort alla icke-livskraftiga eller obefruktade ägg, som kommer att verka ogenomskinliga och / eller visa oregelbunden cytoplasma och misslyckad klyvning24.
OBS: Normala klyvnings- och utvecklingshändelser kommer att vara uppenbara hos friska embryon enligt beskrivningen25. Petriskålar bör hållas tre fjärdedelar fulla (~ 30 ml för en skål med en diameter på 10 cm) under hela protokollet.- Tillsätt två droppar 0,05 % viktprocent metylenblått till varje petriskål, blanda försiktigt och förvara embryon vid 28,5 °C under återstoden av protokollet.
- Cirka 6 timmar efter befruktning (hpf)4,5,26, ersätt systemvatten i embryo petriskålar med 1,5x PTU (arbetslösning gjord i steg 1.2.2) och fyll på metylenblå.
OBS: PTU måste tillsättas till embryon innan pigmenteringen börjar (dvs. före 24 hpf)25 eftersom redan pigmenterade vävnader inte kommer att depigmenteras vid tillsats av PTU21. Det bör dock noteras att minskad ögonstorlek, okulära och kraniofaciala underskott och störningar i vissa signalvägar (t.ex. sköldkörtelsignalering) har rapporterats hos PTU-behandlad zebrafisk 27,28,29. Utvecklingstoxiciteten hos PTU verkar vara beroende av koncentration och tidpunkt för PTU-tillsats 27,29. Som nämnts ovan för validering av PTU-effekt (steg 1.2) bör tecken på PTU-toxicitet också övervakas noggrant och, om det misstänks, bör arbetskoncentrationen och/eller tiden för PTU-tillsats optimeras. - På 2-3 dpf dechorionate embryon med användning av nygjord pronaslösning.
- Lös upp pronas i 1,5x PTU i en koncentration av 2 mg/ml genom virvel.
VARNING: Pronase är förpackat som ett mycket fint pulver och är irriterande. Vidta åtgärder för att undvika inandning och/eller kontakt med hud, ögon etc. - Separera kläckta embryon från okläckta embryon och pronasbehandla endast okläckta embryon.
- Byt ut 1,5x PTU mot 2 mg/ml pronaslösning gjord i steg 2.4.1 och låt stå på okläckta embryon i 4-5 min med mild omrörning (t.ex. på en bordsrotator/shaker eller genom manuell virvning).
- Häll av pronaslösningen och skölj omedelbart med färsk 1,5x PTU. Triturera försiktigt 1,5x PTU skölj över embryon med en bulb-draw transfer pipett.
- Upprepa en andra 1,5x PTU-sköljning för att kasta allt korionsskräp och fyll sedan på 1,5x PTU för underhåll.
OBS: Embryon kan också dechorioneras manuellt med hjälp av fintippade pincett. I detta fall bör korionskräp avlägsnas och 1,5x PTU fyllas på efter manuell dechorionation.
- Lös upp pronas i 1,5x PTU i en koncentration av 2 mg/ml genom virvel.
- Övervaka embryo / larvhälsa och fyll på 1,5x PTU var 1-2: e dag. Embryon/larver hålls i 1,5x PTU tills ablation vid 5 dpf.
OBS: Vikten av steg 2.3 och 2.4 behandlas närmare i avsnittet Diskussion.
3. Screening av zebrafisklarver för rpe65a: nfsB-eGFP och genetisk ablation av retinalpigmentepitelet (5-6 dagar efter befruktning)
- Gör en ny 10 mM metronidazol (MTZ) lösning på 5 dpf (dag för ablation). Denna process tar 2 timmar att slutföra.
- Tillsätt MTZ-pulver i systemvatten utan PTU och blanda noggrant genom kraftig skakning (t.ex. 250 rotationer per min) i 1 timme vid 37 °C.
- Kyl 10 mM MTZ-lösning i ytterligare 1 timme vid rumstemperatur på en bordsrotator / shaker och säkerställ fullständig upplösning innan du lägger till petriskålar med larver.
OBS: Fluorescensscreening och separation av eGFP+- larver (steg 3.2) kan utföras under inkubationerna vid 37 °C och rumstemperatur.
VARNING: MTZ är farligt, och försiktighet bör vidtas för att förhindra intag, inandning och / eller kontakt med huden eller ögonen. MTZ-pulver och alla flytande derivat som beskrivs här kan behöva kasseras som kemiskt avfall beroende på statliga och institutionella bestämmelser. Bekräftelse av lämpliga MTZ-avfallshanteringsmetoder, om några, rekommenderas före användning.
- Skärm zebrafisklarver för rpe65a: nfsB-eGFP-transgenen.
- Bedöva larver med 0,168 g/L trikain (MS-222) och separera transgena (eGFP+) larver (figur 1) från icke-transgena (eGFP-) larver med hjälp av ett fluorescensstereomikroskop med en 488 nm excitationslaser/-filter.
OBS: Trikain bör tillsättas till 1,5x PTU och/eller farmakologiska sammansatta lösningar eftersom larver bör förbli nedsänkta i behandlingen medan de screenas för eGFP. Inkubera larver i trikain endast under screeningens varaktighet (t.ex. ≤10 min för en enda 10 cm petriskål som innehåller 50 larver). - Väck skärmade larver omedelbart genom att pipettera direkt i en petriskål med färsk 1,5x PTU utan trikain.
- Efter avslutad screening separeras eGFP+-larverna ytterligare i två grupper av petriskålar: en grupp som ska få MTZ-behandling (ablated/MTZ+) och en grupp som ska vara den oablaterade (MTZ-) kontrollen.
- Bedöva larver med 0,168 g/L trikain (MS-222) och separera transgena (eGFP+) larver (figur 1) från icke-transgena (eGFP-) larver med hjälp av ett fluorescensstereomikroskop med en 488 nm excitationslaser/-filter.
- Ablate retinal pigment epitel.
- Ta bort 1,5x PTU från de oablaterade (MTZ-) kontrollskålarna och tillsätt färskt systemvatten utan PTU.
- Ta bort 1,5x PTU från de ablaterade (MTZ+) behandlingsskålarna och tillsätt den nygjorda 10 mM MTZ-lösningen (steg 3.1.).
- Ta bort 10 mM MTZ-lösningen efter exakt 24 timmar (betecknad 1 dag efter skada (dpi)) och tillsätt färskt systemvatten utan PTU. Byt ut färsksystemets vatten utan PTU på MTZ-skålen /erna. Larver kommer inte att utsättas för PTU igen under resten av protokollet.
OBS: Det kan vara svårt att pipettera eller hälla av alla 1,5x PTU (steg 3.3.1 och 3.3.2) eller 10 mM MTZ (steg 3.3.3) mellan lösningsutbyten utan larvförlust eftersom djur aktivt simmar runt. I detta fall kan tvätt (er) av systemvatten utan PTU tillsättas för att säkerställa ett framgångsrikt utbyte av lösningar.
4. Larvunderhåll efter genetisk ablation (6+ dagar efter befruktning)
- Kontrollera larver och fyll på systemvatten utan PTU dagligen fram till avlivning (steg 5.6) eller återgå till zebrafiskens bostadsanläggning.
- Övervaka framgången och omfattningen av ablation in vivo på 2 dpi (7 dpf) med hjälp av överförd ljusbelysning på ett stereomikroskop (figur 2).
5. Införliva farmakologisk behandling i zebrafisk retinal pigmentepitelablationsprotokoll
OBS: Som tidigare utförts3 beskrivs behandling med 15 μM IWR-1 eller volymmatchad dimetylsulfoxid (DMSO) fordonskontroll med början vid 4 dpf här som ett exempelexperiment för att testa RpEGEN. Koncentrationer och tidslinjer kan variera med olika farmakologiska föreningar och rekommendationer för dos-responsvalidering, behandlingstid, screening och andra aspekter av experimentell design för farmakologiska manipulationsstudier behandlas i avsnittet Diskussion. Följ steg 6 och 7 om bildanalys krävs.
- Samla in och underhålla embryon enligt beskrivningen i steg 2. Dechorionate embryon på 2 dpf.
- Skärm eGFP+- larver på 4 dpf enligt beskrivningen i steg 3.2. I stället för petriskålar, placera eGFP+ larver i 6-brunnsplattor med en densitet av n ≤ 10 larver per 6-brunn för farmakologisk behandling. Utse separata 6-brunnsplattor för larver som kommer att vara unablated (MTZ-) och larver som kommer att ablated (MTZ +).
OBS: eGFP-signalen är synlig på 4 dpf men verkar svagare än signalintensiteten på 5 dpf. - Förbehandla 4 dpf eGFP+ -larver med 15 μM IWR-1 eller volymmatchad DMSO-fordonskontroll i exakt 24 timmar före genetisk ablation med 10 mM MTZ-lösning.
OBS: Ofta behövs mycket lite förening för farmakologiska behandlingsexperiment. För att undvika att väga ut små mängder IWR-1-pulver köps denna farmakologiska förening redan i DMSO-lösning, i en koncentration av 25 mM, och aliciteras i mindre volymer vid ankomst för att undvika upprepade frys-tina cykler.- Bestäm volymen av farmakologiska och fordonskontrollbehandlingar som behövs och alikvot 1,5x PTU i koniska rör i enlighet därefter. En volym på 5 ml/brunn på en 6-brunnsplatta rekommenderas.
- Tillsätt IWR-1-beståndet till 1,5x PTU för en slutlig koncentration på 15 μM IWR-1 (t.ex. 3 μL 25 mM IWR-1 per 5 ml 1,5x PTU). Lägg till en matchad volym DMSO-lager till 1,5x PTU (t.ex. 3 μL ≥ 99,7% DMSO per 5 ml 1,5x PTU). Här kommer detta att ge en slutlig koncentration på 0,06% volym / volym (% v / v) DMSO. Blanda väl genom virvel och visuellt bekräfta upplösning av föreningar.
VARNING: DMSO, IWR-1 och andra farmakologiska föreningar och lösningsmedel kan behöva kasseras som kemiskt avfall beroende på statliga och institutionella bestämmelser. Bekräftelse av faronivå och lämpliga avfallshanteringsmetoder för dessa föreningar, om sådana finns, rekommenderas före användning. - Ta bort 1,5x PTU från eGFP+ -larverna i 6-brunnsplattor och tillsätt 5 ml/brunn nytillverkade 0,06 % v/v DMSO- eller 15 μM IWR-1-behandlingar från steg 5.3.2.
- På 5 dpf, ablatera RPE. Förutom 24 timmars förbehandling (steg 5.3) kommer larverna att förbli nedsänkta i farmakologiska och fordonskontrollbehandlingar under 24 timmars genetisk ablation med 10 mM MTZ och under återhämtning efter ablation, fram till fixering (t.ex. från 4-9 dpf).
- Gör 10 mM MTZ lösning 2 h innan du utför genetisk ablation (steg 3.1).
- Bestäm volymen av farmakologiska och fordonskontrollbehandlingar som behövs för både obablaterade (MTZ-) och ablaterade (MTZ +) 6-brunnsplattor och alikvot lämpliga volymer av antingen färskt systemvatten utan PTU (MTZ-) eller 10 mM MTZ-lösning (MTZ +) i koniska rör. Detta kommer att ge fyra behandlingsbetingelser: 1) 0,06% v / v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v/v DMSO, MTZ+; och 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
- Lägg till IWR-1- och DMSO-lagerlösningar till respektive koniska rör enligt steg 5.3.2. Blanda väl genom virvel och visuellt bekräfta upplösning av föreningar.
- Ta bort 0,06 % v/v DMSO- och 15 μM IWR-1-behandlingar i 1,5x PTU (steg 5.3.2) från utsedda oablaterade (MTZ-) och ablaterade (MTZ+) 6-brunnsplattor och fyll på med lämpliga behandlingar som gjordes i steg 5.4.3.
- Ta bort 0,06 % v/v DMSO- och 15 μM IWR-1-behandlingar i 10 mM MTZ-lösning efter exakt 24 timmar och fyll på med behandlingar i sötvatten utan PTU. Fyll på 0,06% v/v DMSO och 15 μM IWR-1-behandlingar i färskt systemvatten utan PTU på den oablaterade (MTZ-) 6-brunnsplattan/plattorna.
- Följ larvunderhåll efter ablation enligt beskrivningen i steg 4 och fyll på 0,06% v / v DMSO eller 15 μM IWR-1-behandlingar dagligen i systemvatten utan PTU.
- Avliva larver på 9 dpf (4 dpi för åldersmatchade MTZ-behandlade syskon) genom att nedsänka djur i 0,3 g/L trikainlösning (dödlig överdosering) i kombination med snabb kylning (t.ex. placera petriskålar på is) i minst 20 min30. Kontrollera att larverna inte svarar på beröring och fixerar i 4 % PFA (steg 1.5) i 3 timmar vid rumstemperatur eller vid 4 °C över natten.
- Bearbeta larvvävnad efter fixering för z-stack-bildförvärv på ett konfokalmikroskop som beskrivits tidigare 5,31 och här i avsnittet Representativa resultat. Analys i steg 6 och 7 kommer att kräva åtminstone förvärv av kärnmarkör (t.ex. DAPI) och brightfield z-stack-bilder.
6. Konfokalmikroskop z-stack bildförbehandling i FIJI (ImageJ)
- Importera och formatera konfokalmikroskop z-stack-bilder med FIJI32.
- Öppna mikroskopbilder med importalternativen för bioformat inställt på Visa stack med: Hyperstack och färgläge: Gråskala.
- Generera en projektion med maximal intensitet av den importerade mikroskopbilden genom att välja Bild | Staplar | Z-projektet. I ZProjection-fönstret anger du Starta sektor och Stoppa sektor så att alla segment för den bilden inkluderas. Ange till exempel Starta segment: 1 och Stoppa segment: 18 för en z-stack som har totalt 18 segment. Välj Projektionstyp: Max intensitet och klicka på OK.
- Konvertera projektionsfilen med maximal intensitet till en 8-bitars bild (om inte redan) genom att välja Bild | Typ | 8-bitars.
- Omorientera bilden så att ryggsidan är uppe och distal (dvs linsen) lämnas genom att välja Bild | Förvandla | Vänd horisontellt (för det sista kommandot väljer du det alternativ som bäst passar den riktning som behövs för den bilden). För en flerkanalig bild, klicka på Ja i processstacken? fönster för att omorientera alla kanaler.
OBS: Detta steg är kritiskt, men behövs inte om bilden redan är i dorsal upp, distal vänster orientering. Se figur 3A-D och figur 4 för bilder med ögon i rätt riktning för bearbetning. - Spara projektionen med maximal intensitet på 8 bitar som en taggad TIF-fil (Image File) genom att välja Arkiv | Spara som | Tiff....
- Generera RPE-region av intresse (ROI) med FIJI.
- Öppna en 8-bitars TIF-bild som genereras enligt beskrivningen i steg 6.1. Starta ROI Manager genom att välja Analysera | Verktyg | ROI Manager.
- Använd | Zooma och växla mellan DAPI- och ljusfältskanalerna för att identifiera den eller de punkter där den apikala sidan av RPE ligger intill spetsen av det yttre begränsande membranet (OLM) (figur 3B', B", D', D"; blå pilspetsar). Använd detta anatomiska landmärke som utgångspunkt för ROI.
- Skapa RPE-ROI med polygonvalsverktyget (i FIJI-verktygsfältet) med både DAPI- och brightfield-bildkanalerna och zoomfunktionen (Bild | Zooma) för att identifiera apikala och basala RPE-gränser. Ta de dorsala och ventrala ändarna av ROI (dvs där ROI övergår från den apikala till basala sidan av RPE) till en skarp punkt snarare än att avtrubba eller avrunda (Figur 3B ', B ", D ', D "; magenta linjer).
Obs!: Att skapa en spetsig ROI-ände är ett viktigt steg för att optimera slutpunktsidentifiering med RpEGEN och behandlas i avsnittet Diskussion. - Lägg till ROI genom att klicka på Lägg till i ROI Manager. Justera avkastningen efter behov och klicka på Uppdatera i ROI Manager.
- Spara ROI-filen genom att välja Mer>> | Spara... inom ROI Manager. Använd identiska namn för matchade ROI- och TIF-bildfiler (t.ex. [filnamn].tif och [filnamn].roi).
- Kombinera 8-bitars TIF- och ROI-filer för varje villkor i en enda mapp. Mappen, DMSO_9dpf, innehåller till exempel alla matchade TIF- och ROI-filer för den 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-behandlade larvgruppen.
7. Kvantifiering och visualisering av RPE-regenerering med RpEGEN-skript
- Installera och förbered RpEGEN-skript.
- Ladda ned de senaste RpEGEN-skripten från GitHub-lagringsplatsen (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) genom att klicka på Kod | Ladda ner ZIP.
- Packa upp mappen och placera den på önskad plats för arbetsytan (t.ex. Skrivbord).
- Öppna MATLAB.
- Navigera till rpEGEN-mappen i fönstret Aktuell mapp (vanligtvis på vänster sida).
- Högerklicka på RpEGEN-mappen och välj Lägg till i sökväg | Valda mappar och undermappar. Detta lägger till mappen i MATLAB-sökvägen så att den automatiskt kan hitta och köra alla skript i mappen.
- Dubbelklicka på RpEGEN-mappen i fönstret Aktuell mapp för att visa alla undermappar och M-filer.
- Dubbelklicka på filen RpEGEN.m för att öppna i redigeringsfönstret .
- Under avsnittet ANVÄNDARDEFINIERADE VARIABLER i filen RpEGEN.m anger du katalogplatserna för mapparna som innehåller ROI-filerna (.roi), bildfilerna (.tif) och var utdatafilerna ska sparas. Ange gruppnamnet för .mat-filen som ska exporteras (t.ex. DMSO_9dpf, DMSO_4dpi osv.) och platsen för ljusfältskanalen i TIF-bildstacken (t.ex. 3, om ljusfältet är den tredje kanalen i en bildstack). Om bildfilen bara innehåller ljusfältsbilden ska den vara lika med 1.
- Kör RpEGEN.m skript och verifiera resultatet.
OBS: RpEGEN kräver att Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox och Statistics and Machine Learning Toolbox aktiveras på användarens MATLAB-licens för att kunna köras. Dessutom krävs den fritt tillgängliga ReadImageJROI-verktygslådan33 för att importera FIJI-ROI till MATLAB; Den finns dock i RpEGEN-mappen tillsammans med andra M-funktionsfiler som inte kräver någon aktivering.- Kör skriptet genom att klicka på knappen Kör i menyn Editor högst upp i MATLAB.
OBS: När kommandofönstret har initierats kommer det att ge utförliga utdata som indikerar skriptets progression. När du har sparat MAT-filen som innehåller extraherade data visas en figur med tre paneler och sparas som en PDF i utdatakatalogen för varje bildkörning. Dessa är kvalitetskontrollsiffror (QC) för att se till att allt har fungerat korrekt och inkluderar: 1) ljusfältsbilden överlagd av ROI (figur 4A); 2) ROI med mittlinje och tillhörande vinkelavstånd (grader) (figur 4G); och 3) ROI med mittlinjens medianintensitetsvärden (0-255, 8-bitars färgskala) (figur 4H). Vänta tills QC-PDF-filerna har sparats i utdatamappen och den sista siffran har försvunnit innan du går vidare till nästa steg. - Öppna de enskilda PDF-filerna som exporteras till utdatamappen i valfri PDF-visare och kontrollera att alla ROI:er matchar ljusfältsbilderna, att mittlinjevärdena är rimliga approximationer av mitten av ROI:erna och att medianintensitetsvärdena fylls i på lämpligt sätt med data (dvs. inte alla samma värde över hela mittlinjen).
OBS: En detaljerad beskrivning och struktur för varje variabel som sparats i MAT-filen av RpEGEN.m finns i tabell 1.
- Kör skriptet genom att klicka på knappen Kör i menyn Editor högst upp i MATLAB.
- Kör skriptet RpEGEN_PermPlot.m.
OBS: RpEGEN_PermPlot.m-skriptet använder utdata från RpEGEN.m för att köra statistiska jämförelser med hjälp av en permutationssimulering av medianerna för två grupper och tillhandahåller också koden för att reproducera diagrammen i detta dokument med hjälp av den fritt tillgängliga GRAMM-verktygslådan34, som också har inkluderats i RpEGEN-mappen.- Dubbelklicka på filen RpEGEN_PermPlot.m för att öppna den på en ny flik Editor .
- Under AVSNITT 1 - ANVÄNDARDEFINIERADE VARIABLER i filen RpEGEN_PermPlot.m anger du katalogplatsen för utdatamappen som innehåller MAT-filerna från att köra RpEGEN.m och anger varje MAT-filnamn som ska laddas (t.ex. DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
- Kör det här avsnittet av skriptet genom att klicka på knappen Kör avsnitt i menyn Editor högst upp i MATLAB.
- I avsnitt 2 anger du namnen på de två grupperna för statistisk jämförelse i data_A och data_B variabler (det här är de grupper från vilka medianer kommer att härledas med hjälp av permutationssimuleringen). I variabeln bin_sz anger du antalet grader över vilka medianintensitetsvärdena för datauppsättningarna ska integreras (standardvärdet är 1-graders lagerplatser).
OBS: Variabeln reps anger antalet permutationer som ska användas för att bygga en sannolikhetsfördelning och kan ställas in på valfritt tal (standardvärdet är 20 000). I allmänhet kommer ett högre antal repetitioner att vara mer statistiskt robusta men kommer att öka bearbetningstiden. - Kör det här avsnittet av skriptet genom att klicka på knappen Kör avsnitt i menyn Editor högst upp i MATLAB. Det här avsnittet kan ta lite tid att slutföra beroende på antalet repetitioner som anges, men ger en kontinuerlig statusuppdatering i kommandofönstret.
- Kör avsnitten HEATMAP FIGURE och GROUP RESULTS AND P-VALUES oberoende av detta med knappen Kör avsnitt . Redigera datavariabler i alla avsnitt som kommenteras med "ANGE DATA HÄR". PDF-filer av dessa siffror sparas automatiskt för var och en och kan enkelt ändras i vilken vektorprogramvara som helst efterbehandling.
OBS: Diagrammet som genereras i RpEGEN_PermPlot.m-filen är ad hoc och kommer sannolikt att kräva ändringar baserat på varje användares specifika data- och visualiseringsbehov. Siffrorna ger dock en solid grund som enkelt kan individualiseras med hjälp av både MATLAB- och GRAMM-webbplatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att hämma den kanoniska Wnt-signalvägen är känd för att avsevärt försämra zebrafiskens RPE-regenerering med hjälp av det genetiska ablationsparadigmet (rpe65a: nfsB-eGFP) och farmakologisk manipulationsmetodik (IWR-1) som beskrivs i protokollet3. Detta experiment upprepades här för att validera en automatiserad metod för kvantifiering av zebrafiskens RPE-regenerering baserat på pigmentering. Resultaten som sammanfattas nedan omfattade alla steg i protokollet, från befruktningsdagen (0 dpf) till kvantifiering av RPE-regenerering med RpEGEN.
Genomförande av RPE-ablationsprotokollet (med farmakologisk manipulation) i larvzebrafisk
Embryon som samlats in från tre separata föräldragrupper (N = 3) började behandling med 1,5x PTU runt 6 hpf och frånvaro av pigmentering i RPE och ytmelanocyter bekräftades visuellt på 1 dpf. Embryon dekorionerades enzymatiskt på 2 dpf med användning av 2 mg/ml pronas (steg 2.4). På 4 dpf bedövades larver med trikain (MS-222) och screenades för eGFP med hjälp av ett fluorescensstereomikroskop (steg 3.2 och 5.2). eGFP+ -larver flyttades till 6-brunnsplattor (n = 10 larver/brunn) och behandlades med antingen 0,06 % v/v DMSO (fordonskontroll) eller 15 μM IWR-1 (steg 5,3). Larvtätheten som rapporterades här baserades ursprungligen på approximationen av 1 larv / cm2 tillväxtområde och validerades genom noggrann hälsoövervakning (t.ex. simblåsans utveckling) över tiden. Intensiteten hos eGFP verkade svag på 4 dpf, så larver screenades igen på 5 dpf för att bekräfta ljust eGFP-uttryck (Figur 1). RPE65 (rpe65a i zebrafisk) är en markör för mogen RPE7 och i teleostfisk genereras näthinne- och RPE-celler kontinuerligt från ciliärmarginalzonen (CMZ), en stamcellsnisch vid näthinnans distala spets, intill linsen35. Således, i rpe65a: nfsB-eGFP transgena linjen, finns den mer omogna RPE i periferin och verkar eGFP- (ungefär en tredjedel av den totala RPE-vävnaden) medan de mogna, centrala två tredjedelarna av RPE uttrycker eGFP (figur 1B; vita pilspetsar). Transgenen var också synlig i tallkottkörteln (figur 1A; gul pilspets), vilket förväntades eftersom rpe65a visar tallkottkörteluttryck hos zebrafisk36. Jämförelsevis svaga eller eGFP-larver drogs från 6-brunnsplattor och avlivades på 5 dpf. Vid exakt 24 timmar efter behandling med DMSO eller IWR-1 behandlades 5 dpf larver med 10 mM MTZ för att ablatera RPE (steg 3.1, 3.3 och 5.4). MTZ tvättades ut efter exakt 24 timmar (dvs på 6 dpf/1 dpi) för att RPE-regenerering skulle kunna ske.
Larver observerades dagligen på ett stereomikroskop med hjälp av överförd ljusbelysning från 6 dpf / 1 dpi till tiden för eutanasi på 9 dpf / 4 dpi. Framgången med genetisk ablation bekräftades in vivo på 2 dpi genom frånvaron av pigment i de centrala två tredjedelarna av ögat i MTZ+-larver (figur 2B; röda pilspetsar) jämfört med 7 dpf MTZ-kontrollsyskon (figur 2A) (steg 4.2). Som förväntat föreföll området utan pigment på 2 dpi analogt med området rpe65a: nfsB-eGFP transgenuttryck observerat på 5 dpf (figur 1B). Bedömningen utfördes på 2 dpi och inte tidigare eftersom RPE genomgår repigmentering efter avlägsnande av PTU och beroende på observationstiden in vivo kan en markant skillnad mellan den ablaterade centrala RPE och skonade (oablaterade) perifera RPE vara svår att urskilja om den senare inte har repigmenterats helt. Trots möjligheten till makroskopisk tvetydighet visade sig RPE-ablation vid 1 dpi tidigare vara lätt uppenbar i sektionerad vävnad, vilket avslöjade en förlust av central RPE och yttre kärnskikt (ONL; dvs fotoreceptor) vävnadsintegritet tillsammans med bevis på celldöd (pyknotiska kärnor) (figur 5)3. Mot vävnadsförlust bestämdes robust proliferation vara en viktig drivkraft under vävnadsregenerering i rpe65a: nfsB-eGFP zebrafiskmodell3. Både det tidiga apoptotiska svaret, där RPE-ablation leder till degenerering av intilliggande vävnader (t.ex. fotoreceptorer och Bruchs membran; Figur 6A-C) och det perifera till centrala proliferativa svaret som följer, vilket ger heterogena regenereringszoner som rör sig inåt i skadestället (figur 6D-F), har karakteriserats och diskuterats i stor utsträckning tidigare3.
Vävnadsberedning, konfokal bildförvärv och bildförbehandling för automatiserad kvantifiering baserad på RPE-pigmentering med RpEGEN
På 9 dpf/4 dpi avlivades DMSO- och IWR-1-behandlade larver genom överdosering av trikain och fixerades i 4 % PFA i 3 timmar vid rumstemperatur (steg 5.6). Fyra larver från varje oberoende modergrupp valdes slumpmässigt ut för efterföljande vävnadsbehandling (N = 3; n = 12 larver per behandling). Kryoprotektion, kryosektion (vid 12 μm tjocklek), nukleär motfärgning med DAPI och täckglasmontering utfördes enligt hänvisningen i steg 5.7 5,31. En central sektion, med synlig synnerv, från varje larv avbildades på ett konfokal laserskanningsmikroskop med hjälp av ett 40x oljenedsänkningsmål (numerisk bländare = 1,30) för att förvärva 512 x 512-pixel z-stack-bilder med ett 1 μm z-stegintervall. Varje bild innehöll data från tre kanaler: kanal 1 = 405 nm excitation för DAPI, kanal 2 = 488 nm excitation för eGFP, kanal 3 = överfört ljus för ljusfält. Eftersom pixelintensiteten kvantifierades i ljusfältsbilder hölls de överförda ljuslampans spänningsinställningar konstanta och alla data som samlades in för statistiska jämförelser avbildades samma dag.
Konfokalmikroskop z-stack-bilder förbehandlades för automatiserad kvantifiering enligt beskrivningen i steg 6 med hjälp av FIJI. Bilder uteslöts från förbehandling och kvantifiering om vävnaden äventyrades på ett sätt som skulle göra ROI-generering svår (t.ex. från rivning (Figur 7A; magenta pilspetsar) eller landmärke obstruktion (Figur 7B; magenta ovaler)) eller skeva ROI-intensitetsmätningar (t.ex. från vikning (Figur 7C; magenta ovaler)). Trots att några larver utelämnas med dessa uteslutningskriterier representerar alla dataset här N = 3 med följande antal biologiska replikat (larver): n = 11, DMSO MTZ-; n = 10, IWR-1 MTZ-; n = 11, DMSO MTZ+; n = 12, IWR-1 MTZ+. Med hjälp av DAPI-kanalen initierades RPE-ROI genom att först identifiera den punkt där den dorsala apikala sidan av RPE (näthinnan) var direkt intill OLM: s dorsala spets (Figur 3B",D"; blå pilspetsar) (steg 6.2.2). Eftersom distal RPE-förlängning kan variera mellan sektioner användes OLM som ett anatomiskt landmärke för att standardisera RPE ROI-slutpunkter och normalisera vinkelavståndsmätningar i MATLAB (där 0 ° = dorsal ROI-slutpunkt och 180 ° = ventral ROI-slutpunkt). Vid RPE-ablationer med farmakologisk manipulation eller i en mutant bakgrund bör ett anatomiskt landmärke identifieras och valideras före förbehandling och kvantifiering. Här var OLM uppenbar i alla larver kvantifierade och äventyrades inte av rivning (som i Figur 7B) eller behandling med DMSO eller IWR-1. Efter identifiering av den dorsala utgångspunkten genererades ROI efter den apikala sidan av RPE (dorsal-to-ventral) tills punkten intill spetsen av den ventrala OLM nåddes (Figur 3B",D"; blå pilspetsar). Därefter gjordes en ventral ROI-slutpunkt mellan de apikala och basala (koroidvända) sidorna av RPE som diskuteras i steg 6.2.3 (Figur 3B",D"; magenta linje). ROI fortsatte, efter den basala sidan av RPE (ventral-till-dorsal) tills den nådde basalsidan intill utgångspunkten vid dorsal OLM. ROI omslöts sedan genom att skapa en spetsig dorsal ände (Figur 3B',D'; magenta linje) som gjort ventralt. Genetisk ablation har visat sig resultera i en förlust av centralt eGFP-uttryck som återvinns när regenereringen fortskrider (sammanfattat i Figur 6)3; Beroende på regenereringens omfattning och intensiteten hos eGFP vid den tidpunkt då den är intressant kan eGFP-kanalen därför endast vara användbar för ROI-generering i MTZ- grupp. Därför, medan konfokala förvärv också innehöll eGFP-kanalbilder, slutfördes ROI-genereringen med DAPI- och brightfield-kanalerna som nämns i steg 6.2.3. RPE ROI-generering var enkel i DMSO- och IWR-1-behandlad MTZ- larvgrupper och omfattade regioner med synligt pigmenterade apikala mikrovilli (Figur 3B; röd pilspets) tillsammans med de framträdande pigmenterade cellkropparna. Samma parametrar tillämpades på MTZ+ larvgrupper (Figur 3D; röd pilspets); På grund av kvarvarande skadad vävnad inom skadestället var dock apikala mikrovilli och pigmenteringsgränser svåra att avgränsa i ljusfältskanalen ensam i vissa fall. I dessa områden användes DAPI-kanalen också för att identifiera cellulärt skräp inom RPE-skadestället, vilket ingick i ROI (Figur 3C,D; exempel på skadeplatslokaliserat cellulärt skräp indikeras med cyanpilspetsar). Immunfärgning med markörer för omogen/mogen RPE (t.ex. ZPR2; Figur 6D,E)37 och/eller fotoreceptorer (t.ex. ZPR1)37,38 skulle också kunna användas för att underlätta beräkningen av RPE-avkastningar i ablaterade larver.
Tidigare visade ablaterade larver behandlade med IWR-1 från 4 dpf till 4 dpi signifikant försämring av RPE-regenerering jämfört med DMSO-behandlade syskonkontroller (figur 8C)3. Detta rapporterades som procentandelen av central pigmentåtervinning, vilket krävde betydande tidigare erfarenhet av modellen och manuella mätningar av vinkelavstånd för att beteckna regenereringsgränser (figur 8B; svarta pilspetsar). RpEGEN skapades för att automatisera kvantifiering av RPE-regenerering och minska inneboende fördomar. Inte bara det, RpEGEN möjliggjorde också generering av mycket robusta datamängder; Till exempel genererades 10 datapunkter tidigare från manuell kvantifiering av n = 10 DMSO-behandlade MTZ+ -larver (figur 8C; % pigmentåtervinning per sektionsmätningar)3, medan 174 801 datapunkter genererades från n = 11 DMSO-behandlade MTZ+ -larver/ROI här med hjälp av RpEGEN (figur 9C; pixelintensitetsmätningar).
RpEGEN utvecklades för att stegvis bedöma regionala förändringar i pigmentering över hela RPE genom att härleda en skelettiserad mittlinje (1 pixelbredd) från den ursprungliga ROI som genererades med HJÄLP av FIJI (figur 4A,B). För att införliva alla pixlar i ROI för analys (dvs. inte bara mittlinjepixlarna) utfördes en euklidisk avståndstransformering på varje pixel från mittlinjen för att skapa en karta över närmaste mittlinjeindex för varje pixel i ROI-masken. Denna karta över index gjorde det möjligt för varje pixel utanför mittlinjen att tillskrivas en enda mittlinjepixel, vilket skapade en omfattande datauppsättning över hela RPE för varje larv (figur 4E). RPE: s dorsala till ventrala längd representerades av vinkelavstånd (figur 4G; 0-180 °) i motsats till normaliserat pixelavstånd (figur 4F; 0-1 godtyckliga enheter), eftersom detta var mer intuitivt baserat på tidigare mätningar av RPE-regenerering 3,4,5 och det faktum att vinkelavståndet inte varierar med morfologiska skillnader. Medianintensiteter härledda från 5-graders bins var det mått som valdes för att belysa storskaliga trender och minimera högfrekvent variabilitet som observerades i 1-graders binned data (tabell 1, figur 10A). Permutationssimulering valdes för att testa nollhypotesen för att se om medianerna för de två behandlingsgrupperna (här DMSO MTZ+ och IWR-1 MTZ+ (båda 4 dpi), figur 10B) liknar39. Denna omsamplingsteknik saknar strikta antaganden om fördelningen av data och kan användas på en rad teststatistik (t.ex. medelvärde, median etc.) för att generera robusta p-värdesuppskattningar. Ett antal av dessa parametrar (t.ex. lagerplatsstorlek för rådata och mediandata, permutationssimuleringsrepetitioner etc.) kan anpassas och modifieras för att passa användarnas behov. För den senare valdes 20 000 repetitioner för att generera en statistiskt robust jämförelse, men man bör se till att balansera beräkningseffektivitet med statistisk robusthet eftersom för få repetitioner kan ge felaktiga p-värdesuppskattningar. Det rekommenderas att flera repetitionsvärden körs (10 000, 20 000 osv.) för att säkerställa att p-värdesfördelningen och värdena är relativt stabila innan tolkningar påbörjas. Ökande permutationsrepetitioner kommer att öka den statistiska kraften (men det tar också längre tid att köra), vilket kan vara fördelaktigt för vissa datauppsättningar.
Konfokala bilddatauppsättningar kvantifierades med RpEGEN enligt beskrivningen i steg 7. De kommenterade RpEGEN- och supportskripten finns på GitHub (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) tillsammans med 8-bitars TIF och motsvarande ROI-filer för intresserade användare att testa. Värmekartor som visade rådata från MTZ-larv-ROI visade en total fördelning av mörkare pixelintensiteter (där 0 = svart och 255 = vit, 8-bitars färgskala) som sträckte sig över dorsal (0 °) till ventral (180 °) längd av RPE, oavsett behandling med 0,06% v / v DMSO eller 15 μM IWR-1 (figur 9A,B). Plottning av medianpixelns intensitet underlättade visualiseringen mellan alla grupper och visade likheter mellan MTZ-grupperna över RPE (figur 10A; svarta och grå linjer). Dessa data stödde närvaron av ett intakt pigmenterat RPE-monolager (figur 9E,F) och tillhandahöll baslinjemedianpixelintensitetsvärden (dvs. under 150) för osablaterad RPE (figur 10A; svarta och grå linjer). Jämförelsevis visade råa (figur 9C,D) och mediandata (figur 10A; blå och röda linjer) från MTZ+ larv-ROI en total fördelning av ljusare pixelintensiteter i den centrala RPE, igen, oavsett behandlingstillstånd. Ablaterade DMSO-behandlade larver visade centraliserad fördelning av ljuspixlar vid cirka 100 ° (± 15 °) (figur 9C; orange-röda behållare). Detta motsvarade en synlig frånvaro av pigmentering i det centrala RPE-skadestället i/runt synnerven (figur 9G; blå pilspetsar). Ablaterade IWR-1-behandlade larver visade också centraliserad fördelning av ljuspixlar som expanderades både dorsalt (till cirka 50 °) och ventralt (med cirka 5 °) jämfört med MTZ + DMSO-behandlade syskonkontroller (figur 9D; orange-röda fack). Förekomsten av ett expanderat skadestället var tydligt synligt i sektionerad vävnad (figur 9H; blå pilspetsar). Med undantag för två 1-graders fack var den observerade skillnaden mellan MTZ+-grupperna statistiskt signifikant i den centrala RPE (figur 10B; ljusblått skuggat område mellan ~ 40-140 °; p-värde ≤ 0,05), vilket indikerar signifikant mindre central RPE-pigmentering i MTZ+ IWR-1-behandlade larver jämfört med MTZ+ DMSO-behandlade syskonkontroller. Tolkningen av dessa råa (figur 9C,D) och mediandata (figur 10A) med statistisk jämförelse (figur 10B) med rpEGEN validerades inte bara genom att observera sektionerad vävnad (figur 9G,H), utan stödde också tidigare resultat från manuell kvantifiering (figur 8)3.
Figur 1: rpe65a: nfsB-eGFP transgenuttryck 5 dagar efter befruktning. (A-C) Helmonterade bilder av en PTU-behandlad 5 dpf-larv som visar svagt transgent uttryck i tallkottkörteln (A; gul pilspets) och ljust transgenuttryck i RPE (B,C) vid tidpunkten för screening för genetisk ablation. (B) Transgenuttryck är synligt lokaliserat till de centrala två tredjedelarna av RPE, och vita pilspetsar markerar gränsen mellan perifer (omogen) och central (mogen) RPE. Grön = eGFP. Främre är uppe. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Verifiering av framgångsrik genetisk ablation av RPE in vivo. Helmonterade bilder av (A) tre obablaterade (MTZ-) 7 dpf larver som visar RPE-pigmentering i hela ögat och (B) tre ablaterade (MTZ+) 2 dpi larver som visar en ablationszon där det saknas pigment i de centrala två tredjedelarna av RPE (röda pilspetsar). Främre är uppe. Skalstänger = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RPE-regioner av intresse (ROI) för automatiserad kvantifiering med RpEGEN. Tvärgående kryosektioner av (A,B) en unablated (MTZ-) 9 dpf larv och (C,D) en ablated (MTZ+) 4 dpi larv med RPE ROIs markerade i magenta. (B,D) Röda pilspetsar markerar regioner där synligt pigmenterade apikala mikrovilli ingick i avkastningen. (C,D) Cyan pilspetsar pekar på exempel regioner av skada platslokaliserade DAPI + skräp, som användes för att inkludera RPE-cellskräp i ROI. (B',B",D',D") Digitala zoomar av både dorsala och ventrala ROI-regioner (svarta prickade rutor i B och D) visar föreslagna ROI-utgångspunkter (blå pilspetsar) och de spetsiga ROI-ändarna som är kritiska för slutpunktsdetektering i MATLAB. Brightfield-bilder visas också i figur 9E,G. Vit/grå = kärnor. Dorsal är uppe och distal är kvar. (A-D) Skalstaplar = 40 μm. (B',B",D',D") Skalstaplar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Arbetsflöde för RpEGEN-bearbetning. (A) Exempel på en korrekt orienterad 8-bitars ljusfältsbild och FIJI-genererad ROI (röd) importerad till MATLAB. Dorsal är uppe och distal är kvar. Färgfältet representerar 8-bitars gråskaleintensitetsvärden där 0 = svart och 255 = vitt. (B) Initial binär skelettisering (vit) av ROI-masken (röd) som visar förekomsten av felaktiga sporer och avgränsningen av start- och slutpunkterna för geodetisk pixelavståndsavgränsning som visas i (C). Färgfältet i (C) representerar euklidiskt pixelavstånd. (D) Sporrar tas bort med hjälp av en förenklad billigaste väg från ändpixeln tillbaka till startpixeln, vilket resulterar i en kontinuerlig mittlinje utan sporer (röd). (E) Närmaste linjära mittlinjeindex baserat på en avståndstransformering mellan alla pixlar i ROI-masken och mittlinjepixlarna (vita). Dessa indexvärden gör att varje bildpixel i ROI-masken kan tilldelas den närmaste mittlinjepixeln för analys. Färgfältet representerar de linjära pixelindexvärdena för mittlinjen. (F) Ett exempel på det normaliserade pixelavståndet längs mittlinjen, där 0 (blå, distal-mest dorsal pixel) är startpixeln och 1 (röd, distal-mest ventral pixel) är slutpixeln. (G) Liknar (F) men använder vinkelavståndet, där 0 grader (blå) är startpixeln och 180 grader (röd) är slutpixeln. (H) Exempel på de medianpixelintensitetsvärden som beräknats för varje mittlinjepixel. Färgfältet representerar medianvärdet för gråskaleintensitet för alla ROI-pixlar som bidrar till varje given mittlinjepixel. Denna figur visar bilder från en testdatauppsättning och inte larver från behandlingsgrupperna 0,06% v/v DMSO eller 15 μM IWR-1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Bevis på RPE-ablation och fotoreceptordegeneration. (A) Tvärgående kryosektioner av en unablated 6 dpf larv. (A,A') Efter exponering för PTU är transgenuttryck begränsat till mogna RPE-celler, med det ljusaste uttrycket begränsat till de centrala två tredjedelarna av RPE. Pilspetsar indikerar apikala mikrovilli. (A") Differentialinterferenskontrastbilder (DIC) avslöjar normal yttre kärnskiktsarkitektur (ONL; dvs fotoreceptor). (B,B') Tvärgående kryosektioner av en 1 dpi larv avslöjar signifikant störning av eGFP + -cellmorfologi och desorganisation vid ONL-laminering. Pilar indikerar delaminerade och pyknotiska kärnor. (B") DIC-bilder avslöjar ytterligare den markanta störningen av ONL-arkitekturen. Grön = eGFP, blå = kärnor, gul = ONL. Dorsal är uppe och distal är kvar. Skalstången i (A) representerar 40 μm och kan appliceras på (B). Skalstången i (A') representerar 40 μm och kan appliceras på (A",B',B").). Denna figur och figurlegendtext har modifierats från Hanovice et al. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Modell av RPE-regenerering hos larvzebrafiskar. (A) nfsB-eGFP uttrycks i mogen RPE i de centrala två tredjedelarna av ögat. (B) Applicering av MTZ leder till apoptos (TUNEL, röd) av RPE och fotoreceptorer. (C) RPE-ablation leder till degenerering av fotoreceptorer och Bruchs membran (streckad linje). (D) Obablaterad RPE i periferin börjar sprida sig och sträcka sig in i skadestället (blå). (E) Eftersom regenererad eGFP+ RPE förekommer i periferin kan RPE delas in i fyra zoner: perifer RPE (pRPE), differentierad RPE (dRPE), övergångszon (TZ) och skadeställe (IS). (E, infälld) Regenererad differentierad RPE (grön) förekommer i periferin proximal till den oablaterade perifera RPE och innehåller proliferativa celler intill övergångszonen. Övergångszonen består av fortfarande differentierande RPE-celler (ZPR2, röda) och proliferativa celler (blå). Skadestället består av opigmenterade proliferativa celler som inte uttrycker några RPE-differentieringsmarkörer. (F) Regenerering av ett funktionellt RPE-skikt och Bruchs membran är fullständig med 14 dpi. Denna figur och figurlegendtext har modifierats från Hanovice et al. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Komprometterade vävnadssektioner uteslutna från bildanalys. (A-C) Tvärgående kryosektioner av larver från 0,06% v / v DMSO och 15 μM IWR-1 dataset som uppfyllde uteslutningskriterierna. En larv visar dorsal RPE-vävnadsrivning (A; magenta pilspetsar) och två andra larver visar vävnadsvikning som antingen hindrar ett anatomiskt landmärke (dorsal OLM) i DAPI-kanalen (B; magenta prickade ovaler) eller kan skeva RPE-intensitetsmätningar från ljusfältskanalen (C; magenta prickade ovaler). Vit/grå = kärnor. Dorsal är uppe och distal är kvar. Skalstaplar = 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Farmakologisk hämning med IWR-1 försämrar RPE-regenerering. Tvärgående kryosektioner av ablaterade (MTZ+) 4 dpi larver från (A) 0,06% v/v DMSO och (B) 15 μM IWR-1 behandlingsgrupper. Ljusfältsbilder (A,B) och kvantifiering av procent RPE-återhämtning/sektion (C) visar en signifikant fördröjning i återhämtningen av ett pigmenterat monolager i IWR-1-behandlade larver (Studentens oparade t-test, *** p < 0,0001). (B) Svarta pilspetsar anger den mest centrala kanten av det regenererande RPE. Dorsal är uppe och distal är kvar. Skalstången i (B) representerar 40 μm och kan appliceras på (A). Denna figur och figurlegendtext har modifierats från Hanovice et al. 2019 (figur 13)3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Rådatautmatning från automatiserad kvantifiering av RPE-regenerering i RpEGEN. (A-D) Värmekartor som visar ljusfältspixelintensitetsfördelningar sammanställda från hela RPE ROI-regionen, från dorsal (x-axlar; vinkelavstånd = 0°) till ventral (x-axlar; vinkelavstånd = 180°), för alla larver i varje dataset: (A) n = 11, DMSO MTZ-; (B) n = 10, IWR-1 MTZ-; (C) n = 11, DMSO MTZ+; (D) n = 12, IWR-1 MTZ+ (från tre oberoende modergrupper, N = 3). Till exempel visar (A) data från 177 460 pixlar över 11 AVKASTNINGAR. På y-axlarna visas pixelintensiteten baserat på en 8-bitars färgskala där 0 = svart och 255 = vitt. Rådata visas i 5-graders (x-axel) med 5-8-bitars intensitetsvärde (y-axel) lagerplatser där rött = maximalt antal lagerplatser och mörkblått = minsta antal lagerplatser. (E-H) Tvärgående kryosektioner av representativa (E,F) unablated (MTZ-) 9 dpf larver och (G,H) ablated (MTZ+) 4 dpi larver från 0,06% v/v DMSO och 15 μM IWR-1 behandlingsgrupper. RPE-ROI markeras i magenta och extremiteter i vinkelavstånd indikeras (0° = dorsal, 180° = ventral). I stort sett visar dessa data fördelningen av mörkare pixlar (intensitetsvärden mellan 0-150) i (A,B,E,F) oablaterade ROI jämfört med (C,D,G,H) ablaterade ROI, oavsett behandling. Data från ablaterade ROI visar (C,G) centraliserad (100° ± 15°) fördelning av ljusare pixlar (intensitetsvärden mellan 150-250) i DMSO-behandlingsgruppen som (D,H) expanderar dorsalt (till ~ 50 °) och något ventralt (med ~ 5 °) i IWR-1-behandlade larver. (G,H) Dessa centrala ablationszoner frånvarande pigment markeras med blå pilspetsar. Svarta pilar indikerar placeringen av synnerven. Bilder från DMSO-behandlade larver visas också i figur 3. Skalstaplar = 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Gruppresultat och statistisk jämförelse härledd från automatiserad kvantifiering av RPE-regenerering i RpEGEN. (A) 5-graders binned medianvärden och 95% konfidenskuvert härledda från rådata för varje grupp. Diagrammet visar likhet mellan MTZ-grupperna (svarta och grå linjer) över RPE: s dorsala (0 °) till ventrala (180 °) längd med anmärkningsvärda skillnader mellan och bland MTZ + - grupperna (blå och röda linjer) i det centrala RPE (ljusblått skuggat område mellan ~ 40-140 °). Specifikt verkar medianpixelintensiteten ljusare (0 = svart och 255 = vit) i IWR-1 MTZ + 4 dpi jämfört med någon annan behandlingsgrupp, vilket motsvarar minskad central RPE-pigmentering. (B) En statistisk jämförelse av medianvärdena härledda från 1-graders fack över rpe-längdens dorsala (0°) till ventrala (180°) längd för DMSO MTZ+ 4 dpi och IWR-1 MTZ+ 4 dpi förstärker observationen i (A). p-värden beräknades med hjälp av en permutationssimulering med 20 000 repetitioner och ett dubbelsidigt test för varje 1-graders bin. Under nollhypotesen att de två grupperna har liknande medianvärden för motsvarande 1-graders bin, indikerar ett p-värde ≤ 0,05 en statistiskt signifikant skillnad mellan gruppmedianerna (streckad svart linje = 95% konfidensintervall (CI)). Närvaron av p-värden ≤ 0,05 över det centrala RPE (ljusblått skuggat område mellan ~ 40-140 °) indikerar signifikant mindre pigmentering i ablated (MTZ +) IWR-1-behandlade larver jämfört med ablated (MTZ +) DMSO-behandlade syskonkontroller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Variabelt namn | Variabel typ | Variabel storlek | Variabel Beskrivning | ||
| ROIname | Cell | {N x 1} | Namnen på de ROI-filer som behandlas | ||
| ROIxy | Cell | {N x 1} | ROI-hörn för varje bearbetad ROI-fil | ||
| IMGname | Cell | {N x 1} | Namnen på de TIF-bildfiler som bearbetas | ||
| IMG | Cell | {N x 1} | 8-bitars ljusfältsbilddata för varje bearbetad TIF | ||
| ROIBW | Cell | {N x 1} | Logisk (0 eller 1) ROI-mask med samma dimensioner som IMG-bilder | ||
| Cline | Cell med tabeller | {N x 1} (n x 16) | Mittlinjedata för enskilda bilder inklusive x, y, avstånd, vinkel, index, antal punkter och statistik | ||
| CIdx | Cell | {N x 1} | Centerline indexdata relaterade ROI-maskpunkter till närmaste mittlinjepunkt för beräkning av CLine | ||
| CLineBW | Cell | {N x 1} | Logisk (0 eller 1) matris med samma dimensioner som IMG-bilder som anger platsen för mittlinjen (=1) | ||
| RAW_data | Bord | N x 3 | Tabell som kombinerar alla rådata för varje pixel i ROI:erna för alla olika IMG-bilder | ||
| BIN_1_deg_all | Bord | N x 9 | Tabell som innehåller 1-graders binned data och statistik med hjälp av data från RAW_data | ||
| BIN_5_deg_all | Bord | N x 9 | Tabell som innehåller 5-graders binned data och statistik med hjälp av data från RAW_data | ||
| BIN_10_deg_all | Bord | N x 9 | Tabell som innehåller 10-graders binned data och statistik med hjälp av data från RAW_data | ||
Tabell 1: Beskrivning av variabler som exporterats från RpEGEN.m-skriptet till MAT-filen. Definitionerna är följande: ROI(s) = region(er) av intresse; TIF = taggat bildfilformat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver metodik för att genetiskt ablatera RPE och studera mekanismer för degenerering och regenerering hos larvåldrade zebrafiskar. Detta protokoll har också framgångsrikt utförts hos vuxnazebrafiskar 3 men med mindre omfattande karakterisering, varför larver är i fokus här. Kritiska aspekter av denna del av protokollet (steg 1-4) inkluderar: 1) tillsats av 1,5x PTU till embryon före melanogenesens början, 2) dechorionating PTU-behandlade embryon på 2-3 dpf, 3) noggrann screening för eGFP och 4) tidpunkt för vattenförändringar under genetisk ablation med MTZ. PTU hämmar melaninsyntesen21,22 och har använts i detta RPE-ablationsparadigm för att underlätta screening för rpe65a:nfsB-eGFP transgenuttryck och för att möjliggöra karakterisering av RPE-degenerativa och regenerativa processer baserat på frånvaro respektive efterföljande retur av pigmenterad vävnad3. Eftersom PTU kommer att hämma ytterligare pigmentering, men inte depigmentvävnader när melanogenesen har börjat21, måste PTU tillsättas innan pigmenteringen börjar, som börjar runt 24 hpf i zebrafisk25. Här, och i tidigare studier 4,5, har PTU tillsatts vid cirka 6 hpf26 för att säkerställa hämning innan melaninsyntesen börjar. Medan PTU möjliggör visualisering av viktiga protokollsteg kan PTU-behandling påverka vissa aspekter av utvecklingen (som diskuteras i steg 2.3) och försämra embryokläckningen. Den senare processen, om den försenas för länge, kan leda till morfologi- och motilitetsunderskott och påverka livskraften40; således är dechorionating (kläckande) embryon antingen enzymatiskt med pronas eller manuellt använda pincett på 2-3 dpf viktigt för att upprätthålla och standardisera larvhälsan före genetisk ablation. En annan viktig faktor för att undvika problem med äldre larvhälsa och livskraft (som inte är relaterad till PTU-behandling) är att larver bör börja standardiserade utfodringsregimer om de förblir utanför ett vattenlevande anläggningssystem över 9 dpf / 4 dpi för experiment41.
Som förklarats driver rpe65a transgent uttryck i moget RPE i de centrala två tredjedelarna av det bakre ögat. Uttryck av eGFP hos PTU-behandlade 5 dpf larver är normalt lätt att detektera och synligt intensiv (ljus), som visas i figur 1. Larver som svagt uttrycker eGFP vid 5 dpf jämfört med syskon med ljust uttryck kan också observeras. Variation i uttrycksintensitetsförhållanden (dvs. ljusa kontra svaga) mellan generationer kan också existera, med vissa generationer som har mer svagt uttryckande larver än andra. I vilket fall som helst representerar larver med svagt eGFP-uttryck vanligtvis en minoritet av djuren i varje koppling. Även om det är okänt om svagt uttryckande larver visar mindre allvarliga RPE-skadefenotyper, har ablationer utförts i den ljusa eGFP+ -kohorten från varje koppling och jämförelsevis svaga syskon har avlivats vid screening och uteslutits från analys. På samma sätt har omfattande karakterisering av zebrafiskens RPE-ablations- och regenereringsfenotyper utförts hos larver heterozygota för rpe65a:nfsB-eGFP-transgenen, genom att korsa rpe65a:nfsB-eGFP heterozygota vuxna till vildtypsvuxnavuxna 3. Det är dock osannolikt om larver homozygota för rpe65a:nfsB-eGFP visar allvarligare ablationsfenotyper. Andra ansträngningar för att standardisera ablationsprotokollet inkluderar tillsats av lika, uppmätta volymer (t.ex. 30 ml per 10 cm petriskål) till MTZ- och MTZ + -rätter under 24 timmars genetisk ablationsperiod. På samma sätt har larver i farmakologiska behandlingsskålar fått lika uppmätta volymer (t.ex. 5 ml per 6-brunn) och snabb påfyllning av färska föreningar (t.ex. var 24: e timme). Vid hantering av diskar med olika MTZ- och/eller farmakologiska föreningsbehandlingar bör noggranna åtgärder vidtas för att förhindra spill och oavsiktlig korskontaminering under transport och vattenförändringar.
Zebrafiskens RPE-ablationsprotokoll kan modifieras för att inkludera farmakologisk manipulation (steg 5). Detta har tidigare gjorts för att identifiera immunsvar5, mTOR4 och Wnt3 signalvägar som kritiska regulatorer för RPE-regenerering; den senare har visat sig vara repeterbar här och användes för att validera RpEGEN. Förutom att belysa kritiska RPE-regenereringsvägar har farmakologisk manipulation använts i stor utsträckning för zebrafisk retinal regenereringsstudier 10,42,43,44,45,46,47. Innan det införlivas i RPE-ablationsprotokollet bör farmakologiska medel utvärderas noggrant med avseende på toxicitet, effekt och behandlingstid. Detta kan göras genom att utföra dosresponsexperiment för att bedöma toxicitet48; Bedömning av uttryck av kända målgener/målproteiner 4,5. och utvärdera kända funktionella konsekvenser av farmakologisk manipulation, till exempel utarmning av leukocyter med PLX3397-behandling 48,49,50,51. Här tillsattes DMSO (fordonskontroll) och IWR-1 24 timmar före genetisk ablation och larver screenades omedelbart före farmakologisk förbehandling på 4 dpf. Medan eGFP+ larver kan särskiljas från eGFP-larver på 4 dpf, kan intensiteten hos eGFP verka ganska svag, varför larverscreenades för eGFP-uttryck på 5 dpf (representativa resultat). Screening för eGFP före 4 dpf kan vara svårt eftersom uttrycket kan vara så lågt att det inte kan upptäckas för ögat. Således kan förbehandling med farmakologiska medel före 4 dpf (dvs. på 2 dpf)4 tillsättas till oskärmade larver som kommer att separeras på 5 dpf när eGFP är tydligt synlig. I alla scenarier där larver behöver manipuleras (t.ex. under screening, inbäddning för avbildning etc.) bör farmakologiska behandlingsförhållanden bibehållas och, oavsett screeningålder, bör RPE abladeras med MTZ på 5 dpf.
Förutom det genetiska ablationsprotokollet beskrivs steg-för-steg-instruktioner för konfokalmikroskopbildförbehandling och automatiserad kvantifiering av RPE-regenerering med RpEGEN (steg 6-7). RpEGEN skapades för att standardisera RPE-regenereringskvantifiering mellan användare och öka robustheten hos utdatauppsättningen, samtidigt som man minimerar inneboende fördomar som kan komma med den tråkiga manuella kvantifieringen som gjorts tidigare. Kritiska aspekter av denna del av protokollet utförs under ROI-generering (steg 6). Först måste bilden/ögat vara i dorsal uppåt, distal vänsterorientering (t.ex. figur 3A-D, figur 4) eftersom RpEGEN har optimerats för denna riktning. Det är också viktigt att rpe-roi-ändarnas dorsala och ventrala terminaländar avsmalnande till en spetsig spets som visas i figur 3B',B",D',D" (magentalinjer). Om dessa ändar istället är kvadrerade eller avrundade kan RpEGEN-skriptet ha svårt att bestämma start- och slutpixlarna i mittlinjen och kan generera sporrar vid terminala ROI-ändar snarare än en centraliserad linje (Figur 4B). Sporrar vid terminalens ROI-ändar kan leda till förkortning av mittlinjen under avspurtning (figur 4D) och / eller problem med vinkelavståndsmätningar i perifer RPE (figur 4G). Identiska namngivningssystem för TIF- och ROI-filerna som motsvarar varje enskild larv är också ett viktigt steg och absolut nödvändigt för att para ihop 8-bitars TIF-filen med rätt ROI i RpEGEN. Felmatchade TIF- och ROI-filnamn kommer att resultera i att det inte går att generera RpEGEN-bearbetningsarbetsflödet som beskrivs i avsnittet Representativa resultat (figur 4) och i slutändan förhindra RPE-regenereringskvantifiering med hjälp av detta skript.
Sammantaget ger detta protokoll instruktioner för att framgångsrikt ablatera RPE i larvzebrafisk, att manipulera signalvägar som kan vara av intresse före, under eller efter RPE-skada och att kvantifiera RPE-regenerering på ett standardiserat sätt med begränsade inneboende fördomar. I samband med tillgängliga in vivo - och in vitro-modeller för att studera RPE:s regenerativa potential är zebrafisken unik i sin kapacitet för inneboende RPE-regenerering14. Detta är dock en akut modell av RPE-skada, inte kronisk liksom RPE-degenerativa sjukdomar som är inriktade på terapeutisk utveckling (t.ex. AMD). Även om detta är en begränsning av modellen, är det fortfarande en utmärkt plattform för att studera mekanismerna för RPE-regenerering, som till stor del är okända och kan anpassas i framtiden för att studera kronisk skada och sjukdom. De verktyg och metoder som beskrivs här är mångsidiga och kan också tillämpas på studier av cellulära processer som är involverade i det degenerativa svaret och för att studera ödet för RPE-intilliggande vävnader efter ablation. På samma sätt kan RpEGEN-skriptet ändras för att passa användarnas datautmatningsbehov. till exempel för att utföra rumsliga analyser av andra markörer än pigment (t.ex. in situ-hybridiseringssonder, proteinuttryck etc.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
L.L.L. är meduppfinnare på US Patent #9,458,428, som beskriver en påskyndad metod för att härleda retinal pigmentepitel från humana pluripotenta stamceller; detta är inte relaterat till innehållet häri. J.M.G. och G.B.F. har inget att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet som beskrivs här stöddes av National Institutes of Health (RO1-EY29410 till J.M.G och NIH CORE Grant P30-EY08098 till Institutionen för oftalmologi); UPMC Immune Transplant & Therapy Center (till L.L.L. och J.M.G.); och E. Ronald Salvitti-professuren i oftalmologiforskning (till J.M.G.). Ytterligare stöd erhölls från Wiegand Fellowship in Ophthalmology (till L.L.L), Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, och ett obegränsat bidrag från Research to Prevent Blindness, New York, NY. Författarna vill också tacka Amanda Platt för teknisk hjälp och Dr. Hugh Hammer och vattenpersonalen för utmärkt djurvårdsstöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
- Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
- Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
- Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
- Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
- Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
- Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
- Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
- Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
- George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
- Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
- Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
- Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
- McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
- Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
- Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
- Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
- Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
- Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
- Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
- Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
- Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
- Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
- Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
- Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
- Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
- Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
- Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
- Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
- Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
- Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
- Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
- Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
- de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).
