Summary
Intracerebral infeksjon med Theilers murine encefalomyelittvirus (TMEV) i C57BL/6-mus replikerer mange av de tidlige og kroniske kliniske symptomene på viral encefalitt og påfølgende epilepsi hos mennesker. Denne artikkelen beskriver virusinfeksjon, symptomer og histopatologi for TMEV-modellen.
Abstract
En av hovedårsakene til epilepsi er en infeksjon i sentralnervesystemet (CNS); Omtrent 8% av pasientene som overlever en slik infeksjon utvikler epilepsi som en konsekvens, med priser som er betydelig høyere i mindre økonomisk utviklede land. Dette arbeidet gir en oversikt over modellering av epilepsi av smittsom etiologi og bruker den som en plattform for ny antiseizure sammensatt testing. En protokoll for epilepsiinduksjon ved ikke-stereotaktisk intracerebral injeksjon av Theilers murine encefalomyelittvirus (TMEV) i C57BL/6-mus presenteres, som replikerer mange av de tidlige og kroniske kliniske symptomene på viral encefalitt og påfølgende epilepsi hos mennesker. Den kliniske evalueringen av mus under encefalitt for å overvåke anfallsaktivitet og oppdage potensielle antiseizure-effekter av nye forbindelser er beskrevet. Videre vises histopatologiske konsekvenser av viral encefalitt og anfall som hippocampusskader og nevroinflammasjon, samt langsiktige konsekvenser som spontane epileptiske anfall. TMEV-modellen er en av de første translasjonelle, infeksjonsdrevne, eksperimentelle plattformene som tillater undersøkelse av mekanismene for epilepsiutvikling som følge av CNS-infeksjon. Dermed tjener det også til å identifisere potensielle terapeutiske mål og forbindelser for pasienter med risiko for å utvikle epilepsi etter en CNS-infeksjon.
Introduction
En av de hyppige konsekvensene av viral encefalitt er epileptiske anfall. Mange virusinfeksjoner utløser symptomatiske anfall i den akutte fasen av infeksjonen; Risikoen for slike anfall er økt med over 20% blant allmennheten 1,2,3. Pasienter som overlever infeksjonen har også en økt risiko på 4% -20% for å utvikle kronisk epilepsi i månedene til år etter infeksjon 1,4. Theilers murine encefalomyelittvirus (TMEV) er identifisert som et egnet virus for å studere akutte og kroniske anfall i en musemodell av viral encefalitt 5,6,7. TMEV er et ikke-innkapslet, positivt, enkeltstrenget RNA-virus av Picornaviridae-familien og har tradisjonelt blitt brukt til å studere demyelinisering i ryggmargen hos SJL-mus, som C57BL/6 (B6) mus er beskyttet mot fordi de har evnen til å fjerne viruset raskt etter infeksjon. Imidlertid induserer TMEV akutte anfall hos 50% -75% av mannlige og kvinnelige B6-mus innen den første uken etter infeksjon (pi), mens ca 25% -40% utvikler kronisk epilepsi uker til måneder pi 2,5,6,8,9. Bortsett fra anfall, viser musene også den vanlige histopatologien til en epileptisk hippocampus med nevrodegenerasjon og gliose 5,6,8,10,11,12. Videre utfører TMEV-infiserte B6-mus betydelig verre i atferdstester for læring og minne og har kognitiv komorbiditet, som også ses hos kliniske pasienter med epilepsi13,14,15.
Tradisjonelt benytter modeller av epilepsi og anfall enten anvendelse av kjemokonvulsive stoffer eller elektrisk stimulering for å indusere anfall; Imidlertid mangler disse modellene konstruktiv validitet og viser ofte mer alvorlige anfall og hjerneskade enn det som er sett hos kliniske pasienter16. Det finnes ingen modell som passer for hvert forskningsspørsmål17. Bruk av TMEV-modellen er spesielt interessant hvis de predisponerende faktorene for anfallsutvikling etter en infeksjon i CNS blir undersøkt, eller hvis forbindelser screenes for deres antiseizure-effektivitet.
Siden TMEV-modellen er etablert og brukt på tvers av flere forskjellige laboratorier internasjonalt, har forfatterne identifisert mange detaljer som muliggjør vellykket implementering av modellen, for eksempel spesifisiteten til forskjellige virus- og musestammer. Den mest pålitelige anfallsinduksjonen ble generert med Daniels stamme av TMEV- og B6J-mus 2,5,6,8,9. Modellen brukes i dag av National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som en plattform for å identifisere nye legemidler mot epilepsi og anfall18,19. Dette papiret inneholder den detaljerte protokollen for virusinduksjon og klinisk overvåking for å tillate andre forskere å utnytte denne modellen av viral encefalitt for å fremme forståelsen av sykdomsmekanismer, samt for narkotikatesting.
Følgende protokoll gjenspeiler en studie designet for sammensatt testing i denne modellen, selv om mange andre typer studier kan utføres. Mus blir bedøvet kort før injeksjon med Daniels stamme av TMEV i den tidlige regionen av høyre halvkule (bakre og mediale til høyre øye). Avhengig av forskningsspørsmålet, hvis ikke-infiserte kontrolldyr kreves, får mus sterilt fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4, inkludert KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] og Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2,97mM]) i stedet forTMEV. Tidligere erfaring med TMEV-infiserte mus har indikert at håndteringsinduserte anfall oppstår mellom dag 3 og dag 7 etter infeksjon. Hyppigheten av injeksjon, rute og tid for testing av eksperimentelle forbindelser varierer i henhold til deres egenskaper. Det anbefales å utføre virusinokulasjonen på en fredag, noe som gjør at dag 3-7 anfallsovervåking kan skje uken etter, mandag-fredag. I løpet av anfallsovervåkingsuken kan eksperimentelle forbindelser administreres (i.p.) to ganger daglig (med minst 4 timers mellomrom) med mindre annet er foreslått av forbindelsens kinetikk eller virkningsmekanisme. Krampeovervåking under behandling kan utføres på et tidligere bestemt tidspunkt. Injeksjons- og observasjonstider varierer avhengig av individuelle forbindelser. Dyr injiseres med testforbindelsen eller med et kjøretøy i stedet for legemiddelforbindelsen. Disse to gruppene kan håndteres og observeres analogt med eksperimentgruppen. Under forsøket skal den ene personen som håndterer musene og skårer anfallene, blindes for behandlingen.
Protocol
Alle beskrevne prosedyrer ble godkjent av de respektive myndighetene. Dyr opprettholdes i henhold til anbefalingene i "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (National Research Council) og i samsvar med Public Health Service-politikken og Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Utah, dyreprotokoll (nummer: 21-11009, Institutt for farmakologi og toksikologi) og ved Freie Universität Berlin (protokoll: G0015/21, LAGeSo Berlin, Institutt for farmakologi og toksikologi), henholdsvis. Resultatene vist i figur 3 og figur 5 ble godkjent under 33.9-42502-04-11/0516 og 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Institutt for farmakologi, toksikologi og farmasi, University of Veterinary Medicine Hannover).
1. Vurderinger og forberedelser til utforming av studien
- Virus
- Daniels stamme av TMEV ble vennlig levert av Robert Fujinami fra University of Utah. Opprinnelig ble den isolert fra en mus i Harvard-kolonien20. Slå opp de spesifikke klassifiseringene og forskriftene for biologiske agenser i de respektive landene før du håndterer TMEV, og diskuter med det institusjonelle biosikkerhetspersonellet for å sikre overholdelse av forskrifter. Vanligvis er TMEV klassifisert som BSL 2, avhengig av stammen og genetiske modifikasjoner. Standarddose som er nødvendig for å indusere anfall hos et flertall av dyrene er 3 x 105 plakkdannende enheter (PFU).
MERK: Dosen må kanskje tilpasses, for eksempel hvis transgene mus brukes. Totalt sett har titere mellom 2 x 104 PFU og 2,44 x 107 PFU blitt brukt for å indusere anfall. Kontrolldyr får steril PBS og opplever ikke anfall. Viruset smitter ikke mennesker; Imidlertid bør PPE (laboratoriefrakk, hansker, vernebriller) brukes av eksperimenter til enhver tid, og musekropper og sengetøy bør autoklaveres før avhending.
- Daniels stamme av TMEV ble vennlig levert av Robert Fujinami fra University of Utah. Opprinnelig ble den isolert fra en mus i Harvard-kolonien20. Slå opp de spesifikke klassifiseringene og forskriftene for biologiske agenser i de respektive landene før du håndterer TMEV, og diskuter med det institusjonelle biosikkerhetspersonellet for å sikre overholdelse av forskrifter. Vanligvis er TMEV klassifisert som BSL 2, avhengig av stammen og genetiske modifikasjoner. Standarddose som er nødvendig for å indusere anfall hos et flertall av dyrene er 3 x 105 plakkdannende enheter (PFU).
- Dyr
- For å indusere og undersøke anfall, bruk B6J-mus, da andre musestammer ikke nødvendigvis viser anfall, for eksempel SJL / J, FVB / N eller Balb / c mus5. Det er ingen forskjell mellom hunnmus og hannmus i akutt anfallsfrekvens5. Utfør forsøkene på ungdom til voksne mus (starter ved 5-6 ukers alder).
- Diett
- Kosthold har blitt bestemt som en kilde til lab-til-lab variabilitet i sykdommens alvorlighetsgrad; Vurder derfor kostholdet som en potensiell faktor for variasjon22.
- Gruppestørrelse
- Siden ikke alle dyr utvikler akutte eller kroniske anfall i denne modellen, bruk ca. 20 mus / gruppe for sammensatt testing.
- Dyrevelferd
- Hvis en mus viser signifikante bivirkninger fra infeksjon eller administrasjon av undersøkelsesforbindelsen (f.eks. sløvhet, dårlig pelsstell, overdreven rødhet og purulent utflod fra såret) etter en observasjonstid bestemt av de lokale IACUC-retningslinjene (f.eks. 48 timer), avlive musen humant.
- Avlive enhver mus som demonstrerer ekstremt vekttap (>20%) i infeksjonsperioden humant.
- Hvis dyr ikke spiser riktig, gi dem tilgang til supplerende pellets fuktet med pediatrisk elektrolyttløsning eller lignende.
2. Virus inokulering
- Sterilisering av injeksjonssprøyten
- Fjern hetten på insulinsprøyten. Legg polyetylenslangen som en krage rundt nålen for å sikre en tilstrekkelig injeksjonsdybde på 2,5 mm. Senk sprøyten i etanol i 30 minutter. Plasser sprøyten under UV-lys i 30 minutter.
- Sett hetten tilbake på kanylen. Pakk sprøyten inn i en steriliseringspose og tape den lukket. Etikett med dato for forberedelse.
- Virusinjeksjon
- Få alikoter av Daniels stamme av TMEV fra -80 ° C fryseren. Tine viruset og ha det på is. Unngå tining og frysing av viruset. Fyll sprøyten med virussuspensjonen (3 x 105 PFU fortynnet i 20 mikroliter PBS eller DMEM dyrkningsmedium).
FORSIKTIG: Viruset er smittsomt for mus, men ikke for mennesker. - Rengjør benken med desinfeksjonsmiddel og arbeid under en røykdemper. Virusinokulering er ikke steril, men er så ren som mulig.
- Overfør musen til anestesiinduksjonskammeret, og bruk 2% isofluran i oksygen for å indusere anestesi. Å nå kirurgisk toleranse tar noen minutter; Juster konsentrasjonen basert på dyrets pust og anestesidybde.
- Overfør den bedøvede musen fra anestesiboksen under hetten. Sjekk kirurgisk toleranse, f.eks. Hele prosedyren utføres på mindre enn 30 sekunder, slik at dyret ikke trenger å inhalere isofluran under injeksjonen. Tilsett øyesalve for å forhindre tørking av hornhinnen.
- Rengjør dyrets hode med en alkoholpute. Vipp musens hode litt mot venstre slik at injeksjonsstedet peker oppover.
- Trekk huden litt bakover, stikk nålen inn i hodet og injiser 20 μL intrakortikalt til en dybde på 2,5 mm i den tidlige regionen på høyre halvkule (bakre og mediale til høyre øye).
- Utfør injeksjonen ensidig på samme halvkule i alle dyr. Bruk øyet og øret som landemerker for plasseringen av parietal cortex. Plasseringen er tidligere verifisert histologisk; se figur 1. Injeksjonskoordinater i henhold til stereotaktisk injeksjon i forhold til bregma er −2,0 (AP); +3,0 (ML); -1,5 (DV).
- La sprøyten sitte på plass i 5-15 s. Skriv ned hvis det lekker fra injeksjonen eller hvis det ses luftbobler - i så fall klargjør du en ny sprøyte. Når sprøyten trekkes forsiktig ut, roter den litt. Påfør øyesalve for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi.
- VALGFRITT: Kode dyret på halen eller øret avhengig av lokale prosedyrer (valgfritt, men enkelt da dyret er bevisstløs).
- Overfør dyret til et nytt bur, som plasseres halvt på/halvt av en varmepute (35-40 °C) under restitusjon fra anestesien. Ikke la dyrene være uten tilsyn før de har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal hvile.
MERK: Dyr kan grupperes igjen etter utvinning (infiserte dyr blandes ikke med mock-infiserte dyr). Infiserte mus bør ikke plasseres i samme rom som ikke-infiserte mus. - Hold styr på musens vekt de første 7 dagene pi da de går ned i vekt etter infeksjon og kan kreve ekstra fôring.
- Få alikoter av Daniels stamme av TMEV fra -80 ° C fryseren. Tine viruset og ha det på is. Unngå tining og frysing av viruset. Fyll sprøyten med virussuspensjonen (3 x 105 PFU fortynnet i 20 mikroliter PBS eller DMEM dyrkningsmedium).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av TMEV-injeksjonsprosedyre. Fra venstre til høyre: For en høyre parietal cortex injeksjon, injiseres nålen litt lateralt av en imaginær linje mellom øyet og motsatt øre. Kragen for dybdekontroll er merket med gult. Injeksjonskanalen kan sees i koronal hjerneseksjon, markert med pilen. Injeksjonsstedet tilsvarer koordinatene gitt over pilen. Det høyre bildet viser fordelingen av Theiler-viruset (fiolett) i CA1 i hippocampusformasjonen. Figuren ble utarbeidet ved hjelp av biorender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Sammensatt testing
- Sammensatt forberedelse
- Se gjennom formuleringsinstruksjonene. Forbered kjøretøyløsning i henhold til anbefalinger eller instruksjoner. Som et eksempel presenteres prosedyren for det antiepileptiske legemidlet levetiracetam (LEV). LEV reduserer anfallsbelastningen til 30 %-40 % av vehikkelnivået ved en dose på 350 mg/kg. Kjøretøyet som ble brukt i denne studien er 0,5% metylcellulose.
- Beregn doser avhengig av forbindelsen. Vei ut stoffet i henhold til beregningen. For behandling av 1 kg mus, vei ut 350 mg LEV.
- Forbered en stamløsning med riktig volum av kjøretøyløsning, som instruert av formuleringsinstruksjonene (f.eks. Sonikering, kjøretøyhjelpestoffer, etc.). Tatt i betraktning et injeksjonsvolum på 0,01 ml/g mus, vil injeksjonsvolumet for 1 kg være 10 ml for 350 mg LEV, noe som resulterer i en oppløsning på 35 mg/ml19. Rapporter beregningen og dosen i mg/kg og volumet i ml.
MERK: En eksemplarisk protokoll finnes på side 2 i tilleggsmateriale 1.
- Sammensatt administrasjon
- Randomiser bur til kjøretøyet eller sammensatt gruppe. Bruk mock-infiserte mus for studier på mekanismene for epilepsiutvikling eller for valideringsformål, men ikke for rutinemessig legemiddelscreening.
- Rapporter miljøforhold som temperatur, fuktighet, tid på dagen osv.
- Vortex løsningen med blandingen så vel som kjøretøyløsningen. Aspirer kjøretøyet eller forbindelsen i en sprøyte og fargekode sprøytene for å unngå blanding.
- Vei dyrene. Sørg for at B6J-mus er >18 g på dag 3 pi (ikke avrundet). Rapporter vekten.
- Administrer forbindelsen (f.eks. ved intraperitoneal injeksjon eller andre egnede veier). Skriv tid og rute for administrasjon.
- Overvåk dyrene for eventuelle atferdsendringer etter sammensatt administrering, spesielt etter de første injeksjonene. Hvis anfall oppstår, rapporterer anfallsintensitet i henhold til Racine skala23; Se trinn 3.2.
MERK: En eksemplarisk protokoll for administrering av forbindelser finnes i tilleggsmateriale 1, side 3, mens anfall observert under administrering vil bli registrert på tilleggsmateriale 1, side 4-5.
- Anfallsovervåking av håndteringsinduserte anfall
- Utfør denne prosedyren av en eksperimentør blindet for behandlingen. Ta alle burene til benken. Observer dyrene for anfall 2x daglig i lysfasen.
- Skår anfallsaktiviteten etter en modifisert Racine-skala23: 0 = ingen endring i atferd, 1 = munn- og ansiktsbevegelser, 2 = hodenikking, 3 = ensidig forbenklonus, 4 = bilateral forbenklonus med oppdrett, 5 = generalisert tonisk-klonisk aktivitet med tap av postural tone, noen ganger hopping, 6 = langvarig og overdreven hopping og hyperaktivitet. Rapporter antall og intensitet av anfall.
- Skyv en penn over buret for å lage litt støy.
- Overfør hvert dyr til en annen boks og tilbake.
- Rist buret forsiktig med en frem og tilbake bevegelse, pass på at du ikke rister buret så kraftig at dyr vil treffe sidene eller toppen av buret og står i fare for å opprettholde fysisk skade.
- Overvåk alle dyr i buret for anfall. Når som helst, hvis en mus har et anfall, overfør det tilbake til hjemmeburet og skriv ned nivået av anfallet uten ytterligere anfallsstimulering ved støy eller håndtering.
- For dyr som ikke har grepet spontant eller etter forsiktig burristing, utløs anfall ved mer intens håndtering: Snu musen forsiktig ved å snu den på halen fra venstre til høyre.
MERK: Dyr med anfall er hyperexcitable, og kan være hoppete. - Observer hvert dyr for anfallsadferd igjen. Gjenta prosessen for påfølgende bur.
MERK: En eksemplarisk protokoll for beslagsovervåking finnes i tilleggsmateriale 1, side 6-7.
- Datarapport om sammensatte effekter
- Analyser den daglige kroppsvekten ved hjelp av gjentatte målinger (RM) ANOVA.
- Bruk de daglige kumulative verdiene for anfallsbelastning for en grafisk fremstilling av dataene. Presenter effektdata (antall dyr uten Racine stadium 3-5 anfall) som antall beskyttet/antall testede i hver respektive gruppe (vanligvis N = 20). Sammenlign derfor dataene mellom kjøretøy- og narkotikabehandlede grupper for respons (beslaglagt eller ikke-beslaglagt) ved hjelp av en Fishers eksakte test.
MERK: Et dyr anses som "beskyttet" mot anfall hvis et anfall av stadium 2 eller mindre, og ikke-beskyttede dyr har anfall i trinn 3-5. - Analyser tolerabilitetsdataene på samme måte, som antall dyr med atferdssvikt eller toksiske effekter / antall testet i hver gruppe. Legg merke til eventuelle bivirkninger, inkludert dødsfall.
- Hvis mindre enn 50% av musene som injiseres med kjøretøyet, griper akutt, må du ikke vurdere dataene.
Representative Results
Sammensatte effekter på akutte anfall
Atferdsmessige anfall registreres hvis de oppstår under injeksjon (DI) eller under de påfølgende AM / PM-anfallshåndterings- / overvåkingsøkter. Beslag observert under håndtering av anfall kan presenteres som et varmekart, som er vist i figur 2 for LEV (350 mg/kg). For analysen av anfallsbyrde er gjennomsnittet av de endelige (dag 7) kumulative anfallsbyrdeverdiene for den kjøretøybehandlede gruppen tatt og sammenlignet ved Mann-Whitney U-testen med den sammensatte gruppen behandlet (anfallsbyrdeverdier inkluderer de som ble samlet inn ved observasjonen etter injeksjon). Når det gjelder sammensatt effekt, avgjør en Fishers eksakte test om det er en statistisk forskjell i effekt mellom kjøretøy- og narkotikabehandlede grupper. På samme måte analyseres tolerabilitetsdata med Fishers eksakte test. Kroppsvektsanalyse utføres ved gjentatte målinger av ANOVA for å bestemme endringer i løpet av forsøket, samt forskjeller mellom sammensatte og kjøretøybehandlede mus.
Figur 2: Et varmekart over atferdsmessige anfall etter testing med vehikkel (0,5 % metylcellulose) eller LEV (350 mg/kg). Injeksjoner to ganger daglig forekom 1 time før håndtering og anfallsobservasjoner. Atferdsmessige anfall ble registrert hvis de oppstod under injeksjon (DI) eller under de påfølgende AM/PM-anfallshåndterings-/overvåkingsøktene. LEV (350 mg/kg) reduserer anfall observert under håndtering (35,9 % av kjøretøyenes anfallsbyrde) signifikant i løpet av observasjonsperioden på 5 dager. Varmekartet lages ved å vise anfall trinn 1-3 i grønt, 4 i gult og 5 i oransje. Denne nye figuren ble opprettet fra et publisert datasett19. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kronisk epilepsi
Bortsett fra den rapporterte anfallsbyrden i den første uken pi, er det flere avlesninger som kan være nyttige avhengig av studien og hypotesen. Hvis dyr holdes langvarig, vil en undergruppe av infiserte dyr utvikle spontane epileptiske anfall ved flere uker pi, som forekommer sjeldnere enn akutte anfall og dermed krever EEG-registrering. For å registrere EEG fra mus, må elektroder implanteres i en stereotaksisk kirurgi24. Figur 3 viser ulike epileptiske hendelser i kronisk fase ved EEG-registrering hos mus infisert med TMEV8.
Figur 3 Typiske EEG-spor i kronisk fase (14 uker pi) etter DA-virusinfeksjon hos mus. (A-C) Representative EEG-hendelser der det ikke ble sett atferdsmotorisk korrelat, dvs. (A) enkeltpigger, (B) piggklynger, (C) samt et elektrografisk, antatt fokalt anfall. (VG Nett) Representative EEG-hendelser med atferdskorrelater. Musen illustrert i D hadde anfallslignende hendelser med myoklone rykninger (indikert med "M", ledsaget av bevegelsesartefakter), stereotype bevegelser (indikert med "hodepress", når musen presset hodet flatt på bakken) eller atferdsarrest; "Scr" beskriver en bevegelsesartefakt av skrape, (E) og (F) viser typiske EEG-endringer under generaliserte kramper: (E) et Racine stadium 3-anfall med en varighet på 22 s og 1 Hz, og (F) et stadium 5-anfall med en varighet på 34 s og 5,4 Hz. Denne figuren er publisert før8 og er gjengitt med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Histologi
Siden epilepsi og anfall vanligvis ledsages av hippocampus-patologi hos pasienter, som rekapituleres i eksperimentelle modeller, analyserer de fleste laboratorier også hippocampus-endringer eller effekten av en potensiell antiseizure-behandling på patologi. Vanligvis analyserte parametere inkluderer hippocampus neurodegenerasjon og krymping, samt betennelse ved merking for spesifikke immuncellepopulasjoner. For slike analyser, ved slutten av forsøket, blir mus dypt bedøvet til pustestans oppstår og hjertefrekvensen reduseres betydelig eller viser arytmi. Blod fjernes ved intrakardial perfusjon av PBS etterfulgt av 4% paraformaldehyd (PFA)25 for å fiksere vevet. Vevet behandles deretter ved kryoseksjonering og (immun)farging26, etterfulgt av mikroskopiske analyser.
Figur 4: Hippocampus degenerasjon hos epileptiske TMEV-infiserte mus. (A,B) Cresylfiolettfargede koronale snitt viser normal cytoarkitektur i en (A) kontroll (PBS) mus og hippocampus degenerasjon i en (B) TMEV mus ved 2 måneder pi. Merk: Forstørrede laterale ventrikler, kollaps av alveus og tynning av pyramidecellelaget. (C) Kvantifisering av denne skaden viser en signifikant reduksjon i hippocampusområdet og en tilsvarende økning i ventrikkelområdet hos TMEV-mus (N = 7) vs. PBS-mus (N = 6; data er gjennomsnittlige ± SEM; p < 0,001; Student t-test). (D,E) NeuN-merking illustrerer videre størrelsen på nevroncelletap i seksjoner tatt ved 6 måneder pi. Piler indikerer regioner med fullstendig pyramidecelletap. (E) Gyrus dentatus ser ut til å være relativt intakt selv hos epileptiske mus. Skalastang = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Denne figuren er publisert før6 og er gjengitt med tillatelse fra Oxford University Press. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 Representative fotomikrografer av ulik alvorlighetsgrad av T-celleinfiltrasjon på grunn av akutt encefalitt 7 dager etter infeksjon. Seriesnitt med ipsilateral dorsalhippocampus ble farget med antistoffer mot CD3 for å merke T-lymfocytter. (A,D) En normal hippocampus uten T-celleinfiltrasjon slik den dukket opp hos liksominfiserte dyr. (B, E) Moderat T-celleinfiltrasjon som ses hos de fleste TMEV-infiserte mus. (C, F) En alvorlig infiltrasjon av T-lymfocytter, som bare ble sett hos noen av de infiserte musene. Denne figuren er publisert før8 og er gjengitt med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Tilleggsfilen består av skjemaet som brukes til sammensatt testing i TMEV-modellen. Side 1 gir en oversikt over det eksperimentelle oppsettet. Informasjon om preparat av forbindelser, kjøretøy og sammensatte løsninger er registrert på side 1-2. Sammensatt applikasjon er registrert på side 3. Skåringsarkene på side 4-5 brukes til å registrere anfallene som er observert og kvantifisert av eksperimentøren som utfører sammensatt injeksjon. På side 4 kan det samles inn data for bur 1-4 av 5 mus hver, og på side 5 kan merd 5-8 registreres, som er standard antall dyr for sammensatt testing i våre hender. Scoringsarkene på side 6-7 brukes av den blindede observatøren som utfører observasjonen, håndteringen og den milde burristingen 1 time etter hver sammensatte injeksjon. Igjen kan anfallsscore noteres for åtte merder totalt på disse eksemplariske poengarkene. Den siste siden 8 kan brukes til å registrere eventuelle andre observasjoner eller notater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Dette er den første infeksjonsbaserte gnagermodellen for epilepsi som tillater undersøkelse av akutt og kronisk anfallsutvikling. Det vil bidra til å identifisere narkotikamål og nye forbindelser for sykdomsforebygging eller modifikasjon for en av de vanligste etiologiene av epilepsi.
Som beskrevet ovenfor kan det være nødvendig å vurdere batch- og virustiteren nøye for å sikre at en tilstrekkelig andel av TMEV-behandlede mus viser håndteringsinduserte anfall. Hvis dyr har færre anfall enn vanlig, bruk en gruppe N = 20 dyr for å verifisere viruseffektiviteten. Hvis aktiviteten reduseres (mindre enn 50%), er det på tide å lage nye alikoter og teste dem med N = 20 dyr. Hvis de nye alikotene ikke er mer effektive, bør en ny batch av viruset renses. For noen transgene muselinjer kan det være nødvendig å bruke en lavere viral titer; Derfor bør virustiteren fortynnes etter behov etter foreløpige eksperimenter. De fleste tilgjengelige data på B6-mus stammer fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA eller Charles, Sulzfeld, Tyskland); Imidlertid er lignende anfallsrater hos B6-mus hentet fra Harlan (Eystrup, Tyskland) bekreftet8. Beslagsfrekvensen av transgene dyr med B6-bakgrunn er sammenlignbar med villtype B6-mus, men kan variere hvis de genetiske endringene har innflytelse på virusinvasjon, inflammatorisk respons eller nevrodegenerasjon21. Akutte anfall observeres spontant, men utløses av håndtering og støy, så det er av største betydning å håndtere alle dyr på samme måte når anfallsrater sammenlignes. To ganger daglig har håndteringen tidligere gitt høy anfallsbelastning og en større andel mus som viser anfall i dag 3-7 etter infeksjon 6,8,19. Ekstra håndteringstimer (dag 1 og dag 2) kan også benyttes for å øke anfallsbyrden. Videre kan dyr observeres før hver håndteringsøkt for å sikre at spontane anfall ikke forekommer. Et høyt laboratoriemiljø kan for eksempel produsere anfall, noe som igjen kan gjøre dyr motstandsdyktige mot håndteringsinduserte anfall under testtider.
Mens TMEV-infeksjon produserer håndteringsinduserte anfall hos de fleste mus, er det ukjent hvorfor noen dyr er resistente mot denne behandlingen. Som beskrevet ovenfor kan det være at elektrografiske anfall (med minimal eller ingen assosiert atferd) forekommer og normalt ikke kvantifiseres uten samtidig EEG-registrering. Det kan også være at små forskjeller i injeksjonsplassering letter redusert viral effekt i hjernen; Imidlertid er anfall rapportert etter kortikal og striatale infeksjon 5,6,8,9 på grunn av virusets tropisme til hippocampus. For narkotikascreeningstudier i denne modellen, for å identifisere en reduksjon i anfall (f.eks. en 50% reduksjon i anfallsbyrden), er det nødvendig med et større antall dyr for hver gruppe (f.eks. N = 20). Videre nødvendiggjør variasjonen i anfallsatferd i denne modellen større forskjeller i narkotika vs. kjøretøyeffekter for å identifisere en signifikant anfallsreduksjon. En begrensning ved denne modellen er derfor kravet om større gruppestørrelser. Likevel gir tilstrekkelige gruppestørrelser også mulighet for identifisering av anfallsdempende og betennelsesdempende effekter i denne modellen19.
De aller fleste observerbare anfall i denne modellen skjer i løpet av den akutte infeksjonsperioden. Til tross for forekomsten av hippocampus degenerasjon, immuncelleaktivering og kognitive underskudd observert hos mus behandlet med TMEV, utvikler bare en liten del av de behandlede dyrene til slutt kroniske, spontane anfall. Denne lave totale anfallsbyrden vil kreve et stort antall infiserte mus for å kunne studere spontane anfall på riktig måte i denne modellen, noe som er utenfor omfanget og evnen til mange prosjekter. Dybdeelektrodeimplantasjon og EEG-overvåking vil også øke belastningen på forsøksdyrene. Mens dybdeelektroder kan hjelpe til med å identifisere spontan anfallsaktivitet, kan endringer i hippocampus-anatomi etter infeksjon gjøre konsekvent elektrodeplassering til en utfordring.
Det presserende behovet for å identifisere nye behandlinger for epilepsi krever utvikling av modeller som kan brukes som en rask screeningmetode for antiseizure effekt. Denne modellen inneholder funksjoner for å håndtere denne presserende forespørselen. Videre gjør det faktum at det ikke krever noen stereotaktisk kirurgi det til en egnet og lett å utføre modell for undersøkelse av antiseizure-forbindelser.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
SB støttes av et starttilskudd fra FU Berlin. KSW støttes av R37 NS065434 og ALSAM Foundation. LAB støttes av en D-SPAN award 1F99NS125773-01. Vi takker Robert Fujinami, Ph.D. for å gi oss Theiler-viruset og University of Utah Cell Imaging Core Facility for mikroskopistøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent paper | - | - | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | - | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | - | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | - | - |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | - | - | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | - | - | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | - | - | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | - | - | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
- Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
- Vezzani, A., et al.
- Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J.
- Libbey, J. E., et al.
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
- Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
- Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
- Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
- Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
- Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
- Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
- Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
- Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
- Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
- Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
- Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
- Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
- Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al.
