Summary
この論文は、主にナノスケールでの現象を明らかにするために使用される光学的(線形および非線形)とホログラフィック方法の複合力に焦点を当てています。バイオフォトニックおよび振動化学反応の研究から得られた結果を代表例として挙げ、ナノスケールでダイナミクスを明らかにするホログラフィーの能力を強調しています。
Abstract
この方法では、ナノスケールでの自然系の動的応答の隠された詳細を明らかにする光学およびホログラフィーの可能性を利用する。第1部では、天然フォトニック構造の光学的およびホログラフィック研究、ならびに光泳動効果の出現条件、すなわち、光誘起熱勾配によるナノ構造の変位または変形をナノスケールで提示する。この効果は、温度によって誘発される昆虫の羽を覆う鱗屑の変形を監視するリアルタイムのデジタルホログラフィック干渉法によって明らかにされる。光泳動効果の出現につながる幾何学とナノ波形の関係が実験的に実証され、確認されています。第2部では、複雑な振動ブリッグス・ラウシャー(BR)反応で起こる相転移現象など、非線形ダイナミクスを持つ化学系の隠れた詳細を明らかにするために、ホログラフィーをどのように潜在的に使用できるかが示されています。ナノスケールでのホログラフィーの提示された可能性は、大気中の未燃炭化水素の移動および異なるエアロゾルの分離、マイクロプラスチックの分解および粒子一般の分画、ならびにミクロンサイズの燃料粒子の温度および熱伝導率の評価を含む、粒子の捕捉および浮上などの様々な用途のための光泳動効果およびパターン形成を制御および成形するための巨大な可能性を開く可能性がある。
Introduction
ナノ世界のユニークな現象をすべて完全に理解し、気づくためには、ナノスケールで構造やダイナミクスに関するすべての詳細を明らかにすることができる技術を採用することが重要です。このため、線形法と非線形法のユニークな組み合わせと、ナノスケールでのシステムのダイナミクスを明らかにするホログラフィーの力が提示されます。
説明されたホログラフィック技術は、所定の時点で信号が写真カメラ、サーマルカメラ、および干渉計によって同時に記録されるため、トリプルレック法(recは記録の略語)と見なすことができる。線形および非線形光学分光法およびホログラフィーは周知の技術であり、その基本原理は文献1、2に広く記載されている。
長い話を短くするために、ホログラフィック干渉計は、システムのダイナミクスを特徴付けるために、時間の異なる瞬間に記録された波面の比較を可能にします。以前は振動ダイナミクス3,4を測定するために使用されていました。最も単純な干渉測定法としてのホログラフィーの力は、システム内の最小変位を検出する能力に基づいています。まず、ホログラフィーを用いて、異なる生体構造における光泳動効果5(すなわち、光誘起熱勾配によるナノ構造の変形の変位)を観察し、明らかにした。本方法の真の提示のために、代表的な試料を、多数の試験済み生物試料6から選択した。スペイン女王フリチラリー蝶の翼、イッソリア・ラトニア(リンネ、1758年;I. lathonia)、を本研究の枠組みにおいて使用した。
生体組織におけるナノスケールでの光泳動の発生を首尾よく実証した後、同様のプロトコールを適用して、振動化学反応における相転移によって引き起こされる自発的対称性破壊プロセス7をモニターした。この部分では、化学的に非線形BR反応で起こる低濃度のヨウ化物およびヨウ素(状態Iと呼ばれる)から高濃度のヨウ化物およびヨウ素への相転移(状態IIと定義)が研究された8,9。ここでは、このような凝縮系で起こるナノスケールでの相転移や自発対称性破壊ダイナミクスを研究できるホログラフィックアプローチを初めて報告しました。
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Protocol
1. 事前特徴付け
- サンプルの完全な事前特性評価を実行します。
- 市販の供給源から購入した乾燥試料に対してすべての実験を行います。サンプルを実験室で、乾燥した暗所で、室温で保管してください。
- ホログラフィック測定の前に、走査型電子顕微鏡(SEM)、線形光学分光法、および非線形光学顕微鏡(NOM)10 による完全なサンプル特性評価を実行します(図1)。
- 線形技術によって測定されたサンプルの光学特性に加えて、非線形光学特性の特性評価を可能にする高強度レーザービームで補足情報を収集します。
- 対応する非線形光学感受性を使用して非線形光学応答を定量化し、さまざまな生物学的サンプルの特性評価に使用される非破壊多光子励起蛍光や第2高調波発生(SHG)などの非線形光学技術の基礎を形成します。
- 振動BR反応で起こる非線形化学現象について、以下の濃度の反応物を用いて、状態Iから状態IIへのin situ相転移の干渉モニタリングの研究を行う:[CH2(COOH)2]0=0.0789モルdm-3、[MnSO4]0=0.0075モルdm-3、[HClO4]0=0.03モルdm-3、 [キオ3]0 = 0.0752 mol dm-3、および[H2O2]0 = 1.269 mol dm-3(ブラケットの後の0はプロセス開始時の初期濃度を表す)。BR反応に使用する総容量を2.5mLにしてください。
注:ここで用いた濃度値は、Pagnacco et al.8による研究のものと等しいが、反応体積は10で割ったものである。
- 実験用のサンプルを準備します。
- この実験には、スペインの女王フリチラリー蝶、 I. lathonia の羽を使用してください。翼を硬い面に置き、直径10mmのカッターで断面を作ります。蓋付きの任意の容器にサンプルを入れることができるサンプルボックスに入れます。
図1:蝶の翼鱗の波状の断面。その断面を非線形光学走査顕微鏡(A、B)に記録した。スペイン女王フリチラリー蝶I.ラトニアの翼のSEM観察(C)も行われた。この数値は14 から修正されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. 実験セットアップ
- ホログラフィックのセットアップ
メモ:ホログラフィック干渉測定は、オーダーメイドの光学セットアップで実行しました(図2)。- 実験室の温度を23°C±0.2°Cに調整してください。 レーザーをオンにします。これらのホログラフィック観察には、励起波長が532nmのレーザー(詳細は 材料表を参照)を使用してください。
- 光学素子の位置合わせを確認します(図2)。まず、 セットアップが図 2 のスキームに従って行われていることを確認します。
- レーザー光を凹面鏡Mに完璧に合わせ、光ビームエキスパンダー(L)の位置を確認して調整します。
- サンプルSに衝突するビーム部分を決定し、反射ビームOを形成していることを確認します。残りのビームが参照ビームRの生成に使用する球面ミラーCMに集められているかどうかを確認します。検出器Cが2つの指定されたビームの干渉ゾーン内に配置されているかどうかを確認します。
メモ:相補型金属酸化物半導体(CMOS)センサが検出器として使用されます。 - 使用するカメラの指示に従ってカメラをセットアップします。 図 2 に示すように、ホログラフィック実験用の光学/写真カメラをセットアップします (C はカメラ、詳細は 材料表を参照)。BR反応の目に見える変化を見るために2台目の光学/写真カメラと、光学テーブルの上に50mKの熱分解能と13mmの焦点距離を持つサーマルカメラをセットアップします。
注: ホログラフィック実験で使用されたカメラは、対物レンズを使用しません。光はチップに直接衝突します。
- サンプルをホログラフィック セットアップに準備します。
- ステップ1.2.1のように翼のサンプルを準備します。調製した試料を直径15mmの丸い金属支持体の上に置く。支持体には、サンプルを保持する金属リングが取り付けられているネジ用の3つの既存の穴があります。
- リングを支持体に取り付けます。取り付けたサンプルを、光学テーブル上にあるサンプルマウントの部分に置きます。
- 化学反応モニタリング用のサンプルを準備します。光学テーブル上の、意図した場所に、キュベット/容器が置かれる平らな接着面を有する支持体を置く。
- ステップ1.1.5のように反応の初期化に使用する試薬を準備する。反応物をキュベットに充填し、以下の体積および濃度の順序でキュベット中で混合する:0.2817モルdm-3CH2(COOH)2の0.7mL;0.0375モルの0.5mL dm-3 MnSO4;0.15モルの0.5mLのdm-3HClO4;0.5 mL の 0.376 mol dm-3 KIO3 ;0.3 mLの10.575モルdm-3H2O2とする。
- キュベット内の総容量が 2.5 mL であることを確認し、セットアップのサポートの上に置きます。
- 必要に応じて追加の楽器を設定します。光泳動効果を監視するには、局所加熱のために追加のレーザー(詳細は 材料表を参照)を使用してください。
図 2: ホログラフィックのセットアップ この図は、ホログラフィック実験のためにさまざまなコンポーネントがどのように配置されているかを示しています。略語:L1 = 532nmのレーザー、L = 両凸レンズ、A = 絞り、M = レーザービームを偏向するために使用されるフラットミラー、CM =凹面ミラー、C = CMOSカメラ、S = バタフライウィングセクション、R =参照ビーム、O =オブジェクトビーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. 使用するソフトウェアのセットアップ
注: フレネル近似値11 に基づく自家製の C++ ソフトウェアは、ホログラフィック実験からのデータの分析に使用されます。発表された研究のために開発されたソフトウェアは、 で見つけることができます。12 ソフトウェアの詳細は、現時点では公開できません。ただし、追加情報は要求に応じて提供されます。フレネル近似は、異なるサーフェスに焦点を当て、記録されたシーンに関する完全な情報を含む最初の回折順序の領域を拡大するため、デジタルホログラフィで非常に便利です。
- コンピュータの電源を入れ、ソフトウェアを実行します。
メモ: ソフトウェアを実行する手順は、ソフトウェア自体によって異なります。この目的のための商用ソフトウェアはありません。
4. 実験を行う
- 外部ライトをオフにします。暗い部屋で実験全体を行います。
- 選択した間隔を使用してカメラを同期します。この実験では、ホログラフィック カメラを 60 秒後に起動し、その直後に他の 2 台のカメラをソフトウェアまたは手動で起動します。
- 録音ボタンを押し、録音の開始時にソフトウェアで定義します。
- 関心のあるシステムに動的な変化を誘発する。開始方法は、サンプルの種類によって異なります。光泳動効果の場合、利用可能なレーザー(450 nm、532 nm、660 nm、980 nm)を使用してサンプルを外部加熱します。BR反応の場合には、化学反応剤を混合して反応を開始する。ホログラフィック実験を観察します。
- 実験全体を追跡し、光学的および熱的測定からホログラフィック記録の終了の瞬間を決定するように写真カメラとサーマルカメラを設定します。
- プロセスの終了を宣言します。記録の終了は、プロセスの推定期間に従って事前にプログラムされています。BR反応の場合は、反応の最後に固化を使用します。光泳動効果の場合、そのような特定の瞬間はない。いずれにせよ、このステップはトリプルレコーディングの重要性を強調しています。
5. 成果の取得12
- 結果を保存します。ホログラムを再構築し、より深いデータ分析を行うための時間の関数としてファイルを正確に並べ替えます。
メモ:このステップでは、ホログラフィーに使用するカメラから、撮影日にちなんで名付けられたフォルダ内のコンピュータ(ハードディスク)にデータが転送されます。コピー/貼り付けボタンと名前変更ボタンを使用します。 - プローブ ホログラムで適切な設定を確認します。このようにして、最初のホログラムで最適な設定が選択され、すべてのホログラムの再構築に使用されます。
- 以前に作成したフォルダからホログラムの1つをクリックしてホログラムを1つ選択し(手順5.1)、再構築ボタンをクリックして 再構築 を行います。
- 最高のイメージを実現するように設定を変更し、再構築を再度行います。サンプリング、オフセット、フレネル距離などのパラメータを調整するためのオプションが画面(ソフトウェアメニュー)に表示されます。最適な設定が定義されるまで、これらの手順を繰り返します。
- 再構築を実行します。[ ファイルを開く ] ボタンをクリックし、すべてのファイルを選択して、すべてのホログラムを選択します。ホログラムの数値再構成に必要なパラメータを適用します。ステップ 5.2.1 以降も変更されないままなので、今回は何も実行しないでください。
- [再構築 ]ボタンと インタフェログラムを使用して再構築を実行するには、[次の語句で始まる/次の語句で終わる]フィールドにファイル名を挿入し、[ バッチ]ボタンをクリックします。インタフェログラムは、以前に作成したフォルダに表示されます(手順5.1を参照)。
メモ: 一連のホログラムを時間内に記録した後、最初のホログラムは摂動していない状態を表し、外力の作用によって後続のホログラムが発生します。シフトフレネル変換13を用いてホログラムを再構築する必要がある。 - インタフェログラムは、特定のホログラムを、取得した最初のホログラムと時間的に(複素数で)減算して取得します。
メモ: このプロトコルでは、オブジェクトに対する力の影響を観察できます。時間の関数としての干渉パターンの変化は、測定中にシステム内で発生する変形または変位の結果です。これらの変化は、ナノスケールでシステムのダイナミクスを監視するために使用されます。
6. 結果の分析
- プロセスの最初の品質管理ステップとして視覚的分析を実行します。このステップでは、干渉パターンの目に見える変化を探し、干渉パターンの変化を光学的および熱的測定によって得られた結果と一致させようとします。
- すべての録音の反対尋問を行います。この第2段階では、光学カメラとサーマルカメラの両方からの画像をホログラフィック再構成で視覚的に徹底的に解析し、ナノスケールでのダイナミクスを明らかにします。このようにして、反応モーメントはホログラフィック、熱、および写真画像で同時に見られます。
- 数値/ソフトウェア分析に基づいて結果をグラフィカルに表現し、グラフ(1D、2D、または3D)、チャート、ヒストグラムなどの形式で表示します。結果の完全な分析の後、結論を導き出し、これに基づいてさらなる研究を期待してください。
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Representative Results
光恐怖効果は、 モルフォメネラウス 蝶5の翼の最初の実験で誘導され、監視されました。この効果は、異なる波長(450nm、532nm、660nm、および980nm)のLEDレーザーの作用によって開始された。ここでは、 I. lathonia butterfly14 からの翼が使用された。記録手順の後、ホログラム画像を再構成した。
図3: I.ラトニア 翼のホログラフィック再構成 再構成は、450nmの開始(A)、532nmの開始(B)、および980nmの開始(C)で行った。画像は視覚的感覚の明らかな違いを示しており、波長に応じて、着色された領域は異なるサイズで表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3A-Cで観察されたフリンジは、干渉の結果です。この図は、変化が第2のレーザー(一次レーザーからのビームを妨害しないビームでサンプルに当たるように配置され、記録中の任意の時点で動作させる)でサンプルに照射している間にのみ起こることを明確に示しており、ホログラフィック干渉法を使用して生物学的組織の変形または変位をモニターできることを裏付けている。
図3A-Cは、450nm(図3A)、532nm(図3B)、および980nm(図3C)の間の異なる波長が、組織内で異なる形態学的変位を引き起こすことによって干渉パターンにどのように影響するかを示しています。
振動BR反応に関する第2の実験では、過酸化水素を添加した直後にこの反応が始まり、大量の酸素が生成される(図4A)。状態Iから状態II(図4)への移行は、個々のキネティックラン8では本質的に再現不可能であるため、遷移のモーメントを監視することは非常に困難です。したがって、提示された結果は、多数の試行の結果です。インタフェログラムの解析では、反応が起こった正確な瞬間(すなわち、状態Iから状態IIへの移行が起こったとき)にフリンジパターンの変化が認められた。 図4E は、反応が起こる前の瞬間(左)と正確な瞬間(右)を示しています。ここで用いる波長は573nmである。振幅画像から変位データを算出する際には、直接縞カウントの方法を用いた。1つの縞は、波長の半分(すなわち、286.5nm)の変位に対応する。変位データが位相から計算される場合、次の関係が適用されます: Δl/λ = ΔΦ/2π。
図4:ブリッグス・ラウシャー(BR)反応における状態Iから状態IIへの移行。 ブリッグス・ラウシャー(BR)反応における状態Iから状態IIへの移行のための異なる記録。(a)気泡とのBR反応の開始は、酸素および二酸化炭素の形成に対応する。(b)状態I~状態IIの反応過程。(C)状態Iの終わりから状態IIへの移行。(D)セットアップ中のキュベット。(E)反応前モーメント(左)と反応モーメント(右)のインタフェログラム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
非線形化学現象は100年以上前から知られている15が、それにもかかわらず、その完全なメカニズムとダイナミクス16,17についてはまだ疑問がある。得られた結果は、このような複雑な化学現象をその場でホログラフィック技術で調査・監視する新たな可能性を開くものです。
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Discussion
提示されたバイオフォトニック研究では、低レベルの熱放射によって引き起こされる最小限の形態学的変位または変形を検出するために、新しいホログラフィック法が使用できることが示されている。
生体試料を用いたホログラフィック測定において最も重要なステップは、調製ステップです。サンプルの調製(ホルダーのサイズに合わせて切断/接着する)は、サンプルの機械的特性に依存し、このステップの標準プロトコルを持つことはできません。
BR研究に関しては、化学反応または物理的変換(酸素の放出、不純物など)中のすべての障害が干渉パターンに影響を与え、したがって記録された結果に影響を与えるため、透明な反応容器と比較的明確な光路を有することが極めて重要である。
一般に、記載された方法の最も重要な制限は、研究できるサンプルサイズです。サンプルは、光学セットアップ内に挿入される適切な寸法を有する必要があります。
ここでは、ホログラフィック干渉計(HI)がサンプルの特性評価に不可欠な補完ツールとして考慮されるべきであることを示しています。たとえば、従来の光学/IR画像は強度に関する情報のみをキャプチャしますが、位相に関する情報は完全に失われます18。ホログラフィック干渉計は、強度と位相に関するすべての情報を提供し、さらにリアルタイムでそれらの変化を監視するために使用することができます。
凝縮物質科学においてこの方法を利用することの重要性は、システムダイナミクスのわずかな変化を その場で 明らかにすることです。例えば、BR反応は、対称性破壊過程の最初の原因を明らかにすることができる。対称性を破る過程は、非線形ダイナミクスと結びついた物理的制約によってあらかじめ決められているのか、それとも過程は本当にランダムなのか。一方、別の言い方をすれば、BR振動周期期間のわずかな違いが、遷移外観の著しい乖離を引き起こす可能性があるのか?
提示された結果は、ナノスケールでのダイナミクスのより深い理解につながる最初のステップです。凝縮科学研究におけるホログラフィーの可能性はまだ完全には認識されていないため、この記事の目的は、将来の材料科学研究と応用のためのホログラフィーの力を強調することです。例えば、大気中の未燃焼炭化水素の移動または様々なエアロゾル19の分離などの粒子捕捉および浮上、水中のマイクロプラスチックの分解および粒子一般20の分画、ならびにミクロンサイズの燃料粒子21の温度および熱伝導特性の特性評価。
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Disclosures
著者らは利益相反を宣言する。
Acknowledgments
M. S. P., D. G., D. V., および B. K. は、NATO SPS (NATO Science for Peace and Security) 2019-2022 が資金提供するマルチスペクトル監視のための生物学的および生物的に触発された構造への支持を認める。B. K., D. V., B. B., D. G., および M. S. P. は、セルビア共和国の教育科学技術開発省による制度的資金提供を通じて、ベオグラード物理学研究所から提供された資金を認める。さらに、B. K. は F R S - FNRS からのサポートを認めています。M. P. セルビア共和国教育科学技術開発省 (契約番号 451-03-9/2021-14/200026) からの支援を認めます。S. R. M.は、ポスドク研究員として、ワロン地域のBEWARE Fellowship(Convention n°2110034)の支援を受けました。T. V.はヘラクレス財団からの財政的支援を認めています。D.V.、M.S.P.、D.G.、M.P.、B.B.、およびB.K.は、研究助成金N62902-22-1-2024を通じて海軍研究グローバル局の支援を認めています。この研究は、ベオグラード大学機械工学部のマリーナ・シモヴィッチ・パブロヴィッチの博士号の要件を部分的に満たすために実施されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Vibration Isolation, Four Optical Table Supports | Thorlabs | PTR502 | High Load Capacity: 2,500 kg, Height 600 mm |
| Cuvette | Standard glass cuvette | ||
| Holographic camera (optical camera for holography) | Cannon | EOS 50D | Sensor Size 22.3 x 14.9 mm; Pixel pitch 4.69 µm; Max. resolution 4752 x 3168; JPEG file format |
| Hydrogen peroxide, H2O2 | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Laser | Laser Quantum | Torus 532 laser | Wavelength 532 nm; Power 390 mW; Coherence length 10 m |
| LED lasers | |||
| Malonic acid, C3H4O4 | Acr s Organics (Geel, Belgium) |
||
| Manganese sulphate, MnSO4 | Fluka (Buchs, Switzerlend) | ||
| Nonlinear optical microscope | IPB | ||
| Optical accessories | Thorlab | ||
| Optical spectroscope | |||
| Optical table | Thorlabs | TOP450II PTR52509 | dimensions 2000*1250*310 mm |
| Perchloric acid, HClO4 | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Potassium iodate, KIO3 | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Software | Home-build software made by one of the authors: Dusan Grujic. This software was conducted in partial fulfillment of the requirements for the PhD deegree of D.G. | ||
| Thermal camera | Flir | A65 | 640x512 pixel; Thermal resolution 50 mK |
| Video camera | Nikon | 1v3 | 18.4 Mpixel; 60 fps |
References
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