Summary
Посттрансляционные модификации (PTM) изменяют структуры и функции белка. Методы одновременного обогащения нескольких типов PTM могут максимизировать охват в анализах. Представлен протокол с использованием двухфункциональной Ti(IV)-иммобилизованной хроматографии сродства металлов с последующей масс-спектрометрией для одновременного обогащения и анализа белка N-гликозилирования и фосфорилирования в тканях поджелудочной железы.
Abstract
Масс-спектрометрия может обеспечить глубокий охват посттрансляционных модификаций (ПТМ), хотя обогащение этих модификаций сложными биологическими матрицами часто необходимо из-за их низкой стехиометрии по сравнению с немодифицированными аналитами. Большинство рабочих процессов обогащения PTM на пептидах в рабочих процессах протеомики снизу вверх, где белки ферментативно перевариваются до анализа полученных пептидов, обогащают только один тип модификации. Однако именно весь набор ПТМ приводит к биологическим функциям, и обогащение одного типа ПТМ может пропустить такие перекрестные помехи ПТМ. Перекрестные помехи PTM наблюдались между гликозилированием белка и фосфорилированием, двумя наиболее распространенными ПТМ в белках человека, а также двумя наиболее изученными ПТМ с использованием рабочих процессов масс-спектрометрии. Используя стратегию одновременного обогащения, описанную в настоящем описании, оба ПТМ обогащаются из посмертной ткани поджелудочной железы человека, сложной биологической матрицы. Двухфункциональная Ti(IV)-иммобилизованная хроматография сродства металлов используется для разделения различных форм гликозилирования и фосфорилирования одновременно в нескольких фракциях в удобном методе на основе спин-наконечника, что позволяет проводить последующий анализ потенциальных перекрестных взаимодействий PTM. Этот рабочий процесс обогащения для глико- и фосфопептидов может быть применен к различным типам образцов для достижения глубокого профилирования нескольких ПТМ и выявления потенциальных молекул-мишеней для будущих исследований.
Introduction
Посттрансляционные модификации белка (PTM) играют важную роль в модуляции белковых структур и, следовательно, их функций и последующих биологических процессов. Разнообразие человеческого протеома увеличивается экспоненциально из-за комбинаторной изменчивости, обеспечиваемой различными ПТМ. Различные варианты белков из их канонических последовательностей, предсказанных геномом, известны как протеоформы, и многие протеоформы возникают из ПТМ1. Изучение протеоформного разнообразия в здоровье и болезнях стало областью исследований, представляющих большой интерес в последние годы 2,3.
Изучение протеоформ и, более конкретно, ПТМ с большой глубиной стало более поверхностным благодаря развитию методов протеомики на основе масс-спектрометрии (МС). Используя MS, аналиты ионизируются, фрагментируются и идентифицируются на основе m/z фрагментов. Методы обогащения часто необходимы из-за низкого относительного содержания ПТМ по сравнению с немодифицированными формами белков. Хотя анализ интактных белков и их ПТМ, называемый нисходящим анализом, стал более рутинным, ферментативное переваривание белков и анализ их компонентных пептидов в анализах снизу вверх по-прежнему является наиболее широко используемым путем для анализа ПТМ. Двумя наиболее широко изученными ПТМ и двумя наиболее распространенными ПТМ in vivo являются гликозилирование и фосфорилирование4. Эти два PTM играют важную роль в передаче и распознавании клеток и, таким образом, являются важными модификациями для характеристики в исследованиях заболеваний.
Химические свойства различных ПТМ часто обеспечивают пути к обогащению этих ПТМ на уровнях белка и пептида до анализа. Гликозилирование является гидрофильным ПТМ из-за обилия гидроксильных групп на каждом моносахариде. Это свойство может быть использовано для обогащения гликопептидов в гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC), которая может отделять больше гидрофильных гликопептидов от гидрофобных немодифицированных пептидов5. Фосфорилирование добавляет фосфатный фрагмент, который отрицательно заряжен, за исключением кислотного рН. Благодаря этому заряду различные катионы металлов, включая титан, могут быть использованы для привлечения и связывания фосфопептидов, в то время как нефосфорилированные виды смываются. Таков принцип иммобилизованной аффинной хроматографии металлов (IMAC). Дальнейшие обсуждения этих и других стратегий обогащения для гликозилирования и фосфорилирования можно найти в недавних обзорах 6,7.
Сравнительно большие количества исходного пептидного материала (0,5 мг и более) часто необходимы для протоколов обогащения из-за низкой стехиометрии ПТМ на пептидах. В сценариях, где такое количество образца может быть нелегко получить, таких как биопсия ядра опухоли или анализ спинномозговой жидкости, полезно использовать легкие рабочие процессы, которые приводят к максимальной биомолекулярной информации. Недавние стратегии, разработанные нашей лабораторией и другими, выявили одновременный и параллельный анализ гликозилирования и фосфорилирования с использованием одного и того же рабочего процесса обогащения PTM 8,9,10,11,12. Хотя химические свойства этих двух ПТМ могут отличаться, эти ПТМ могут быть проанализированы в несколько этапов из-за инновационных методов разделения и используемых материалов. Например, электростатическая хроматография отталкивающе-гидрофильного взаимодействия (ERLIC) накладывает разделения на основе гидрофильных взаимодействий между аналитами и подвижной фазой с взаимодействием заряд-заряд между аналитами и материалом стационарной фазы 13,14,15,16. При кислом рН притяжение фосфорилированных пептидов к стационарной фазе может улучшить их удержание и отделение от немодифицированных пептидов. Материал, состоящий из Ti(IV), иммобилизованных на гидрофильных микросферах, может быть использован для элюирования на основе HILIC и IMAC для разделения фосфопептидов и нейтральных, кислых и манноз-6-фосфорилированных гликопептидов17,18. Эта стратегия известна как двухфункциональная Ti(IV)-IMAC. Использование этих стратегий для обогащения нескольких PTM в одном рабочем процессе может сделать анализ потенциальных взаимодействий перекрестных помех PTM более доступным. Кроме того, требования к общему количеству и времени отбора проб меньше, чем у обычных методов обогащения при параллельном выполнении (т.е. HILIC и IMAC на отдельных аликвотах образцов).
Чтобы продемонстрировать двухфункциональную стратегию Ti(IV)-IMAC для одновременного анализа гликозилирования и фосфорилирования белка, мы применили ее для анализа посмертных тканей поджелудочной железы человека. Поджелудочная железа вырабатывает как пищеварительные ферменты, так и регуляторные гормоны, включая инсулин и глюкагон. Функция поджелудочной железы нарушается при заболеваниях поджелудочной железы. При диабете нарушается регуляция уровня сахара в крови, что приводит к повышению уровня глюкозы в крови. При панкреатите воспаление возникает в результате аутопереваривания органа3. Изменения в профилях ПТМ, включая гликозилирование и фосфорилирование, могут привести, как это часто бывает, к другим заболеваниям.
Здесь мы описываем протокол для метода одновременного обогащения на основе спин-наконечника, основанного на двухфункциональной стратегии Ti(IV)-IMAC, для N-гликопептидов и фосфопептидов, полученных из белков, извлеченных из ткани поджелудочной железы. Протокол включает экстракцию и переваривание белка, обогащение, сбор данных MS и обработку данных, как показано на рисунке 1. Репрезентативные данные этого исследования доступны через консорциум ProteomeXchange с идентификатором PXD033065.
Рисунок 1: Рабочий процесс для одновременного анализа N-гликопептидов и фосфопептидов из тканей поджелудочной железы человека. Ткани сначала крио-измельчены в мелкий порошок перед экстракцией белка с использованием моющего средства додецилсульфата натрия (SDS). Затем белки подвергаются ферментативному перевариванию. Полученные пептиды аликвотируются перед обогащением с использованием двухфункционального Ti(IV)-IMAC. Необработанные данные собираются с помощью наноразмерной обратнофазной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (nRPLC-MS) и анализируются с использованием программного обеспечения для поиска в базе данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Этот протокол предназначен для того, чтобы сделать анализ PTM более доступным и обеспечить более широкий анализ нескольких PTM в одном рабочем процессе. Этот протокол может быть применен к другим сложным биологическим матрицам, включая клетки и биожидкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Было получено согласие на использование тканей поджелудочной железы для исследований от ближайших родственников умершего, и было получено разрешение Институционального наблюдательного совета по медицинским наукам Университета Висконсина-Мэдисона. Надзор IRB не требуется, поскольку он не затрагивает людей, как это признано в 45 CFR 46.102(f).
ВНИМАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при обращении с реагентами, используемыми в этом протоколе, которые включают кислоты (муравьиную, уксусную, трифторуксусную), основания (гидроксид аммония) и криогены (жидкий азот). Ознакомьтесь с паспортами безопасности для реагентов, используемых для ознакомления с сопутствующими опасностями и необходимыми мерами предосторожности. Концентрации, обозначаемые с использованием процентных показателей, представляют собой объем/общий объем (v/v) и разбавляются водой.
1. Криопыление тканей, лизис и экстракция белка
- Наполните дьюар жидким азотом. Предварительно охладите части тканевого измельчителя, которые будут контактировать с тканями поджелудочной железы, а именно камеру, измельчитель и восстановительную ложку в контейнере из полистирола.
- Переложите замороженные кусочки ткани в предварительно охлажденный держатель для образцов и добавьте ложку жидкого азота в ткань.
- Поместите измельчитель в камеру и ударьте по нему молотком пять-десять раз, чтобы раздавить образец. Извлеките измельчитель из камеры и соскоблите адгезивный тканевый порошок и кусочки.
- Добавьте ложку жидкого азота в камеру, если ткани начнут плавиться. Повторяйте процесс измельчения до тех пор, пока образец не станет мелким порошком без больших кусков ткани. Разложите образцы примерно на 100 мг аликвот в предварительно охлажденные пробирки.
- Готовят лизисный буфер, содержащий 4% додецилсульфата натрия (SDS), 150 мМ NaCl и 25 мМ Tris (pH = 7,4). Растворите по одной таблетке протеазы и ингибитора фосфатазы в 500 мкл воды для 20-кратного запаса каждого. Добавьте необходимый объем в 20 раз каждого ингибитора в буфер лизиса для окончательной 1-кратной концентрации.
- Добавьте в пробирку 600 мкл лизизного буфера на 100 мг ткани и инкубируйте при 95 °C в нагревательном блоке в течение 10 мин с встряхиванием при 800 об/мин. Извлеките образцы из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры.
- Обработка образцов ультразвуком при энергии 60 Вт (20 кГц) в течение 45 с с использованием импульсов 15 с с остатком 30 с между ними. Гранулируют образцы при 3 000 х г в течение 15 мин при 4 °C.
- Добавьте супернатант к 5-кратному растворителю осаждения, 300 мкл лизисного буфера к 1,5 мл растворителя осаждения, содержащего 50% ацетона, 49,9% этанола и 0,1% уксусной кислоты. Охладите ночью при -20 °C.
- Снова гранулируйте образцы при 3000 х г в течение 15 мин при 4 °C и удалите надосадочное вещество. Вымойте гранулу, разбив шпателем и смешав с таким же количеством растворителя для осаждения. Гранула снова, повторяя этап промывки 2x.
- Гранулируйте образец при 16 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Гранулы образца высушены на воздухе в вытяжном шкафу в течение 15 мин и хранят при -80 °C до готовности к продолжению.
2. Переваривание и обессоливание белка
- Повторное суспендирование белковой гранулы в 300 мкл свежесваренного буфера пищеварения, содержащего 50 мМ триэтиламмония бикарбоната (TEAB) и 8 М мочевины.
- Оцените концентрацию белка в растворе с помощью белкового анализа в соответствии с протоколом производителя.
- К белку в растворе добавляют дитиотрейтол (ДТТ) до конечной концентрации 5 мМ, перемешивают и уменьшают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляют йодоацетамид (IAA) до конечной концентрации 15 мМ, смешивают и алкилат при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Гасят алкилирование путем повторения добавления ДТТ в том же объеме, что и раньше, и перемешивают.
- Добавьте LysC/трипсин в соотношении 1:100 фермент:белок и инкубируйте при 37 °C в течение 4 ч. Затем добавьте 50 мМ TEAB, чтобы разбавить 8 М мочевины, используемой для < 1 М. Добавьте трипсин в соотношении фермент:белок 1:100 и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
- Гашение пищеварения с добавлением трифторуксусной кислоты (ТФА) до 0,3% v/v. На каждый 1 мг исходного белка обусловливают обессоливающий картридж (1 куб. см, 10 мг) с 1 мл ацетонитрила (ACN) и 3 раза с 1 мл 0,1% TFA.
- Загрузите переваренную смесь в обессоливающий картридж. Промыть смесь 3 раза, используя 1 мл 0,1% TFA. Если элюирование медленное, применяйте положительное давление, но избегайте скорости потока > одной капли в секунду.
- Пептиды элюта с использованием 1 мл 60% ACN и 0,1% раствора муравьиной кислоты (FA). Сушите элюированные пептиды при температуре приблизительно 35 °C с помощью центробежного вакуумного концентратора до полного испарения растворителя.
- Повторное суспендирование пептидов в 300 мкл воды и оценка концентраций пептидов с использованием пептидного анализа в соответствии с протоколом производителя. Разделить пептиды на 500 мкг аликвот и полностью высушить.
3. Обогащение ERLIC N-гликопептидами
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные скорости и время работы центрифуги могут отличаться в зависимости от образцов и должны быть оптимизированы. В общем, 300 х г в течение 2 мин подходит для кондиционирования и промывки материала и 100 х г в течение 5 мин для элюирования.
- Взвесьте приблизительно 3 мг ваты и упакуйте ее в пустой наконечник пипетки объемом 200 мкл (спин-кончик; см. Таблицу материалов).
- Переложите сильный анионообменный обогатительный материал в пробирку и добавьте 200 мкл 0,1% TFA на 10 мг материала. Для обогащения 500 мкг пептидов используют 15 мг материала. Активируйте материал, встряхивая в течение 15 мин.
- Используя адаптер для трубки, поместите отжимной наконечник на трубку объемом 2 мл и добавьте в наконечник достаточное количество суспензии для 15 мг материала. Удалите жидкость, вращаясь в настольной центрифуге.
- Кондиционируйте материал центрифугированием 3x с 200 мкл ACN. Повторите трехкратное кондиционирование с использованием 100 мМ ацетата аммония (NH4Ac), 1% TFA и 80% ACN/0,1% TFA (нагрузочный буфер).
- Повторное суспендирование 500 мкг пептидных образцов примерно в 200 мкл нагрузочного буфера и протекание через спин-наконечник. Перезагрузите проточный 2x, чтобы обеспечить полное связывание.
- Промывайте материал центрифугированием 5 раз с использованием 200 мкл 80% ACN/0,1% TFA, а затем 2x с использованием 200 мкл 80% ACN/0,1% FA.
- Элюируют пептиды центрифугированием 200 мкл каждого из следующих веществ: 50% ACN/0,1% FA (E1); 0,1% FA (E2); 0,1% TFA (E3); 300 мМ KH2PO4, 10% ACN (E4).
- Промывайте материал центрифугированием 2x с 200 мкл 80% ACN/5% NH4OH. Элюируют оставшиеся пептиды 200 мкл 10% NH4OH (E5).
- Полностью высушите все элюи с помощью центробежного вакуумного концентратора при температуре около 35 °C.
- Выполните обессоливание основного элюирования (Е5) с помощью обессоливающего наконечника в соответствии с протоколом производителя.
- Высушите элюирование от обессоливающего наконечника с помощью центробежного вакуумного концентратора при температуре приблизительно 35 °C до полноты.
4. Обогащение фосфопептидами Ti(IV)-IMAC
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные скорости и время работы центрифуги могут отличаться в зависимости от образцов и должны быть оптимизированы. В общем, 300 х г в течение 2 мин подходит для кондиционирования и промывки материала и 100 х г в течение 5 мин для элюирования.
- Взвесьте приблизительно 3 мг ваты и упакуйте ее в пустой наконечник пипетки объемом 200 мкл (спин-кончик).
- Переложите материал для обогащения фосфопептидов Ti-IMAC в пробирку и добавьте 200 мкл 0,1% TFA на 10 мг материала. Для обогащения 500 мкг пептидов используют 10 мг материала.
- Используя адаптер трубки, поместите спин-наконечник на трубку объемом 2 мл и добавьте в наконечник достаточное количество суспензии для материала 10 мг. Удалите жидкость, вращаясь в настольной центрифуге.
- Обустройте материал 200 мкл 40% ACN/3% TFA, используя те же настройки центрифуги, что и описанные выше. Повторное суспендирование пептидных образцов в 200 мкл 40% ACN/3% TFA и протекает через спин-наконечник. Перезарядите сквозной поток дважды, чтобы обеспечить более полное связывание.
- Промыть материал центрифугированием 200 мкл 50% ACN, 6% TFA и 200 мМ Раствор NaCl с последующей промывкой 2x в 200 мкл 30% ACN и 0,1% раствора TFA.
- Пептиды элюта с 200 мкл 10% NH4OH. Полностью высушите элюирование под вакуумом. Выполните обессоливание с помощью обессоливающего наконечника в соответствии с протоколом производителя. Высушите элюирование от обессоливающего наконечника под вакуумом до полноты.
5. Двухфункциональное одновременное обогащение Ti(IV)
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные скорости и время работы центрифуги могут отличаться в зависимости от образцов и должны быть оптимизированы. В общем, 300 х г в течение 2 мин подходит для кондиционирования и промывки материала и 100 х г в течение 5 мин для элюирования.
- Взвесьте примерно 3 мг ваты и упакуйте ее в пустой отжимной наконечник.
- Переложите примерно 1 г материала Ti(IV)-IMAC в пробирку. Добавьте 0,1% TFA к известной концентрации материала, например, 20 мг/200 мкл (материал можно хранить в этой суспензии при 4°C).
- Для обогащения из пептидов 500 мкг добавьте достаточное количество суспензии в спин-наконечник для переноса 20 мг материала. Вымойте отжимной наконечник центрифугированием с 200 мкл 0,1% TFA.
- Повторно суспендируйте образцы в 200 мкл загрузочного/промывочного растворителя (80% ACN и 3% TFA) и протейте через отжимной наконечник. Перезагрузите проточной в 2 раза.
- Промывайте отжимной наконечник 6x центрифугированием 200 мкл загрузочного/промывочного растворителя. Вымойте отжимной наконечник 200 мкл 80% ACN/0,1% раствора FA.
- Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующего: 60% ACN/0,1% FA (E1) и 40% ACN/0,1% FA (E2). Проанализируйте каждое элюирование отдельно.
- Элюируют пептиды 200 мкл каждого из следующих: 20% ACN/0,1% FA и 0,1% FA. Объедините два элюирования и проанализируйте как один образец (E3).
- Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующих: 40% ACN/3% TFA; 50% ACN/6% TFA, 200 мМ NaCl; и 30% ACN/0,1% TFA. Объедините эти элюирования и проанализируйте как один (E4) после обессоливания с помощью упакованного наконечника.
- Обусловите материал до основного рН, используя 200 мкл 90% ACN/2,5% NH4OH для 3x. Откажитесь от этих стирок.
- Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующего: 60% ACN/10% NH4OH (E5) и 40% ACN/10% NH4OH (E6). Проанализируйте эти элюирования отдельно после обессоливания с помощью упакованного наконечника.
- Элюируют пептиды с 200 мкл каждого из следующих веществ: 20% ACN/10% NH4OH; 10% ACN/10% NH4OH; и 10% NH4OH. Объедините эти элюирования и проанализируйте как один (E7) после обессоливания с помощью упакованного наконечника.
- Полностью высушите все элюи под вакуумом.
6. Нанопоточная обратная фазовая жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (nRPLC-MS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы сбора и анализа данных MS разнообразны, и, таким образом, только один предлагаемый конвейер LC-MS (и связанные с ним параметры) описан здесь в следующих шагах. Образцы, полученные с использованием ранее описанных этапов подготовки и обогащения образцов, могут быть проанализированы с использованием других инструментальных установок, в том числе с использованием коммерчески доступных хроматографических колонок, при условии достаточного качества данных.
- Потяните и упакуйте капилляр длиной 15 см (внутренний диаметр 75 мкм) с использованием материала C18, как описано в19. Готовят подвижную фазу А (0,1% FA в воде) и подвижную фазу B (0,1% FA в ACN).
- Восстанавливайте обогащенные пептидные образцы в 15 мкл 3% подвижной фазы B. Загрузите 2 мкл образца (~13% объема образца) непосредственно на колонну. Проанализируйте каждый образец в техническом дубликате.
- Пептиды элюта используют градиент от 3% до 30% подвижной фазы В в течение 90 мин при скорости потока 0,3 мкл/мин. Промыть колонну с использованием 75% В в течение 8 мин, затем 95% В в течение 8 мин, закончив метод уравновешиванием при 3% В в течение 12 мин.
- Работа масс-спектрометра в режиме положительных ионов с использованием данных-зависимых сборов верхних 20 пиков со следующими параметрами: напряжение распыления 2 кВ; Обнаружение MS1 в LC/MS от 400-2000 м/з при разрешении 120 000, цель автоматического регулирования усиления (АРУ) 2E5, максимальное время впрыска 100 мс, 30% ВЧ объектив, квадрупольная изоляция с окном 1,6 м/з , для состояний заряда 2-8 и неопределенных, и динамическое исключение 30 с; ОбнаружениеMS 2 в LC/MS с использованием ступенчатой фрагментации HCD при 22%, 30% и 38%, фиксированной первой массы 120 м/z при разрешении 30 000, цели 5E4 AGC и минимальной интенсивности 2,5E4.
7. Анализ данных MS
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлен один конвейер анализа данных с использованием двух разных программ для анализа одного и того же набора данных. Фосфорилирование и гликозилирование могут быть найдены одновременно с использованием одного программного обеспечения вместо двух отдельных программ, как описано здесь, хотя в целом время поиска программного обеспечения пропорционально пространству поиска, то есть количеству рассматриваемых ПТМ. По этой причине параллельно с поиском гликопептидов и фосфопептидов используются два разных программного обеспечения.
- Обрабатывайте необработанные файлы данных с помощью соответствующего программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
- Поиск спектров по базе данных UniProt для человека (или соответствующего видоспецифичного). Установлено карбамидометилирование Cys в качестве фиксированной модификации. Установите максимальное количество пропущенных ферментативных расщеплений как два.
- В файлах исходных данных с использованием коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу материалов) осуществляется поиск гликопептидов для анализа20. Используйте допуск по массе предшественника 10 ppm и допуск по массе фрагмента 0,01 Da с минимальной длиной пептида в четыре остатка.
- Поиск с использованием встроенной в программное обеспечение базы данных N-гликанов, дополненной типичными гликанами маннозы-6-фосфата(M6P),включая гексНАк(2)Гекс(4-9)Фосфо(1-2), ГексНАк(3-4)Гекс(4-9)Фосфо(1-2), ГексНАк(2)Гекс(3-4)Фосфо(1) и ГексНАк(3)Гекс(3-4)Фосфо(1).
- Устанавливают N-гликозилирование в качестве общей модификации. Установите максимальное общее количество модификаций на спектральное соответствие пептида (PSM) как одно общее и два редких.
- Установлены следующие переменные модификации: окисление Met (редко), деамидирование в Asn и Gln (редко) и фосфорилирование в Ser, Thr и Tyr (общее). Установите следующие идентификационные фильтры: > отсечки баллов 150, |лог-проб| > 1, а дельта-мод > 10.
- Экспортируйте и анализируйте результаты поиска на вкладках Группы белков и пептидов.
- Вручную проверяют идентификацию, содержащую гликаны M6P, на наличие иона оксония PhosphoHex (243 м/z) в спектрах MS/MS и удаляют ложноположительные идентификации, которые не содержат этого диагностического иона.
- В файлах исходных данных с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом (см. Таблицу материалов) поиск фосфопептидов для анализа21. Используйте толерантность к пептидам первого поиска 20 ppm и толерантность к пептидам основного поиска 4,5 ppm.
- Установите максимальное количество модификаций на пептид равным 5. Установите PSM и коэффициент ложного обнаружения белка (FDR) на 1% и минимальную длину пептида на 7 остатков.
- Установка переменных модификаций, таких как окисление при Met, Ацетилирование N-концевого белка и фосфорилирование при Ser, Thr и Tyr. Анализируйте результаты поиска с помощью файлов modificationSpecificPeptides.
- Определите количество идентификаций ПТМ на уровнях белка, пептида и сайта модификации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативные данные масс-спектрометрии, включая необработанные файлы и результаты поиска, были переданы консорциуму ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE с идентификатором набора данных PXD03306522.
В этой работе дубликаты реплик инъекций были проанализированы для каждого элюирования обогащения. Идентификации, сделанные из обеих технических реплик, были сопоставлены в конечном счете. Из-за полустохастического характера получения данных при выборе пептидных предшественников для фрагментации MS/MS между техническими дубликатами ожидается перекрытие идентификации примерно на 70-80%. В приложениях, использующих эти методы, рекомендуется по крайней мере две технические реплики. При последующем статистическом анализе следует принимать во внимание биологические реплики для различных экспериментальных условий. В зависимости от требуемой строгости для представления данных может быть полезно установить фильтры для идентификации, например, идентификации по меньшей мере в х числа технических или биологических реплик, подлежащих представлению.
Пример общей ионной хроматограммы (ТИЦ) для каждого элюирования от каждого обогащения можно увидеть на дополнительном рисунке S1, дополнительном рисунке S2 и дополнительном рисунке S3. Использование строгих фильтров во время поиска в базе данных необработанных файлов MS может обеспечить более точную и более уверенную идентификацию спектров MS / MS в пептидных последовательностях с помощью PTM. Как видно из ТИК для каждого элюирования, образцы пептидов по-прежнему сложны даже после фракционирования от обогащения. Нанопоточная хроматография в сочетании с высоким разрешением, высокой точностью массы и быстрым сканированием масс-спектрометра может помочь анализировать сложные смеси, такие как пептиды из триптического дайджеста, с большой чувствительностью и глубиной. Пример спектров MS/MS для гликозилированного и фосфорилированного спектров можно увидеть на рисунке 2. Хорошо аннотированные спектры, подобные этим, являются результатом богатой фрагментации прекурсоров, что повышает уверенность в идентификации, назначенной программным обеспечением для поиска в базе данных.
На рисунке 3 показана идентификация пептидов, выполненная с использованием двухфункционального метода обогащения Ti(IV)-IMAC спин-наконечником над каждой фракцией элюирования. Большинство гликопептидов элюируются в первых четырех фракциях, в то время как большинство фосфопептидов элюируются в последних трех фракциях. Это разделение различных PTM между фракциями помогает предотвратить любые помехи в ионизации, которые могут возникнуть, если они не были так адекватно разделены по элюциям.
На рисунке 4 сравниваются результаты гликопротеомики метода двойного Ti по сравнению с обогащением только гликопептидом ERLIC. Как видно из рисунка 4А, многие идентификации на уровнях белка, гликоформы, ПТМ и сайта модификации являются общими для обоих методов. Однако ERLIC имеет больше уникальных идентификаций на всех уровнях по сравнению с методом двойного Ti. Это включает в себя гликоформы M6P (гликаны с высоким содержанием маннозы с по меньшей мере одной фосфатной группой), которые требуют дополнительной ручной курирования данных для удаления ложноположительных идентификаций. Кроме того, типы гликанов, идентифицированных с использованием любого метода, аналогичны. Пропорции каждого типа гликана после объединения в шесть категорий на основе их композиций аналогичны между обоими способами16.
Результаты фосфопротеомики по методу двойного Ti сравниваются с обычным обогащением фосфопептидами IMAC на рисунке 5. Двухфункциональное обогащение Ti(IV) работает аналогично обычному IMAC, о чем свидетельствует существенное перекрытие на уровнях белка, пептида и PTM. Используя любой из методов, большинство фосфорилированных аминокислот представляют собой серин и треонин, при этом также идентифицировано около 1% фосфорилированного тирозина. Оба метода также могут быть использованы для идентификации мультифосфорилированных пептидов.
Списки модифицированных белков сопоставляются с генами и анализируются с использованием обогащения генной онтологией (GO), как показано на рисунках 6 и 7. Анализ GO для модифицированных белков, идентифицированных с помощью ERLIC и IMAC, показан на дополнительном рисунке S4 и дополнительном рисунке S5. Бесплатный онлайн-инструмент Metascape выполняет обогащение и создает сети, основанные на обогащенных путях и процессах, связывая их сходством23. Термины узлов для каждого анализа GO можно найти в Дополнительной таблице S1, Дополнительной таблице S2, Дополнительной таблице S3 и Дополнительной таблице S4. Поскольку гликозилирование является основным белком ПТМ во внеклеточном матриксе, неудивительно, что несколько терминов, обогащенных с помощью списка идентифицированных N-гликопротеинов, связаны с внеклеточным матриксом. Фосфорилирование участвует в клеточной сигнализации, и это можно увидеть в нескольких обогащенных терминах, найденных с использованием списка идентифицированных фосфопротеинов.
Рисунок 2: Аннотированные высокостоверные спектры MS/MS из N-гликозилированных и фосфорилированных пептидов. (A) Манноза-6-фосфорилированный пептид GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Фосфо(1))VTR из катепсина D (CATD), идентифицированный по времени удержания 53,08-53,33 мин от седьмого элюирования обогащения. Присутствие иона оксония PhosphoHex при 243 м/з повышает уверенность в этом назначении PTM. (B) Фосфорилированный пептид VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK из связанного с тиоредоксином трансмембранного белка 1 (TMX1) со временем удержания 32,31-32,72 мин от шестого элюирования обогащения. Наличие нейтральных потерь -98 (-H3PO4) между ионами пептидных фрагментов и их дефосфорилированными вариантами (обозначаемыми фрагментом*) повышает уверенность в этом назначении PTM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение идентификации пептидов при двухфункциональном обогащении Ti(IV)-IMAC по семи элюциям. Число идентификаций включает пептиды, идентифицированные по меньшей мере в одном из двух технических (инъекционных) репликаций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сравнение результатов гликопротеомики при двухфункциональном обогащении Ti(IV)-IMAC по сравнению с обычным обогащением гликопептидами ERLIC. (A) диаграммы Венна гликопротеина, гликоформы (белка, сайта, гликана), гликанная композиция и идентификация гликосита между методами обогащения. (B) Круговые диаграммы гликанов, идентифицированных на пептидных основах между методами обогащения. Гликаны разделены на шесть групп в зависимости от их состава16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение результатов фосфопротеомики при двухфункциональном обогащении Ti(IV)-IMAC по сравнению с обычным фосфопептидным обогащением Ti(IV)-IMAC. (A) Диаграммы Венна идентификации фосфопротеина, фосфопептида и фосфозита между методами обогащения. (B) Круговые диаграммы уверенно локализованных (75% или выше вероятности) фосфозитов, расщепленных аминокислотным остатком. С) Сложенный стержневой участок идентифицированных фосфопептидов, связанных с рядом фосфорилированных остатков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Генное онтологическое обогащение N-гликопротеинов, идентифицированных с использованием двухфункционального обогащения Ti(IV)-IMAC. N-гликопротеины сопоставляются с генами и значительно обогащенные пути и термины процесса идентифицируются с использованием всего генома в качестве фона. Различные цвета используются для обозначения кластеров терминов, которые связаны сходством терминов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Генная онтология обогащения фосфопротеинов, идентифицированных с использованием двухфункционального обогащения Ti(IV)-IMAC. Фосфопротеины сопоставляются с генами и значительно обогащенные пути и термины процесса идентифицируются с использованием всего генома в качестве фона. Различные цвета используются для обозначения кластеров терминов, которые связаны сходством терминов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Пример общих ионных хроматограмм (ТИК) от каждого элюирования от двухфункционального обогащения Ti(IV)-IMAC (E1-E7, панели A-G). Общий сигнал (ионный ток) строится в течение 117-минутного периода сбора данных. Интенсивность базового пика задается значением NL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Пример общих ионных хроматограмм (ТИК) от каждого элюирования от обогащения ERLIC (E1 -E5, панели A-E). Общий сигнал (ионный ток) строится в течение 117-минутного периода сбора данных. Интенсивность базового пика задается значением NL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Пример суммарной ионной хроматограммы (ТИЦ) из элюирования от обогащения Ti-IMAC. Общий сигнал (ионный ток) строится в течение 117-минутного периода сбора данных. Интенсивность базового пика задается значением NL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Генная онтология обогащения N-гликопротеинов, идентифицированных с использованием обычного обогащения гликопептидами ERLIC. N-гликопротеины сопоставляются с генами и значительно обогащенные пути и термины процесса идентифицируются с использованием всего генома в качестве фона. Различные цвета используются для обозначения кластеров терминов, которые связаны сходством терминов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S5: Генная онтология обогащения фосфопротеинов, идентифицированных с использованием обычного обогащения фосфопептидами с помощью Ti(IV)-IMAC. Фосфопротеины сопоставляются с генами и значительно обогащенные пути и термины процесса идентифицируются с использованием всего генома в качестве фона. Различные цвета используются для обозначения кластеров терминов, которые связаны сходством терминов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные таблицы S1-S4: Информация о узлах Metascape для анализа обогащения генной онтологии. Таблицы содержат информацию о узлах для списков N-гликопротеинов и фосфопротеинов, идентифицированных с использованием двойного Ti (Таблица S1 и Таблица S2), N-гликопротеинов с использованием ERLIC (Таблица S3) и фосфопротеинов с использованием IMAC (Таблица S4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Двухфункциональная стратегия Ti(IV)-IMAC полезна для одновременного анализа N-гликопептидов и фосфопептидов из одного образца в рамках одного рабочего процесса подготовки образца. Было также показано, что методы, основанные на ERLIC, выполняют одновременное обогащение ПТМ. Обе стратегии ранее использовались для глубокого охвата в анализе PTM14,18. Адаптируя метод двойного Ti к сокращению времени инкубации образца с помощью спин-наконечников, мы надеемся, что этот протокол стал менее ресурсоемким и, таким образом, более доступным.
Одновременный анализ множественных ПТМ достигается за счет синергетических взаимодействий между аналитами и функциональными группами на поверхности обогатительного материала. В первой упаковке спин-кончиков с хлопком удержание гликопептидов в режиме HILIC увеличивается из-за преобладания гидроксильных групп на целлюлозе24. При использовании воды и ацетонитрила (смешивающегося с водой растворителя) гликопептиды задерживаются и разделяются за счет образования водных и органических слоев. Материал для двухфункционального обогащения Ti(IV) зависит от иммобилизованных Катионов Ti(IV) для связывания фосфопептидов. Гидрофильные свойства боковых цепей материала используются для удержания гликопептидов в режиме HILIC, которые сначала элюируются с использованием кислотного элюирования с увеличением содержания воды. Материал дополнительно промывают обычными буферами обогащения фосфопептидов IMAC для элюирования сиалилированных гликопептидов, которые имеют более высокое сродство к стационарной фазе, чем другие нейтральные гликопептиды. После кондиционирования материала до основного рН гидроксид аммония и раствор ACN используются для разрыва электростатических взаимодействий, которые удерживают фосфопептиды связанными с материалом. В то же время снижение органического содержания позволяет разделить моно- и мультифосфорилированные пептиды и гликопептиды M6P.
При разделении PTM с использованием нескольких этапов элюирования в одном рабочем процессе биомолекулярная информация может быть максимизирована из ограниченных образцов. Предостережением при таких двойных рабочих процессах анализа PTM является требование относительно большого количества образца (0,5 мг пептидов) в качестве исходного материала для каждого обогащения при сборе не менее пяти фракций. Тем не менее, одновременная стратегия обогащения, представленная здесь, по-прежнему предлагает значительную экономию материалов по сравнению с обычными стратегиями. Еще до обогащения необходимо несколько важных шагов, чтобы обеспечить целостность PTM и избежать потери артефактов информации PTM. К ним относятся надлежащее хранение образцов при низких температурах, когда они не используются (в идеале -80 ° C), использование ингибиторов протеазы и фосфатазы во время экстракции белка и использование метода очистки гидрофильных пептидов, такого как картриджи HLB, используемые здесь.
Было отмечено, что ERLIC (обычное обогащение гликопептидами) привело к лучшему покрытию гликопротеома, в то время как двухфункциональный Ti(IV)-IMAC был превзойден в уникальных идентификациях обычным Ti-IMAC в результатах фосфопротеомики. Физическая структура и повышенная гидрофильность материала ERLIC по сравнению с материалом двойного обогащения Ti, вероятно, являются основным фактором улучшения покрытия гликопротеома в ERLIC. Увеличение покрытия фосфопротеома в обычном IMAC может быть результатом снижения подавления ионов при удалении гликопептидов на первых этапах элюирования и промывки. Несмотря на это незначительное снижение охвата при одновременном двойном рабочем процессе Ti, значительное перекрытие с обычным одиночным обогащением PTM по-прежнему достигается с дополнительным преимуществом выполнения только одного рабочего процесса обогащения вместо двух.
Что касается временных ограничений, ERLIC и обычный Ti-IMAC имеют меньше фракций, чем двойной рабочий процесс Ti. Что касается необходимых ресурсов, то анионообменный материал, необходимый для ERLIC, дешевле, чем функционализированный материал, необходимый для двух Ti и обычных рабочих процессов IMAC. В этих протоколах анализировалось только N-связанное, а не O-связанное гликозилирование. Фермент PNGase F может (и должен) использоваться для расщепления N-гликанов, чтобы ограничить количество ложных срабатываний, получаемых при поиске O-гликопептидов. Однако было показано, что эта стратегия снижает специфичность HILIC и ERLIC для обогащения гликопептидами25. В протоколе стратегия с использованием двух отдельных программ используется для анализа необработанных файлов данных. Byonic, коммерческое программное обеспечение, считается золотым стандартом в анализе данных гликопротеомики. Из-за разнообразия N-гликановых структур пространство поиска пептидов увеличивается, тем самым увеличивая время поиска. Фосфорилирование также может быть добавлено в качестве общего ПТМ в дополнение к гликозилированию во время поиска, хотя время поиска может резко возрасти в зависимости от того, рассматривается ли пептидное мультифосфорилирование. MaxQuant, программное обеспечение с открытым исходным кодом, может быть оптимизировано для минимизации FDR в результатах фосфопротеомики, хотя сложное гликозилирование не так легко искать. Существуют также другие варианты с открытым исходным кодом для поиска гликопротеомных данных 26,27,28. В зависимости от экспериментальных целей и доступных ресурсов, описанный здесь конвейер LC-MS и анализа данных могут быть использованы в представленном виде или модифицированы. Ожидается, что дальнейшая оптимизация методов улучшит охват ПТМ.
ПТМ играют важную роль в биохимических процессах из-за изменений в структуре белка, которые они передают. Идеально, чтобы все протеомные анализы учитывали все белковые ПТМ одновременно. Важность суммы всех белкового гликозилирования, например, была названа мета-гетерогенностью29. Однако цель полного анализа PTM пока невозможна с современными технологиями на основе MS. Протеомика снизу вверх с последующим обогащением, специфичным для PTM, то есть HILIC и IMAC, по-прежнему является золотым стандартом для анализа PTM, хотя, используя одновременные стратегии обогащения, такие как описанные здесь, биомолекулярная информация может быть лучше выяснена. Было обнаружено, что перекрестные взаимодействия происходят между различными ПТМ30,31, включая гликозилирование и фосфорилирование32. Количественный анализ таких взаимодействий при заболеваниях, например, при заболеваниях поджелудочной железы, таких как диабет и рак, может оказаться плодотворным в расширении нашего понимания механизмов заболевания. При оптимизации методов экстракции среди различных типов образцов описанные здесь протоколы обогащения могут быть использованы для углубленного профилирования гликопротеома и фосфопротеома в сложных биологических матрицах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование было частично поддержано грантовым финансированием от NIH (R01DK071801, RF1AG052324, P01CA250972 и R21AG065728) и Фонда исследований ювенильного диабета (1-PNF-2016-250-S-B и SRA-2016-168-S-B). Данные, представленные здесь, также были частично получены при поддержке NIH / NCATS UL1TR002373 через Институт клинических и трансляционных исследований Университета Висконсина. Приборы Orbitrap были приобретены при поддержке гранта NIH (NIH-NCRR S10RR029531) и Офиса вице-канцлера по исследованиям и высшему образованию в Университете Висконсин-Мэдисон. Мы также хотели бы отметить щедрую поддержку Организации донорства органов и тканей Университета Висконсина, которая предоставила поджелудочную железу человека для исследований, и помощь Дэна Треммеля, доктора Сары Д. Сакетт и профессора Джона Одорико для предоставления образцов в нашу лабораторию. Наша исследовательская группа хотела бы выразить особую благодарность семьям, которые пожертвовали ткани для этого исследования. L.L. признает грант NIH S10OD025084, пилотный грант по борьбе с раком поджелудочной железы от Центра рака карбона Университета Висконсина (233-AAI9632), а также звание профессора выдающихся достижений Виласа и профессора заслуженной кафедры Чарльза Мельбурна Джонсона с финансированием, предоставленным Исследовательским фондом выпускников Висконсина и Школой фармации Университета Висконсин-Мэдисон.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
