Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

Published: May 19, 2022 doi: 10.3791/63778
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Northern Illinois University

Summary

Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.

Abstract

Epitel hücrelerinin bazal tarafında bulunan özel bir hücre dışı matriks tabakası olan bazal membran (BM), epitel dokusu morfolojisinin ve organ morfogenezinin kurulması ve sürdürülmesi için kritik öneme sahiptir. Dahası, BM doku modellemesi için gereklidir, bir sinyal platformu görevi görür ve dokuları ve organları şekillendirmek için dış kuvvetler sağlar. BM'nin normal gelişim ve patolojik durumlar sırasında oynadığı birçok önemli role rağmen, BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını kontrol eden biyolojik yollar ve bazal sekresyonun BM proteinlerinin polarize birikimine nasıl yol açtığı tam olarak anlaşılamamıştır. Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli, BM membran proteinlerinin bazal birikimini incelemek için mükemmel bir model sistemidir, çünkü BM'nin tüm ana bileşenlerini üretir ve salgılar. sabit dokularda görüntü işleme ile birleştirilen konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme, özellikle BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığı ve birikiminde rol oynayan hücresel faktörlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Bu makalede, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epitelindeki endojen olarak etiketlenmiş proteinler kullanılarak BM içeren veziküllerin ve biriken BM'nin boyanması ve görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol hem kalitatif hem de nicel soruları ele almak için uygulanabilir ve epitel dokusu gelişimi sırasında polarize hücre içi kaçakçılık ve veziküllerin salgılanmasında rol oynayan faktörlerin hızlı ve verimli bir şekilde tanımlanmasına olanak tanıyan yüksek verimli taramaya uyum sağlamak için geliştirilmiştir.

Introduction

Bodrum membranı (BM), epitel yapısı ve morfogenez1 için kritik olan katmanlı hücre yapışık hücre dışı matriksin (ECM) ince bir tabakasıdır. ~ 50 proteinden oluşur ve epitel ve endotel hücrelerinin altında her yerde bulunur ve iskelet, pürüzsüz ve kalp kası hücrelerini ve adipositleri 1,2,3 ile örter. BM'nin epitel hücrelerinin bazal tarafındaki üç ana bileşeni Kollajen IV, Perlekan ve Lamininlerdir. BM, epitel hücrelerinin temelini oluşturur ve doku ayrılması ve bariyeri, büyüme ve destek ve hücre polarizasyonu 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 dahil olmak üzere birçok fonksiyondan sorumludur. . Bir sinyal platformu olarak rolü, gelişim sırasında epitel hücrelerinin ve dokularının morfolojisini ve farklılaşmasını düzenler 3,13,14. Ayrıca, BM'nin yanlış düzenlenmesi ve / veya bütünlüğünün ihlali, tümör metastazı2,15,16 dahil olmak üzere birçok patolojik durumun birincil nedenleridir. BM tarafından doku ve organ morfogenezi sırasında gerçekleştirilen temel fonksiyonlara rağmen, BM proteinlerinin polarize hücre içi kaçakçılığına ve sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların bileşenleri belirsiz olarak bilinmektedir.

BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını ve BM proteinlerinin epitel hücreleri tarafından salgılanmasını incelemek için, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli (FE) güçlü bir model sistemdir (Şekil 1). Bir Drosophila yumurtalık, ovaroller adı verilen 16-20 uzun, tüp benzeri yapıdan oluşur (Şekil 1A, B)17,18,19. Her ovarol, ön uçta başlayan ve olgun yumurta kanalından çıkana kadar arkadan hareket eden yumurta odalarının (her biri bir yumurtaya yol açan) yaş ilerlemesiyle bir yumurta montaj hattı olarak düşünülebilir. Her yumurta odası, merkezi germline hücrelerini (GC'ler) çevreleyen somatik folikül hücrelerinin (FC'ler) tek katmanlı bir tabakası olan FE tarafından kapsüllenir. FE, apikal alanın germ hattına baktığı ve BM proteinlerinin bazal olarak18,19 salgılandığı belirgin bir apikal-bazal polarite ile oldukça polarize edilir. FC'ler, Kollajen IV, Perlecan ve Lamininler20,21 dahil olmak üzere BM'nin tüm ana bileşenlerini aktif olarak salgılar. FC'ler gibi epitel hücrelerinde, BM bileşenleri üretilir ve hücre dışı birikimleri için özel bir polarize sekresyon yolu gerektirir. Örneğin, BM'nin en bol bileşeni olan Kollajen IV (Coll IV) söz konusu olduğunda, polarize hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu çevreleyen detaylar, üretimi ve birikimi birçok çalışmanın odak noktası olmasına rağmen belirsizdir. Coll IV, endoplazmik retikulumda (ER) çevrilir, bu da her fibrilin - üç polipeptitten (iki α1 zinciri ve bir α2 zinciri) oluşan - üçlü bir sarmal22'ye monte edildiği yerdir. Uygun Coll IV katlama ve fonksiyonu, Plod ve PH4αEFB 20,22,23,24,25,26 gibi lizil ve prolil-hidroksilazlar dahil olmak üzere ER şaperonları ve enzimleri gerektirir. Bu posttranslasyonel enzimler, Coll IV'ün ER sıralamasını düzenler, çünkü her birinin kaybı, Coll IV'ün bazal ER20,23,24,25,26'da sıkışmasına neden olur. Daha sonra, yeni sentezlenen Coll IV, COPII kaplı veziküllerde Golgi için ER'den çıkar. Kargo reseptörü Tango1, kollajenlerin büyük multimerik proteinleri barındırabilen büyük Golgi'ye bağlı veziküllere paketlenmesine yardımcı olur20,27. Coll IV, hücre içi ekzositik veziküllere paketlendikten sonra, özellikle epitel hücrelerinden bazal olarak salgılanır. BM birikimini bazal tarafa yönlendirmek için, epitel hücreleri özellikle polarize BM sekresyonuna adanmış başka bir dizi faktöre ihtiyaç duyar. Drosophila yumurtalıklarının FE'sini kullanarak, nükleotid değişim faktörleri (GEF'ler) Crag ve Stratum, GTPazlar Rab8 ve Rab10'un yanı sıra fosfoinositid PI (4,5) P2 seviyeleri ve Kinesin 1 ve 3 motor proteinleri 20,28,29,30,31 dahil olmak üzere bu yeni hücresel sürecin birkaç bileşeni karakterize edilmiştir. . Bu bileşenler, BM proteinlerinin polarize dağılımını sağlamada kritik öneme sahiptir.

FE'deki BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu izlemek için, Viking-GFP (Vkg-GFP veya α2 Coll IV-GFP) ve Perlecan-GFP (Pcan-GFP) gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri (protein tuzakları)32,33 kullanılabilir. Bu protein tuzak hatlarının BM proteinlerinin endojen dağılımını doğru bir şekilde yansıttığı ve veziküler kaçakçılığın daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir 28,30. FE'de BM'nin polarize birikiminde rol oynayan bileşenler ilk olarak Vkg-GFP ve Pcan-GFP20,28,29,30 için protein tuzak hatları kullanılarak karakterize edildi. Protein tuzakları, mutantlar ve Gal4 hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kullanılabilir. Ayrıca, protein tuzakları floresan boyalar ve / veya floresan immünoboyama ile kombinasyon halinde kullanılabilir, bu da vahşi tip ve mutant koşulları karşılaştırırken BM proteinlerinin lokalizasyonunun kesin karakterizasyonuna izin verir35.

BM proteini içeren veziküllerin dağılımını ve lokalizasyonunu doğru ve verimli bir şekilde değerlendirmek için, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ve süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri diğer görüntüleme yaklaşımlarına önemli bir avantaj sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi göreceli kullanım kolaylığı ile birleştirir. CLSM, galvanometreler kullanarak numuneyi bir lazerle raster tarama tarzında tarayarak gelişmiş bir optik çözünürlüğe izin veren bir mikroskopi tekniğidir. İğne deliği açıklığı, konfokal mikroskopun temel bir bileşenidir. İğne deliği diyafram açıklığı, odak düzleminin üstünden veya altından gelen odak dışı sinyalleri engelleyerek, z ekseni36'da oldukça üstün bir çözünürlük sağlar. Bu aynı zamanda z-düzleminde, bir dizi optik bölüme karşılık gelen z-yığını adı verilen bir dizi görüntü elde etmeyi mümkün kılar. z-yığınları daha sonra görüntüleme yazılımı yardımıyla 3D rekonstrüksiyon yoluyla numunenin 3D görüntüsünü oluşturur. Geleneksel epifloresan (geniş alan) mikroskoplar, konfokal mikroskopların aksine, odak dışı ışığın görüntü kalitesine katkıda bulunmasına izin vererek görüntü çözünürlüğünü ve kontrastıazaltır 36,37. Bu, epifloresan mikroskopisini protein lokalizasyonu veya kolokalizasyonu üzerinde çalışırken daha az çekici bir aday haline getirir.

CLSM, BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin görüntülenmesi ve karakterizasyonu da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygun bir yaklaşım olmasına rağmen, Abbe'nin ışık kırınım sınırının (200-250 nm) altındaki örnekleri görüntülerken hala bir sorun teşkil etmektedir. Bu tür örnekleri görüntülerken, konfokal mikroskopi, özellikle bir yağ hedefi kullanırken, yüksek çözünürlükle sonuçlanabilir. Bununla birlikte, süper çözünürlük teknikleri konfokal mikroskopinin sınırını aşmaktadır. Süper çözünürlüklü mikroskopi elde etmek için, her biri belirli çözünürlük sınırlarına sahip ve her biri farklı analizler için uygun olan çeşitli yaklaşımlar vardır. Bu yaklaşımlar arasında fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ve Airyscan (süper çözünürlük) mikroskobu 38,39,40,41,42,43,44,45,46 bulunmaktadır. . Airyscan, PALM / STORM, STED ve SIM'den daha kaba bir çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, yine de ~ 120 nm'ye kadar bir çözünürlüğe ulaşabilir (CLSM'nin çözünürlüğünün yaklaşık iki katı). Ayrıca, bu süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımının, kalın numuneleri ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip numuneleri görüntülerken SIM ve diğer süper çözünürlüklü tekniklere göre bir avantajı olduğu gösterilmiştir47,48.

Airyscan nispeten yeni bir süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi teknolojisidir46. Odak dışı ışığı reddetmek için iğne deliği ve tek nokta dedektörlerini kullanan geleneksel CLSM'lerin aksine, bu süper çözünürlüklü yaklaşım, her tarama konumunda tüm ışığı toplayan 32 kanallı galyum arsenit fosfit (GaAsP) fotoçarpan tüp alanı dedektörü kullanır45. 32 dedektörün her biri küçük bir iğne deliği olarak çalışarak iğne deliği boyutunu geleneksel 1,0 Havadar Üniteden (A.U.) gelişmiş 0,2 A.U.'ya düşürerek 1,25 A.U. çapı45'in verimliliğini korurken daha da yüksek bir çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, Airyscan tarafından kullanılan doğrusal dekonvolüsyon,45 çözünürlüğünde 2 kata kadar artışa neden olur. Bunu göz önünde bulundurarak, CLSM ve özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, BM proteinlerinin bazal birikimini düzenleyen BM proteinlerini ve proteinlerini incelemek için çok uygundur, çünkü lokalizasyon ve kolokalizasyon çalışmaları için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilirler, böylece bu süreçleri kontrol eden mekansal, zamansal ve moleküler olaylarda yeni bilgiler sağlayabilirler.

Lokalizasyon deneyleri yapmak için kullanılabilecek konfokal mikroskopiye alternatif bir yaklaşım, görüntü dekonvolüsyonudur. Geniş alan mikroskobu, odak dışı ışığın dedektörlere ulaşmasına izin verdiğinden, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntülerden odak dışı ışığı çıkarmak veya yeniden atamak için matematiksel ve hesaplamalı dekonvolüsyon algoritmaları uygulanabilir, böylece görüntünün çözünürlüğünü ve kontrastını artırabilir49. Dekonvolüsyon algoritmaları, çözünürlüğü ve kontrastı daha da artırmak için konfokal görüntülere de uygulanabilir ve neredeyse süper çözünürlüklü mikroskopi50 ile karşılaştırılabilir nihai görüntüler üretir. Airyscan, Sheppard'ın piksel yeniden atamasıyla birlikte Weiner filtre tabanlı dekonvolüsyondan yararlanır ve bu da oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği 45,51 kullanıldığında, her üç uzamsal boyutta (x ve y'de 120 nm ve z'de350 nm) çözünürlükte 2 kat artış gözlenmiştir.

Bu makale, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birleştirilmiş bir model sistem olarak Drosophila yumurtalık FE'sini kullanarak BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve birikimini boyamak, elde etmek ve görselleştirmek için ayrıntılı ve optimize edilmiş protokoller sunmaktadır. Vkg-GFP ve Pcan-GFP gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinlerini ifade eden Drosophila çizgileri, BM protein kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için etkili ve doğru araçlardır. Ek olarak, mutant ve Gal4 / UAS hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kolayca kullanılabilirler. Endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri önerilmekle birlikte, spesifik BM proteinlerine karşı antikorların kullanımı da tarif edilen protokollerle uyumludur. Bu protokoller, konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak hücre içi kaçakçılığı ve bozulmamış epitel dokusunda BM proteinlerinin salgılanmasını incelemek isteyen bilim adamları için özellikle yararlıdır. Dahası, epitel doku analizini Drosophila genetiğinin geniş araçlarıyla birleştirme yeteneği, bu yaklaşımı özellikle güçlü kılmaktadır. Son olarak, bu protokoller veziküler kaçakçılığı ve ilgilenilen diğer proteinlerin sıralanmasını incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Yumurtalık diseksiyonları için sinek hazırlığı

  1. İstenilen genotipten 10-15 Drosophila melanogaster dişi sineğini (1-2 günlük), 25 ° C'de diseksiyondan 2-3 gün önce az miktarda granül fırıncı mayası serpilmiş ~ 8 mL Drosophila sinek ortamı içeren dar bir şişeye koyun. Şişeye birkaç erkek eklemek yumurta odası verimini artırabilir. Bununla birlikte, toplam sinek sayısının 20'yi geçmediğinden emin olun, çünkü bu yumurtalık gelişimini olumsuz yönde etkileyebilir.
    NOT: Drosophila erkek ve kadınlarının tanımı ve daha önce Drosophila deneyimi olmayan bilim adamları için yararlı ipuçları ve tavsiyeler alıntılanan34,52. makalelerde bulunabilir. Maya eklenmesi yumurta üretimini uyaracak ve temsil edilen farklı aşamalara sahip yumurtalıklar üretecektir. Ayrıca, yumurtalıkları yağlayacak ve eksize edilmesini kolaylaştıracaktır. Granül maya yerine ıslak maya da kullanılabilir, ancak daha zayıf stoklar için sinekler sıkışabilir ve ölebilir.

2. Yumurtalık diseksiyonu ve fiksasyonu

NOT: Yumurtalık diseksiyonu ve boyama ile ilgili ek kaynaklar için, okuyucular belirtilenprotokoller 53,54,55'e yönlendirilir.

  1. Diseksiyon gününde, PFA stok çözeltisini 1x fosfat tampon salin (PBS) içinde seyrelterek% 4'lük bir paraformaldehit (PFA) nihai konsantrasyonu ile taze fiksasyon çözeltisi hazırlayın.
  2. CO 2 kullanarak sinekleri anestezi altınaalın ve bir sinek pedine yerleştirin. Diseksiyona kadar sinekleri anestezi altında tutun. Hareketleri durduktan sonra uygun şekilde uyuşturulmuş sinekleri düşünün, bu genellikle 10-20 s sürer.
    NOT: CO2 kullanımı daha güvenli ve daha hızlı bir seçenek olarak önerilse de, sinekler buz kullanılarak uyuşturulabilir.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında sığ çöküntü kuyucukları olan bir cam içbükey slayt veya boyama kabı yerleştirin ve kuyucukları 1x PBS ile doldurun.
  4. Bir çift forseps kullanarak alt toraksta bir dişi sineği kavrayın. Sineklerin cinsiyetini, karnın arka ucunda erkek cinsel organlarının yokluğu ve ön ayaklarında seks taraklarının yokluğu ile ikincil bir özellik olarak sağlayın52. Başka bir çift forseps (adım 2.5) kullanarak sinekleri ayrı ayrı parçalara ayırırken, diseksiyon mikroskobu altında 1x PBS ile doldurulmuş kuyucuklara batırın (20x büyütme önerilir).
  5. Diseksiyon mikroskobuna bakarken, sinek karnının arka kısmını çekmek için başka bir çift forseps kullanın ve iç organları (örneğin, yumurtalıklar, bağırsak) görünür hale getirin.
  6. Yumurtalıkları karından çıkmaya zorlamak için sinek karnının ön kısmını (bir diş macunu tüpünde olduğu gibi) hafifçe sıkın. Bu yöntem yumurtalıkları sağlam tutmalıdır. Diğer organları ayırın ve dikkatlice çıkarın ve kalıntıları uçurun.
  7. Forseps veya diseksiyon iğneleri kullanarak, genel yumurtalık yapısını sağlam tutarken yumurtalıkların yumurtalıklarını ayırın. Bu adımın amacı, yumurtalıkları kaplayan kas kılıfını kırmak ve daha verimli ve homojen bir lekelenmeye izin vermektir.
  8. Yumurtalıkları hızlı bir şekilde 1x PBS içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüm sinekler disseke edilene kadar tüpü buz üzerinde tutun. Mikrotübüller veya mikrofilamentler (veya bu sitoiskelet bileşenleri tarafından trafiğe maruz kalan veziküller) görselleştirilecekse, tüpü buz üzerinde tutmayın, çünkü bu depolimerizasyona neden olabilir.
  9. Tüm yumurtalıklar disseke edildikten ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldıktan sonra, tüpün dibine batmalarına ve PBS'nin ~ 50 μL dışındaki tüm miktarlarını çıkarmalarına izin verin. 1 mL% 4 PFA ekleyin ve 15 dakika boyunca bir somun platformu rocker'ına yerleştirin. Önemli olarak, eksik fiksasyon lekelenme ve görüntüleme sorunlarına yol açabileceğinden, uygun fiksasyona izin vermek için yumurtalıkların fiksasyon çözeltisinde ileri geri hareket edip etmediğini kontrol edin.
    NOT: Nutatörün hızı çok önemli değildir. Bazı nutatörler hız kontrolüne sahipken, diğerleri önceden ayarlanmış bir hıza sahiptir. Önceden ayarlanmış hız yeterlidir ve ayarlanabilirse, 40-50 rpm'ye ayarlayın.
  10. Fiksasyon çözeltisini çıkarın (adım 2.9'da olduğu gibi) ve daha sonra mikrofüj tüplerini 5-6 kez hafifçe ters çevirerek% 0.1 Triton-X 100 (1x PBST) içeren 1 mL 1x PBS ile iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Ardından, 1 mL 1x PBST (toplam 40-60 dakika) ile dört adet 10-15 dakikalık yıkama (uzun yıkama) ile devam edin.
    NOT: Deterjan yüzdesinin arttırılması GFP denatürasyonuna neden olabileceğinden, yıkamalar için 1x PBS +% 0.1 Triton-X 100 kullanılması tavsiye edilir, bu da floresanın azalmasına ve GFP etiketli BM proteinlerinin tespit edilmesine neden olabilir.
  11. DNA ve F-aktin boyama gibi boya boyaması için, adım 3'e geçin. İmmün boyama için, adım 4'e geçin. Yumurtalıklar, devam etmeden önce 4 ° C'de 1x PBST'de 24 saate kadar saklanabilir.

3. Standart DNA / F-Aktin boyama

  1. Fiksasyon ve yıkamadan sonra PBST'yi çıkarın. 500 μL DNA ve F-Aktin boyama çözeltisi ekleyin. DNA / F-Aktin çözeltisini hazırlamak için, Hoechst (DNA boyası; 1 mg / mL stok çözeltisinin 1:1000 seyreltilmesi) ve florofor etiketli falloidin (F-aktin boyası; Alexa Fluor 546 için 1:500 seyreltme veya Alexa Fluor 647 için 1:100 seyreltme, her biri 66 μM stok çözeltisi) 500 μL PBST içinde karıştırın.
  2. Etkili görüntüleme için floresanı korumak üzere yumurtalıkları ve boyaları karanlıkta tutmak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 15 dakika boyunca bir somun platformu rocker üzerinde inkübe edin.
  3. Kuluçkadan sonra, DNA / F-Aktin çözeltisini çıkarın (adım 2.9'da olduğu gibi). Adım 2.10'da açıklandığı gibi 1x PBST'de iki hızlı yıkama ve üç uzun (10-15 dakika) yıkama gerçekleştirin. Adım 5'te açıklandığı gibi montaja geçin.

4. Floresan immün boyama

NOT: Bu, floresan görüntüleme için standart bir immün boyama protokolüdür ve çoğu primer antikor ile uyumludur.

  1. Bloke etme ve primer antikor immünoboyaması (1. Gün)
    1. Fiksasyon ve yıkamadan sonra, adım 2.9'da açıklandığı gibi PBST'yi çıkarın. 1 mL blokaj çözeltisi (PBS +% 5 BSA) ekleyin ve yumurtalıkları en az 1 saat boyunca bir somun platform rocker üzerinde bloke edin.
      NOT: BSA'ya ek olarak, blokaj çözeltisine fetal sığır serumu (FBS) veya normal keçi serumu (NGS) eklenebilir. Alternatif olarak, yumurtalıklar 4 ° C'de bir somun platformu rocker üzerinde gece boyunca bloke edilebilir.
    2. Adım 2.9'daki gibi bloke edici çözeltiyi çıkarın ve bloke edici çözeltiye uygun konsantrasyonlarında (kullanılan antikora özgü) seyreltilmiş birincil antikorlar içeren 300 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin. 4 ° C'de bir nutating platform rocker üzerinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve ikincil antikor immünoboyamasına devam edin.
      NOT: Bazı birincil antikorlar kaydedilebilir ve tekrar kullanılabilir. Bazı durumlarda, yeniden kullanılan birincil antikorlar arka plan boyamasını azaltabilir ve bu da daha iyi görüntüleme ile sonuçlanabilir. Bununla birlikte, verimliliği sağlamak için her antikor için yeniden kullanım test edilmelidir.
  2. Sekonder antikor immünoboyaması (2. Gün)
    1. Birincil antikor solüsyonunu çıkardıktan sonra, adım 2.10'da olduğu gibi iki hızlı yıkama ve dört uzun (10-15 dakika) yıkama yapın. Taze 1x PBST kullanılarak dikkatlice yapılan tekrarlayan yıkamalar, spesifik olmayan arka planı azaltacak ve optimum görüntülemeye yol açacaktır.
    2. Adım 2.9'daki gibi PBST'yi çıkarın ve kullanılan birincil antikorları tespit edecek floresan sekonder antikorlar içeren 500 μL sekonder antikor çözeltisi ekleyin. Görüntü yakalama ve analiz için kritik olan floresanın optimum şekilde korunması için tüpü bu noktadan itibaren alüminyum folyo ile kaplayarak ışıktan koruyun.
      NOT: İkincil antikor çözeltisi, endojen olarak etiketlenmiş proteinlerle örtüşmeyen floroforlarla konjuge edilmiş ikincil antikorlar içermelidir. Örneğin, GFP etiketli proteinler kullanılıyorsa, Alexa Fluor ikincil antikorlarının kırmızı veya uzak kırmızı dalga boylarında kullanılması önerilir (örneğin, 546, 568 veya 647 nm). Hoechst ve Alexa Fluor 546 veya 647 konjuge falloidin gibi floresan boyalar ikincil çözeltiye eklenebilir. Bu lekeler genel hücre yapısını (yani çekirdekler ve F-Aktin) işaretlemek için yararlı olabilir. Konsantrasyonlar için adım 3.1'e bakın.
    3. Yumurtalıkları, oda sıcaklığında 2 saat boyunca bir nutating platform rocker üzerindeki ikincil antikor çözeltisinde inkübe edin. Adım 2.10'da olduğu gibi 1x PBST'de iki hızlı yıkama ve dört uzun (10-15 dakika) yıkama gerçekleştirin. Adım 5'teki gibi montaja devam edin.

5. Lekeli yumurtalıkların montajı

NOT: Bu yöntem, yumurtalıklar iyi gelişmiş ve bol miktarda bulunuyorsa çok iyi çalışır. Yumurtalıkların slayta dikkatli bir şekilde monte edilmesi, optimum görüntüleme için kritik öneme sahiptir.

  1. Son yıkamadan sonra, yumurta odalarını ayırmak için yumurtalıkları tüpte yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetlemek için bir p1000 pipet kullanın. Tüpü 5-10 dakika dik konumda tutarak yumurta odalarının dibe batmasına izin verin. Tek tek yumurta odalarının dikkatli bir şekilde ayrılması, optimum görüntü elde etmek için kritik öneme sahiptir.
  2. PBST'yi bir Pasteur pipet kullanarak çıkarın ve ~50 μL bırakın. kalan PBST'nin mümkün olduğunca çoğunu bir p200 pipet kullanarak çıkarın. 22 mm x 22 mm'lik bir kapak kayması üzerine eşit şekilde yayılacak kadar iki damla montaj ortamı ekleyin. Yumurtalıklar, montajdan önce 1 aya kadar 4 °C'de mikrosantrifüj tüplerinde montaj ortamında saklanabilir.
    NOT: Ticari olarak birkaç farklı montaj ortamı mevcuttur; optimum görüntüleme koşulları elde etmek için Aqua-Poly/Mount veya ProLong Glass Antifade Mountant gibi sert ayarlı montajcıların kullanılması önerilir. Gliserolün bir montaj ortamı olarak kullanılması, kötü görüntüleme koşullarına (örneğin, florofor instabilitesi) yol açabileceğinden önerilmez. Polimerize olmayan montaj ortamları için, yerine sabitlemek için bir kapak kayma sızdırmazlık maddesi/oje kullanarak kapak kapağını kapatın.
  3. Bir cam sürgüyü etiketleyin ve tozu ve parmak izlerini temizlemek için yumuşak, tozsuz kağıtla silin. Viskoz montaj ortamının mikrosantrifüj tüpünden kızağa kolayca aktarılmasını sağlamak için p200 pipet ucunun ucunu kesin. Daha sonra, montaj ortamındaki tüm yumurta odalarını yavaşça cam slayta aktarın ve kabarcıklar oluşturmadığınızdan emin olun.
  4. Diseksiyon mikroskobu altında, montaj ortamını ve ayrılmış yumurta odalarını, yaklaşık olarak kapak kaymasının büyüklüğündeki bir alanı kaplamak için yeni bir p200 ucu veya forseps kullanarak yavaşça yayın.
  5. Forseps kullanarak, kabarcıkları önlemek için kapak kapağını (tozsuz kağıtla temizlenmiş) yumurta odalarına dikkatlice bir açıyla yerleştirin.
  6. Polimerize etmek için slaytı oda sıcaklığında karanlıkta düz bir yüzeyde 2 gün saklayın. Montaj ortamı sertleştikten sonra, slayt görüntüleme için birkaç hafta boyunca karanlıkta 4 ° C'de saklanabilir.
    NOT: Görüntülemeden önce sert ayarlı montaj ortamının polimerize olması önemlidir. Ortam henüz polimerize olmamışsa, yumurtalıklar örtü kapağının altında yüzer ve görüntü alımını etkiler. Ayrıca, montaj ortamının optimum yansıtıcı indeksi ancak tamamen ayarlandıktan sonra elde edilir (ayrıntılar için üreticinin bilgilerine bakın).
  7. Alternatif montaj yöntemi: Yumurtalıkların bol olmaması durumunda doku kaybını azaltmak için bu yöntem önerilir. Bu yöntemde (aşağıda açıklanmıştır), ovarolleri ve kızak üzerindeki yumurta odalarını, adım 5.1'de açıklandığı gibi pipetle bir mikrosantrifüj tüpünde ayırmak yerine, montaj sırasında ayırın.
    1. Son yıkamadan sonra, yıkama çözeltisinin ~ 100 μL dışındaki tümünü çıkarın. Bir Pasteur pipet veya p1000 pipet kullanarak PBS'deki bozulmamış yumurtalıkları slayda aktarın. Bir p200 pipet kullanarak, slayttan mümkün olduğunca fazla PBST'yi dikkatlice çıkarın. Gerekirse PBST'yi silmek için tozsuz bir kağıt kullanın. Yumurtalıklara dokunmayın.
    2. İki damla montaj ortamı ekleyin. Forseps veya diseksiyon iğneleri kullanarak yumurtalıkları ve yumurta odalarını dikkatlice ayırın. Yabancı dokuyu çıkarın ve atın ve ardından yumurta odalarını ve yumurtalıkları montaj ortamına yayın. 5.5-5.6 arasındaki adımlara geçin.

6. Konfokal görüntü alımı

NOT: Bu bölüm, herhangi bir konfokal mikroskop kullanılarak optimum görüntü elde etmek için anahtar parametreler sağlar (Şekil 2).

  1. Mikroskopu kurun ve örneği aşağıda açıklandığı gibi bulun.
    1. Görüntülemeden önce, floresan mikroskobun göz merceğini kullanarak ilgilenilen bölgeyi (ROI) bulmak çok önemlidir. Düşük büyütme hedefi (20x) veya görüntü yakalama için kullanılacak hedefi (ör. 40x veya 63x) kullanın. Görüntülemek için bir yumurta odası seçin.
      NOT: Görüntü alma için 40x veya 63x gibi yüksek büyütme hedeflerinin kullanılması önerilir (bkz. 6.2.1).
    2. Yatırım getirisi seçildikten sonra, görüntü alma işlemine devam edin; konfokal görüntüleme için adım 6.2'ye ve süper çözünürlüklü görüntüleme için adım 7'ye geçin.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi optimum görüntü alımı için anahtar parametreleri seçin (temsili görüntüler için anahtar parametrelere örnekler Tablo 1'de verilmiştir).
    1. Bir hedef seçme: FE'deki BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığının ve sekresyonunun konfokal görüntü elde edilmesi için, 40x veya 63x hedefi kullanın.
      NOT: Mümkün olan en iyi çözünürlüğü elde etmek için, en yüksek akromatik düzeltmeyi sağlayan yüksek sayısal diyafram açıklığına (NA) sahip Plan-Apochromat hedeflerinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
    2. Her kanal/parça için lazer seçme: GFP için lazer 488 nm kullanın; DAPI veya Hoechst için lazer 405 nm kullanın; Alexa Fluor 546 veya 568 için lazer 561 nm kullanın; Alexa Fluor 647 için lazer 640 nm kullanın.
      NOT: Her lazer seçimi farklı bir kanal/iz oluşumu ile sonuçlanacaktır. Burada, kanal terimi, her kanalın belirli dalga boyunda seçilen ROI için uyarılmış floroforlar için kaydedilen yoğunluk dağılımı tarafından oluşturulan görüntüyü ifade eder.
    3. İğne deliği ayarı: Görüntü yakalama sırasında odak dışı ışığı azaltmak için her kanalın iğne deliğini 1 AU olarak ayarlayın.
    4. Lazer yoğunluğu ve dedektör kazancı ayarları: Görüntü hassasiyetine ince ayar yapmak için hem dedektör ana kazancını hem de lazer gücünü kullanın. Görüntü hassasiyetini doğru şekilde ayarlamak için bir aralık göstergesi önerilir. Hem ana kazancı hem de lazer gücünü, dedektör doygunluğundan kaçınırken ilgilenilen yapıların (örneğin, BM içeren veziküller) açıkça görülebildiği uygun bir hassasiyete sahip olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Fotobeyazlatmayı önlemek için, gereken minimum lazer gücünü kullanın. Mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanırken önce dedektör kazancının arttırılması önerilir. Dedektör kazancının artması istenen yoğunluğa ulaşamazsa, lazer gücünü artırın. Lazer güç yoğunluğu %0,5-%1,2 arasında olması önerilir.
    5. Çerçeve boyutu: Edinme yazılımı tarafından belirlenen en uygun görüntü boyutunun kullanılması önerilir. Çoğu uygulama için maksimum 1024 x 1024 çözünürlük kullanın. Daha yüksek çözünürlük, satın alma süresini önemli ölçüde artıracaktır.
    6. Tarama hızı: Çoğu örnek için güvenli olan 6-9 arasında bir tarama hızı kullanın. Örnek gürültülüyse, sinyal-gürültü oranlarını iyileştirmek için daha yavaş bir tarama hızı kullanın. Bununla birlikte, düşük tarama hızları fotobeyazlatma ve elde etme süresini arttırır.
    7. Ortalama yoğunluk ortalaması: Görüntü kalitesini artırmak için, aynı ayarlara sahip ardışık taramalar yoluyla ortalama yoğunluk ortalamasını kullanın. Çoğu durumda, numuneyi fotobeyazlatmadan sinyal-gürültü oranlarını iyileştirmek için ortalama iki kullanın.
    8. Yakınlaştırma: Yakınlaştırma işlevini kullanarak tarama alanını ayarlayın. FE'deki BM içeren vezikülleri net bir şekilde görselleştirmek için en etkili değer olarak hem 40x hem de 63x hedefleriyle 2x-4x arasında bir yakınlaştırma kullanın. Satın alma süresini azaltmak için minimum yatırım getirisini dikkatlice seçin.
  3. Zeiss Zen yazılımını kullanarak bir z-yığını elde etmek için aşağıdaki Z-kesitleme parametrelerini kullanın ve bunları aşağıda açıklandığı gibi ayarlayın.
    NOT: Veziküller ve BM proteinleri içeren diğer hücre içi yapılar 3 boyutlu (3B) yapılardır. FE aracılığıyla bir z-yığını elde etmek, görüntü kalitesini ve çözünürlüğünü önemli ölçüde artıracaktır. Genellikle, dokunun kalınlığını / derinliğini kapsayan bir aralık, hücre içi lokalizasyonu etkili bir şekilde görselleştirmek için yeterlidir. Optimum 3D rekonstrüksiyon için, yazılım tarafından belirlenen en uygun aralığın kullanılması önerilir. 40x ve 63x hedefler için, optimum 3D rekonstrüksiyona izin vermek için her bir z bölümü arasında 0,5 μm'den daha yüksek aralıklardan kaçının.
    1. Edinme sekmesinin altındaki ana alanda bulunan z-Stack onay kutusuna tıklayın. Z-yığını için Dilim Başına Tüm İzler tarama modunu seçin. Bu, her z konumu dilimi için kanal izlerinde bir değişikliğe neden olur.
    2. Örneği gözlemlemek için istediğiniz kanalı seçin ve canlı bir tarama başlatmak için Canlı'ya tıklayın. GFP etiketli BM proteinini tespit etmek için gereken kanalın kullanılması önerilir.
    3. Z-yığını için açıklandığı gibi bir aralık ayarlayın. Mikroskop üzerindeki ince ayar düğmesini kullanarak, numunenin bir ucu için z-konumunu bulun ve İlk Önce Ayarla'ya tıklayın. Benzer şekilde, numunenin diğer ucu için z konumunu bulun ve Son Ayarla'ya tıklayın.
    4. Z-yığınındaki her konum için, aralık göstergesi seçiliyken her bir kanala ayrı ayrı tıklayın ve adım 6.2.4'te açıklandığı gibi lazerin yoğunluğunu ve ana kazancı gerektiği gibi ayarlayın.
    5. Adım boyutunu adım 6.3'ün altındaki NOT'ta önerildiği gibi atamak için z yığınının aralığını ayarlayın. z-stack alımına başlamak için Denemeyi Başlat'a tıklayın.

7. Süper çözünürlüklü görüntü alma

  1. Airyscan uyumlu bir reklam verme amacı seçin. BM proteininin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek için, 63x yağ hedefinin kullanımı en uygunudur (Şekil 3). Hedefi 63x olarak ayarlayın ve yavaşça lensine bir damla daldırma yağı yerleştirin. Slaytı, numuneyi bulmak için hedefe bakan kapak kayması olacak şekilde objektif üzerine yerleştirin.
  2. Floroforun aşağıda açıklandığı gibi görüntülenmesi için uygun ayarlara sahip bir konfigürasyon seçin.
    1. Yeni bir deneme yapılandırmak için Edinme sekmesindeki Akıllı Kurulum düğmesini tıklayın. Airyscan (süper çözünürlük) öğesini seçin; bu seçildiğinde, Çözünürlük (Airyscan SR), SNR / hassasiyet (Airyscan Confocal) ve Speed (Multiplex SR-2Y) arasında daha fazla seçim yapılması gerekecektir. Sabit doku için, en iyi alımla sonuçlanacak şekilde Çözünürlük'ü seçin.
    2. İzler/kanallar eklemek için Denemenizi Yapılandırın kutusundaki + işaretini tıklayın. Boya Veritabanından belirli boyalar için parçaları seçin. Çok kanallı bir deneme için, uygun boyaları seçerek her parçayı gerektiği gibi ekleyin.
    3. Tüm parçalar eklendikten sonra, yazılım tarafından sağlanan deneme tekliflerinden birini seçin. Bu deney için, En Akıllı (Hat) teklifine kıyasla hız biraz daha yavaş olacağından, her boya için en iyi donanım ayarlarını oluşturacağı ve maksimum sinyal kazancı ve minimum emisyon çapraz konuşması ile sonuçlanacağı için En İyi Sinyal'i kullanın. Deneme ayarlandıktan ve yüklendikten sonra, Edinme sekmesindeki Görüntüleme Ayarları penceresinde görünür.
    4. Akıllı bir kurulum seçildikten sonra, dedektör GaAsP-PMT için dalga boyları aralığı otomatik olarak seçilecektir. Aralığı artırmak veya azaltmak için alttaki kaydırma çubuğunu hareket ettirerek aralığı ayarlayın ya da aralığı gerektiği gibi tamamen başka bir bölgeye taşıyın. Çapraz konuşmayı önlemek için iki farklı kanalın aralıklarının çakışmadığından emin olmak için bunu kullanın. Yapılandırmayı gelecekte yeniden kullanmak üzere kaydedin.
  3. Yapılandırma ayarlandıktan sonra, yakınlaştırma ve tarama alanını adım 6.2.8'deki gibi ayarlamaya devam edin. Tarama süresini ve depolama alanını azaltmak için ilgili bölgeye odaklanmak üzere tarama alanını optimize edin. Görüntüleri almaya devam edin.
  4. Her bir kanal için, Kanal altında bir parça seçin ve Canlı'yı tıklayın. Adım 6.2.4'te açıklandığı gibi aralık göstergesi aracını kullanarak ana kazancı ve lazer gücünü ayarlayın ve doygun pikselleri önlemek için açıklanan tüm yönergeleri izleyin. Airyscan Dedektörü Görünümü düğmesine tıklayarak altıgen dedektör görünümünün ortalandığını ve hizalandığını onaylayın. Çoğu durumda, altıgen dedektör görünümü otomatik olarak ortalanır ve hizalanır. Ek kanallar için bu işlemi tekrarlayın.
  5. Edinme modu geçiş penceresinde, Görüntü Boyutu altında, dedektörün yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak için SR (süper çözünürlükle sınırlı piksel sayısı) üzerine tıklayın. Bu, çerçeve boyutunu otomatik olarak ayarlayacaktır.
  6. Genellikle gerekli olmadığı için ortalamayı Hiçbiri olarak tutun ve bu tarama süresini azaltacaktır. Bazı durumlarda, ortalama 2x'lik bir değer, sinyal-gürültü oranını iyileştirebilir.
  7. 8 bit veri derinlikleriyle ham veri toplayın. Bir görüntü elde etmek için Tuttur'a tıklayın. Bir z-yığını edinmek için adım 6.3'ü izleyin.
  8. Aşağıda açıklandığı gibi görüntü işleme gerçekleştirin. Bu, 16 bitlik bir görüntü üretecektir.
    1. Görüntü veya z-yığını elde edildikten sonra, İşleme > Yöntemi'ne tıklayın ve Airyscan İşleme'yi seçin.
    2. Başlamak için otomatik filtre uygulayın ve numune için en iyi sonuçları elde etmek üzere SR değerini değiştirerek daha fazla el ile işleme gerçekleştirin. En uygun SR değeri belirlendikten sonra, işlenmiş bir görüntü oluşturmak için Uygula'ya tıklayın. Z-stack görüntüleri söz konusu olduğunda, 3D İşleme kutusuna tıklayarak bir z-dilimi (Geçerli Görüntü [2D]) veya tüm z-stack olarak işleyin .

8. Görüntü işleme ve veri analizi (ortogonal projeksiyon, 3D rekonstrüksiyon ve yoğunluk profili)

NOT: Bu yöntem için, ortogonal projeksiyonlar, 3B rekonstrüksiyonlar ve yoğunluk profilleri oluşturmak için kullanılan adımlar Zen yazılımı için açıklanmıştır (bkz. Benzer veri analizleri ImageJ yazılımı56 ile de yapılabilir.

  1. Aşağıda açıklandığı gibi ortogonal projeksiyon yapın (Şekil 4).
    1. Konfokal veya süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak bir z-yığını elde edildikten sonra, hücrenin z eksenindeki vezikülleri 2B görünümde görüntülemek için ortogonal bir projeksiyon oluşturun (3B rekonstrüksiyona kıyasla). Bunu yapmak için, İşleme > Yöntemi'ne tıklayın ve Ortogonal Projeksiyon'u seçin.
    2. Parametreler altında, gerekli projeksiyon düzlemini seçin. Z ekseninin (z-yığını) projeksiyonu için Ön (XY) düzlemini seçin. Yöntem altında, en yüksek kalitede projeksiyonla sonuçlanmak için Maksimum'u seçin.
    3. Ardından, başlangıç konumunu (başlangıç z-dilimi) seçerek projeksiyonun kalınlığını belirleyin ve projeksiyondaki kalınlığı (toplam z-dilimi sayısı) belirleyin. Z eksenindeki bir hücreninkine eşit kalınlığı seçmek idealdir.
    4. Parametreler ayarlandıktan sonra, z-yığınının projeksiyonunu XY düzlemi tarzında oluşturmak için Uygula'ya tıklayın.
      NOT: Belirli bir ilgili nesnenin miktarını karşılaştırmak için birden fazla z-yığınının ortogonal projeksiyonlarını oluştururken, veri doğruluğu için projeksiyonun kalınlığını aynı (veya mümkün olduğunca yakın) tutmak zorunludur.
  2. Aşağıda açıklandığı gibi 3B rekonstrüksiyon gerçekleştirin (Şekil 5).
    1. Yapıların lokalizasyonunu ve şeklini gözlemlemek için z-yığınlarının 3B rekonstrüksiyonlarını oluşturun. Bunu, konfokal ve süper çözünürlüklü yaklaşımlar kullanılarak elde edilen z-yığınları için yapın. Süper çözünürlüklü z-yığınlarını ilk olarak 3B yeniden yapılandırma için adım 7.8'de olduğu gibi 3B işlemeyi kullanarak işleyin.
    2. Bir 3B görüntü oluşturmak için, önizleme penceresindeki 3B simgesine tıklayın. Tıklandığında, ekranın alt yarısındaki ekran kontrolü bölümünde bir 3B sekmesi görünecektir. Saydamlık, Hacim, Maksimum, Yüzey ve Karışık gibi 3B görünümler görünür olacaktır. Veziküllerin yapısını görüntülerken Yüzey veya Karışık görünümler kullanın (tercih edilir).
    3. En yüksek kaliteli görüntü için Hassas ayarını seçin, çünkü en hızlı ayar daha az doğru olur ve zayıf 3B işlemeye neden olur.
    4. Görüntü oluşturulduktan sonra, ilgilenilen nesneleri görüntülemek üzere tercih edilen bir konuma odaklanmak için döndürüp yakınlaştırarak görüntüyü değiştirin. Görünüm sekmesi altındaki 3B görüntüyü değiştirin.
    5. Tatmin edici bir görünüm elde edildikten sonra, 3B sekmesinin altında Görüntülenen Çözünürlük'ü seçin ve ardından Görüntü Oluştur'a tıklayın. Bu, görüntünün görüntülendiği yönde bir anlık görüntüsünü oluşturur ve çeşitli dosya biçimlerinde kaydedilip dışa aktarılabilir.
  3. Aşağıda açıklandığı gibi bir yoğunluk profili oluşturun (Şekil 7).
    NOT: Farklı floresan sinyallerle ilişkili piksellerin dağılım ve yoğunluk profilleri, birlikte lokalizasyonlarını belirlemek için bir bindirme görüntüsü olarak görüntülenebilir.
    1. Konfokal veya süper çözünürlüklü görüntüleme yoluyla en uygun görüntü elde edildikten sonra, Önizleme penceresinin Görünüm panelinde Profil'e tıklayın. Önizleme penceresinde, yoğunluk profilini mesafenin bir fonksiyonu olarak görüntüleyen bir histogramın yanı sıra mesafeleri ve yoğunluk değerlerini gösteren bir tablo görünecektir.
    2. Ekranın altındaki görüntü kontrolleri alanında, Profil Tanımı sekmesindeki Ok Aracı'na tıklayın. Farklı piksellerin yoğunluk profilinin değerlendirilmesi gereken nesnenin uzunluğu boyunca bir ok çizin. Oku çizmek için görüntüyü yakınlaştırın.
    3. Yoğunluk profili, okun yolu boyunca mesafenin ve karşılık gelen tepe noktalarının görüntüleneceği görüntü önizlemesinin solunda görünecektir. Görüntünün kendisinde görüntülenen histogramı kaldırmak için, Profili Grafiklerde Göster kutusunun işaretini kaldırın.
    4. Görüntü kontrol alanındaki Boyutlar sekmesinde, yoğunluk profiline dahil edilmemesi gereken kanalların seçimini kaldırın.
    5. Grafikler sekmesinde, Grafik Öğelerini Biçimlendir açılır kutusunu açmak için Ek Açıklamalar/Ölçümler kutusunun altında gösterilen Profil'e çift tıklayın. Okun rengini, stilini ve kontur kalınlığını değiştirmek için bunu kullanın. İstediğiniz ayarları seçtikten sonra kutuyu kapatın.
    6. Profil Görünümü sekmesine tıklayın. Yeni görüntü bölümünde, dosyayı kaydetmek için Geçerli Görünüm'e ve ardından Farklı Kaydet'e tıklayın. Veri sıkıştırmasını ve kaybını önlemek için dosyayı .tif dosyası olarak kaydetmeniz önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Burada açıklanan yöntemler, Drosophila yumurtalıklarının FE'si gibi polarize epitel hücrelerinde BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu verimli ve doğru bir şekilde görüntülemek ve karakterize etmek için kullanılabilir. Daha sonra, açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilen beklenen sonuçların yanı sıra yararlı tavsiyeler ve potansiyel tuzaklar sunuyoruz. Bunu yapmak için, endojen olarak etiketlenmiş bir Vkg (Drosophila Col IV) olan Vkg-GFP kullanılır. Bununla birlikte, aynı sonuçlar Pcan-GFP gibi endojen olarak etiketlenmiş diğer BM proteinleri ile de elde edilebilir.

En uygun edinme parametrelerinin ayarlanması (Şekil 2)
Epitel hücrelerinde Vkg ve Pcan gibi BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu doğru bir şekilde karakterize etmek için, konfokal mikroskobun edinim parametrelerini sağlanan yöntemlerde açıklandığı gibi doğru bir şekilde ayarlamak çok önemlidir.

Konfokal mikroskopi kullanılarak, Vkg-GFP'nin hücre içi lokalizasyonu, FE'de bazal olarak salgılanmadan ve biriktirilmeden önce tespit edilebilir (Şekil 2A). ER'deki çeviriden sonra, Coll IV'ün hücre içi ekzositik veziküllere paketlenmeden önce Golgi'ye taşındığı gösterilmiştir. Bu görüntüleme yaklaşımını kullanarak, Vkg-GFP'nin hücre içi bölmelerde farklı şekillerde biriktiğini, potansiyel olarak farklı organelleri, endozomal kompartmanları ve vezikül tiplerini temsil ettiğini gözlemledik (Şekil 2A, oklar). Ekzositik veziküllerde, Coll IV zaten üç polipeptitten oluşan fibriller halinde monte edilmiştir: iki α1 zinciri ve bir α2 zinciri ( Drosophila'da Vkg), konfokal görüntüleme kullanılarak da görselleştirilebilen gerilmiş veziküllerin oluşumuna yol açar (Şekil 2A, oklar). Daha sonra, Coll IV, BM'de biriktiği epitel hücrelerinden bazal olarak spesifik olarak salgılanır (Şekil 2, ok uçları).

Edinme parametreleri doğru ayarlanmazsa, BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığı sırasında farklı morfolojileri ve pozisyonları tam olarak gözlemlemek mümkün değildir (Şekil 2B, C). Örneğin, edinme parametreleri hücre içi yapıları değil, hücre dışı BM'yi görselleştirmek için optimize edilmişse, BM proteini içeren endozomal bölmeler ve veziküller (burada Vkg-GFP ile işaretlenmiştir) loş görünür veya görünmez (Şekil 2B). Tersine, dedektörler aşırı doymuşsa, Vkg-GFP'nin hücre içi lokalizasyonu optimal durumda olduğu gibi tespit edilebilir (Şekil 2A ve Şekil 2C'yi karşılaştırın), ancak arka plan floresan gürültüsündeki bir artış, özellikle kolokalizasyon deneyleri için BM protein lokalizasyonunun yorumlanmasını daha zor hale getirir (bkz . Şekil 7). ). Genel olarak, bu veriler epiteldeki BM proteinlerinin doğru lokalizasyonunu sağlamak için uygun edinim parametrelerinin önemini göstermektedir.

Optimum süper çözünürlük ve dekonvolüsyon parametrelerinin ayarlanması (Şekil 3)
Konfokal görüntü elde etmek için gösterildiği gibi, düşük veya aşırı doygunluğu önlemek için süper çözünürlüklü mikroskopi kullanırken elde etme parametrelerini doğru bir şekilde ayarlamak da çok önemlidir. Bu süper çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımı, süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için dekonvolüsyon parametrelerinin dikkatli bir şekilde yapılandırılmasını da içerir (Şekil 3). Dekonvolüsyon işlemi en uygun şekilde yapılandırıldığında, süper çözünürlüklü görüntüleme, veziküller veya Golgi yapıları (Şekil 3A ve Şekil 7C), BM'nin kendisi (Şekil 3A, ok uçları) gibi BM proteinleri içeren hücre içi yapıların (Şekil 3A, oklar) çözünürlüğünü önemli ölçüde artırır ve sinyal-gürültü oranını arttırır45 . Süper çözünürlüklü mikroskopi, konfokal mikroskopiye kıyasla her üç uzamsal boyutta da çözünürlükte ~ 2 kat artışa yol açar. Çözünürlükteki bu artış, standart CSLM ile alınanlara kıyasla süper çözünürlüklü görüntüleme kullanılarak alınan BM proteinlerinin ve BM'nin hücre içi kaçakçılığının daha iyi tanımlanmış görüntüleri ile açıkça gösterilmektedir (Şekil 2A ve Şekil 3A'yı karşılaştırın).

Dekonvolüsyon parametreleri düzgün ayarlanmazsa, süper çözünürlük en uygun şekilde elde edilmez ve çözünürlükteki artış kaybolur. Süper çözünürlüklü görüntülerin az işlenmesi bulanık görüntülere yol açar, bu da BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunun loş görünmesine ve optimal koşullar altında olduğu kadar iyi tanımlanmamasına neden olur (Şekil 3B ile Şekil 3A'yı karşılaştırın). Tersine, görüntülerin aşırı işlenmesi, BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunun pikselli göründüğü grenli görüntülere yol açar (Şekil 3C). Bu veriler, BM proteinlerinin hücre içi dağılımını yansıtan anlamlı ve temsili görüntüler elde etmek için uygun dekonvolüsyon parametrelerinin kullanılmasının önemini vurgulamaktadır.

Toplamda, bu veriler, konfokal mikroskopiye kıyasla süper çözünürlüklü görüntü işleme kullanarak BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığının gelişmiş çözünürlüğünü açıkça göstermektedir ve vurgulamaktadır. Spesifik olarak, bu yaklaşım, ilgili hücre içi yapıların çözünürlüğünü artırarak BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Bu, FE'deki BM proteinlerinin polarize birikiminde rol oynayan yeni faktörleri daha iyi tanımlamak ve karakterize etmek için farklı boyut ve yapı şekillerinin karşılaştırılmasına izin verir.

BM proteinlerinin hücre içi dağılımının görselleştirilmesini arttırmak için FE aracılığıyla optik z-kesitlerinin (z-yığını) ortogonal projeksiyonu ve 3D rekonstrüksiyonu (Şekil 4 ve Şekil 5)
BM proteinlerinin hücre içi dağılımı FE boyunca 3D'de (x-, y- ve z-eksenleri) mevcut olduğundan, süper çözünürlüklü veya konfokal mikroskopi kullanarak, FE yoluyla optik z-kesitlerinin ortogonal projeksiyonu ve / veya 3D rekonstrüksiyonu, BM proteinlerinin vahşi tip veya mutant hücreler içindeki lokalizasyonunu ve dağılımını değerlendirmek için kullanılabilir (örneğin, Şekil 4 ve Şekil 5'te).

Ortogonal projeksiyon, elde edilen tüm z-kesitlerinin tek bir düzlemde yansıtılmasını sağlar. Bu yöntem özellikle konfokal (Şekil 4A) veya süper çözünürlüklü (Şekil 4B) görüntüleme kullanarak BM proteinleri içeren veziküllerin ve bölmelerin tek bir görüntüdeki genel dağılımını göstermek için yararlıdır. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü mikroskopi kullanıldığında konfokal mikroskopiden önemli ölçüde daha iyi çözünürlük ve daha az arka plan gürültüsü ortaya çıkar (Şekil 4B ve Şekil 4A'yı karşılaştırın).

BM içeren bölmelerin ve veziküllerin genel dağılımını görselleştirmek için bir başka yaklaşım, konfokal (Şekil 5A) veya süper çözünürlüklü (Şekil 5B) görüntüleme ile alınan bir optik z-kesit yığınını monte ederek bir 3D rekonstrüksiyon oluşturmaktır. Bu yaklaşım, hücre içi BM proteinlerinin lokalizasyonunu ve dağılımını ve Vkg-GFP içeren bölmelerin ve veziküllerin şeklini, özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi kullanıldığında değerlendirmek için çok etkili olabilir (Şekil 5). Geleneksel konfokal mikroskopi (Şekil 5A), süper çözünürlüğe (Şekil 5B) kıyasla daha yüksek arka plan gürültüsü ile sonuçlanır, bu da 3D görüntülemede hesaba katıldığında artefaktlarla sonuçlanabilir. Ayrıca, daha düşük konfokal çözünürlük, oluşturulan görüntülerin süper çözünürlükle üretilenlerden daha az pürüzsüz ve tanımlanmış olmasına neden olur (Şekil 5A ve Şekil 5B'yi karşılaştırın).

Süper çözünürlüklü görüntüleme kullanılarak BM proteinlerinin polarize sekresyonunda rol oynayan bileşenlerin kaybı ile ilişkili fenotiplerin karakterizasyonu (Şekil 6)
Şimdiye kadar gösterildiği gibi (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5), süper çözünürlüklü mikroskopi ve görüntü işleme, Drosophila yumurtalıklarının vahşi tip FE'sinde BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu ve dağılımını değerlendirmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu yaklaşım BM proteinlerinin mutant veya nakavt koşullarında lokalizasyonunu belirlemek ve karşılaştırmak için de kullanılabilir. Bu nedenle, bu, BM proteinlerinin polarize hücre içi kaçakçılığına, sekresyonuna ve birikimine adanmış yeni tanımlanmış bileşenlerin rollerini karakterize etmek için etkili bir yöntemdir.

GTPaz değişim faktörü (GEF) Crag'ın, BM proteinlerinin polarize birikimine adanmış biyolojik bir yolda önemli bir bileşen olduğu gösterilmiştir28. Crag knockdown FC'lerde, BM proteinleri hem apikal hem de bazal olarak birikir, bu da Crag'ın Vkg-GFP gibi BM proteinlerinin polarize sekresyonunu kontrol ettiğini gösterir (Şekil 6). Süper çözünürlüklü mikroskopinin kullanılması, Crag kaybından kaynaklanan fenotipin daha iyi karakterize edilmesini sağlar. Örneğin, BM proteinlerinin güçlü bir apikal birikimi ve ektopik apikal BM'nin organizasyonu, Crag-knockdown FC'lerde gözlenir (Şekil 6B, ok uçları). Ayrıca, fenotip daha az anormal olduğunda, FC'lerde küçük yamalarda apikal olarak biriken BM membranı tespit edilir (Şekil 6B, oklar). Toplamda, bu veriler, BM'nin polarize birikiminde yer alan bileşenlerin rollerini daha iyi anlamak için mutant fenotipleri karakterize etmek için süper çözünürlüklü mikroskopinin kullanılabileceğini göstermektedir.

Konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak görüntülenen antikorlar ve endojen olarak etiketlenmiş BM proteinleri kullanılarak yapılan kolokalizasyon deneyi (Şekil 7)
Son olarak, spesifik hücre içi belirteçlere veya endojen olarak etiketlenmiş BM proteinleri ile birlikte yeni tanımlanmış bileşenlere karşı antikorların kullanımı, polarize epiteldeki BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu daha iyi karakterize etmek için kullanılabilir. Bu noktayı göstermek için bir cis-Golgi işaretleyicisi olan GM-130 kullanılır. Salgı veziküllerinde paketlenmeden önce, Coll IV Golgi'ye taşınır. Vkg-GFP'nin hücre altı dağılımı konfokal (Şekil 7A, B) veya süper çözünürlüklü (Şekil 7C, D) görüntüleme kullanılarak değerlendirildiğinde, her iki yaklaşım da Vkg-GFP'nin GM-130 ile kısmen birlikte lokalize olduğunu ve Coll IV'ün sekresyondan önce Golgi'ye ayrıldığını doğruladığını göstermektedir. Bununla birlikte, süper çözünürlüklü görüntüleme kullanıldığında, sinyal-gürültü oranında bir artış ve Vkg-GFP ile GM130 arasındaki kolokalizasyonun daha iyi bir çözünürlüğü gözlenmiştir (Şekil 7A ile Şekil 7C karşılaştırıldığında).

Ayrıca, yeşil (Vkg-GFP) ve kırmızı (GM-130) piksellerin uzamsal dağılımı ve seviyeleri, bir optik bölümün floresan yoğunluğunun konfokal (Şekil 7B) ve süper çözünürlüklü (Şekil 7D) mikroskopi ile alınan FC'ler aracılığıyla ölçülmesiyle ölçüldüğünde, Vkg-GFP ve GM-130'un kolokalizasyonu gözlenir. Vkg-GFP ve GM-130 piksellerinin dağılımı, Vkg-GFP ve GM-130 piklerinin örtüşmelerinin kolokalizasyonlarını gösterdiği histogramlarda çizilmiştir (Şekil 7B',D'). Böylece, bu görüntü analiz aracı kullanılarak, Vkg-GFP'nin belirli hücre içi bölmelerdeki konumu kesin olarak belirlenebilir. Bununla birlikte, konfokal görüntülerden (Şekil 7B') üretilen histogramların süper çözünürlüklü (Şekil 7D') görüntülerle karşılaştırılması, süper çözünürlüklü mikroskopinin, daha küçük piklerin eksikliğiyle temsil edilen zirvelerin daha yüksek yoğunluğu ve azaltılmış arka plan gürültüsü ile görülebileceği gibi, daha iyi sonuçlar verdiğini doğrulamaktadır (Şekil 7B' ve Şekil 7D'yi karşılaştırın). ) süper çözünürlükte oluşturulan histogramlarla ilişkili. Toplamda, bu veriler, konfokal mikroskopinin kolokalizasyonu ölçmek için kullanılabilmesine rağmen, süper çözünürlüğün daha güçlü bir yaklaşım olduğunu ve lokalizasyonun daha verimli ve kesin bir şekilde ölçülmesine yol açtığını vurgulamaktadır.

Figure 1
Şekil 1: Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli (FE): bazal membran (BM) proteinlerinin polarize birikimini incelemek için bir model sistem. (A) Diseksiyon ve eksizyon sonrası bozulmamış yumurtalıkların floresan stereomikroskopla alınan görüntüsü. Yumurtalıklar endojen GFP etiketli BM proteinini (Vkg-GFP) eksprese eder. Ölçek çubuğu = 1 mm. (A') Bir dişi sineğin iki yumurtalıkları yumurta kanalına tutturulur. Her yumurtalık 16-20 yumurtalık içerir. Tek bir yumurtalık özetlenmiştir (dikdörtgen). Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) Vkg-GFP'yi eksprese eden bir ovarol aracılığıyla konfokal mikroskopla alınan ve DNA (mavi) ve F-Aktin (kırmızı) için boyanmış uzunlamasına kesit. Ovaroller farklı aşamalardaki yumurta odalarından oluşur. Yumurta odaları, germline hücrelerini (GC'ler) çevreleyen tek katmanlı bir foliküler epitelden (FE) oluşur. FE, BM proteinlerini sentezler ve temel olarak salgılar (örneğin, Pcan ve Vkg). Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) FE'nin şeması. FE, apikal alanın germline hücrelerine baktığı ve bazal alanın BM'ye (yeşil) baktığı farklı bir apikal-bazal polariteye sahip klasik bir epiteldir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin konfokal görüntüleme kullanılarak görüntülenmesi. (A-C) Vkg-GFP (yeşil) eksprese eden ve DNA (mavi) ve F-Aktin (kırmızı) için boyanmış bir yumurta odasından uzunlamasına kesit. (A'-C') Vkg-GFP (oklar) içeren hücre içi bölmeler ve veziküller ve bazal ve hücre dışı olarak biriken BM (ok uçları) konfokal mikroskopi kullanılarak gösterilir. (A) Vkg-GFP'nin hücre içi kaçakçılığının görülebildiği en uygun şekilde elde edilmiş görüntü. (A') Vkg-GFP, FC'lerin sitoplazması boyunca farklı hücresel bölmelerde (örneğin, Golgi) ve veziküllerde lokalizedir. Kollajen IV'ün fibril organizasyonu nedeniyle, Vkg-GFP içeren veziküller uzatılmış görünür (oklar). (B) BM proteinlerinin hücre içi dağılımını değil, hücre dışı BM'yi görselleştirmek için edinme parametrelerinin optimize edildiği az pozlanmış görüntü. Vkg-GFP (yeşil), sitoplazma (B') boyunca loş görünür ve bu da (A) 'ya kıyasla tespit edilemeyen Vkg-GFP içeren veziküllere neden olur. (C) GFP dedektörünün doygun olduğu aşırı pozlanmış görüntü, arka plan floresansının artmasına neden olur. Vkg-GFP'nin (yeşil) hücre içi dağılımı, FC'lerin (okların) sitoplazması boyunca lokalize olarak görülebilmesine rağmen, aşırı maruz kalma, hücre içi yapıların (A-A') olduğu gibi olduklarından daha büyük göründüğü görüntüleme artefaktlarıyla sonuçlanır. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığının süper çözünürlüklü görüntüleme ve işleme kullanılarak görüntülenmesi. (A-C) Vkg-GFP'yi (yeşil) eksprese eden ve DNA (mavi) ve F-Aktin (kırmızı) için boyanmış bir yumurta odasından uzunlamasına kesit. (A) Vkg-GFP'nin hücre içi kaçakçılığının açıkça gözlemlendiği optimum şekilde işlenmiş süper çözünürlüklü görüntü. (A') Vkg-GFP, FC'lerin sitoplazması boyunca farklı hücresel bölmelerde (örneğin, Golgi) ve veziküllerde (oklar) ve BM'de (ok uçları) lokalizedir. (B) (A)'dan daha yüksek arka plan floresansı ile sonuçlanan az işlenmiş görüntü. Vkg-GFP'nin (yeşil) hücre içi lokalizasyonu loş ve daha az tanımlanmış görünmektedir (B ile A karşılaştırıldığında). (C) Vkg-GFP'nin hücre içi lokalizasyonunun pikselli ve grenli göründüğü bir görüntüyle sonuçlanan aşırı işlenmiş görüntü. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımları kullanılarak elde edilen ve işlenen bir z-yığınının ortogonal projeksiyonu. (A-B) Vkg-GFP'yi (yeşil) eksprese eden ve konfokal (A) veya süper çözünürlüklü (B) mikroskopi kullanılarak DNA (mavi) ve F-Aktin (kırmızı) için boyanmış bir yumurta odasından optik z-kesitlerin ortogonal projeksiyonu. (A) Optimal konfokal parametreler kullanılarak elde edilen bir z-yığınının projeksiyonu. Vkg-GFP'nin hücre içi lokalizasyonu, FC'lerdeki z ekseni boyunca gözlemlenebilir (A', oklar). BM de görülebilir ve çok parlak görünür (A', ok uçları). (B) Optimum süper çözünürlüklü işleme kullanılarak elde edilen bir z-yığınının projeksiyonu. İyi tanımlanmış hücre içi bölmeler ve Vkg-GFP içeren veziküller, FC'lerdeki z ekseni boyunca gözlemlenebilir (B', oklar). BM de çok iyi tanımlanmıştır (B', ok uçları). Standart konfokal görüntüleme ile süper çözünürlüklü görüntüleme arasındaki fark açıktır, çünkü Vkg-GFP ve BM'nin hücre içi lokalizasyonu, standart konfokal mikroskopiden daha fazla süper çözünürlüklü kullanıldığında önemli ölçüde daha belirgindir. Ayrıca, konfokal mikroskopi ile çekilen görüntü daha yüksek arka plan floresansına sahiptir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımları kullanılarak elde edilen ve işlenen bir z-yığınının 3D rekonstrüksiyonu. (A-B) Vkg-GFP (yeşil) eksprese eden ve DNA (mavi) ve F-aktin (kırmızı) için boyanmış yumurta odalarının z-yığınlarının (karışık görünüm) 3D oluşturulması. (A) Konfokal mikroskopi ile elde edilen bir z-yığınının 3D oluşturulması. Vkg-GFP içeren bölmelerin ve veziküllerin yeri ve şekli hücrelerin (A') her yerinde görülebilir. (B) Optimum süper çözünürlüklü işleme yoluyla elde edilen bir z-yığınının 3D oluşturulması. Vkg-GFP içeren bölmelerin ve veziküllerin yeri ve şekli görülebilir (B'). Veziküllerin şekli, BM ve çekirdeklerin yanı sıra sorunsuz bir şekilde tanımlanır ve çözünürlük konfokal mikroskopiye kıyasla daha yüksektir (B 've A' ile karşılaştırıldığında). Vkg-GFP içeren bölmelerin ve veziküllerin şekli ve boyutu, süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak daha iyi belirlenebilir (B 've A' ile karşılaştırıldığında). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Crag'daki Vkg-GFP lokalizasyonunun karakterizasyonu FC'leri devirdi. (A-B) Vkg-GFP (yeşil) eksprese eden bir yumurta odasından uzunlamasına kesit, DNA (mavi) ve F-Aktin (kırmızı) için boyanmış ve optimum süper çözünürlüklü işleme ile elde edilmiştir. (A) Uygun BM birikimi için kritik bir protein olan wildtype Crag'ı ifade eden kontrol hattı. FE, tipik BM protein lokalizasyonunu gösterir, burada Vkg-GFP hücre içi olarak dağıtılır ve FE'de (A') bazal olarak biriktirilir. (B) FE'de Crag için RNAi'yi eksprese eden transgenik Drosophila hattı, bir Crag nakavtıyla sonuçlanır. Crag kaybı, BM proteinlerinin (örneğin, Vkg-GFP) apikal olarak FE'de (B', oklar ve ok uçları) yanlış lokalizasyonuna yol açar. Süper çözünürlüklü görüntü, Crag kaybıyla ilişkili BM yanlış lokalizasyon fenotiplerini karakterize etmek için kullanılır. Spesifik olarak, bazı Crag RNAi FC'ler, BM proteinlerinin (B', ok uçları) güçlü bir apikal yanlış lokalizasyonunu gösterirken, diğer Crag RNAi FC'ler daha zayıf bir apikal yanlış lokalizasyon (B', oklar) sunar. Süper çözünürlüklü görüntüleme, Crag kaybıyla ilişkili fenotipleri açıkça ortaya koymaktadır (B', ok uçları ve oklar). Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımları kullanılarak Vkg-GFP ve GM-130'un (Golgi belirteci) kolokalizasyonu. (A-D) Vkg-GFP'yi eksprese eden yumurta odacıklarından uzunlamasına kesitler ve bir cis-Golgi belirteci (GM-130, kırmızı) için immünoboyalı, konfokal (A, B) veya süper çözünürlüklü (C,D) mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. (A,B) Konfokal görüntüleme, hücre içi Vkg-GFP'nin bir cis-Golgi belirteci (A, ok ucu) ile kısmen kolokalize olduğunu göstermektedir. (B) (A)'nın yakınlaştırılmış alanı. Beyaz ok boyunca yeşil (Vkg-GFP) ve kırmızı (GM-130) piksellerin dağılımları histogram (B') içinde çizilir. Histogramın x ekseni ok boyunca olan mesafeyi (μm) temsil ederken, y ekseni piksel yoğunluğunu temsil eder. Çakışan yeşil ve kırmızı zirveler (*) Vkg-GFP ve GM-130'un nerede birlikte lokalize olduğunu gösterir. (C,D) Süper çözünürlüklü görüntüleme ayrıca hücre içi Vkg-GFP'nin bir cis-Golgi belirteci (C, ok ucu) ile kısmen kolokalize olduğunu göstermektedir. (D) (C)'nin yakınlaştırılmış alanı. Beyaz ok boyunca yeşil (Vkg-GFP) ve kırmızı (GM-130) piksellerin dağılımları histogram (D') olarak çizilir. Histogramın x ekseni ok boyunca olan mesafeyi (μm) temsil ederken, y ekseni piksel yoğunluğunu temsil eder. Çakışan yeşil ve kırmızı zirveler (*) Vkg-GFP ve GM-130'un nerede birlikte lokalize olduğunu gösterir. Bu veriler, süper çözünürlüklü görüntülemenin, kolokalizasyonu karakterize etmek ve ölçmek için konfokal görüntülemeden daha verimli ve kesin bir yaklaşım olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Temsili görüntüler için konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi elde etme ve işleme parametreleri. Tüm ana görüntüleme parametreleri, sağlanan temsili görüntüler için derlenir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

BM, embriyonik ve organ morfogenezi ve yetişkin fizyolojik fonksiyonları için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, BM, epitel polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi için bir sinyal platformu görevi görür ve dokulara destek2 sağlar. Bununla birlikte, BM proteinlerinin uygun şekilde yerleştirilmesini düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığına ve polarize sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların daha iyi anlaşılması, bu yolakların bileşenlerinin ve BM işlemedeki rollerinin dikkatli bir analizini gerektirir. Bunu başarmanın bir yolu, konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanmaktır. Burada, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak FE'deki BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve salgılanmasını etkili bir şekilde görüntülemek için Drosophila yumurtalıklarının hazırlanması ve boyanması veya immünoboyaması için yöntemler tanımlanmıştır.

Vahşi tip ve mutant koşullarda BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve salgılanmasını görselleştirmek için protein tuzağının ve endojen olarak etiketlenmiş proteinlerin avantajları
Sağlanan protokol, vahşi tip (kontrol) ve mutant koşullarda FE'deki BM proteinlerinin lokalizasyonunu ve dağılımını görüntülemek ve değerlendirmek için protein tuzaklarından ve endojen olarak etiketlenmiş BM proteinlerinden (örneğin, Vkg-GFP ve Pcan-GFP) tam olarak yararlanır. Bu hatların BM proteinlerine karşı antikorların kullanımına göre önemli avantajları vardır. İlk olarak, ilgilenilen spesifik proteinlere karşı antikorlar genellikle nadirdir ve düşük bolluktadır. Ek olarak, sıklıkla antikorlarla ilişkili doku penetransı ile ilgili sorunlar vardır ve bu da ilgilenilen proteinin yanlış gözlemlenmesine ve değerlendirilmesine yol açabilir. Dahası, protein tuzak çizgileri, (i) gen ekspresyonunu manipüle etme yöntemleri (örneğin, UAS / Gal4), (ii) mutantlar ve (iii) RNA girişim (RNAi) çizgileri gibi BM'nin uygun şekilde birikmesi için gerekli faktörlerin işlevlerini belirlemek için kullanılan farklı genetik arka plana yerleştirilebilir. Son olarak, bu protein tuzakları canlı görüntüleme57 kullanarak BM'nin lokalizasyonunu ve işlevini görselleştirmek için kullanılabilir.

Bununla birlikte, bir floresan etiketinin ilgilenilen bir proteine füzyonu, lokalizasyonuna ve işlevlerine müdahale edebilir. Bu nedenle, etiketin protein üzerindeki anormal etkilerini değerlendirmek çok önemlidir. Bir floresan etiketinin eklenmesinin BM proteinlerinin işlevine ve lokalizasyonuna müdahale etmemesini sağlamanın bir yolu, transgenik Drosophila hattının homozigot canlı olup olmadığını belirlemektir. Burada ve daha önce açıklanan farklı deneylerde kullanılan Vkg-GFP ve Pcan-GFP hatlarının homozigot uygulanabilir olması, GFP etiketinin eklenmesinin bu esansiyel proteinlerin işlevine müdahale etmediğini gösterir29,30.

Görüntüleme için doku hazırlama, fiksasyon ve boyama önemi
FE'yi verimli ve doğru bir şekilde görüntülemek için, yumurtalık dokusunu bu yöntemde belirtildiği gibi düzgün bir şekilde hazırlamak, sabitlemek ve boyamak çok önemlidir. İlk olarak, diseksiyondan sonra, diğer tüm organları dikkatlice çıkarın ve fiksasyondan önce kalıntıları uçurun. Dokuyu düzeltmek için paraformaldehit (PFA) kullanılması önerilir, çünkü parlak GFP floresansına yol açar ve çoğu antikorla uyumludur. Bununla birlikte, PFA tüm antikorlarla uyumlu olmayabilir; bazıları glutaraldehit veya metanol fiksasyonu gerektirebilir. Ayrıca, primer antikorun spesifik olmayan bağlanması nedeniyle arka plan floresansını önlemek için, yumurtalık dokusu, bloke edici çözeltide en az 1 saat boyunca bir fındık platformu rocker üzerinde inkübe edilmeli ve protokolde açıklandığı gibi birincil ve ikincil antikor inkübasyonundan sonra birkaç kez kapsamlı bir şekilde yıkanmalıdır. Son olarak, optimal görüntülemeyi elde etmek için yumurtalık dokusunun uygun şekilde monte edilmesi şarttır. Bu, üst üste istiflenmelerini önlemek için bireysel yumurta odalarının dikkatli bir şekilde ayrılmasını gerektirir. Dokunun kapak kapağının altında kaymasını önlemek için görüntülemeden önce montaj ortamının tamamen polimerize olmasına izin vermek de önemlidir. Bu ayrıca montaj ortamının süper çözünürlüklü görüntüleme için çok önemli olan optimum yansıtıcı indeksine ulaşmasını sağlar. Bunu yapmamak görüntü kalitesini etkileyecektir. Ayrıca, hazırlanan slaytlar, floresan söndürülmeden önce 4 ° C'de 1 aya kadar saklanabilir. Sağlanan protokole ek olarak, yumurtalık diseksiyonu ve boyama53,54,55 için başka protokoller de mevcuttur.

Uygun edinme ve işleme parametrelerinin kullanılması, optimal görüntüleme ve konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak BM proteinlerinin lokalizasyonunu değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
Daha önce açıklandığı gibi, numunenin optimum görüntülerini elde etmek için konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme için elde etme parametrelerinin uygun şekilde ayarlanması çok önemlidir. Görüntü elde etmek için, yatırım getirisi yakınlaştırma işlevi kullanılarak dikkatlice seçilmeli ve ardından çerçeve boyutu ve yakalama hızı en uygun şekilde ayarlanmalıdır. Ayrıca, Şekil 2'de gösterildiği gibi, lazer gücünü ve dedektör kazancını, dedektörleri doyurmadan hücre içi kaçakçılığı görselleştirmek için uygun şekilde ayarlamak çok önemlidir. Bu parametreler, az pozlanmış veya aşırı pozlanmış görüntülerden kaçınmak için çok dikkatli bir şekilde ayarlanmalıdır (Şekil 2). Az pozlanmış görüntüler, hücre içi yapıların görselleştirilmesinin ve karakterize edilmesinin zor olacağı düşük çözünürlüklü görüntülerle sonuçlanacaktır (Şekil 2B). Dedektörün doygunluğu nedeniyle aşırı pozlanmış görüntüler, verilerin yanlış yorumlanmasına ve birlikte lokalizasyon artefaktlarına yol açar (Şekil 2C). Amaç, endojen olarak etiketlenmiş BM proteinlerinin veziküler lokalizasyonunu belirlemekse, bazal BM'deki GFP etiketli proteinlerden (örneğin, Vkg-GFP ve Pcan-GFP) floresan dedektörü hızla doyurur. Bununla birlikte, daha az GFP etiketli BM proteini içeren veziküller loş görünecektir. Bu nedenle, görüntü hassasiyetini BM içeren hücre içi yapıları (örneğin, veziküller) kullanarak ayarlamak önemlidir, BM'de değil (Şekil 2). İğne deliği boyutunu seçmek de çok önemlidir. İdeal olarak, özellikle z eksenindeki çözünürlük önemli olduğunda, en iyi kalitede görüntüler için her kanal için 1 AU'luk bir iğne deliği boyutu seçilmelidir. Daha küçük iğne deliği boyutu, daha ince optik bölümler için idealdir. Bununla birlikte, optimum z ekseni çözünürlüğü gerekmediğinde veya bir z-yığını yakalanmadığında, fotobeyazlatmayı önlemek için iğne deliği boyutu artırılabilir. Ayrıca, çok loş sinyaller için, iğne deliği boyutunun arttırılması, daha yüksek sinyal-gürültü oranı ve daha fazla fotonun yakalanması nedeniyle veri yorumlamaya yardımcı olabilir.

Süper çözünürlüklü görüntüleme için, Şekil 3'te gösterildiği gibi, kötü çözümlenmiş az veya fazla işlenmiş görüntüler oluşturmaktan kaçınmak için dekonvolüsyon işlemine özellikle dikkat edilmelidir. Son olarak, optimum bir 3D rekonstrüksiyon elde etmek için, yazılım tarafından belirlenen en iyi aralığın ayarlanması şiddetle tavsiye edilir. Z-kesitleri arasında çok büyük bir aralık (yani, 0,5 μm'den yüksek) zayıf 3D işlemeye yol açacak ve fenotipin sonraki analizini etkileyecektir.

BM hücre içi kaçakçılığı görüntülerken geleneksel konfokal mikroskopiye göre süper çözünürlüğün avantajı
Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, BM proteinlerinin lokalizasyonu ve dağılımı konfokal görüntüleme kullanılarak doğru bir şekilde değerlendirilebilse de, açıklanan süper çözünürlüklü yaklaşım, BM proteinlerini içeren hücre içi yapıların çözünürlüğünde önemli bir artışın yanı sıra gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı ile daha kesin görüntüleme verileri üretir. Dahası, bu süper çözünürlüklü mikroskopi tekniğinin kullanımı nispeten kolaydır. Süper çözünürlüklü görüntüleme, konfokal mikroskopiye kıyasla çözünürlüğü önemli ölçüde artırdığından, x ve y eksenlerinde 120 nm'ye ve z ekseninde 350 nm'ye kadar, bu yaklaşım, FC'ler gibi epitel hücrelerinde BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu daha doğru bir şekilde karakterize ederek BM'nin polarize birikimi hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde etkileyecektir.

Ayrıca, başka bir süper çözünürlüklü görüntüleme yaklaşımı (Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu, SIM) ve nokta taramalı konfokal mikroskopi için tasarlanmış dekonvolüsyon algoritmalarının kullanımı (yani, Nikon'un gelişmiş çözünürlüklü yazılım modülü), BM biriktirme29'da yer alan faktörlerin rolünü karakterize etmek için daha önce kullanılmıştır. Bu tekniklerle ilişkili artan çözünürlük, BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve BM'nin organizasyonunu anlamamız konusunda önemli bilgiler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar Airyscan mikroskobuna kıyasla bazı sınırlamalar getirmektedir. Örneğin, SIM, dokunun derinliklerinde optik z-kesitleri elde ederken en uygun görüntüleri elde etmede çok verimli değildir. Bu, BM birikiminde yer alan yeni bileşenler taranırken SIM kullanımını zorlaştırır. Ek olarak, konfokal görüntülere uygulanan dekonvolüsyon algoritmalarının kullanımı aynı süper çözünürlük seviyesine ulaşmaz. Genel olarak, sabit doku üzerinde Airyscan süper çözünürlüklü görüntüleme, BM hücre içi kaçakçılığı ve birikimini incelemek için güçlü ve üstün bir yaklaşımdır.

Bununla birlikte, diğer herhangi bir süper çözünürlüklü mikroskopide olduğu gibi, bu yaklaşımla da birkaç rahatsızlık vardır ve görüntüleme sırasında dikkate alınması gerekir. İlk olarak, süper çözünürlük modu genellikle numunenin konfokal moddan daha uzun elde edilmesini gerektirir. Bu nedenle, numunenin fotobeyazlatılmasını en aza indirmek için edinme parametreleri ve ilgilenilen bölge dikkatlice ayarlanmalıdır. Ayrıca, süper çözünürlüklü mikroskopi tarafından oluşturulan görüntü dosyaları, konfokal mikroskopi tarafından oluşturulan dosyalardan çok daha büyüktür ve görüntü işleme ve depolama için özel bilgisayarlara veya sunuculara ihtiyaç duyabilir.

Son olarak, Drosophila oogenezi sırasında BM proteinlerinin canlı görüntülenmesi, BM polaritesinde rol oynayan yeni faktörleri karakterize etmek için kullanılmıştır57. Bununla birlikte, bu yaklaşımın, özellikle BM protein kaçakçılığı sırasında hücre içi yapıların çözünürlüğünde sınırlamaları vardır. Süper çözünürlüklü mikroskopi, BM proteinlerinin polarize birikiminde tanımlanmış faktörlerin rollerini tam olarak belirlemek için canlı görüntüleme ile birlikte kullanılacak güçlü bir yaklaşımdır.

Bu yöntemin endojen olarak etiketlenmiş proteinler ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak veziküler kaçakçılığa adanmış hücre içi bileşenlerin lokalizasyonunu incelemek için diğer uygulamaları
Gelişim sırasında ve yetişkin bir organizmada dokuların ve organların kurulması ve korunması, kısmen hücreden hücreye sinyalleşmeye ve hücresel gerginlik ve yapışmaya dayanır. Bu süreçler hücre içi kaçakçılığa, endositoza, ekzositoza ve spesifik proteinlerin salgılanmasına bağlıdır. Böylece, endojen olarak etiketlenmiş proteinler ve konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak BM'nin hücre içi kaçakçılığını deşifre etmek için burada açıklanan yöntemler, her süreci incelemek için kolayca uyarlanabilir. Dahası, endojen olarak etiketlenmiş proteinler üretmek için CRISPR / Cas9 aracılı genetik düzenlemenin kullanım kolaylığı, bu yaklaşımı daha da çok yönlü ve güçlühale getirir 58.

Sonuç olarak, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak Drosophila yumurtalık FE'sinde BM proteinlerinin hazırlanması ve görüntülenmesi için yöntemler tanımlanmıştır. Bu protokoller, BM proteinlerinin uygun şekilde yerleştirilmesine adanmış yeni bileşenleri tanımlamak için yüksek verimli tarama için uygulanabilir. Son olarak, bu metodolojinin kullanılması, epitel hücrelerinin BM proteinlerinin polarize sekresyonunu nasıl kontrol ettiğini, epitel mimarisinin kurulmasında ve sürdürülmesinde kilit bir süreç olduğunu anlamamıza önemli katkılarda bulunma potansiyeline sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Yazarlar, Julie Merkle'ye el yazması hakkındaki yararlı yorumları için minnettardır. Bu çalışma, O.D.'ye NIH hibe R15GM137236 tarafından desteklenmiştir. Konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüler, NSF MRI hibe 2018748 ile satın alınan Airyscan 2'li bir Zeiss LSM 900 kullanılarak elde edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 phalloidin Invitrogen A22283 F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin Invitrogen A22287 F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody abcam ab30637 For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount Polysciences, Inc. 1860620 Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast) Genesee Scientific 62-103 To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution) Sigma-Aldrich A7284 For blocking solution
Depression wells Electron Microscopy Sciences 7156101 For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle Fisher scientifc 13-820-024
Drosophila Incubator Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) Bloomington Drosophila Stock Center 33594 RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5) Fine Science Tools 11251-30 For dissection
Glass Concavity Slide Electron Microscopy Sciences 7187804 For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 Invitrogen A11036 Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342) Invitrogen H3570 DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes Kimtech Fisher Scientific: 06-666 Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC Leica For ovary imaging
Microscope Slides Corning 294875X25 Microscope Slides
Nutating platform rocker Corning Life Sciences 6720 For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF Genesee Scientific 66-121 Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution Electron Microscopy Sciences Fisher Scientific: 15713 For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher scientific BP2944100 For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant Invitrogen P36980 Mounting Medium
Square Cover Glass Corning 285022 Cover glass for microscope slides
Triton x-100 Sigma-Aldrich 9036-19-5 For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 Zeiss Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope Zeiss Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) Zeiss Image acquisition and processing

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
  2. Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
  3. Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
  4. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  5. Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
  6. Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
  7. Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
  8. Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
  9. Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
  10. Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
  11. Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
  12. Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
  13. Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
  14. Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
  15. Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
  16. Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
  17. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 1-20 (2015).
  18. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
  19. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
  20. Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
  21. Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), Cambridge, England. 3805-3815 (2006).
  22. Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
  23. Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
  24. Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
  25. Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Developmental Biology. 227 (2), 690-705 (2000).
  26. Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
  27. Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
  28. Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
  29. Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
  30. Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
  31. Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
  32. Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
  33. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  34. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetics. 201 (3), 815-842 (2015).
  35. Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetics. 211 (1), 15-34 (2019).
  36. Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
  37. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
  38. Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
  39. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  40. Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
  41. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).
  42. Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
  43. Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
  44. Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
  46. Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, Clifton, N.J. 111-130 (2021).
  47. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  48. Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
  49. Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
  50. He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
  51. Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
  52. Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
  53. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
  54. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  55. Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, Clifton, N.J. 21-28 (2015).
  56. Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
  57. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, Clifton, N.J. 215-226 (2016).
  58. Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetics. 208 (1), 1-18 (2018).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 183 Bodrum zarı Drosophila Yumurtalık Epitel Konfokal mikroskopi Süper çözünürlüklü mikroskopi İnsan ticareti
<em>Drosophila</em> Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal… More

Shah, H. P., Devergne, O. Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis. J. Vis. Exp. (183), e63778, doi:10.3791/63778 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter