Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تحليل التدفق الخلوي للمؤشرات الحيوية للكشف عن العيوب الوظيفية للحيوانات المنوية البشرية

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63790
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Toxicology, College of Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), 2Department of Chemical Defense Medicine, College of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University)

Summary

يوفر البروتوكول الحالي حلا عمليا يسمح بقياس موت الخلايا المبرمج ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا ، وتلف الحمض النووي في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام مقياس خلوي واحد.

Abstract

يستخدم تحليل معلمة السائل المنوي التقليدي على نطاق واسع لتقييم خصوبة الذكور. ومع ذلك ، فقد وجدت الدراسات أن ~ 15 ٪ من مرضى العقم لا يظهرون أي تشوهات في معايير السائل المنوي التقليدية. هناك حاجة إلى تقنيات إضافية لشرح العقم مجهول السبب والكشف عن عيوب الحيوانات المنوية الدقيقة. في الوقت الحالي ، تكشف المؤشرات الحيوية لوظيفة الحيوانات المنوية ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، وتلف الحمض النووي ، عن فسيولوجيا الحيوانات المنوية على المستوى الجزيئي وهي قادرة على التنبؤ بخصوبة الذكور.

باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي (FCM) ، يمكن قياس كل من هذه العلامات بسرعة ودقة ودقة في عينات السائل المنوي البشري ، ولكن تكاليف الوقت تزداد بشكل كبير ويمكن إعاقة النتائج إذا احتاجت جميع المؤشرات الحيوية إلى الاختبار باستخدام مقياس خلوي واحد. في هذا البروتوكول ، بعد الجمع والحضانة الفورية عند 37 درجة مئوية للتسييل ، تم تحليل عينات السائل المنوي بشكل أكبر بحثا عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) / بروبيديوم يوديد (PI). تم تمييز MMP بمسبار 5،5 ′ ، 6،6 ′-رباعي كلورو -1،1 ′ ، 3،3 ′-رباعي إيثيل - بنزيميدازول كاربوسيانين يوديد (JC-1) ، وتم تقييم تلف الحمض النووي باستخدام مقايسة بنية كروماتين الحيوانات المنوية (SCSA) مع تلطيخ برتقال أكريدين (AO). وبالتالي ، يمكن أن يكون تحليل التدفق الخلوي لعلامات وظيفة الحيوانات المنوية مجموعة أدوات عملية وموثوقة لتشخيص العقم وتقييم وظيفة الحيوانات المنوية في كل من المقعد والسرير.

Introduction

أصبح العقم مشكلة صحية عامة ، حيث يساهم العقم عند الذكور بنسبة 40٪ -50٪ من جميع الحالات 1,2. على الرغم من أن تحليل جودة السائل المنوي التقليدي يلعب دورا مهما في تحديد إمكانات خصوبة الذكور ، إلا أن ما يقرب من 15٪ من مرضى العقم لديهم معايير طبيعية للحيوانات المنوية مثل عدد الحيوانات المنوية وحركتها ومورفولوجيا3. علاوة على ذلك ، فإن فحوصات الحيوانات المنوية الروتينية لها قابلية تكرار ضعيفة ، وتوفر معلومات محدودة عن وظيفة الحيوانات المنوية ، ولا يمكنها إعطاء تقييم دقيق لخصوبة الذكور أو تعكس العيوب الدقيقة للحيوانات المنوية. تم تطوير تقنيات متعددة لاختبار وظيفة الحيوانات المنوية ، مثل فحص hemizona (HZA) ، ومقايسة اختراق الحيوانات المنوية ، واختبار التورم تحت التناضح ، واختبار الأجسام المضادة للحيوانات المنوية ، ولكن هذه الطرق تستغرق وقتا طويلا وعرضة للتأثيرات الذاتية للمشغلين. لذلك ، من الضروري تطوير طرق سريعة ودقيقة لتحليل وظائف الحيوانات المنوية.

FCM هي تقنية تحليل سريعة أحادية الخلية تم تطويرها في سبعينيات القرن العشرين ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع في مختلف مجالات بيولوجيا الخلية والطب. FCM هي أداة قوية لتقييم وظيفة الحيوانات المنوية التي تحلل الحيوانات المنوية المسمى بمسبار مضان محدد4. تمر الحيوانات المنوية عبر أشعة الليزر أحادية القناة أو متعددة القنوات ، ويتم إنتاج الضوء المتناثر والتألق المنبعث بواسطة شعاع ليزر. يتضمن الضوء المبعثر الضوء المبعثر الأمامي (FSC) والضوء المبعثر الجانبي (SSC) ، والذي يعكس حجم الخلية المختبرة ودقة الخلية أو البنية الداخلية. يتم جمع هذه الإشارات وعرضها وتحليلها بواسطة نظام الكمبيوتر ، وبالتالي ، يتم قياس سلسلة من الخصائص من الحيوانات المنوية بسرعة وبدقة. لذلك ، فإن FCM هي تقنية سريعة وموضوعية ومتعددة الأبعاد وعالية الإنتاجية اكتسبت اهتماما متزايدا في مجال تحليل الحيوانات المنوية. يمكن لتطبيق FCM تعويض أوجه القصور في الطرق التقليدية ويوفر نهجا جديدا للكشف عن البنية الداخلية للحيوانات المنوية ووظيفتها.

يرتبط موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ارتباطا وثيقا بخصوبة الذكور5. يعد الكشف عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية مؤشرا مهما لتقييم وظيفة الحيوانات المنوية على المستوى الجزيئي. يعرف FCM على نطاق واسع بأنه طريقة موثوقة وحساسة للكشف عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-FITC / PI. المبدأ الأساسي هو أن فوسفاتيديل سيرين (PS) ينتقل من الطبقة الداخلية لغشاء الخلية إلى طبقته الخارجية في المرحلة المبكرة من موت الخلايا المبرمج. Annexin V هو بروتين فوسفوليبيد يعتمد على الكالسيوم2+ (عادة ما يتم تصنيفه بواسطة FITC) وله تقارب كبير مع PS ، وبالتالي ، يكتشف PS المكشوف للسطح الخارجي لغشاء الخلية6. يمكن تمييز النخر وموت الخلايا المبرمج مع تلطيخ Pl. لذلك ، يتم استخدام طريقة التلوين المزدوج Annexin V-FITC / PI على نطاق واسع ، لأنها سريعة وبسيطة وسهلة للكشف عن خلايا الحيوانات المنوية المختلفة لموت الخلايا المبرمج.

يحتوي الحيوان المنوي الناضج للثدييات على ما يقرب من 72-80 ميتوكوندريا7 ، مما يشير إلى سبب بيولوجي للاحتفاظ بالحيوانات المنوية الميتوكوندريا8. تم العثور على الميتوكوندريا المنوية للعب أدوار مهمة في الحفاظ على حركة الحيوانات المنوية والخصوبة9. تعد صبغة JC-1 ، التي يمكن استخدامها كمؤشر ل MMP في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، واحدة من أكثر الفلوروكرومات شيوعا لتقييم نشاط الميتوكوندريا للحيوانات المنوية10. JC-1 هي صبغة كاتيونية تتراكم بشكل محتمل في الميتوكوندريا. يحتوي JC-1 على أقصى انبعاث مضان عند 525 نانومتر (أخضر) ويشكل مجاميع J 11 عند الارتباط بالأغشية ذات الإمكانات العالية (ΔΨm ، 80-100 mV) ، مما يؤدي إلى تحول في انبعاث التألق إلى ~ 590 نانومتر (برتقالي-أحمر). وبالتالي ، يشار إلى إزالة استقطاب الميتوكوندريا المنوية من خلال انخفاض في نسبة شدة التألق الأحمر / الأخضر ، ويمكن استخدام FCM للكشف عن مستويات MMP في عينات السائل المنوي البشري.

تم اختراع منهجية SCSA بواسطة Evenson et al.12 ، ويعتبر اختبارا دقيقا وقابلا للتكرار مع بيانات فريدة ثنائية المعلمات (مضان أحمر مقابل أخضر) على مقياس 1024 × 1024 قناة 13. في الحيوانات المنوية التالفة ، يتم تمييز الحمض النووي والبروتينات المتغيرة في نوى الحيوانات المنوية بواسطة AO ، ويتم قياس كسور شريط الحمض النووي بواسطة مضان أحمر ، بينما تنبعث الخيوط المزدوجة السليمة من مضان أخضر في FCM14. في الوقت الحاضر ، تم تطوير العديد من الطرق لتقدير سلامة الحمض النووي للحيوانات المنوية. ومع ذلك ، على عكس SCSA ، غالبا ما تكون هذه المقايسات كثيفة العمالة وتفتقر إلى القدرة على تشخيص العقم عند الذكور. ترتبط نتائج اختبار SCSA بشكل كبير بحمل الحمض النووي البشري والإجهاض ، وتوفر أدلة دامغة على أن SCSA قد يكون مفيدا في تحليل السائل المنوي البشري ، وقد يكون بمثابة أداة قيمة لأطباء العقم15.

تعكس سلامة الكروماتين و MMP وموت الخلايا المبرمج جوانب مختلفة من وظيفة الحيوانات المنوية ، وبالتالي ، فإن الجمع بين هذه المؤشرات الحيوية قد يوفر نظرة ثاقبة أكثر شمولا لحالة الحيوانات المنوية. يمكن استخدام FCM لإجراء قياسات منفصلة إما لسلامة الكروماتين أو MMP أو موت الخلايا المبرمج في عينات السائل المنوي البشري. على الرغم من أن تكلفة FCM وتكلفة الأصباغ قد حدت من التطبيق الواسع لهذه التقنيات في المختبرات السريرية للصحة الإنجابية ، إلا أن قيمتها لتقدير الخصوبة مقبولة.

ومع ذلك ، نظرا لأن كل تجربة تتطلب معالجة مسبقة لعينات الحيوانات المنوية ، ويجب اختبار جميع العينات المعالجة مسبقا في أقرب وقت ممكن ، فإن القياس المتزامن لجميع المؤشرات الحيوية الثلاثة لعينة باستخدام FCM واحد قد يؤدي إلى وقت انتظار طويل لبعض التجارب ويعيق موثوقية النتائج. وذلك لأن الحيوانات المنوية تتلقى أضرارا إضافية أثناء عملية الانتظار ، إذا لم يتم ترتيب البروتوكول بشكل صحيح مع مراعاة جميع التجارب الثلاث بالكامل. تقدم هذه الورقة بروتوكولا يحقق القياس الطلاقة لجميع المؤشرات الحيوية الثلاثة في قياس خلوي واحد دون المساس بشكل كبير بجودة التجربة الناجمة عن أوقات الانتظار الطويلة.

Protocol

ملاحظة: يتضمن سير العمل للكشف عن المؤشرات الحيوية لتلف وظيفة الحيوانات المنوية عن طريق قياس التدفق الخلوي (1) تحضير الخلايا ، (2) تلطيخ الكواشف الفلورية ، و (3) تحليل التدفق الخلوي وتفسير البيانات (الشكل 1). يتبع البروتوكول إرشادات لجان الأخلاقيات في جامعة الجيش الطبية (1.0 / 2013.4-12).

1. إعداد الخلية

  1. الحصول على عينات السائل المنوي البشري عن طريق الاستمناء في الجرار عينة سريرية بلاستيكية ، ويفضل بعد 3-5 أيام من الامتناع عن ممارسة الجنس.
  2. احتضان عينات السائل المنوي على الفور في حاضنة 37 درجة مئوية وتسييل العينات تماما (حتى 1 ساعة).

2. عد خلايا الحيوانات المنوية باستخدام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA)

  1. امزج عينات السائل المنوي المسال جيدا.
  2. أضف 10 ميكرولتر من السائل المنوي إلى غرفة عد الحيوانات المنوية (انظر جدول المواد).
  3. امسح الشرائح في محلل فئة الحيوانات المنوية (انظر جدول المواد) ، وعد ما لا يقل عن ست مناطق و 400 منوي لتقدير تركيز الحيوانات المنوية.
    ملاحظة: يجب أن تكون عينات السائل المنوي طازجة وليست مجمدة لموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية وتحليل MMP.

3. تلطيخ خلايا الحيوانات المنوية

  1. الكشف عن موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-FITC / PI
    1. أضف 1 × 106 خلايا منوية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
    2. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS).
    3. الطرد المركزي تعليق خلايا الحيوانات المنوية عند 300 × غرام لمدة 7 دقائق وتجاهل المادة الطافية.
    4. إعادة تعليق خلايا الحيوانات المنوية في 200 ميكرولتر من 1x ملزمة عازلة.
    5. أضف 2 ميكرولتر من الملحق الخامس ل FITC و 2 ميكرولتر من PI (انظر جدول المواد).
    6. دوامة الخلايا برفق ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) في الظلام ، ووضعها في مقياس التدفق الخلوي على الفور لتحليلها.
  2. تحليل إمكانات غشاء الميتوكوندريا باستخدام مسبار JC-1
    1. أضف 2 × 106 خلايا منوية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. أعد تعليق تعليق خلية الحيوانات المنوية في 1 مل من محلول العمل JC-1 (انظر جدول المواد).
    3. دوامة بلطف الخلايا واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام.
    4. أجهزة الطرد المركزي التعليق في 600 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف.
    5. اغسل الحبيبات مرتين باستخدام 1 مل من PBS بسرعة 600 × جم لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    6. أعد تعليق خلايا الحيوانات المنوية المصبوغة في 1 مل من PBS في أنابيب مقياس التدفق الخلوي ، وضع الأنابيب في مقياس التدفق الخلوي على الفور للتحليل.
    7. استخدم سيانيد الكربونيل م-كلوروفينيل هيدرازون (CCCP) كعنصر تحكم إيجابي. أعد تعليق خلايا الحيوانات المنوية (كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.2.1) في 1 مل من محلول عمل CCCP (انظر جدول المواد) ، وقم بدامة الخلايا برفق واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي التعليق في 600 × غرام لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف. كرر الخطوات 3.2.2-3.2.6.
  3. فحص بنية كروماتين الحيوانات المنوية
    1. ضع حصة من السائل المنوي الخام المسال (0.25 مل) في أنبوب التبريد ، وقم على الفور بتجميد عينات السائل المنوي في النيتروجين السائل (-196 درجة مئوية) حتى تصبح جاهزة ل SCSA.
    2. قم بإذابة عينات السائل المنوي في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بتخفيفها باستخدام محلول TNE (انظر جدول المواد) إلى تركيز 1-2 × 106 خلايا / مل.
    3. أضف 200 ميكرولتر من العينة المخففة إلى أنبوب اختبار مقياس التدفق الخلوي واخلطها مع 400 ميكرولتر من المحلول الحمضي (انظر جدول المواد) لمدة 30 ثانية.
    4. قم بتلطيخ العينات ب 1.2 مل من محلول تلطيخ AO (انظر جدول المواد) وضعها في مقياس التدفق الخلوي على الفور للتحليل.
    5. استخدم عينة مرجعية كمعيار داخلي لإعداد مقياس التدفق الخلوي والمعايرة. خفف العينة المرجعية بمحلول TNE 4 °C إلى تركيز 1-2 × 106 خلايا / مل. كرر الخطوات 3.3.1-3.3.4.
      ملاحظات: يتم تخزين جميع المحاليل والمخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية. (1) لا ينبغي تخفيف السائل المنوي قبل التجميد السريع. يجب إذابة عينات السائل المنوي الخام وتخفيفها باستخدام المخزن المؤقت TNE في وقت قياسات قياس التدفق الخلوي. (2) بالنسبة لعيادات العقم ، يجب تجميد ~ 0.25 مل من السائل المنوي الخام في مجمد فائق البرودة أو خزان LN2. يمكن بعد ذلك إرسال هذه الحصص المجمدة إلى مختبر تشخيص SCSA على الثلج الجاف أو في الشاحن الجاف LN2. (3) تم استخدام عينة قذف بشرية توضح عدم تجانس سلامة الحمض النووي (على سبيل المثال ، مؤشر تجزئة الحمض النووي بنسبة 15٪ [DFI]) كمرجع قياسي داخلي.

4. إعداد مقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: قبل بدء تشغيل مقياس التدفق الخلوي ، يجب إجراء فحص نظام الجهاز للتحقق من الأداء التحليلي. قم بتشغيل العينات بعد اكتمال جميع الفحوصات واجتيازها.

  1. افتح برنامج مقياس التدفق الخلوي وابدأ تشغيل مقياس الخلايا.
  2. جمع عينة البيانات.
    1. أولا، قم بتحميل عينة تحكم على مقياس التدفق الخلوي، وانقر فوق RUN لبدء جمع البيانات (اضبط الإعدادات إذا لزم الأمر). انتظر حتى تبدأ الأداة في شفط العينة وتقديم معاينة في الوقت الفعلي للأحداث المكتشفة.
      ملاحظة: عينة التحكم: تحكم سلبي (خلايا الحيوانات المنوية غير الملوثة) لموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية. تحكم إيجابي (الخلايا المعالجة ب CCCP) ل MMP ؛ عينة مرجعية ل SCSA.
    2. قم بإنشاء مخططات نقطية لعرض البيانات وحدد معلمات المحور x / y (مثل FSC و SSC) والخطية لتحديد البيانات المعروضة. حدد وطبق بوابة متعددة الأضلاع لتحديد عدد الحيوانات المنوية لتحليلها ، بحيث ترسم الأداة الأحداث المكتشفة في الوقت الفعلي.
    3. تحليل أحداث الحيوانات المنوية داخل المنطقة.
      1. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، قم بتعيين FL1 كمحور x و FL2 كمحور x. لعزل الخلايا الحية أو غير المتجانسة أو الميتة ، انقر فوق البوابة الرباعية واسحبها لتقسيم مجموعات الحيوانات المنوية إلى أربع مجموعات سكانية محددة.
      2. بالنسبة إلى MMP ، قم بتعيين FL1 كمحور x و FL2 كمحور ص. قم بإنشاء بوابة متعددة الأضلاع لتقسيم مجموعات الحيوانات المنوية إلى مجموعتين محددتين.
      3. بالنسبة ل SCSA ، اضبط FL4 كمحور x (مضان أحمر ، 125/1024 قناة قياس التدفق الخلوي) و FL1 كمحور y (مضان أخضر ، 475/1024 قناة قياس التدفق الخلوي). ارسم البوابات بزاوية 45 درجة لاستبعاد إشارات الحطام الخلوي.
    4. قم بتعيين حد تشغيل للإشارة إلى وقت التوقف عن جمع البيانات. احسب ما مجموعه 10000 خلية منوية لكل عينة لتحليل موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية و MMP و SCSA.
    5. اضبط معدل الموائع (بطيء ومتوسط وسريع ، أو معدل الموائع المخصص) ، اعتمادا على أرقام الخلايا.
      ملاحظات: لتحليل SCSA ، لتحديد تركيزات الحيوانات المنوية ، قم بإذابة العينة الخام المجمدة وتشغيلها على FCM. إذا كان معدل التدفق >250 / ثانية ، فقم بتخفيف العينة إلى معدل التدفق الصحيح. قم بقياس جميع العينات بشكل مستقل مرتين ، واحسب القيم المتوسطة. تم اختبار عينة مرجعية عند قياس كل 10-15 عينة لضمان توحيد واستقرار الجهاز من يوم لآخر.
    6. اضبط العتبة للتخلص من الحطام والضوضاء من عينات الخلايا. قم بتطبيق هذه الإعدادات على جميع العينات في التجربة.
    7. إذا لزم الأمر ، اضبط تعويض اللون لتصحيح امتداد التألق.
    8. قم بإرجاع العينات برفق قبل تحميلها على مقياس التدفق الخلوي ، وقم بتسمية العينة ، وقم بتشغيل العينات.
    9. بمجرد تشغيل جميع العينات ، احفظ بيانات العينة كملفات FCS عن طريق إعطائها اسم ملف لمزيد من تحليل البرامج. احفظ قالب العمل الخاص بالتجربة الحالية لاسترداده في عمليات التشغيل المستقبلية (اختياري).

5. تحليل البيانات

  1. استيراد البيانات إلى برنامج تحليل البيانات لمقياس التدفق الخلوي (انظر جدول المواد).
  2. انقر نقرا مزدوجا فوق النموذج الأول في مساحة العمل. انتظر حتى تفتح نافذة الرسم البياني ، والتي تعرض مخططا للأحداث على طول معلمات FSC مقابل SSC. قم بإنشاء بوابة تعزل الحيوانات المنوية المدرجة داخل البوابة ، مما ينتج عنه مجموعة "طفل" من مجموعة الأحداث الأصلية.
  3. انقر نقرا مزدوجا داخل المنطقة المسورة ، وافتح نافذة رسم بياني جديدة تحتوي على أحداث الحيوانات المنوية فقط. اضبط معلمات المحور x و y لتحديد قناة الفلورسنت.
  4. حدد أداة البوابة . انقر داخل المخطط لجعل البوابات تظهر ، بحيث تعزل البوابات التي تم إنشاؤها مجموعات الخلايا المختلفة.
  5. انقر بزر الماوس الأيمن (أو انقر مع الضغط على مفتاح التحكم) فوق أي من الصفوف المميزة، وحدد نسخ التحليل إلى المجموعة. ضع شجرة البوابة على جميع العينات داخل المجموعة.
  6. حفظ جدول البيانات وتصديره.

Representative Results

يوضح الشكل 2 قياس موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-FITC / PI. تم قياس إشارة FITC (التألق الأخضر) في قناة FL1 ، وتم قياس إشارة PI (مضان أحمر) في قناة FL2. في تحليل Annexin V / PI ثنائي المتغير ، حدد صانعو الربع أربعة مجموعات مميزة للحيوانات المنوية. تم التعبير عن النتائج كنسب مئوية للحيوانات المنوية Annexin V- / PI − (خلايا قابلة للحياة أو حية) ، والحيوانات المنوية Annexin V + / PI − (خلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة أو الخلايا المبرمجة) ، والحيوانات المنوية Annexin V + / PI + (الخلايا المبرمج المتأخرة) ، والحيوانات المنوية Annexin V− / PI + (الخلايا الميتة)16,17 (الشكل 2B). كما تم استخدام عنصر تحكم سلبي (خلايا الحيوانات المنوية غير الملوثة) لإعداد التعويض والأرباع (الشكل 2 أ).

يوضح الشكل 3 قياس MMP باستخدام مسبار JC-1 في الحيوانات المنوية البشرية. يتم تقديم MMP٪ كنسبة مضان برتقالي أحمر / (أخضر + برتقالي-أحمر) من خلال تحليل الرسم الخلوي. عادة ما تظهر عينة السائل المنوي ذات النوعية الجيدة مضان برتقالي أحمر مرتفع ومضان أخضر منخفض (الميتوكوندريا النشطة ، الربع العلوي الأيسر) (الشكل 3 أ). على العكس من ذلك ، عادة ما تظهر عينة السائل المنوي ذات الجودة الرديئة مضان برتقالي أحمر منخفض ومضان أخضر مرتفع (الميتوكوندريا غير النشطة ، الربع السفلي الأيمن) ، ربما بسبب اضطراب الميتوكوندريا (الشكل 3 ب).

يوضح الشكل 4 بيانات SCSA13,14. تم الحصول على هذه الصور الخلوية النموذجية SCSA من عينتين فرديتين. جاءت العينة (أ) من رجل خصب والعينة (ب) من رجل مصاب بالعقم. تم إجراء تحليل لبيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج FlowJo. تظهر المخططات الخلوية مصدر كل مكون من مكونات بيانات SCSA. يشير المحور السيني (مضان أحمر مع 1024 تدرجا من التألق الأحمر) إلى الحمض النووي المجزأ. يشير المحور Y (مضان أخضر مع 1024 تدرجا) إلى قابلية تلطيخ الحمض النووي الأصلي. يمثل الخط المنقط عند y = 750 حدود الحيوانات المنوية الطبيعية. فوق هذا الخط من y = 750 توجد منوية تحتوي على كروماتين غير مكثف جزئيا ، والتي تم تحديدها على أنها منوية غير ناضجة.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل للكشف عن المؤشرات الحيوية لتلف وظيفة الحيوانات المنوية عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم الحصول على عينات السائل المنوي ومعالجتها مسبقا كما هو موضح في البروتوكول الخطوة 1. (1) تحضير الخلية ، (2) تلطيخ الكواشف الفلورية ، و (3) تحليل التدفق الخلوي وتفسير البيانات. الاختصارات: MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا. SCSA = فحص بنية كروماتين الحيوانات المنوية ؛ PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات ؛ AO = برتقال أكريدين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية لموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية باستخدام تلطيخ Annexin V-FITC / PI. يحتوي الربع السفلي الأيسر على الحيوانات المنوية Annexin V- / PI− (خلايا قابلة للحياة أو حية) ، ويظهر الربع الأيمن السفلي الحيوانات المنوية Annexin V + / PI− (خلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة أو الخلايا المبرمجة) ، ويمثل الربع الأيمن العلوي الحيوانات المنوية Annexin V + / PI + (خلايا موت الخلايا المبرمج المتأخرة) ، ويحتوي الربع الأيسر العلوي على الحيوانات المنوية Annexin V− / PI + (الخلايا الميتة). (أ) السيطرة السلبية (خلايا الحيوانات المنوية غير الملوثة)؛ ب: عينة بها موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية. الاختصارات: FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. PI = يوديد البروبيديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: قياس جهد غشاء الميتوكوندريا باستخدام مسبار JC-1. أ: الحيوانات المنوية ذات الكثافة العالية للتفاعل المتعدد. ب: الحيوانات المنوية الفرعية ذات الكثافة المختلطة منخفضة التنس. اضبط FL1-A و FL2-A كمحور x (مضان أخضر) والمحور y (مضان برتقالي-أحمر) ، على التوالي. الاختصارات: MMP = إمكانات غشاء الميتوكوندريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الكشف عن تلف الحمض النووي (DNA) في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام مقايسة تركيب كروماتين الحيوانات المنوية. أ: عينة من السائل المنوي ذات بنية كروماتين طبيعية. ب: عينة من السائل المنوي تحتوي على نسبة عالية من الحيوانات المنوية ذات بنية كروماتين غير طبيعية. تم استخدام برنامج FlowJo لإنشاء بوابات كمبيوتر حول مجموعات الخلايا التي تم تحديدها على النحو التالي: 1) الحيوانات المنوية الطبيعية ، 2) الحيوانات المنوية HDS ، 3) الحيوانات المنوية DFI ، و 4) حطام الخلايا ، وتم حساب النسب المئوية للحيوانات المنوية HDS و DFI. اختصار: SCSA = فحص بنية كروماتين الحيوانات المنوية ؛ HDS = قابلية عالية لتلطيخ الحمض النووي ؛ DFI = مؤشر تجزئة الحمض النووي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم العثور على سلامة الكروماتين ، MMP ، وموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية البشرية لتكون منبئات قيمة للنتائج الإنجابية. كما سلط أحدث دليل مختبري صادر عن منظمة الصحة العالمية لفحص ومعالجة السائل المنوي البشري (الطبعة السادسة) الضوء على بعض هذه المؤشرات (سلامة الكروماتين وموت الخلايا المبرمج) كفحوصات موسعة تتجاوز الفحص الأساسي للبارامترات الروتينية مثل عدد الحيوانات المنوية18. وتشير المنشورات الأخيرة أيضا إلى أن هذه المؤشرات قد تكون علامات أكثر حساسية للاستجابة للتعرضات الخطرة الخارجية، مما يشير إلى قدرتها على تحديد الضرر التناسلي في مرحلة مبكرة19،20. قد يوفر الجمع بين هذه المؤشرات والفحوصات الروتينية أيضا فهما أكثر شمولا حول ملف ضعف الحيوانات المنوية وتعقيد الضرر التناسلي للذكور لدى السكان.

هناك العديد من القضايا الرئيسية التي تحدد بشكل كبير نجاح تحليل الحيوانات المنوية مع FCM. أولا ، يتطلب قياس الحيوانات المنوية MMP وموت الخلايا المبرمج فحصا فوريا بعد تسييل السائل المنوي. لتقليل تكلفة الوقت ، يمكن لفنيين أن يتوليا بشكل منفصل مسؤولية المعالجة المسبقة ل MMP وتحليل موت الخلايا المبرمج للعينة. نظرا لأن المعالجة المسبقة لموت الخلايا المبرمج أبسط ، فإنها ستنتقل إلى خطوة قياس التدفق الخلوي بشكل أسرع من تحليل MMP. بالنسبة لتحليل SCSA ، يجب حفظ عينات السائل المنوي الطازجة بالتبريد فور توفرها بعد التسييل. يمكن بعد ذلك تخزين عينات الحيوانات المنوية في النيتروجين السائل لفترة طويلة نسبيا ولا تحتاج إلى فحص فوري.

وفقا لذلك ، يمكن ضغط التكلفة الزمنية للتجربة في الموقع إلى 40 دقيقة ، وهي مدة تحليل MMP بالإضافة إلى خطوة التدفق الخلوي لتحليل الحيوانات المنوية. ثانيا ، يجب تحديد إعداد البوابة في منصة القياس الخلوي للتدفق لكل دفعة من العينات بشكل منفصل. يمكن اختيار عينات الحيوانات المنوية ذات المجموعات الفرعية للخلايا الصافية في مخطط التشتت كمرجع لرسم منطقة البوابة. ثالثا ، نظرا لعدم وجود قيم مرجعية سريرية مقبولة على نطاق واسع لمؤشرات هذه التجربة ، يمكن استخدام النتائج التاريخية كأداة مهمة لمراقبة الجودة. كما يتم تشجيع ضبط الضوابط الإيجابية والسلبية في كل دفعة من القياسات ، خاصة بالنسبة ل SCSA و MMP.

النتائج التمثيلية لتحليل الحيوانات المنوية المقدمة هنا مشتقة باستخدام Accuri C6. ومع ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية على منصات تجارية أخرى مع تعديل طفيف. عادة ، ستكون هناك حاجة إلى ما مجموعه 5 × 106 خلايا منوية لتلبية متطلبات قياس جميع المؤشرات. إذا كان تركيز الحيوانات المنوية للعينة أقل بكثير من المستوى المتوسط ، فستزداد الحاجة إلى حجم السائل المنوي.

على غرار المعلمات الروتينية للحيوانات المنوية ، هناك أيضا اختلاف ملحوظ داخل الفرد في سلامة الكروماتين ، MMP ، وموت الخلايا المبرمج للحيوانات المنويةالبشرية 21. وفقا لذلك ، قد توفر الاختبارات المتعددة للعينات التي تم جمعها في أوقات مختلفة تقديرا أكثر دقة لمستوى تلف وظيفة الحيوانات المنوية. على الرغم من عدم وجود فترة موصى بها للامتناع عن ممارسة الجنس قبل أخذ عينات من الحيوانات المنوية لتحليل التدفق الخلوي ، يمكن اعتماد 2-7 أيام من الامتناع عن القذف ، التي اقترحتها منظمة الصحة العالمية للتحليل الروتيني للحيوانات المنوية. وقد يساعد ذلك على تحسين إمكانية مقارنة النتائج بين المختبرات وبين العينات المختلفة التي جمعت من نفس الرجال.

أحد القيود الرئيسية لهذه الطريقة هو أن اثنين من المؤشرات الحيوية الثلاثة التي تم اختبارها - موت الخلايا المبرمج وإمكانية غشاء الميتوكوندريا - تتطلب عينات جديدة من السائل المنوي. هذا قد يحد من تطبيقها على الرجال الذين يمكنهم تقديم عينات السائل المنوي إلى المختبر. لاختبار تلف الحمض النووي (SCSA) ، يجب تحضير عينات مرجعية قبل التجربة لمعايرة مقياس التدفق الخلوي. وتجدر الإشارة إلى أن تطبيق البروتوكول الحالي يتطلب أداة FCM في المختبر ، والتي لا تزال تمثل تحديا كبيرا للعديد من المختبرات السريرية ، على الرغم من أن التعاون مع خدمة طرف ثالث قد يكون خيارا بديلا في بعض المناطق.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن حساب الأصباغ والكواشف الأخرى هو أيضا عامل مالي للذكور الذين قد يحتاجون إلى الفحص. أخيرا ، قد يحتاج البروتوكول إلى تعديل إذا تم استخدام علامات تجارية أو إصدارات مختلفة من FCM لفحص المؤشرات الحيوية. باختصار ، تقدم هذه الورقة نهجا عمليا لتقدير ثلاثة مؤشرات حيوية لتلف الحيوانات المنوية البشرية بواسطة آلة قياس خلوي أحادية التدفق. قد يوفر هذا معلومات قيمة حول الصحة الإنجابية للذكور ويكمل الفحص الروتيني للحيوانات المنوية.

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر جميع العاملين الميدانيين على مساعدتهم والأشخاص الذين تمت مقابلتهم على تعاونهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M citric acid buffer Sigma-Aldrich Chemical Co., USA 251275-5G Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C.
0.2 M Na2PO4 buffer Sigma-Aldrich Chemical Co., USA V900061-500G Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C.
10 mM CCCP stock solution Sigma-Aldrich Chemical Co., USA C2759 Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C.
10 µM CCCP working solution Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM.
1 mM JC-1 stock solution Sigma-Aldrich Chemical Co., USA T4069 JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL  aliquot and store at −20 °C.
37 °C incubator Thermo Scientific, USA
5 µM JC-1 working solution Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly.
Accuri C6 Flow cytometer BD Pharmingen, San Diego, CA, United States
Acid solution, pH 1.2 Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl.
Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL Polysciences, Inc, Warrington, Pa 65-61-2 Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL.
AO staining solution (working solution) Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer.
Biological safety hood Airtech, USA
Computer-aided sperm analysis system (CASA ) Microptic, Barcelona, Spain Sperm Class Analyzer 5.3.00
Sperm Counting Chamber Goldcyto, Spain
Equipments
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD Biosciences, San Jose, CA 556547 Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze.
FlowJo 10 Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA
Horizontal centrifuge Thermo Scientific, USA
liquid nitrogen tank Thermolyne, USA
Materials
PBS Beyotime, Shanghai, China C0221A Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature
Staining buffer, pH 6.0 Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution.
The reference sample for SCSA analysis The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels.
TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4).
TNE buffer, 10x, pH 7.4 Perfemiker, Shanghai, China PM11733 Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
  2. Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
  3. Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
  4. Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
  5. Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
  6. Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
  7. Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
  8. Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
  9. Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
  10. Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
  11. Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
  12. Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
  13. Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
  14. Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, Clifton, N.J. 147-164 (2013).
  15. Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
  16. Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
  17. Zhang, H. -B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
  18. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022).
  19. Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
  20. Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
  21. Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).

Tags

قياس التدفق الخلوي ، المؤشرات الحيوية ، العيوب الوظيفية للحيوانات المنوية ، معلمات السائل المنوي التقليدية ، العقم مجهول السبب ، موت الخلايا المبرمج للحيوانات المنوية ، إمكانات غشاء الميتوكوندريا (MMP) ، تلف الحمض النووي ، تقنيات FCM ، ملحق V-fluorescein Isothiocyanate (FITC) / تلطيخ بروبيديوم يوديد (PI) ، 5،5 و 8242 ؛ ، 6،6 و 8242 ؛ -رباعي كلورو -1،1 و 8242 ؛ ، 3،3 و 8242 ؛ -رباعي إيثيل - بنزيميدازول كاربوسيانين يوديد (JC-1) مسبار ، مقايسة بنية كروماتين الحيوانات المنوية (SCSA) ، تلطيخ أكريدين أورانج (AO)
تحليل التدفق الخلوي للمؤشرات الحيوية للكشف عن العيوب الوظيفية للحيوانات المنوية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ling, X., Zou, P., Ao, L., Zhou, N., … More

Ling, X., Zou, P., Ao, L., Zhou, N., Wang, X., Sun, L., Yang, H., Liu, J., Cao, J., Chen, Q. Flow Cytometric Analysis of Biomarkers for Detecting Human Sperm Functional Defects. J. Vis. Exp. (182), e63790, doi:10.3791/63790 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter