Summary
La dispersión dinámica de la luz (DLS) se ha convertido en un ensayo adecuado para evaluar el tamaño de partícula y la distribución de los complejos hierro-carbohidratos administrados por vía intravenosa. Sin embargo, los protocolos carecen de estandarización y necesitan ser modificados para cada complejo hierro-carbohidratos analizado. El presente protocolo describe la aplicación y las consideraciones especiales para el análisis de la sacarosa de hierro.
Abstract
Los complejos de nanopartículas de hierro-carbohidratos administrados por vía intravenosa se usan ampliamente para tratar la deficiencia de hierro. Esta clase incluye varios complejos de nanopartículas estructuralmente heterogéneos, que exhiben una sensibilidad variable a las condiciones requeridas para las metodologías disponibles para caracterizar fisicoquímicamente estos agentes. Actualmente, los atributos críticos de calidad de los complejos hierro-carbohidratos no se han establecido completamente. La dispersión dinámica de luz (DLS) se ha convertido en un método fundamental para determinar el tamaño y la distribución de partículas intactas. Sin embargo, aún quedan desafíos con respecto a la estandarización de las metodologías en todos los laboratorios, las modificaciones específicas requeridas para productos individuales de hierro y carbohidratos y cómo se puede describir mejor la distribución del tamaño. Es importante destacar que el diluyente y las diluciones en serie utilizadas deben estandarizarse. La amplia varianza en los enfoques para la preparación de muestras y el informe de datos limita el uso de DLS para la comparación de agentes de carbohidratos de hierro. Aquí, detallamos un protocolo robusto y fácilmente reproducible para medir el tamaño y la distribución del tamaño del complejo hierro-carbohidratos, sacarosa de hierro, utilizando el promedio Z y el índice de polidispersidad.
Introduction
La sacarosa de hierro (IS) es una solución coloidal compuesta de nanopartículas que consiste en un complejo de un núcleo polinuclear de hierro-oxihidróxido y sacarosa. El IS se emplea ampliamente para tratar la deficiencia de hierro entre pacientes con una amplia variedad de estados de enfermedad subyacente que no toleran la suplementación oral de hierro o para quienes el hierro oral no es efectivo1. IS pertenece a la clase de medicamentos complejos según lo definido por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), que es una clase de medicamentos con química compleja acorde con productos biológicos2. La evaluación regulatoria de medicamentos complejos puede requerir métodos fisicoquímicos ortogonales adicionales y/o estudios preclínicos o clínicos para comparar con precisión los fármacos complejos de seguimiento 3,4. Esto es importante porque varios estudios han informado que el uso de IS versus un producto de SI de seguimiento no produce los mismos resultados clínicos. Esto subraya la criticidad del uso de técnicas de caracterización novedosas y ortogonales que son adecuadas para detectar diferencias en las propiedades fisicoquímicas entre los productos de IS 5,6.
La elucidación precisa del tamaño y la distribución del tamaño del SI es de importancia clínica, ya que el tamaño de las partículas es un factor influyente importante en la tasa y el alcance de la opsonización, el primer paso crítico en la biodistribución de estos fármacos complejos 7,8. Incluso ligeras variaciones en el tamaño de partícula y la distribución del tamaño de partícula se han relacionado con cambios en el perfil farmacocinético de complejos de nanopartículas de óxido de hierro 9,10. Un estudio reciente de Brandis et al. mostró que el tamaño de partícula medido por DLS fue significativamente diferente (14,9 nm ± 0,1 nm vs. 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) al comparar un fármaco listado de referencia y un producto genérico de gluconato férrico de sodio, respectivamente11. La calidad, seguridad y eficacia consistentes de lote a lote de los productos de carbohidratos de hierro dependen completamente de la ampliación del proceso de fabricación, y la posible deriva de fabricación debe considerarse cuidadosamente9. El proceso de fabricación puede resultar en sacarosa residual, y esto variará según el fabricante12. Cualquier modificación en las variables del proceso de fabricación puede conducir a cambios significativos en el producto farmacéutico complejo final con respecto a la estructura, estabilidad compleja y disposición in vivo 9.
Para evaluar la consistencia del fármaco y predecir el comportamiento in vivo del fármaco, se requieren metodologías analíticas ortogonales contemporáneas para determinar las propiedades fisicoquímicas de las nanomedicinas complejas. Sin embargo, hay una falta de estandarización de las metodologías, lo que puede resultar en un alto grado de variación interlaboratorio en el reporte de resultados13. A pesar del reconocimiento de estos desafíos por parte de las autoridades reguladoras mundiales y la comunidad científica14, la mayoría de las características fisicoquímicas de los SI siguen estando mal definidas, y no se ha definido el complemento completo de atributos críticos de calidad en el contexto de los documentos de orientación regulatoria disponibles15. Los borradores de los documentos de orientación específicos del producto emitidos por la FDA para complejos hierro-carbohidratos sugieren DLS como un procedimiento para evaluar el tamaño y la distribución de tamaño de los productos de continuación16,17.
Varias publicaciones han detallado protocolos DLS establecidos para determinar las dimensiones de las nanopartículas IS13,18. Sin embargo, debido a que la preparación de la muestra, las condiciones del procedimiento, la instrumentación y los parámetros de configuración de la instrumentación son diferentes entre los métodos publicados, los resultados de DLS no pueden compararse directamente en ausencia de un método estandarizado para interpretar los resultados13,18. La diversidad en las metodologías y los enfoques de presentación de datos limitan la evaluación adecuada de estas características con fines comparativos19. Es importante destacar que muchos de los protocolos DLS publicados anteriormente para evaluar el IS no tienen en cuenta el efecto de la difusión de sacarosa en la suspensión debido a la presencia de sacarosa libre, que ha demostrado elevar falsamente los radios hidrodinámicos calculados por el promedio Z de las nanopartículas en soluciones coloidales13,18. El presente protocolo tiene como objetivo estandarizar la metodología para la medición del tamaño de partícula y la distribución del SI. El método ha sido desarrollado y validado para este propósito.
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Protocol
1. Funcionamiento de la máquina
- Puesta en marcha de la máquina y el software
NOTA: La figura suplementaria S1A-D describe los pasos para poner en marcha el equipo y el software.- Encienda el instrumento al menos 30 minutos antes de comenzar las mediciones y luego inicie la PC.
- Haga doble clic en el icono del software del instrumento para iniciar el programa.
- Introduzca el nombre de usuario y la contraseña en la ventana de inicio de sesión. Asegúrese de que cada usuario tenga su propia cuenta.
- Espere a que las tres barras negras en la esquina inferior derecha se iluminen en verde, lo que indica que la unidad está lista para funcionar.
- En el caso de largos períodos de inactividad, cuando el usuario cierre la sesión automáticamente, en Seguridad, haga clic en Iniciar sesión y vuelva a ingresar la contraseña.
- Creación de un archivo de medición
NOTA: Se crea un nuevo archivo de medición al comienzo de cada día de medición. Todas las mediciones se enumeran y almacenan en el archivo de medición. Para obtener más información sobre este procedimiento, consulte la figura suplementaria S2A-B.- Cree un nuevo archivo de medición haciendo clic en Archivo | Nuevo | Archivo de medición. En la nueva ventana, seleccione la ubicación de almacenamiento y asigne un nombre al archivo de medición. Confirme los detalles haciendo clic en Guardar.
- Para abrir un archivo, haga clic en Archivo | Abrir | Archivo de medición. Seleccione el archivo de medición en la ventana abierta, confirme los detalles haciendo clic en Abrir, seleccione el nombre del archivo y haga clic en Guardar.
- Impresión de los resultados
- Imprima o guarde los resultados de la prueba de idoneidad del sistema (SST) (consulte el paso 1.5) y el valor medio de la medición de la muestra de acuerdo con la figura suplementaria S3.
- Marque las mediciones en la vista Registros del archivo de medición.
- Haga clic derecho en Impresión por lotes y espere a que se abra otra pequeña ventana.
- Seleccione el informe de intensidad de PSD de las opciones y confírmelo haciendo clic en Aceptar.
- Procedimiento general para iniciar una medición
NOTA: El procedimiento para iniciar una medición se describe en la figura suplementaria S4A-D. Siga la ruta descrita a continuación para el archivo de parámetros de unidad requerido (denominado SOP):- Seleccione el POE requerido de la lista desplegable. Dado que los SOP utilizados más recientemente se muestran en la lista, si se necesita un SOP anterior, seleccione Buscar SOP y confirme haciendo clic en la flecha verde. Una vez que se abra la ubicación de almacenamiento de los SOP, continúe con el paso 1.4.2.
NOTA: Para obtener detalles de los parámetros importantes del sistema específicos para la sacarosa de hierro (por ejemplo, el tiempo de equilibrio de un atenuador), consulte la Tabla 1. - En la nueva ventana, realice las entradas necesarias en Nombre de muestra y Notas. Confirme haciendo clic en Aceptar y espere a que la ventana de medición se abra automáticamente.
- Inicie la medición haciendo clic en el botón verde Inicio .
- Una vez que suene una señal acústica al final de la medición, cierre la ventana de medición .
- Seleccione el POE requerido de la lista desplegable. Dado que los SOP utilizados más recientemente se muestran en la lista, si se necesita un SOP anterior, seleccione Buscar SOP y confirme haciendo clic en la flecha verde. Una vez que se abra la ubicación de almacenamiento de los SOP, continúe con el paso 1.4.2.
- Medición de la prueba de idoneidad del sistema (SST)
NOTA: No toque la parte inferior de la cubeta (zona de medición). Al principio y al final de la secuencia, mida el estándar de partículas de 20 nm.- Llene ~1 ml del estándar de partículas sin diluir en una cubeta de poliestireno y cierre con la tapa.
NOTA: El patrón diluido preparado en el paso 1.5.1 se puede utilizar durante 1 mes. - Después de llenar, cierre la cubeta y verifique si hay burbujas de aire. Retire las burbujas de aire golpeando ligeramente la cubeta.
- Coloque la cubeta en el soporte de la celda del instrumento con la marca de flecha hacia adelante y cierre la tapa de la cámara de medición.
- Cargue el POE del parámetro de unidad e introduzca los siguientes datos en la ventana de inicio:
Nombre de la muestra: SST 20 nm Particle Standard
Luego, agregue una nota: Número de identificador y fecha de vencimiento del estándar - Inicie la medición.
- Después del final de la medición, cuando suene la señal acústica, cierre la ventana de medición.
- Imprimir el informe (véase el punto 1.1.3).
NOTA: El SST se pasa si el tamaño de partícula Z-promedio corresponde al valor del certificado de análisis ± 10%.
- Llene ~1 ml del estándar de partículas sin diluir en una cubeta de poliestireno y cierre con la tapa.
- Medición de la solución de sacarosa de hierro
- Pipetear 0,5 ml de una solución de IS con un contenido de hierro del 2 % m/V en un matraz aforado de 25 ml y llenar hasta la marca con agua con bajas partículas (por ejemplo, recién desionizada y filtrada [tamaño de poro 0,2 μm]); esta solución contiene 0,4 mg Fe/ml.
NOTA: La preparación de la muestra en el paso 1.6.1. Con esta dilución específica se estableció durante el desarrollo del método, y esto se determinó como la dilución óptima para este propósito. - Para la limpieza preliminar, llene la cubeta de poliestireno aproximadamente 3/4 de su capacidad con la solución dosificadora preparada, agite suavemente y luego vacíe lo más completamente posible.
NOTA: No toque la parte inferior de la cubeta (zona de medición), y evite las burbujas de aire al no agitar la cubeta. - Para la medición, pipetear 1 ml de la solución dosificadora en la cubeta y colocar una tapa.
- Compruebe la solución dosificadora en la cubeta para ver si hay burbujas de aire. Si hay burbujas de aire, retírelas golpeando ligeramente la cubeta.
- Pipetear 0,5 ml de una solución de IS con un contenido de hierro del 2 % m/V en un matraz aforado de 25 ml y llenar hasta la marca con agua con bajas partículas (por ejemplo, recién desionizada y filtrada [tamaño de poro 0,2 μm]); esta solución contiene 0,4 mg Fe/ml.
- Realización de la medición
- Coloque la cubeta de plástico con la solución dosificadora en el dispositivo con la marca de flecha hacia adelante y cierre la tapa.
- Cargue el parámetro SOP (consulte el paso 1.4.1) e introduzca los siguientes datos en la ventana de inicio:
Nombre de la muestra: Número de lote - Inicie la medición.
- Después del final de la medición, cuando suene la señal acústica, cierre la ventana de medición .
- Calcule el valor medio de las seis mediciones individuales de acuerdo con la figura suplementaria S5. Marque las mediciones individuales en la vista Registros del archivo de medición, haga clic con el botón derecho en Crear resultado promedio, agregue el nombre del valor medio en Nombre de muestra y confirme haciendo clic en Aceptar.
- Espere a que el software cree un nuevo registro al final de la lista y busque el nombre ingresado y el resultado promedio en ese registro.
- Imprima el informe (consulte el paso 1.1.3).
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Representative Results
El método descrito fue validado de acuerdo con ICH Q2(R1)20, que implicó la medición de soluciones de prueba en condiciones variables. La precisión fue de solo 0.5% RSD para el tamaño promedio Z, mientras que se calculó un máximo de 3.5% RSD para el PDI. Los resultados medios de diferentes analistas y días solo difirieron en un 0,4% para el tamaño promedio Z y un 1,5% para el PDI. Las estadísticas se calcularon a partir de 12 mediciones realizadas por dos analistas en días variables. Ni los cambios en la concentración de prueba en el rango de 50%-200% ni el almacenamiento de las soluciones de prueba durante un máximo de 5 días en condiciones refrigeradas tuvieron un impacto en el resultado final.
Parámetros analizados
Tamaño medio Z
El diámetro hidrodinámico se da como el tamaño de partícula promedio Z, y el método para determinarlo se define en ISO 22412: 201717. El tamaño promedio Z es un parámetro también conocido como la media acumulante. El promedio Z es el parámetro de tamaño DLS preferido, ya que el cálculo del promedio Z es matemáticamente estable y el resultado promedio Z es insensible al ruido. Según la EMA y la FDA, el tamaño promedio Z junto con el PDI son los valores recomendados para la caracterización de nanomedicinas15,16,21. El tamaño de partícula promedio Z solo es comparable con el tamaño medido por otras técnicas si la muestra es monomodal, esférica o de forma casi esférica, es monodispersa y se prepara en un dispersante adecuado. Esto se debe a que el tamaño medio de partícula promedio Z es sensible incluso a pequeños cambios en la preparación de la muestra. El tamaño de partícula promedio Z es un parámetro hidrodinámico y, por lo tanto, solo es válido para partículas en dispersión o para moléculas en solución.
Índice de polidispersidad
Este índice es un número calculado a partir de un simple ajuste de dos parámetros a los datos de correlación (el análisis acumulativo). El índice de polidispersidad es adimensional y escalado de tal manera que los valores inferiores a 0,05 rara vez se ven, excepto en estándares altamente monodispersos. Los valores superiores a 0,7 indican que la muestra tiene una distribución de tamaño de partícula muy amplia y es probable que no sea adecuada para la técnica DLS. Varios algoritmos de distribución de tamaño pueden funcionar con datos que se encuentran entre estos dos extremos. Los cálculos para estos parámetros se definen en el documento de la norma ISO 22412:201717.
Distribución de tamaños por intensidad/volumen/número
Los gráficos típicos de distribución de tamaño (intensidad, volumen, número) se representan en la Figura 1. Los gráficos de resultados muestran seis muestras preparadas independientemente de 605211 por lotes de IS a una concentración de 0,4 mg Fe/ml. Para la visualización en la Figura 1, los datos brutos tomados del software DLS se trazaron con software estadístico sin más modificaciones9. Una distribución de tamaño por intensidad impactada por un segundo pico se proporciona como ejemplo de un mal resultado en la Figura 1A. La figura 2 muestra datos de baja calidad que muestran una señal adicional a 5.000 nm.
Figura 1: Distribución por tamaños . (A) intensidad, (B) volumen, y (C) número13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Datos representativos de mala calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La solución de prueba del lote IS 0371022A (0,4 mg Fe/ml), que se almacenó durante 5 días a temperatura ambiente, mostró una señal adicional a ~5.000 nm, que es indicativa de algunas partículas adicionales (por ejemplo, polvo o precipitación). En consecuencia, el PDI originalmente determinado en 0.130 se cambió a 0.184, mientras que el promedio Z todavía estaba cerca del valor original (es decir, 11.33) a 11.99 nm (datos no publicados).
La precisión fue probada por dos técnicos de laboratorio en días separados. El valor medio de 12 réplicas fue de 11,32 nm con una DSR de 0,4% y de 0,125 con una DSR de 1,5% para la media Z y la PDI, respectivamente, para los dos técnicos. Se cumplieron los criterios de aceptación (NMT 5% para el promedio Z, NMT 20% para el PDI) (datos no publicados).
Comparación de parámetros analizables
Además de calcular los parámetros básicos, el promedio Z y la polidispersidad, el software del dispositivo DLS también permite el cálculo de distribuciones de tamaño que se pueden ponderar de acuerdo con la intensidad de la señal del detector o el volumen (o número) de partículas de dispersión. La relevancia de comparar estos parámetros es obvia en los resultados descritos en la Tabla 2. Si bien la distribución de tamaños por número difería hasta en un factor de 2 del promedio Z basado en la intensidad propuesto, solo se calcularon valores ligeramente más bajos mediante la distribución de tamaños por volumen. Cabe señalar, sin embargo, que el informe de resultados basado en la intensidad puede ser inexacto si las soluciones complejas hierro-carbohidratos contienen partículas o agregados más grandes13.
Tabla 1: Parámetros del sistema para el DLS. Abreviaturas: RI = índice de refracción; DLS = dispersión dinámica de la luz13. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Ejemplos de cómo la determinación del tamaño de partícula por IS se ve afectada por el enfoque de presentación de datos. Esta tabla está adaptada de Di Francesco y Borchard13. Abreviaturas: SD = desviación estándar; DSR = desviación típica relativa; PDI = índice de polidispersidad; IS = hierro-sacarosa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura suplementaria S1: Pasos de funcionamiento del sistema. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S2: Creación de un archivo de medición. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S3: Prueba de idoneidad del sistema. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria S4: Inicio de una nueva medición. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria S5: Cálculo de medidas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
DLS se ha convertido en un ensayo fundamental para la determinación del tamaño y la distribución de tamaño de las nanopartículas para aplicaciones en el desarrollo de fármacos y la evaluación regulatoria. A pesar de los avances en las técnicas de DLS, todavía existen desafíos metodológicos con respecto a la selección de diluyentes y la preparación de muestras, que son especialmente relevantes para los complejos de hierro y carbohidratos en soluciones coloidales. Es importante destacar que los métodos de DLS para nanomedicinas de hierro y carbohidratos aún no se han estudiado ampliamente en el medio biológico (por ejemplo, el plasma)22. Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad crítica de armonizar los protocolos de mejores prácticas en función de la selección del diluyente. La selección del diluyente es importante, ya que el uso de agua purificada versus soluciones salinas isotónicas puede afectar la estabilidad de la suspensión coloidal16.
También se debe tener en cuenta que los complejos de hierro y carbohidratos no deben diluirse por debajo de las recomendaciones de información de prescripción en un esfuerzo por mitigar los desafíos de tener una solución oscura y opaca. Las diluciones excesivas no son biorelevantes y pueden afectar la estabilidad de la suspensión coloidal a través de cambios en el blindaje iónico, lo que puede conducir a una posible precipitación e informes de resultados inexactos. Se probaron varias diluciones y diluyentes (datos no publicados) durante el desarrollo de este método, y la preparación de la muestra descrita en el paso 1.6.1 del protocolo se determinó y validó como la dilución óptima para el SI. Se deben considerar varias modificaciones para el análisis DLS de complejos hierro-carbohidratos. Por ejemplo, la preparación de soluciones de prueba debe realizarse en ausencia de cualquier tipo de agitación a alta velocidad. Se debe evitar el uso de mezcladores de vórtice, ya que esto induce la creación de agregados de hierro y sacarosa. Para la preparación de soluciones de prueba, las soluciones de IS se mezclan suavemente en agua con una pipeta automática. Además, al ejecutar las muestras para el análisis DLS, la función de calibración automática debe estar desactivada.
Existen varias limitaciones inherentes del análisis DLS para nanopartículas de hierro-carbohidratos. Debido a la naturaleza de los ángulos de dispersión de la luz y la salida promedio Z, los diámetros hidrodinámicos reportados están sesgados hacia partículas más grandes en la solución de medición. Por lo tanto, el tamaño de partícula puede ser sobreestimado, y la verdadera distribución del tamaño de partícula puede ser subestimada13. Las técnicas de notificación de resultados deben considerarse en el contexto de cuán grandes son las partículas complejas hierro-carbohidratos y el potencial de agregación en las condiciones experimentales. También debe tenerse en cuenta que los resultados de las distribuciones de tamaño ponderadas por intensidad, volumen y número pueden diferir mucho entre diferentes unidades DLS del mismo fabricante o de diferentes fabricantes, ya que diferentes fabricantes utilizan diferentes algoritmos para el cálculo. Por lo tanto, ISO22412 solo recomienda el uso de la media Z y la polidispersidad, ya que el algoritmo para su cálculo está estandarizado. Las agencias reguladoras también han recomendado informes de tamaño promedio Z16. También debe tenerse en cuenta que se requerirán modificaciones menores (por ejemplo, el manejo del software, el procedimiento de medición y la preparación de datos) cuando este protocolo se aplique a otros instrumentos.
Incluso a la luz de los desafíos asociados con DLS, esta técnica representa un avance significativo en las metodologías analíticas anteriores y agrega datos convincentes a la caracterización de complejos hierro-carbohidratos. Ha sido respaldado por colaboraciones científicas y agencias reguladoras16,18,19,21. Los esfuerzos futuros en la aplicación del análisis DLS a los complejos hierro-carbohidratos deberían centrarse principalmente en la armonización global de los protocolos para su aplicación al desarrollo de medicamentos y la evaluación regulatoria, incluida la garantía de bioequivalencia. En general, el protocolo analítico aquí descrito tiene como objetivo estandarizar la metodología para la medición del tamaño de partícula y la distribución de SI y puede ser una herramienta útil para la evaluación de la calidad de IS.
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Disclosures
M.B., E.P., M.W. y A.B. son empleados de Vifor Pharma. G.B. es consultor de Vifor Pharma.
Acknowledgments
Ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | NA | equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry |
| Materials | |||
| Disposable plastic cuvettes | |||
| LLG-Disposable plastic cells | LLG labware | LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011 | |
| low-particle water | (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended). | ||
| Microlitre pipette | |||
| Venofer 100 mg/5 mL | Vifor Pharma | ||
| Volumetric flask 25 mL | |||
| Nanosphere | Thermo | 3020A | Particle Standard |
| Software | |||
| Origin Pro v.8.5 | Origin Lab Corporation |
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