Summary
该方法包括经口喂养和胸内注射感染，可以有效评估中肠和/或唾液腺屏障对虫媒病毒感染的影响。
Abstract
蚊媒病毒（MBVs）是脊椎动物的传染性病原体，由许多蚊子物种传播，对公众健康构成严重威胁。一旦摄入，病毒必须克服蚊子中肠屏障才能到达血淋巴，从那里它们可能会传播到唾液腺。当蚊子叮咬时，这些病毒会传播给新的脊椎动物宿主。同样，蚊子可能会感染不同的病毒。一般来说，只有一小部分病毒可以通过肠道 进入 唾液腺。这些病毒向腺体的传播效率受到不同蚊子物种中发现的两个物理屏障的影响：中肠屏障和唾液腺屏障。该协议提出了一种在经口喂养和胸内注射感染后埃及 伊蚊唾液腺中检测病毒的方法。此外，确定肠道和/或唾液腺是否阻碍病毒传播有助于对 埃及伊蚊传播的MBV进行风险评估。
Introduction
蚊媒病毒（MBV）是一组异质的RNA病毒，可以在蚊子媒介中持续存在，随后传播到脊椎动物宿主1。临床上重要的MBV主要分布在四个病毒科，即黄病毒科、托加维里科、呼肠孤病毒科和2，3。近几十年来，这些病毒已在全球范围内报道，导致公共卫生问题。作为最著名的MBV病毒之一，登革热病毒（DENV）在过去20年中已成为100多个国家中最流行的新兴或重新出现的虫媒病毒4。自在内陆发现寨卡病毒（ZIKV）以来，非洲大陆几乎所有热带和亚热带国家和地区都报告了人类寨卡病毒感染5。为了评估病毒传播的风险，近年来的许多研究都集中在这些病毒的蚊媒能力上6，7。因此，有效预防和控制病媒传播疾病至关重要。
埃及伊蚊（Ae. aegypti）是实验室中最容易饲养的蚊子之一，是登革热病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒（CHIKV）和黄热病病毒（YFV）的重要载体8。长期以来， 埃及伊蚊 只在非洲大陆和东南亚发现，但近年来它几乎殖民了所有大陆9。此外， 埃及伊蚊 的全球丰度一直在不断增长，到本世纪末估计将增加20%10。从2004年到2009年，由于日常气温升高， 中国埃及伊蚊 病媒能力明显增加11. 埃及伊蚊 作为致病媒介的地位在中国显著上升。因此，为了应对这些挑战，有必要调查 埃及伊蚊传播病毒的媒介能力。
作为一种噬血节肢动物，雌性蚊子刺穿脊椎动物宿主的皮肤并以血液为食。蚊子偶尔会从感染病毒的宿主那里获取病毒，然后将病毒转移到新的宿主。因此，为了确定媒介能力，在实验室环境中通过喂食系统给蚊子喂食含有虫媒病毒的人工血粉12。单个蚊子在感染几天后被分成头部、身体和唾液分泌物。为了测量病毒感染、传播和传播速率，已通过定量逆转录 PCR （qRT-PCR） 或斑块测定法检测病毒滴度。然而，并非所有蚊子都会发生中肠感染，并且能够在血液喂养后将病毒转移到下一个宿主。它与蚊子的生理屏障有关，可以防止病原体穿透人体，并在其先天免疫力中起着至关重要的作用13。中肠屏障，特别是中肠感染屏障（MIB）和中肠逃逸屏障（MEB），会影响病毒是否可以全身感染媒介及其传播效率。它阻碍了对其他组织感染的分析，例如唾液腺也表现出唾液腺感染和逃逸屏障13，14。为了更好地表征载体中内脏和唾液腺的感染，本文介绍了Ae中虫媒病毒经口喂养和胸内接种的详细方案 。 该方案可能适用于各种蚊媒中的其他虫媒病毒感染，例如 伊蚊 属中的DENV和ZIKV感染，并且可能被证明是一种可行的程序。
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Protocol
1. 病毒和蚊子的制备
- 病毒的制备
注意：所有过程均在生物安全2级（BSL-2）实验室进行。所使用的生物安全污染水平应由病原体的风险评估和特定于国家和地区的法规确定。该过程必须在生物安全柜中进行。- 将 1 x 106 C6/36 细胞接种到 T75 培养瓶中。用 10 mL 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 培养基填充烧瓶，其中含有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素 （P/S）。
注意：Leibovitz的L-15培养基（L15）或Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）也可用于维持C6 / 36细胞。 - 将细胞在28°C的5%CO2 中维持过夜，并在第二天细胞汇合80%-90%时除去细胞上清液。
- 向烧瓶中加入1mL病毒稀释液（感染多重性（MOI）= 0.01），并将细胞在28°C的5%CO2 中孵育1小时。 Ebinur湖病毒（EBIV）15是一种蚊媒的正布尼亚病毒，被用作该协议的模型病毒。
- 除去上清液，用 5 mL PBS 洗涤细胞 3 次。用 15 mL 含有 2% FBS 的新 RPMI 培养基填充烧瓶。将烧瓶保持在28°C的5%CO2 中。
- 当达到所需的病毒滴度时（近5天后，取决于所使用的病毒），收集含有病毒的上清液。对于EBIV，该滴度值为107 噬菌斑形成单位（PFU）/mL。将它们分包装到单独的 2 mL 螺帽储存管中，并将含有 0.5-1 mL 病毒的管储存在 -80 °C。
- 将 1 x 106 C6/36 细胞接种到 T75 培养瓶中。用 10 mL 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 培养基填充烧瓶，其中含有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素/链霉素 （P/S）。
- 病毒滴度的测定
注意：通过斑块测定确定病毒滴度16.BHK-21用于测定EBIV的病毒滴度，因为在感染细胞中观察到明显的细胞病变效应（CPE）。- 将 1 x 105 BHK-21 细胞接种到 24 孔板的每个孔中。用含有10%FBS和1%P / S的1mL DMEM培养基填充每个孔.将细胞保持在37°C的5%CO2 中过夜。
- 用含有10%FBS和1%P / S的新鲜DMEM培养基连续稀释六（10-6）次含病毒的上清液。
- 将 100 μL 病毒稀释剂添加到含有单层 BHK-21 的 24 孔板的每个孔中。在37°C下在5%CO2 中孵育1小时后丢弃病毒稀释剂。 向每个孔中加入 500 μL 含有 1.5% 甲基纤维素的 DMEM。
- 在37°C的5%CO2 中培养细胞48小时（EBIV在48小时后发现表观CPE）。用 750 μL 3.7% 甲醛固定细胞过夜。
- 用 200 μL 2% 结晶紫染色 15 分钟。计算斑块的数量以计算病毒滴度。
- 实验室中的蚊子繁殖
注意：在节肢动物遏制等级 1 （ACL-1） 实验室中饲养蚊子。- 为了制备脱氯水，在20升桶中装满自来水，让它在没有光照的情况下静置7-8天。不要盖上盖子。
- 将 埃及伊蚊 的卵和幼虫保存在具有以下条件的蚊子室中：28±1°C，光照/黑暗循环为12小时，相对湿度为75%±5%。
- 卵孵化后，在装有脱氯水的浅盘（22 cm x 15 cm x 6 cm）中保持近 1，000 只幼虫。用近 1/8 茶匙的小鼠饲料粉喂它们。每天刷新食物，每2天换一次水。
- 一旦幼虫在 5-7 天后化蛹，使用一次性滴管将蛹转移到装满脱氯水的塑料杯（7 盎司）中。
- 将五个装有蛹的杯子（每杯约200个）放入一个网笼（30厘米x 30厘米x 30厘米）中，并将笼子保持在昆虫孵化器中，条件与步骤1.3.2相同。
- 在每个网笼上放一块含有8%（m / w）葡萄糖溶液的小海绵，以喂养成年蚊子。成虫出水后，取出没有蛹的杯子。将网笼与每个笼子约1，000只成年蚊子放在同一个昆虫孵化器中。
2.口腔感染的准备
- 准备雌性蚊子进行口腔感染。使用蚊子吸收机收集5-8天大的蚊子。在-20°C麻醉它们1分钟，并检查蚊子是否头晕。如果没有，请在-20°C下再麻醉一分钟。
- 将它们快速倒入塑料杯（24盎司）中，每杯约200只蚊子（雌性和雄性）。用切好的蚊帐快速盖住每个杯子，然后盖上中间有一个孔（直径约 6 厘米）的盖子。
- 在口腔感染前24小时饿死蚊子，并准备感染性血粉，如下所示。
- 在BSL-2条件下的生物安全柜中，从-80°C冰箱中取出病毒原液并在冰上解冻。用含有 10% FBS 和 1% P/S 的 RPMI 1640 培养基将病毒原液稀释至 2 x 106 PFU/mL 的浓度。
注意：这些过程是在ACL-2实验室的生物安全柜中进行的。
3.进行口腔感染
注意：所有步骤均在ACL-2实验室进行。该过程必须在手套箱中进行，以防止蚊子逃逸。
- 使用人工蚊子喂养系统进行人工喂养1小时。
- 将胶原膜切割成适当的大小（直径约5厘米），用O形圈将它们固定在储液器上，然后将病毒 - 血液混合物（约3mL）添加到储液器中。使用塑料塞密封储液罐并防止泄漏。
注意：这些步骤是在生物安全柜中执行的。 - 将装有蚊子的塑料杯（24盎司）放入手套箱。将密封的储液罐拧到FU1进料器上，将一个储液器放在一个杯子上，然后打开动力装置。喂蚊子1小时
- 将胶原膜切割成适当的大小（直径约5厘米），用O形圈将它们固定在储液器上，然后将病毒 - 血液混合物（约3mL）添加到储液器中。使用塑料塞密封储液罐并防止泄漏。
- 用CO2 麻醉蚊子几秒钟，直到它们晕倒。简而言之，将二氧化碳喷枪通过装有蚊子的杯子上的孔放在网网的中间，打开值，让大量的二氧化碳喷出麻醉蚊子。
- 将它们倒入放在冰上的培养皿中，并迅速盖上盖子。用镊子挑出充血的雌性蚊子。为了识别，雄性有羽毛状的触角，雌性有普通的触角。将它们转移到新的塑料杯中，每杯50只雌蚊。
注意：采摘充血的雌性蚊子以保持一致性，因为喂食量会影响病毒含量。 - 用切好的蚊帐网包裹杯子，然后用中间有孔的盖子盖住。将海绵切成一小块，放在杯子上。
- 使用塑料一次性滴管将8%葡萄糖溶液添加到海绵上。将装有雌性蚊子的杯子保持在27°C，湿度为80%的培养箱中10天。每72小时更换一个新的葡萄糖饱和海绵。
4.胸内接种的准备
- 按如下方式准备显微注射针。使用PUL-1000在拔针器程序中使用以下参数制造显微注射针（图1A）：热指数= 450，力（g）= 110，距离（mm）= 1.00，延迟（s）= 0。
- 在解剖显微镜下以16倍放大倍率用镊子切割拉针的尖端（图1B）。不要把尖端做得太大，否则会伤害蚊子。
- 按照步骤2.1准备雌性蚊子。
注意：以下过程是在ACL-2实验室中进行的。 - 按如下方式制备传染性病毒稀释液：
- 从-80°C冰箱中取出病毒原液并在冰上解冻。将病毒稀释至含有100-500 PFU病毒的100 nL病毒稀释液，RPMI 1640培养基含有10%FBS和1%P / S。
- 通过一次性无菌注射器用矿物油回填针头。按照机器上的说明将针头连接到注射器中。
- 将针头插入含有传染性病毒稀释液的管中。不要折断针尖。按下 FILL 按钮，用病毒溶液填充针头。针头中病毒溶液的最终体积约为4.0μL。一旦针头充满病毒，请注意不要触摸和损坏它。
注意：这些步骤是在生物安全柜中执行的。
5.在解剖显微镜下进行病毒注射
注意：所有步骤均在ACL-2实验室进行。
- 在-20°C麻醉蚊子1分钟。将它们倒入放在冰上的培养皿中，并迅速盖上盖子。
- 用镊子挑出近50只雌蚊，放在冰板上。将冰板放在注射器下方，并在解剖显微镜下将针头插入蚊子的胸腔（图1C）。
- 将进样体积设置为 100 nL，速率设置为 50 nL/s。按下 注射 按钮，让病毒溶液流入蚊子体内。如果注射成功，腹部会略微隆起。
- 将受感染的蚊子放入放在冰上的新塑料杯（24盎司）中。当受感染的蚊子数量足够时，用切开的蚊帐网包裹杯子，然后盖上盖子。
- 将装有传染性蚊子的杯子保持在27°C，湿度为80%的培养箱中10天。按照步骤3.5喂食蚊子。
6. 受感染雌蚊的处理
注意：从每只雌性蚊子身上解剖了三种不同的组织/器官：用于计算病毒感染率（VIR）的肠道，用于计算病毒传播率（VDR）的头部和用于计算病毒传播率（VTR）的唾液。VIR被定义为具有病毒阳性肠道的蚊子数量。VDR被定义为病毒阳性头部的蚊子数量除以病毒阳性肠道的蚊子数量除以100。VTR被定义为唾液呈病毒阳性的蚊子数量除以病毒阳性肠道的蚊子数量除以100。
- 收集受感染雌蚊的唾液
注意：这些过程必须在ACL-2实验室中执行。- 如步骤3.2所示，通过二氧化碳麻醉麻醉受感染的雌性蚊子。将它们倒入放在冰上的培养皿中，然后迅速盖上盖子。
- 将 10 μL 移液器吸头并排放入浸油，并排放在橡胶泥上。
- 用镊子挑出雌性蚊子，然后把它们放在冰板上。用镊子取出他们的腿和翅膀。将一只蚊子的口器放在每个移液管吸头上。
- 在室温下收集蚊子分泌到油中的唾液45-60分钟。
- 将移液器吸头放入含有 200 μL 病毒稀释剂培养基的 1.5 mL 管中（含有 10% FBS 和 1% P/S 的 RPMI 1640 培养基）。在4°C下以5，000× g 离心5分钟，以将唾液排出到管中。将这些试管储存在-80°C，以便随后测定透射率。
- 解剖受感染的雌性蚊子
注意：这些过程必须在ACL-2实验室中执行。- 收集唾液后用镊子割掉雌性蚊子的头部。将每个头放入含有 200 μL RPMI 1640 培养基的单独管中。
- 用镊子抓住胸部，然后用另一个镊子抓住腹部的倒数第二段并将其拉出。肠道将被拉出。清洁拔出的肠道中任何杂散的组织和器官。
- 用PBS清洗肠道，并将每个肠道放入含有200μLRPMI 1640培养基的单独管中。将这些试管储存在-80°C，以便随后测定病毒感染率和传播率。
7. 数据分析
- 核糖核酸提取
- 用低温组织均质机研磨机将组织研磨成碎片，设置为以下参数：工作频率= 60 Hz，操作时间= 15 s，暂停时间= 10 s，周期= 2，设定温度= 4.0°C。
- 将样品在4°C下以12，000× g 离心10分钟。 按照仪器说明，通过自动核酸提取系统提取每个样品的总RNA。
- 执行 qRT-PCR
- 使用一步法 RT-PCR 试剂盒使用定量 PCR 仪器定量病毒 RNA 拷贝17。使用以下引物检测EBIV S段F：ATGGCATCACCTGGGAAAG和R：TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA。将反应过程设置为：第1阶段：42°C5分钟，95°C10秒;第 2 阶段：40 次循环，95 °C 持续 5 秒，60 °C 持续 20 秒。
- 通过接种在细胞上的连续10倍稀释液确定细胞中感染的最低病毒剂量。使用BHK-21细胞确定EBIV的最低病毒剂量，如步骤1.2中所述使用稀释至10-7 。
- 通过qRT-PCR计算最低病毒剂量的Ct值。使用 qRT-PCR 检测的 EBIV 阳性临界值为 35 <。使用以下公式计算每个样本中EBIV的拷贝数：
y = -4.0312x + 3.384 [x = 对数（EBIV 的副本），y = Ct 值，R2 = 0.9905] - 按如下方式计算感染率、传播率和传播率：
感染率（%）=100x（病毒阳性蚊子内脏数量/蚊子总数）
传播率（%）=100×（病毒阳性蚊头数/病毒阳性蚊内脏数）
传播率（%）=100×（病毒阳性蚊子唾液数量/病毒阳性蚊子内脏数量） - 通过使用非参数Kruskal-Wallis分析进行多重比较并在适当的情况下使用Fisher精确测试来分析连续变量的差异以及蚊子感染率，传播率和传播率的差异。
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Representative Results
为了通过人工喂血（病毒最终滴度为6.4 x 106 PFU/mL）和胸内注射（病毒剂量为340 PFU）检查感染蚊子体内的EBIV分布，测定感染后10天蚊子唾液、头部和肠道中的病毒RNA（dpi）。
对于埃及伊蚊，胸内接种雌性蚊子的肠道、头部和唾液中的EBIV病毒滴度远高于口腔感染的雌性蚊子（图2A-C）。胸内接种的雌性蚊子的感染率和传播率为100%，但口腔感染的雌性蚊子的感染率和传播率分别为70%和38.1%（图2D，E）。胸内接种雌性蚊子的传播率高达90%，但口腔感染的雌性蚊子的传播率仅为4.8%。这表明埃及伊蚊的肠道对病毒传播有较强的抑制作用。
图1：微量移液器吸头和胸内注射的示意图 。 （A）在折断吸头之前拉动微量移液器吸头。（B）适当制备的适合胸内接种的微量移液器吸头。（C）蚊子胸内注射示意图。 请点击此处查看此图的大图。
图2：成年蚊子通过口服喂养和胸内接种的媒介能力。 将受感染的雌性蚊子在28°C下孵育10天。 p 值≤ 0.05 被认为具有统计学意义。非参数Kruskal-Wallis分析用于多重比较和适当的费舍尔精确检验。这个数字是根据Xia等人的研究修改的18。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该方法的目标是通过经口喂养和胸内接种评估媒介能力，对一种蚊媒病毒进行全面的风险评估。
在口服喂养实验中，需要挑选出充血的蚊子并将其转移到新的容器中，这对操作人员构成了严重的风险。这是因为任何蚊子，包括未感染的蚊子，都可能是感染源19。因此，必须按照协议中的规定首先麻醉蚊子，然后执行后续步骤。重要的是要注意，选择充血的蚊子并转移它们应该在密封的手套箱中进行。在此过程中保持手套箱关闭，除非箱子里没有自由移动的蚊子。
在感染实验中，最好是两个人一起工作，在两个人确认没有同时逃跑的蚊子后，他们可以打开手套箱，防止感染的蚊子逃跑。如果逃跑，必须杀死或重新捕获这些蚊子。不建议徒手杀死受感染的蚊子。通过使用真空吸引器或其他适当的工具（例如，镊子、画笔、戴手套的手），可以降低操作人员的感染风险。实验结束后，用常规消毒剂对手套箱内部和工作台表面进行消毒。
大多数关于蚊媒能力的蚊媒能力的研究仅集中在口腔感染20，21上。对于口腔感染，病毒必须克服与中肠和唾液腺相关的几个组织屏障才能释放到唾液中14。本实验未证明中肠腺和唾液腺对蚊子媒介容量的影响。当口服喂养和胸内注射相结合时，可以彻底评估不同的组织屏障。根据该程序的结果， 埃及伊蚊的 肠道在病毒的媒介能力中起主导作用，唾液腺屏障可能不存在（图2）。为此，我们的方案有利于确认虫媒病毒感染的中肠或唾液腺屏障的存在。
根据该方法，在样品中仅鉴定出病毒RNA。需要其他检查，例如用透射电子显微镜观察病毒粒子，使用斑块测定确认感染，或用免疫荧光测定检测病毒蛋白，以确认各种样品中的传染性病毒。可以修改这种方法并用于将其他感兴趣的病毒接种到各种蚊子媒介中。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了武汉市科技计划项目（2018201261638501）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
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