Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekylanalyse av Sf9 rensede superprosessive Kinesin-3-familiemotorer

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/63837
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Discipline of Biological Engineering, Indian Institute of Technology Gandhinagar, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Sambalpur University

Summary

Denne studien beskriver rensing av KIF1A (1-393LZ), et medlem av kinesin-3-familien, ved bruk av Sf9-baculovirusuttrykkssystem. In vitro enkeltmolekyl- og flermotorsglideanalyse av disse rensede motorene viste robuste motilitetsegenskaper som kan sammenlignes med motorer fra pattedyrcellelysat. Dermed er Sf9-baculovirus-systemet egnet til å uttrykke og rense motorprotein av interesse.

Abstract

Et komplekst cellulært miljø utgjør utfordringer for enkeltmolekylmotilitetsanalyse. Imidlertid har fremskritt i bildebehandlingsteknikker forbedret enkeltmolekylstudier og har fått enorm popularitet i å oppdage og forstå den dynamiske oppførselen til fluorescerende merkede molekyler. Her beskriver vi en detaljert metode for in vitro enkeltmolekylstudier av kinesin-3-familiemotorer ved bruk av TIRF-mikroskopi (Total Internal Reflection Fluorescence). Kinesin-3 er en stor familie som spiller kritiske roller i cellulære og fysiologiske funksjoner som spenner fra intracellulær lasttransport til celledeling til utvikling. Vi har tidligere vist at konstitutivt aktive dimeriske kinesin-3-motorer utviser rask og superprosessiv motilitet med høy mikrotubuliaffinitet på enkeltmolekylnivå ved bruk av cellelysater fremstilt ved å uttrykke motor i pattedyrceller. Vårt laboratorium studerer kinesin-3-motorer og deres reguleringsmekanismer ved hjelp av cellulære, biokjemiske og biofysiske tilnærminger, og slike studier krever rensede proteiner i stor skala. Ekspresjon og rensing av disse motorene ved hjelp av pattedyrceller ville være dyrt og tidkrevende, mens ekspresjon i et prokaryotisk uttrykkssystem resulterte i betydelig aggregert og inaktivt protein. For å overvinne begrensningene som utgjøres av bakterielle rensesystemer og pattedyrcellelysat, har vi etablert et robust Sf9-baculovirusuttrykkssystem for å uttrykke og rense disse motorene. Kinesin-3-motorene er C-terminalt merket med 3-tandem fluorescerende proteiner (3xmCitirin eller 3xmCit) som gir forbedrede signaler og redusert fotobleking. In vitro enkeltmolekyl- og flermotors glideanalyse av Sf9-rensede proteiner viser at kinesin-3-motorer er raske og superprosessive i likhet med våre tidligere studier ved bruk av pattedyrcellelysater. Andre applikasjoner som bruker disse analysene inkluderer detaljert kunnskap om oligomerforholdene til motorer, spesifikke bindingspartnere parallelt med biokjemiske studier og deres kinetiske tilstand.

Introduction

Et enormt overfylt cellemiljø gir mange utfordringer med å sortere bestemte proteiner og molekyler. Denne intense arbeidsbelastningen med organisering og spatiotemporal fordeling av molekyler i cytoplasma forenkles av molekylære motorer og cytoskeletale spor. Molekylære motorer er enzymene som hydrolyserer energivalutaene som ATP og utnytter den energien under bevegelse og kraftgenerering1. Basert på aminosyresekvenslikheten er kinesiner gruppert i 14 familier, og til tross for denne likheten bidrar hver motor unikt til en celles funksjon. Kinesin-3-familiemotorer utgjør en av de største, bestående av fem underfamilier (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 og KIF28)2, assosiert med ulike cellulære og fysiologiske funksjoner, inkludert vesikkeltransport, signalering, mitose, kjernefysisk migrasjon og utvikling 3,4,5. Forringelse i kinesin-3 transportfunksjon impliserer i mange nevrodegenerative lidelser, utviklingsdefekter og kreftsykdommer 6,7,8,9.

Nylig arbeid har vist at kinesin-3-motorer er monomerer, men gjennomgår lastindusert dimerisering og resulterer i rask og superprosessiv motilitet sammenlignet med konvensjonell kinesin10,11,12,13. Deres biokjemiske og biofysiske karakterisering trenger en stor mengde rensede, aktive proteiner. Imidlertid resulterte deres produksjon i det prokaryote ekspresjonssystemet i inaktive eller aggregerte motorer, antagelig på grunn av inkompatibel proteinsyntese, folde- og modifikasjonsmaskiner 14,15,16,17,18. For å omgå slike begrensninger og øke utbyttet, har vi her etablert et robust Sf9-baculovirusuttrykkssystem for å uttrykke og rense disse motorene.

Baculovirusuttrykkssystemet bruker Sf9 insektcellelinjer som et vertssystem for eukaryotisk rekombinant proteinuttrykk med høy gjennomstrømning19,20. Baculovirus har en sterk polyedrinpromotor som hjelper til med heterologt genuttrykk og produksjon av løselige rekombinante proteiner17. På grunn av sin kostnadseffektivitet, trygt å håndtere og høy mengde aktivt proteinuttrykk, har det blitt et kraftig verktøy21. For å uttrykke et protein av interesse, er et viktig skritt å generere en rekombinant bacmid. Siden de kommersielt tilgjengelige bacmid-genereringssettene er dyre, og vi vil jobbe med flere prøver, utviklet vi en intern protokoll for både store og små innsatser av kinesin-3-motorer i bacmider. Sf9-rensede kinesin-3-motorer ble brukt til å karakterisere in vitro enkeltmolekyl- og flermotoriske mikrotubuliglideegenskaper ved bruk av total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi. Motorer er C-terminalt merket med 3-tandem fluorescerende molekyler (3xmCit) for å gi forbedret signal og redusert fotobleking. På grunn av det økte signal-til-støy-forholdet, mindre fototoksisitet og selektiv avbildning av et svært lite område nær dekselet, har TIRF-avbildning blitt mye brukt til å visualisere proteindynamikk på enkeltmolekylnivå in vivo og in vitro.

Denne studien diskuterer rensing av kinesin-3-motorer ved å bruke Sf9-baculovirusuttrykkssystem og in vitro enkeltmolekylavbildning og flermotors glideanalyse av motorer ved hjelp av TIRF-mikroskopi. Samlet sett viser denne studien at motilitetsegenskapene til Sf9-rensede motorer er identiske med motorer fremstilt fra pattedyrcellelysater. Derfor tror vi at Sf9-baculovirus-systemet kan tilpasses for å uttrykke og rense ethvert motorprotein av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sf9 kultur, transfeksjon og virusgenerering

MERK: Oppretthold Sf9-celler i 30 ml Sf-900 / SFM-medium i 100 ml steril, engangs konisk kolbe uten antibiotika / antimykotisk ved 28 ° C. Hold suspensjonskulturen i en orbital shaker ved 90 o / min. Tilførsel av CO2 og fuktighetsvedlikehold er ikke nødvendig. Celler blir vanligvis subkulturert hver fjerde dag ved å inokulere 0,5 x 10 6 celler / ml for å nå 2,0 x 106 celler / ml tetthet på den fjerde dagen.

  1. P0 virus lager generasjon
    1. For transfeksjon, frøceller i en 35 mm tallerken med 4,5 x 105 celler / ml sammenløp og opprettholde ved 28 ° C uten å riste.
    2. Etter 24 timer, når cellene er festet og ser sunne ut, fortsett for transfeksjon som beskrevet nedenfor.
      1. Rør A: Bland 1 μg bacmid DNA-koding for konstitutivt aktiv KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG-spesifikk kinesin-3-motor med 100 μL usupplert Graces medier.
      2. Rør B: Bland 6 μL transfeksjonsreagens med 100 μL usupplert Graces medium.
      3. Overfør forsiktig innholdet av Tube A til Tube B og bland grundig ved pipettering opp og ned (ca. 20 ganger).
      4. Inkuber blandingen i ~ 45 minutter ved romtemperatur.
    3. Etter å ha fullført inkubasjonen, tilsett 0,8 ml usupplert Grace's media til ovennevnte blanding og bland sakte ved pipettering.
    4. Aspirer forsiktig Sf-900/SFM-mediet fra celler (for å fjerne eventuelle spor av serum som kan påvirke transfeksjonseffektiviteten).
    5. Tilsett transfeksjonsblandingen fra trinn 1.1.3 dråpevis på toppen av cellene og inkuber platen i 6 timer ved 28 °C.
    6. Etter inkubasjonen fjernes transfeksjonsblandingen forsiktig, tilsett 2 ml Sf-900 / SFM-medier og inkuberer videre i 48 timer ved 28 ° C.
    7. Sjekk for motorproteinuttrykket under et omvendt fluorescensmikroskop. Motorproteinet er merket med et fluorescerende protein, mCitrin, en variant av gult fluorescerende protein.
      MERK: Transfiserte celler ble visualisert under et omvendt mikroskop utstyrt med differensialinterferenskontrast (DIC) og epifluorescensbelysning med et 20x mål (200 ganger forstørrelse), kvikksølvlampe og et EM-CCD-kamera. Kontroller effektiviteten av virusgenerering og infeksjon ved å overvåke uttrykket av mCitrine-merkede motorer i celler gjennom mCitrine-eksitasjon og utslippsfilterkube. I tillegg må du se etter morfologiske endringer av infiserte celler, som forstørrede celler/kjerner (figur 1A-C).
    8. Igjen, sjekk cellene 72 timer etter infeksjon. Vanligvis begynner celler å løsne fra overflaten (figur 2).
    9. Hvis >5% av cellene løsner fra overflaten, høstes mediet med infiserte celler i 1,5 ml sterile mikrosentrifugerør og spinner i 5 minutter ved 500 x g.
    10. Samle supernatant og snap freeze aliquots på 1 ml i flytende nitrogen og lagre som P0-lager ved -80 ° C eller bruk den til å generere P1-viruslager.
  2. Generering av P1-virus
    1. For ytterligere å forsterke P0 baculovirus-stammen og bekrefte proteinuttrykk, vokser Sf9-celler i flytende suspensjonskultur.
    2. I en steril 100 ml konisk kolbe, tilsett 10 ml Sf-900 / SFM-medier med en celletetthet på 2 x 106 celler / ml og 1 ml P0-viruslager. Inkuber ved 28 °C med konstant risting ved 90 o/min.
    3. Etter 72 timers infeksjon, sjekk for proteinuttrykket som beskrevet tidligere (trinn 1.1.7). Hvis proteinuttrykket er godt (>90% av cellene viser et lyst mCitrinfluorescenssignal) og viser signifikant celledød (ca. 10% -15%), spinn ned cellene i et 15 ml sterilt konisk rør ved 500 x g i 5 minutter.
    4. Samle supernatanten, snap freeze aliquots av 1 ml (P1 lager) i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C eller fortsett for storskala infeksjon og proteinrensing.
  3. Storstilt smitte
    1. For storskala proteinuttrykk, infiser 30 ml av suspensjonskulturen ved 2 x 106 celler / ml tetthet med 1 ml P1-viruslager og inkuber ved 28 ° C med konstant risting ved 90 o / min.
    2. Etter ~ 72 timer etter infeksjon, sjekk for proteinuttrykket (generelt oppnås maksimalt proteinuttrykk mellom 65-75 timer etter infeksjon).
    3. Hvis >90% av cellene viser et sterkt fluorescerende signal med minimal celledød (<5%), samle cellene i et sterilt 50 ml konisk rør og spinn ned ved 500 x g ved 4 ° C i 15 minutter.
      MERK: Det bør være minimal celledød (<5%), fordi døde celler frigjør det cellulære innholdet i media, noe som fører til tap av uttrykt protein.
    4. Kast supernatanten, samle cellepelleten og fortsett med proteinrensing.

2. Sf9 rensing av kinesin-3 motorer

  1. Til ovennevnte cellepellet tilsettes 3 ml iskald lysebuffer (tilleggstabell 1) nysupplert med 5 mM DTT, 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin og 5 μg/ml PMSF og lyser cellene ved pipettering 20-25 ganger uten å generere luftbobler. For alle buffersammensetninger og reagenser, se supplerende tabell 1.
  2. Spinn cellelysatet ved 150 000 x g i 30 minutter ved 4 °C.
  3. Samle supernatanten i et friskt, sterilt rør og bland med ~40 μL 50% anti-FLAG M2 affinitetsharpiks. Inkuber blandingen i 3 timer ved 4 °C med ende-til-ende-tumbling.
  4. Etter inkubasjon, pellet FLAG-harpiksen ved å spinne ved 500 x g i 1 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten med en 26 G nål og kast.
  5. Vask FLAG-harpikspellet tre ganger med iskald vaskebuffer (tilleggstabell 1) nysupplert med 2 mM DTT, 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin og 5 μg/ml PMSF. Pellet perlene ved å spinne ved 500 x g i 1 min ved 4 °C i hver vask.
  6. Etter den tredje vasken, tøm vaskebufferen forsiktig så mye som mulig uten å forstyrre pelleten. For proteineluering, tilsett ~70 μL vaskebuffer inneholdende 100 μg/ml FLAG-peptid til harpikspelleten og inkuber over natten ved 4 °C med ende-til-ende-tumbling.
  7. På den påfølgende dagen, spinn ned harpiksen ved 500 x g i 1 min ved 4 ° C. Samle supernatanten som inneholder renset protein i et friskt rør og suppler med 10% glyserol. Frys aliquots på 5 μL i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C til videre bruk.
  8. Kjør SDS-PAGE-gelen for å bestemme proteinkonsentrasjonen og utbyttet. Sammen med renset protein av interesse, en standard proteinkontroll, BSA med kjente konsentrasjoner fra 0,2 μg, 0,4 μg, 0,6 μg, 0,8 μg og 1 μg lastes for å generere en standardkurve. Flekk gelen med Coomassie Brilliant blue (figur 3).
  9. Analyser gelen ved hjelp av et innebygd gelkvantifiseringsverktøy i ImageJ-programvaren. Først måler du båndintensiteten til kjente konsentrasjoner av BSA og genererer standardkurven. Deretter måler du intensiteten til det rensede proteinbåndet og bestemmer proteinkonsentrasjonen. For å gjøre det, åpne Image J-programvaren, klikk på Analyser-alternativet i menylinjen og velg Geler i rullegardinmenyen.

3. In vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyse ved bruk av Sf9-rensede kinesin-3-motorer

MERK: Sf9-rensede kinesin-3-motorer kan brukes til å studere biokjemiske og biofysiske egenskaper som ATP-omsetningshastighet, mikrotubuliaffinitet, hastighet, kjørelengde, trinnstørrelse og kraftgenerering. Her beskrives en detaljert protokoll for in vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyse av KIF1A(1-393LZ) ved bruk av Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi. For alle buffersammensetninger og reagenser, se supplerende tabell 1.

  1. Mikrotubuli-polymerisering
    1. I et forkjølt 0,5 ml mikrosentrifugerør, lag en polymerisasjonsblanding ved pipettering i følgende rekkefølge: 12,0 μL BRB80 buffer, pH 6,9; 0,45 μL på 100 mM MgCl2, 1 μL på 25 mM GTP.
    2. Ta ut en 10 μL aliquot av 10 mg / ml tubulin lagret i flytende nitrogen, tine umiddelbart og tilsett i polymerisasjonsblandingen ovenfor. Bland forsiktig ved pipettering 2-3 ganger uten å skape luftbobler.
      MERK: Utfør trinnene ovenfor raskt og strengt på is.
    3. La ovennevnte blanding sitte på is i 5 minutter.
      MERK: Dette er et kritisk skritt for å forhindre denaturering av tubulin eller for å unngå dannelse av korte mikrotubulifrø.
    4. Overfør røret til en forvarmet 37 °C varmeblokk/vannbad og inkuber i 30 minutter for polymerisering av mikrotubuli.
    5. Mens mikrotubuli polymeriserer, tine en aliquot av P12-buffer og bring den til romtemperatur.
    6. Før du har fullført 30 minutters inkubasjon, begynn å forberede MT-stabiliseringsbuffer ved å pipettere 100 μL P12-buffer i et nytt mikrosentrifugerør. Til dette tilsettes 1 μL 1 mM taxol og hvirvler umiddelbart blandingen.
      MERK: Begynn å forberede MT-stabiliseringsbufferen ca. 5 minutter før inkubasjonen er fullført i trinn 3.1.4. Taxol stabiliserer de polymeriserte mikrotubuli ved å binde seg til β-tubulin.
    7. Varm mikrotubulistabiliseringsbufferen i 2-3 minutter ved 37 ° C og tilsett den forsiktig i de polymeriserte mikrotubuli uten å forstyrre polymerisasjonsblandingen i bunnen.
      MERK: Oppvarming av stabiliseringsbufferen vil bringe den til samme temperatur som polymerisasjonsblandingen.
    8. Ikke bank eller pipetter blandingen og inkuber ytterligere ved 37 °C i 5 minutter.
    9. Knips forsiktig på blandingen og bland den med en skråskåret spiss (200 μL kapasitet) sakte ved hjelp av pipetten.
      MERK: Fra dette tidspunktet må du alltid håndtere mikrotubuli med en skråskåret spiss for å unngå mikrotubuliskjæring.
    10. Ta 10-15 μL polymeriserte mikrotubuli i en strømningscelle for å kontrollere riktig mikrotubulipolymerisasjon.
      MERK: Man kan visualisere de umerkede mikrotubuli ved hjelp av et DIC-mikroskopioppsett.
    11. Hvis mikrotubuli er konsentrert, fortynn dem i P12-buffer supplert med 10 μM taxol.
  2. Fremstilling av motilitetsstrømningscellekammer
    1. Forbered et motilitetskammer ved hjelp av et glassglass, dobbeltsidig tape og glassdeksel (22 mm x 30 mm).
    2. Ta et glassglass, legg en dråpe (~ 70 μL) av avionisert destillert vann i midten og tørk det med et lofritt silkepapir.
    3. Klipp to strimler med dobbeltsidig tape (~ 35 x 3 mm) og fest dem fast til glassglasset parallelt, og la et ~ 4-5 mm gap mellom to striper for å skape en smal passasje.
    4. Deretter tar du et deksel og legger til en dråpe (~ 20 μL) deionisert destillert vann i midten. Legg en stripe med lofritt linserengjøringspapir på vanndråpen til den absorberer vannet. Skyv den deretter sakte mot den ene enden av dekselet.
      MERK: Dekselet skal være helt tørt. Ingen vann skal være synlig på dekselet.
    5. Plasser dekselet på de dobbeltsidige stripene som sitter fast på lysbildet, og trykk dekselet jevnt langs stripene for å feste seg fast.
      MERK: Forsikre deg om at den rensede siden av dekselet vender mot glassglasset.
    6. Sørg for at dette sammen skaper et smalt kammer med 10-15 μL kapasitet for å utføre motilitetsanalyse (figur 4A).
  3. In vitro enkeltmolekyl motilitetsanalyse
    MERK: For å studere de mikrotubulibaserte enkeltmolekylmotilitetsegenskapene til motorer, må mikrotubuli adsorberes på dekkflaten i motilitetskammeret.
    1. Fortynn de polymeriserte taksolstabiliserte mikrotubuli i P12-buffer supplert med 10 μM taxol ved 1: 5-forhold og bland ved pipettering sakte med en skrå spiss.
    2. Hold strømningskammeret i skråstilling (~ 15-20 °). Flyt 30 μL fortynnet mikrotubulioppløsning gjennom strømningskammeret fra den øvre enden mens du holder et lofritt silkepapir i den nedre enden for å absorbere væsken. Dette skaper en skjærkraft for å justere mikrotubuli i strømningsretningen og bidrar til å adsorbere mikrotubuli rett og justere parallelt.
    3. La en liten dråpe væske ligge i begge ender av kammeret og hold strømningscellen i en omvendt stilling (dekselet vendt mot bunnen) i et lukket, fuktig kammer for å forhindre tørking av motilitetskammeret.
    4. La det sitte i ~ 30 min slik at mikrotubuli adsorberer til overflaten av dekselet inne i motilitetskammeret.
    5. I mellomtiden forbereder du blokkeringsbuffer ved å blande 500 μL P12-BSA-buffer med 5 μL 1 mM taxol.
    6. Flyt 40-50 μL blokkeringsbuffer og inkuber lysbildet i en omvendt stilling i 10 minutter i et fuktig kammer.
    7. Klargjør motilitetsblandingen ved å pipettere følgende komponenter i et sterilt mikrosentrifugerør med en kapasitet på 500 μL i følgende rekkefølge: 25 μL P12-buffer med taxol, 0,5 μL 100 mM MgCl2, 0,5 μL av 100 mM DTT, 0,5 μL av 20 mg / ml glukoseoksidase, 0,5 μL av 8 mg / ml katalase, 0,5 μL på 2,25 m glukose og 1,0 μL 100 mM ATP.
      MERK: Fluorescensavbildning har blitt mye brukt til biologiske applikasjoner 22,23,24,25,26. Fotoeksitasjon av fluorescerende proteiner genererer reaktive oksygenarter (ROS), noe som kan forårsake fotobleking av fluorescerende proteiner og skade på de biologiske prøvene27,28. Oksygenscavengers som glukose, glukoseoksidase og katalase brukes rutinemessig i motilitetsanalyser for å begrense fotodamage og forlenge bleketiden for fluorescerende proteiner.
    8. Til slutt tilsett 1 μL av den rensede motoren til ovennevnte motilitetsblanding og bland godt før den strømmer inn i motilitetskammeret.
    9. Forsegl begge endene av motilitetskammeret med flytende parafinvoks og avbilde umiddelbart under TIRF-belysning ved hjelp av 100X TIRF-mål på 1,49 NA med 1,5x forstørrelse.
    10. For å fokusere dekseloverflaten, fokuser du først på en av de indre kantene av dobbeltsidig tape i motilitetskammeret under differensialinterferenskontrastbelysning (DIC).
      MERK: Den lyse og ujevne overflaten vil være synlig.
    11. Flytt deretter fokuset inn i motilitetskammeret. Ved hjelp av finjustering fokuserer du dekkflaten og ser etter mikrotubuli som er adsorbert på dekkoverflaten.
    12. Når mikrotubuli er fokusert, bytt til TIRF-belysning med en 488 nm eksitasjonslaser og juster belysningsdybden ved å endre eksitasjonsstrålevinkelen for å få den beste og ensartede TIRF-belysningen (figur 4B).
    13. Fokuser de individuelle mCitrine-merkede motorene som beveger seg prosessuelt langs mikrotubulioverflaten med 100 ms eksponering og ta opp bevegelsen ved hjelp av et EM-CCD-kamera.
      MERK: Selv om motilitetsanalysene ble utført på umerkede mikrotubuli, kan z-projeksjonsfunksjonen med maksimal intensitet brukes til å avsløre omrisset av mikrotubulisporet. Fortrinnsvis ble hendelser på lange mikrotubulispor vurdert for sporingsanalyse.
    14. Manuelt spore posisjonen til fluorescerende merkede individuelle motorer som går på lange mikrotubulispor ramme for ramme ved hjelp av et spesialskrevet plugin i ImageJ (nih.gov) programvare som beskrevet tidligere29.
    15. Generer histogrammer for hastighet og kjørelengde for motorpopulasjonen ved å plotte antall hendelser i hver søppelkasse. Tilpass disse histogrammene til en enkelt Gaussisk toppfunksjon for å oppnå gjennomsnittshastighet og løpelengde12 (figur 4C-E).

4. In vitro mikrotubuli glideanalyse

MERK: For å forstå den kollektive oppførselen til kinesin-3-motorer, ble in vitro mikrotubuli glideanalyse utført 18,30,31. Der motorer immobiliseres på dekslet i en omvendt stilling og når mikrotubuli tilsettes i kammeret, lander mikrotubuli på motorer og glir langs mens motorene prøver å gå på dem (figur 5A, B).

  1. Fluorescerende mikrotubulipolymerisering: Polymeriser mikrotubuli etter protokollen beskrevet tidligere, bortsett fra å blande rhodamin merket tubulin (3 mg / ml) med umerket tubulin (10 mg / ml) i forholdet 1:10.
  2. Etter 30 min polymerisasjon, tilsett forsiktig 30 μL forvarmet mikrotubulistabiliseringsbuffer og inkuber videre i 5 minutter ved 37 ° C.
  3. Deretter skjærer du mikrotubuli ved pipettering med kapillærbelastningsspissen (~ 25-30 ganger).
  4. Forbered motilitetsstrømningskammeret som beskrevet tidligere, strømning 50 μL Sf9-renset GFP nanolegemer (2,5 μL av 100 nM fortynnet i 50 μL P12 buffer) og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med dekselet vendt nedover i et fuktig kammer.
    MERK: Motorene er C-terminalt merket med mCitrine. GFP nanobodies brukes til å immobilisere motorene på grunn av deres lave dissosiasjonskonstant32.
  5. Blokker dekkflaten ved å strømme 50 μL blokkbuffer inn i strømningskammeret for å forhindre ikke-spesifikk proteinadsorpsjon og inkuber videre i 5 minutter.
  6. Forbered motorblandingen ved å pipettere 50 μL blokkbuffer, 1 μL 100mM ATP og 5 μL 100 nM Sf9-renset kinesin-3 motorer. Bland forsiktig før du strømmer inn i kammeret og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i et fuktig kammer.
  7. Vask kammeret to ganger med 50 μL P12 kasein.
  8. I et sterilt mikrosentrifugerør fremstiller du glideanalyseblandingen i følgende rekkefølge, 45 μL P12-kasein med 10 μM taxol, 1 μL 100 mM ATP, 0,5 μL 8 mg / ml katalase, 0,5 μL 20 mg / ml glukoseoksidase, 0,5 μL av 2,25 M glukose og 1 μL av skjære fluorescerende mikrotubuli. Bland innholdet forsiktig før det strømmer inn i motilitetskammeret og forsegle endene av kammeret med flytende parafinvoks.
  9. Bildemikrotubuli som glir under TIRF-belysning ved 100 ms eksponering og tar bildene med vedlagt EM-CCD-kamera.
    MERK: Den gjennomsnittlige glidehastigheten i mikrotubuli ble bestemt ved å manuelt spore omtrent 100 individuelle mikrotubuli ramme for ramme ved hjelp av et spesialskrevet plugin i ImageJ29. Bestem den gjennomsnittlige mikrotubuliglidhastigheten ved å generere et histogram og tilpasse til en Gauss-funksjon (figur 5C, D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å uttrykke og rense aktive og funksjonelle rekombinante motorproteiner i stor skala ved hjelp av Sf9-baculovirusuttrykket, trenger systemet generering av virale partikler stabilt som bærer en kodesekvens for å infisere Sf9-celler. For å oppnå dette ble Sf9-celler transfisert med rekombinant bacmid-koding KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG. Etter 72 timer viste en signifikant populasjon av celler ekspresjon av grønt fluorescerende protein (mCitrin) med forstørrede celler og kjerner (figur 1 og figur 2), noe som tyder på vellykket generering av virale partikler (P0). Disse viruspartiklene ble ytterligere utvidet ved å infisere fersk Sf9-populasjon med et høyere volum for å generere P1-viruslagre for lagring og storskala infeksjon. For rensing av kinesin-3-motor ble en 30 ml kultur av Sf9-celler infisert med 1 ml P1 virale partikler. Etter 72 timers infeksjon ble celler som uttrykker grønt fluorescerende protein høstet, lyset og renset ved hjelp av C-terminal FLAG-affinitetsrensing med anti-FLAG antistoffbelagt harpiks. Interessant nok eluerte tilsetningen av FLAG-peptid til perlene festet med kinesin-3-motorer det meste av proteinet i en enkelt fraksjon, og det rensede proteinet var av høy renhet, vist som et bånd på ~ 120 kDa i Lane 7 i figur 3.

Den vellykkede polymerisasjonen av lange og sunne mikrotubuli for å studere motilitetsegenskapene til S9-rensede kinesin-3-motorer på et enkeltmolekylnivå krever rent tubuliner. I denne studien ble mikrotubuli polymerisert ved bruk av 2X syklet tubulin renset fra geitehjernen ved en kritisk konsentrasjon mellom ~ 2,5-3,0 mg / ml i 30 minutter i fravær av taxol, da taxol reduserer den kritiske konsentrasjonen av mikrotubulikjernering og genererer et stort antall korte mikrotubuli 33,34,35 . Taxol ble tilsatt etter polymerisering for å stabilisere mikrotubuli og forhindre depolymerisering. Mikrotubuli polymerisert ved hjelp av denne metoden resulterte i lange og ensartede strukturer (Video 1) med en gjennomsnittlig lengde på 60-70 μm.

In vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyse av Sf9-renset kinesin-3-motor, viste KIF1A(1-393LZ) under TIRF-belysning (figur 4B) ensrettet, rask og superprosessiv bevegelse langs mikrotubuli (video 2), som vist i kymografen som lange diagonale hvite linjer (figur 4C). Sporingsanalyse av disse lange superprosessive motilitetshendelsene viste en gjennomsnittlig hastighet og løpelengde på henholdsvis 2,44 ± 0,02 μms-1 og 10,79 ± 0,28 μm (figur 4D-E). Disse resultatene er i samsvar med våre tidligere publiserte data12,13 ved bruk av motorer fremstilt fra pattedyrcellelysat ved overuttrykk. Videre viste den multimotoriske mikrotubuliglideanalysen ved hjelp av Sf9-rensede motorer festet på dekselet under TIRF-belysning lang, jevn og ensrettet bevegelse (figur 5C og video 3). Sporingsanalyse av disse lange mikrotubuliglidingshendelsene viste en gjennomsnittlig hastighet på 1,37 ± 0,01 μms-1 (figur 5D).

Sammen tyder disse resultatene på at Sf9-baculovirussystemet gir et utmerket system for ekspresjon og rensing av aktive motorproteiner som generelt er vanskelige å bruke det prokaryote systemet. FLAG-taggen gir en fordel med enkelttrinns rensing av protein i sin rene form. Videre gir mikrotubulipolymerisasjon ved bruk av fersk og ren tubulin og deres stabilisering etter polymerisasjonen lange og ensartede mikrotubuli. I tillegg antyder in vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyse at Sf9-rensede motorer var robuste og viste motilitetsegenskaper som ligner motorer uttrykt i pattedyrsystemer.

Figure 1
Figur 1: 48 timer etter transfeksjon av Sf9-celler med fluorescerende merket kinesin-3-motor: Sf9-celler ble belagt på en 35 mm tallerken med en tetthet på 4,5 x 105 celler / ml. Etter 24 timer ble celler transfisert med rekombinant bacmid DNA som koder for spesifikk kinesin-3-motor, KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG ved bruk av transfeksjonsreagens. Etter 48 timers transfeksjon ble bildene tatt under differensialinterferens og kontrast (DIC) og epifluorescensbelysning. (A) Utransfiserte celler, små, runde og godt festet. (B) Transfiserte celler som uttrykker KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG-merket protein som viser forstørret cellediameter og løst festet til overflaten. Skala bar, 100 μm. (C) Bar graf som indikerer gjennomsnittlig cellediameter av utransfected og transfected celler. Feilfelt representerer gjennomsnitt ± SD. N = 50 celler. Student t-test brukes til å finne signifikansverdien (****p < 0,0001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: 72 timer etter transfeksjon av Sf9-celler med fluorescerende merket kinesin-3-motor: Bilder som viser mer enn 90% av Sf9-cellene som uttrykker fluorescerende merket kinesin-3-motor, KIF1A (1-393LZ). Cellene er løst bundet til overflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sf9-renset kinesin-3 motor: Coomassie-farget SDS-PAGE gel som representerer Sf9-renset kinesin-3 motor, KIF1A (1-393LZ) C-terminalt merket med 3xmCit-FLAG. Fra venstre til høyre, Proteinstige (M), BSA standard proteinkontroll, 0,2 μg (bane 2), 0,4 μg (bane 3), 0,6 μg (bane 4), 0,8 μg (bane 5) og 1,0 μg (bane 6), renset kinesin-3 motor (S) (kjørefelt 7). BSA ble brukt som standard for å estimere renset proteinkonsentrasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: In vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyse ved bruk av Sf9 rensede kinesin-3-motorer: (A) Skjematisk strømningscellemotilitetskammer fremstilt ved hjelp av et glassglass, dobbeltsidig tape og glassdeksel. (B) Tegneseriediagram som illustrerer in vitro enkeltmolekylavbildning av fluorescerende merkede motorer som beveger seg langs mikrotubulioverflaten adsorbert på dekselet ved hjelp av Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) mikroskopi. Bare molekylene som er svært nær dekselet blir begeistret på grunn av det unnvikende feltet (~ 150-200 nm) dannet av fullstendig refleksjon av innfallende lys når de belyses i en vinkel utenfor den kritiske vinkelen. (C) Kymograph viser kinesin-3 motor som går prosessuelt (diagonale hvite linjer) langs mikrotubulioverflaten. Tid på y-aksen (vertikal pil) og avstand på x-aksen (horisontal pil). (D-E) Histogrammene for hastighet (D) og løpslengde (E) ble bestemt ved å spore individuelle motorer som gikk på mikrotubulioverflaten ramme for ramme, og histogrammer ble plottet for hver populasjon av motorer og passet til en enkelt Gaussian. Toppen representerer gjennomsnittlig hastighet og kjørelengde, og verdier vises på grafen som gjennomsnitt ± SEM. N = Antall hendelser som telles. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: In vitro mikrotubuliglidanalyse ved bruk av Sf9 rensede kinesin-3-motorer: (A) Skjematisk strømningscellekammer fremstilt ved hjelp av glassglass, dobbeltsidig tape og glassdeksel. (B) Tegneseriediagram som illustrerer rhodaminmerkede mikrotubuli som glir på overflaten av konstitutivt aktive kinesin-3-motorer. Siden kinesin-3-motorer er C-terminalt merket med mCitrine, ble GFP-nanobodies brukt til å feste dem til glassoverflaten. Deretter ble skjærede rhodaminmerkede mikrotubuli introdusert i strømningskammeret og bilder av mikrotubuliglidbevegelse ble tatt under TIRF-belysning. (C) Kymografen representerer jevn mikrotubuligliding (diagonal hvit stripe) av kinesin-3-motorene. Tid på y-aksen (vertikal pil) og avstand på x-aksen (horisontal pil). D. Histogram av hastigheten ble plottet for en populasjon av mikrotubuli og passet til en enkelt Gaussisk topp. Gjennomsnittlig glidehastighet er angitt øverst til venstre som gjennomsnitt ± SEM. N = Antall molekyler som telles. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Polymeriserte mikrotubuli. TIRF-avbildning av polymeriserte mikrotubuli før fortynning for motilitetsanalyse. Filmen ble anskaffet ved 100 ms eksponering og videoen spilles av med 60 bilder/s. Skala bar, 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: In vitro enkeltmolekylanalyse av den konstitutivt aktive kinesin-3-motoren. Fluorescerende merkede KIF1A (1-393LZ) motorer renset fra Sf9-celler som gradvis beveger seg langs mikrotubulioverflaten (umerket) adsorbert på dekselet i et motilitetsanalysekammer. Avbildning ble utført i TIRF-belysning og bilder ble tatt ved 100 ms eksponering. Video spilles av med 30 bilder/s. Skala bar, 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Mikrotubuli glideanalyse av den konstitutivt aktive kinesin-3-motoren. Rhodaminmerkede mikrotubuli glir jevnt på overflaten av glassdekselet belagt med Sf9 renset KIF1A (1-393LZ) motor. Avbildning ble utført i TIRF-belysning og bilder ble tatt ved 100 ms eksponering. Video spilles av med 60 bilder/s. Skala bar, 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende tabell 1: Buffere og reagenssammensetning. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sf9-baculovirusuttrykkssystemet er en av de mest allsidige og vellykkede metodene for proteinproduksjonmed høy gjennomstrømning 19,36,37. Den posttranslasjonelle modifikasjonsevnen til Sf9-celler er svært sammenlignbar med pattedyrsystemet15. En betydelig ulempe ved å bruke dette systemet er at det er tregt og følsomt for forurensning. Et av de mest kritiske trinnene er effektiv infeksjon og vellykket uttrykk i Sf9-celler, noe som krever riktig håndtering og vedlikehold av Sf9-celler uten forurensning. Systemet krever dedikert støvfri plass og instrumenter som temperaturkontrollert inkubator og shaker. Uregelmessig cellekulturpraksis og bruk av overgrodd kultur vil resultere i dårlig infeksjon, langsom vekst og betydelig celledød.

FLAG-tagrensingen av protein uttrykt i Sf9-celler har flere fordeler. For det første kan Sf9-celler lyses effektivt for å få mesteparten av proteinet i sin aktive og oppløselige form. For det andre har FLAG-harpiks mindre uspesifikk proteinadsorpsjon enn HIS og GST-harpiks38. Som et resultat blir en betydelig mengde protein frigjort i en enkelt-trinns eluering i sin rene form. De Sf9-rensede kinesin-3-motorene viste robuste mikrotubulistimulerte ATP-omsetningshastigheter i de biokjemiske ATPase-analysene14. På samme måte, i in vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyser, viste disse motorene rask og superprosessiv motilitet på overflaten av mikrotubuli. Interessant nok viste disse motilitetsegenskapene bemerkelsesverdig likhet med motilitetsegenskapene målt ved bruk av motorer fremstilt fra pattedyrcellelysater11,12,13. I tillegg samsvarer den målte trinnhastigheten til kinesin-3-motorer i in vitro enkeltmolekylmotilitetsanalysen tett med frekvensen av ATP-hydrolyse målt i biokjemisk ATPase-analyse, noe som tyder på at motorer hydrolyserer ett ATP-molekyl per trinn14. Sammen antyder disse resultatene at kinesin3-motorer renset fra Sf9-baculovirusuttrykkssystemet ga en betydelig stor populasjon av aktive og løselige proteiner. Derfor tror vi at Sf9-baculovirus-systemet kan brukes til å rense motorproteiner av interesse med nødvendige modifikasjoner.

In vitro enkeltmolekylmotilitetsanalyse av kinesin-3-motorer som utviser superprosessiv motilitet trenger polymerisering av lange polymeriserte mikrotubuli. Et kritisk trinn i in vitro-polymerisasjon av lange mikrotubuli er å fremstille en polymerisasjonsblanding med kritisk tubulinkonsentrasjon, inkubasjonstid og passende buffer pH. Tubulinen som brukes til mikrotubulipolymerisering bør være svært kompetent, ren og lagret i flytende nitrogen i små aliquots for å unngå frysing og tining. Tubulin, når det er tint, bør ikke fryses tilbake for fremtidig polymerisering fordi tubulin mister sin kompetanse betydelig i hver fryse-tine-syklus. Inkompetent tubulin vil ikke bidra til mikrotubulipolymerisasjonen, men vil hindre polymerisasjonsprosessen og resultere i korte mikrotubuli med ukjente defekter. Den optimale tubulinkonsentrasjonen i polymerisasjonsblandingen bør være mellom 2,5-3 mg/ml og blandingen bør holdes på is i 5 minutter før den inkuberes ved 37 °C for polymerisasjon. Varigheten av mikrotubulipolymerisasjon bør være mellom 20-30 minutter og bør ikke overstige 30 minutter, da langvarig polymerisering ofte resulterer i dannelse av korte og fragmenterte mikrotubuli.

Deretter er stabilisering av polymeriserte mikrotubuli et andre kritisk trinn. Taxol er dårlig løselig i vann og faller ut i en vandig løsning39. Forbered derfor stabiliseringsbufferen friskt med 10 μM taxol, tilsett forsiktig over den polymeriserte mikrotubuliblandingen, og inkuber videre uten å forstyrre. Bruk alltid frossen taxol aliquot fra fryseren på -20 °C for å klargjøre stabiliseringsbufferen, da tint aliquot resulterer i utfelling/aggregering av polymeriserte mikrotubuli. Håndter alltid de polymeriserte mikrotubuli ved hjelp av skrå tips for å unngå brudd. Mikrotubuli polymerisert ved hjelp av denne metoden gir lange mikrotubuli med 60-70 μm lange egnet for superprosessiv motilitetsanalyse. Det neste kritiske trinnet er stabil adsorpsjon av mikrotubuli til dekkflaten i motilitetskammeret. For å oppnå dette, bør deksler lagres på et tørt sted fordi eksponering av deksler til det fuktige miljøet reduserer mikrotubuli-adsorpsjonseffektiviteten og deres stabilitet betydelig.

Forberedelse av en motilitetsanalyseblanding med riktige ingredienser ved bestemte konsentrasjoner og optimal motorproteinkonsentrasjon er viktig for å oppnå robuste motilitetshendelser langs mikrotubulioverflaten. Den mest avgjørende komponenten for å generere jevn og prosessiv motilitet er å bruke en stabil ATP-løsning i analyseblandingen. (Dermed bør det tas hensyn til hvordan ATP-lageret forberedes. Oppløsning av natriumsaltet av ATP i 10 mM PIPES buffer pH 6.9, gir en klar løsning med svært lav pH. ATP er ekstremt ustabil ved lav pH og hydrolyserer raskt til ADP og fosfat, og holder dermed løsningen kald og umiddelbart justering av pH til 7,0 ved bruk av konsentrert KOH forhindrer hydrolyse.) Flyt motilitetsblandingen inn i strømningscellen og forsegle begge kantene med flytende parafin for å forhindre væskestrøm og tørking av kammeret mens avbildning under TIRF-belysning.

Siden kinesin-3-motorer er raske og superprosessive langs mikrotubulisporene, utgjør bildebehandling, datainnsamling og analyse flere utfordringer. Enkeltmolekylavbildning og datainnsamling bør utføres under lav laserintensitet for å forhindre fotobleking av fluorescerende proteiner før motoren fullfører sin prosessive kjøring. De innsamlede dataene vil være av lav intensitet med dårlig signal-til-støy-forhold. Følgelig vil sporing av disse individuelle motilitetshendelsene ved hjelp av eksisterende automatisert sporingsprogramvare for å karakterisere deres motilitetshendelser være vanskelig. Derfor må dataanalyse utføres manuelt ved nøyaktig sporing av fluorescerende merkede motorpunkter som beveger seg langs mikrotubulisporene ramme for ramme med minimale feil. For dataanalyse, fortrinnsvis, velg motilitetshendelsene på de lange mikrotubulisporene for å unngå at motorer når mikrotubulienden før du fullfører kjøringen. For konsistente og reproduserbare resultater, bør du bare vurdere de motilitetshendelsene for å spore, i det minste de siste 10 bildene (500 ms) med en klar start og slutt på prosesskjøringen.

Samlet sett gir metoden flere fordeler i forhold til den eksisterende metoden, for eksempel enkel og en-trinns rensing av aktive motorproteiner, fremstilling av lange mikrotubuli og detaljert trinnvis protokoll med instruksjoner for å oppnå god motilitet. I prinsippet kan metoden brukes til å uttrykke og rense enhver klasse og type proteiner, inkludert men ikke begrenset til myosin, kinesin og dynein. Faktisk har baculovirusuttrykkssystemet blitt etablert for å rense flere virale vaksiner, genterapivektorer og andre farmasøytiske proteiner20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser å erklære.

Acknowledgments

VS og PS takker prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) og prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) for deres ubetingede støtte gjennom hele studien. PS takker Dr. Sivapriya Kirubakaran for hennes støtte gjennom hele prosjektet. V.S. anerkjenner finansiering gjennom DBT (Grant No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 og BT/RLF/Re-entry/45/2015) og DST-SERB (Grant No.: ECR/2016/000913). P.K.N anerkjenner ICMR for finansiering (Grant No. 5/13/13/2019/NCD-III). PS anerkjenner finansiering fra DST (Grant No.: SR / WOS-A / LS-73/2017). DJS anerkjenner fellesskap fra IIT Gandhinagar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For protein purification
Aprotinin Sigma A6279 For protein purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assays and protein purification
FLAG peptide Sigma F3290 For protein purification
Glycerol Sigma G5516 To freeze the protein
HEPES Sigma H3375 For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 For Sf9 lysis buffer
KCl Sigma P9541 For buffers preparation
Leupeptin Sigma L2884 For protein purification
MgCl2 Sigma M2670 For buffers preparation
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For protein purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A. Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. Kumar, D., Gong, C. , Springer International Publishing. 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Tags

Biokjemi utgave 185
Enkeltmolekylanalyse av Sf9 rensede superprosessive Kinesin-3-familiemotorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik,… More

Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter