Summary
Ett protokoll för bearbetning av unga vuxna och äldre gerbil cochleae genom att immunmärka de afferenta synaptiska strukturerna och hårcellerna, släcka autofluorescens i åldrig vävnad, dissekera och uppskatta längden på cochleae och kvantifiera synapserna i bildstaplar erhållna med konfokal avbildning presenteras.
Abstract
Förlusten av bandsynapser som förbinder inre hårceller och afferenta hörselnervfibrer antas vara en orsak till åldersrelaterad hörselnedsättning. Den vanligaste metoden för att detektera förlusten av bandsynapser är immunmärkning eftersom det möjliggör kvantitativ provtagning från flera tonotopiska platser i en enskild cochlea. Strukturerna av intresse är dock begravda djupt inne i den beniga cochlea. Gerbils används som en djurmodell för åldersrelaterad hörselnedsättning. Här beskrivs rutinprotokoll för fixering, immunmärkning av gerbil cochleära helfästen, konfokal avbildning och kvantifiering av bandsynapsnummer och volymer. Vidare lyfts de särskilda utmaningar som är förknippade med att få bra material från värdefulla åldrande individer fram.
Gerbiler avlivas och antingen perfuseras kardiovaskulärt, eller så dissekeras deras tympaniska bullae noggrant ut ur skallen. Cochleae öppnas vid toppen och basen och överförs direkt till fixativet. Oavsett den ursprungliga metoden postfixeras cochleae och avkalkas därefter. Vävnaden märks sedan med primära antikroppar mot pre- och postsynaptiska strukturer och hårceller. Därefter inkuberas cochleae med sekundära fluorescensmärkta antikroppar som är specifika mot deras respektive primära. Cochleae hos åldrade gerbiler behandlas sedan med en autofluorescenssläckare för att minska den typiskt betydande bakgrundsfluorescensen hos äldre djurs vävnader.
Slutligen dissekeras cochleae i 6-11 segment. Hela cochleärlängden rekonstrueras så att specifika cochleära platser kan bestämmas på ett tillförlitligt sätt mellan individer. Konfokala bildstaplar, förvärvade sekventiellt, hjälper till att visualisera hårceller och synapser på de valda platserna. De konfokala stackarna är dekonvolverade, och synapserna räknas antingen manuellt med hjälp av ImageJ, eller så utförs mer omfattande kvantifiering av synaptiska strukturer med bildanalysprocedurer specialskrivna i Matlab.
Introduction
Åldersrelaterad hörselnedsättning är en av världens vanligaste sjukdomar som drabbar mer än en tredjedel av världens befolkning i åldern 65 år och äldre1. De bakomliggande orsakerna diskuteras fortfarande och undersöks aktivt men kan inkludera förlusten av de specialiserade synapserna som förbinder inre hårceller (IHC) med afferenta hörselnervfibrer2. Dessa bandsynapser består av en presynaptisk struktur som har vesiklar fyllda med neurotransmittorn glutamat bunden till den, liksom postsynaptisk α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) glutamatreceptorer 3,4,5. I gerbilen kommer ~20 afferenta hörselnervfibrer i kontakt med en IHC 6,7,8. Fibrer på IHC som vetter mot modiolus står emot stora synaptiska band, medan fibrerna som förbinder på pelarsidan av IHC möter små synaptiska band (dvs. hos katter9, gerbiler7, marsvin10 och möss 3,11,12,13,14). Vidare, i gerbilen, är storleken på de presynaptiska banden och de postsynaptiska glutamatplåsterna positivt korrelerade 7,14. Fibrer som står emot stora band på den modiolära sidan av IHC är små i kaliber och har låga spontana hastigheter och höga trösklar15. Det finns bevis för att fibrer med låg spontan hastighet är mer sårbara för bullerexponering10 och ototoxiska läkemedel16 än fibrer med hög spontan låg tröskel, som ligger på pelarsidan av IHC15.
Förlusten av bandsynapser är den tidigaste degenerativa händelsen vid cochleär neural åldersrelaterad hörselnedsättning, medan förlusten av spiral ganglionceller och deras afferenta hörselnervfibrer ligger efter17,18. Elektrofysiologiska korrelat inkluderar inspelningar av auditiva hjärnstamssvar17 och sammansatta åtgärdspotentialer8; dessa återspeglar emellertid inte subtiliteterna av synapsförlust, eftersom fibrer med låg spontan hastighet inte bidrar till dessa åtgärder16. Mer lovande elektrofysiologiska mätvärden är masspotential-härledd neuralt index19 och peristimulus tidsrespons20. Dessa är emellertid endast tillförlitliga om djuret inte har några andra cochleära patologier, utöver hörselnervfiberförlust, som påverkar aktiviteten hos de återstående hörselnervfibrerna8. Dessutom var beteendebedömda trösklar i gerbilen inte korrelerade med synapsnummer21. Därför är tillförlitlig kvantifiering av överlevande bandsynapser och därmed antalet funktionella hörselnervfibrer endast möjlig genom direkt undersökning av cochleärvävnaden.
Den mongoliska gerbilen (Meriones unguiculatus) är en lämplig djurmodell för att studera åldersrelaterad hörselnedsättning. Den har en kort livslängd, har lågfrekvent hörsel som liknar människor, är lätt att underhålla och visar likheter med mänskliga patologier relaterade till åldersrelaterad hörselnedsättning 2,22,23,24. Gerbils anses vara åldrade när de når 36 månaders ålder, vilket är nära slutet av deras genomsnittliga livslängd22. Viktigt är att en åldersrelaterad förlust av bandsynapser har visats i gerbiler upphöjda och åldrade i tysta miljöer 8,21.
Här presenteras ett protokoll för att immunmärka, dissekera och analysera cochleae från gerbiler i olika åldrar, från unga vuxna till äldre. Antikroppar riktade mot komponenter i presynapsen (CtBP2), postsynaptiska glutamatreceptorplåster (GluA2) och IHC (myoVIIa) används. En autofluorescenssläckare appliceras som minskar bakgrunden i åldriga cochleae och lämnar fluorescenssignalen intakt. Vidare ges en beskrivning av hur man dissekerar snäckan för att undersöka både det sensoriska epitelet och stria vascularis. Cochleärlängden mäts för att möjliggöra val av distinkta cochleära platser som motsvarar specifika bästa frekvenser25. Kvantifiering av synapsnummer utförs med den fritt tillgängliga programvaran ImageJ26. Ytterligare kvantifiering av synapsvolymer och platser inom den enskilda HC utförs med programvara anpassad i Matlab. Denna programvara görs inte offentligt tillgänglig, eftersom författarna saknar resurser för att tillhandahålla professionell dokumentation och support.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll och förfaranden godkändes av de behöriga myndigheterna i Niedersachsen, Tyskland, med tillståndsnummer AZ 33.19-42502-04-15/1828 och 33.19-42502-04-15/1990. Detta protokoll är för mongoliska gerbiler (M. unguiculatus) av båda könen. Ung vuxen avser åldern 3-12 månader, medan gerbiler anses vara i åldern 36 månader och äldre. Om inget annat anges kan buffertar och lösningar beredas och förvaras i kylen i upp till flera månader (4-8 °C). Se till att buffertarna och lösningarna inte har fällts ut före användning.
1. Fixering och organsamling
OBS: Om endast cochleae behövs, rekommenderas att utföra det något enklare förfarandet för fixering genom nedsänkning. Men om en välbevarad hjärna också behövs, är transkardiell perfusion det enda alternativet. Fixeringsmedlet i båda fallen är 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Detta bör vara nygjort men kan förvaras fryst tills det används. Använd alikvoter på ~ 300 ml för en transkardiell perfusion eller ~ 50-100 ml per cochlea för fixering genom nedsänkning.
VARNING: PFA är ett farligt ämne; hantera det enligt allmänna laboratoriesäkerhetsprocedurer.
- Fixering genom transkardiell perfusion
- Spola perfusionsinställningen tills slangen är fri från luftbubblor. Fyll perfusionsslangen med PBS innehållande heparin (0,2 ml i 100 ml PBS) för att förhindra blodkoagulering. Stoppa flödet när slangen är fylld med PBS och vätskeförvaringsflaskan just har tömts; häll 200 ml tinad PFA i den.
OBS: Installationen är nu klar för djuret. Den återstående PBS i slangen är tillräcklig för att spola ut blodet och kommer automatiskt att följas av fixativet när flödet återupptas. - Se till att det finns ett avfallsinsamlingssystem för utflödet av PFA. Använd en färsk kanyl (19 G) och ha stora saxar, pincett (med en tillplattad spets), hemostater, skalpell eller vass kanyl och en gummimatta med stift till hands.
- Avliva gerbilen med en intraperitoneal överdosering av pentobarbital (160 mg/ml, 0,3 ml per djur, kroppsviktsintervall: 50-120 g). Sätt tillbaka djuret i sin bur. När andningsstoppet sätter in så att andningen blir oregelbunden med intervaller på 30 s eller längre, placera gerbilen på ryggen på gummimattan och fixera både framtassar och en baktass med stift (lämna en baktass fri att röra sig för bättre bedömning av perfusionsframgång; se anteckning efter steg 1.1.7).
- För att öppna brösthålan, lyft huden ovanför bröstbenet med pincett och skär huden cirka 0,5 cm under bröstbenet med sax tills den vitfärgade processus xiphoideus är synlig. Håll bröstbenet vid processus xiphoideus med pincett och skär längs membranet för att få en bra utsikt in i brösthålan. Skär revbenen i sidled på båda sidor tills det finns god tillgång till hjärtat. Se till att saxens vinkel är parallell och platt i förhållande till gerbilens kropp för att undvika skador på organ och därmed säkerställa ett slutet cirkulationssystem.
- Kläm fast en hemostat på bröstbenet, lyft bröstkorgen och placera hemostaten över gerbilens axel utan att vila hemostaten på några kroppsdelar för att undvika att blockera blodflödet.
- Öppna vätskeflödet något tills en droppe PBS rinner ut ur kanylen (19 G) ungefär var 2: e sekund. Håll hjärtat med pincett och vrid det lite åt vänster så att vänster kammare tydligt kan ses. Sätt in kanylen i vänster kammare i en vinkel som undviker att tränga in i septumet. Håll nålen på plats antingen för hand eller med en annan hemostat.
OBS: Vänster och höger kammare kan differentieras genom sina olika färgnyanser; vänster ventrikel verkar ljusare i färg än resten av hjärtvävnaden. - Öka långsamt trycket i vätskeflödet och öppna det högra atriumet antingen med en fin sax, en skalpell eller en annan kanyl. Öppna vätskeflödet ytterligare tills cirka 2-3 droppar/s observeras vid droppkammaren, eller ställ in ett flöde på 4 ml/min för pumpen. När fixeringen av hjärtat sätter in, se till att perfusionskaninen förblir på plats utan att hållas längre.
OBS: Tecken på framgångsrik perfusion är långsamma muskelsammandragningar, förstyvning av nacke och extremiteter, levern blir blek och rosiga lungor. Tecknet på misslyckad perfusion är blekning av lungorna, vilket indikerar att lungcirkulationen är perfuserad på grund av punktering av septum. - Vid misslyckad perfusion, försök att flytta kanylen längre upp, in i aortan och kläm fast den på plats med en hemostat.
- Halshugga gerbilen. Ta bort bullae och skär och bryt bort benet enligt beskrivningen i steg 1.2.2.
OBS: Om vävnaden inte är tillräckligt fixerad kommer det sensoriska epitelet att lossna från Cortis organ under dissektion. - Om perfusionen inte visar några tecken på fixering inom 5-10 min, avbryt den och följ omedelbart proceduren nedan för fixering genom nedsänkning. För det, behandla snäckan som i steg 1.2.2 och postfixera vävnaden i cirka 50-80 ml 4% PFA i skruvlocksbehållare i 1-2 dagar på en 2D-shaker vid 8 ° C.
OBS: Eftersom det kan vara svårt att i slutändan betygsätta fixeringskvaliteten under perfusion, rekommenderas det att rutinmässigt postfixa cochleae enligt beskrivningen.
- Spola perfusionsinställningen tills slangen är fri från luftbubblor. Fyll perfusionsslangen med PBS innehållande heparin (0,2 ml i 100 ml PBS) för att förhindra blodkoagulering. Stoppa flödet när slangen är fylld med PBS och vätskeförvaringsflaskan just har tömts; häll 200 ml tinad PFA i den.
- Fixering genom vävnadsfördjupning
- Avliva gerbilerna med en intraperitoneal överdosering av pentobarbital (160 mg/ml, 0,3 ml per djur, kroppsviktsintervall: 50-120 g). När gerbilen har slutat andas, halshugga djuret.
- Ta bort bullae och skär och bryt bort benet med sax respektive pincett för att nå cochleae. Ta bort maellus, incus och halvcirkelformade kanaler. Gör små hål i toppen och i basalvarven genom att försiktigt skrapa över cochlearbenet med pincett. Överför omedelbart bullae till ett överskott av kallt fixativ (minst 50 ml) och fixera vävnaden i kylan (4-8 ° C) under mild omrörning (2D-shaker [100 rpm]) i 2 dagar.
OBS: Efter fixering av vävnaden kan cochleae antingen bearbetas omedelbart eller lagras i PBS med 0,05% natriumazid. VARNING: Natriumazid är giftigt. Observera att lagringstiden kan påverka färgningens kvalitet negativt. Begränsade studier har föreslagit att immunfärgningen verkade svagare efter 2 års lagring av vävnaden i natriumazid.
2. Vävnadsberedning och immunmärkning
- Lös upp etylendiamintetraättiksyra (EDTA) pulver i PBS för att producera en 0,5 M lösning vid pH 8. För detta, placera en bägare på en magnetisk omrörare, fyll den med ungefär hälften av den totala mängden PBS och tillsätt lämplig mängd EDTA-pulver, vilket resulterar i en sur suspension. Tillsätt försiktigt koncentrerad natriumhydroxidlösning (NaOH) medan du övervakar pH med en pH-mätare. Fyll på pbs till önskad slutvolym och filtrera lösningen för att förhindra mikrobiell kontaminering.
OBS: EDTA-pulvret löses upp helt först när suspensionen har nått ett neutralt pH-värde. - För avkalkning, överför cochleae till 80 ml 0,5 M EDTA i PBS. Inkubera vävnaden i kylan (4-8 °C) under försiktig omrörning på 2D-shakern (100 rpm) i 2 dagar.
OBS: Efter avkalkningssteget kan vävnaden lagras i PBS i flera dagar upp till 3 veckor innan den fortsätter med de återstående bearbetningsstegen. För antikroppar som märker stria vascularis är det lämpligt att skära cochleae i hälften längs den modiolära axeln vid denna punkt (dvs. före immunfärgning) för att säkerställa enhetlig tillgång av antikroppar till sina respektive mål. Detta är antikroppsberoende och gäller inte de antikroppar som används här för att märka synaptiska strukturer och IHC. Använd en bit brytbart rakblad och en bladhållare (enligt beskrivningen i steg 4.2) för skärningen. - Utför följande steg (upp till steg 3.2) i 2 ml reaktionsrör för säker tätning. Om vävnadsbiten är för stor för att passa in i röret, trimma överflödig vävnad med sax. För att förbättra antikropparnas penetration, permeabilisera först vävnaden i 1 ml 1% triton (Triton X-100) i PBS på 2D-shakern (100 rpm) vid rumstemperatur i 1 h. Tvätta vävnaden 3x med 1 ml 0,2% triton (Triton X-100) i PBS på 2D-shakern (100 rpm) vid rumstemperatur i 5 min vardera.
- För att blockera ospecifika antigener, inkubera cochleae i 1 ml blockerande lösning (3% bovint serumalbumin [BSA], 0,2% triton, i PBS) på 2D-shakern (100 rpm) vid rumstemperatur i 1 h.
OBS: Blockeringslösningen kan förberedas i förväg men bör inte vara äldre än ~ 10 dagar. - Späd följande primära antikroppar nyligen i samma alikvot av blockerande lösning: anti-myoVIIa (myosin VIIa) för att märka IHC (IgG polyklonal kanin), utspädd 1:400; anti-CtBP2 (C-terminalt bindande protein 2) för att märka presynaptiska band (IgG1 monoklonal mus), utspädd 1:400; och anti-GluA2 för att märka postsynaptiska receptorplåster (IgG2a monoklonal mus), utspädd 1:200. Se till att snäckorna är helt täckta med antikroppslösningen (vanligtvis 0,4 ml) och inkubera dem vid 37 °C i 24 timmar.
- Tvätta sedan vävnaden 5x med 0,2% triton i PBS på 2D-shakern (100 rpm) vid rumstemperatur i 5 min vardera. Välj sekundära antikroppar för att matcha värdarterna hos deras primära motsvarigheter och späd dem igen i 3% BSA, 0,2% triton, i PBS: get-antimus (IgG1) -Alexa fluorophore (AF) 488, utspädd 1: 1,000; get anti-mus (IgG2a)-AF568, utspädd 1:500; och åsna anti-kanin-AF647 (IgG), utspädd 1:1 000. Vik in röret i aluminiumfolie för att förhindra blekning av fluorescensen. Inkubera snäckorna i 0,4 ml sekundär antikroppslösning vid 37 °C i 24 timmar.
OBS: Begränsade studier har visat att inkubation av cochleär vävnad vid 37 °C i 24 timmar med primära och sekundära antikroppar resulterade i ljusare immunfärgning än efter det vanligare inkubationsförfarandet med lägre temperaturer och kortare varaktighet. - Tvätta snäckorna 2x med 1 ml 0,2% triton i PBS i 5 min vardera och 3x med PBS i 5 min vardera på 2D-shakern (100 rpm) vid rumstemperatur.
OBS: Efter dessa tvättsteg kan snäckorna ligga kvar i PBS i kylen vid ~ 4 ° C i flera dagar.
3. Behandling med autofluorescenssläckare (tillval)
OBS: Cochleae från medelålders och åldrade gerbiler visar omfattande bakgrundsautofluorescens. I ung vuxen vävnad är behandling med en autofluorescenssläckare inte nödvändig. Det är i princip möjligt att applicera autofluorescenssläckaren före immunfärgningsproceduren, vilket sedan undviker oavsiktlig reduktion av den önskade antikroppsfluorescensen. Enligt tillverkarens datablad är det emellertid inte längre möjligt att använda tvättmedel (som Triton X-100 i det aktuella protokollet) eftersom de tar bort släckaren från vävnaden.
- Skär snäckorna på mitten under ett stereomikroskop, enligt beskrivningen i steg 4.2.
- Blanda autofluorescenssläckaren med 70% etanol för att erhålla en 5% lösning och inkubera cochleae i denna lösning på 2D-shakern vid rumstemperatur i 1 min. Tvätta snäckan 3x med 1 ml PBS på 2D-shakern vid rumstemperatur i 5 min vardera.
VARNING: Autofluorescenssläckaren är farlig och skadlig. Använd handskar vid hantering av detta ämne.
4. Slutlig fin dissektion
- Dissekera snäckan under ett stereomikroskop. Fyll en polystyrole Petri-skål och dess lock med PBS och håll två fina pincett, Vannas fjädersax, en bladhållare och ett brytbart rakblad till hands. Bryt bitar från rakbladet för att få en skäryta på ~2-4 mm beroende på dissektionssteget. Förbered ett mikroskopglas genom att placera tre droppar monteringsmedium i rad.
OBS: Rakbladets skäryta slits snabbt av. Bladet måste bytas ut efter dissekering och montering ungefär varannan bit av snäckan. - Om det inte redan är gjort i steg 3.1, skär först snäckan i hälften längs modiolus under ett stereomikroskop. För detta, placera en bit av ett rakblad längre än den lindade längden på snäckan i en bladhållare. Lägg snäckan i petriskålen och skär bort överflödig vävnad med rakbladsbiten. Håll snäckan på plats med fina pincett och skär i hälften längs modiolusen.
- Börja med ena halvan, men lämna den andra halvan i petriskålen också. Fixera försiktigt cochlearhalvan med pincett så att skäreggen är vänd uppåt. Använd en fin fjädersax för att skära bort snäckans ben ovanför helikotreman och täck toppen.
- För att påbörja separationen av de cochleära bitarna, isolera mittvarven genom att klippa med sax genom modiolus och hörselnerven, ovanför (scala vestibuli) och under (scala tympani).
- Skär igenom det cochleära benet som täcker stria vascularis i cochlea kanalen. Gör två snitt på båda sidor av cochleabenet ovanför Cortis organ och längs stria vascularis och använd rakbladet för att så småningom separera cochleastyckena.
OBS: Stria vascularis är lätt synlig som en mörk rand. Skärning längs stria vascularis lämnar Cortis organ intakt. - Valfritt: För att samla stria vascularis, skär försiktigt mellan Cortis organ och stria vascularis för att skilja de två. Lämna stria vascularis ansluten till spiralbandet (fäst vid benet som täcker snäckans yttre yta) och ta bort det avkalkade benet med pincett. Placera biten med striasidan uppåt på mikroskopglaset i en droppe monteringsmedium.
OBS: Om den uppsamlade biten är böjd för starkt kan det vara nödvändigt att dela den i mindre bitar för att den ska vara tillräckligt platt för montering på bilden. - Överför cochleadelar till det PBS-fyllda locket på petriskålen med polystyrol och se till att de cochleära hela fästena ligger så plant som möjligt på bilden. Ta bort överflödig vävnad, såsom delar av spiralbandet på den abneurala sidan och delar av spiralbenet på neuralsidan. Ta försiktigt bort tectorialmembranet med superfina pincett.
- Placera cochleadelar på bilden i en droppe monteringsmedium. Placera cochleära hela fästen med Cortis organ uppåt på bilden för att undvika att dölja IHC:erna i den optiska vägen för avbildning. Leta efter invagination av spiral limbus i närheten av IHC: erna, vilket är synligt genom att flytta cochleastycket in i sagittalplanet för att identifiera sidan mot ansiktet uppåt.
OBS: För att digitalt rekonstruera hela snäckan från dess enskilda bitar under vidare bearbetning rekommenderas det starkt att dokumentera skisser av bitarna och notera landmärken. Dessutom bör bitarna helst ordnas i rätt ordning på bilden. - Upprepa steg 4.3 till 4.8 tills hela hörselsnäckan överförs till mikroskopglaset. Lägg vid behov till mer monteringsmedium, täckglaset och täta täckglaset på plats med svart nagellack målat runt kanterna. Låt det torka i mörker vid rumstemperatur och förvara sedan dialyset i mörker vid 4 °C.
OBS: Även om delar av själva det sensoriska epitelet av misstag går förlorade, är det viktigt att ändå montera det som finns kvar av cochleastycket för korrekt längduppskattning.
5. Mätning av cochleär längd
- Mät längden på hörselsnäckan från ljusfältsbilder av dess bitar med hjälp av ett epi-fluorescensmikroskopsystem och tillhörande programvara. Spara bilder med låg förstoring (4x lins) från varje cochleär del och använd lassomätningsverktyget i mikroskopprogrammet för att rita en linje längs raden med IHC i var och en av bilderna. Beräkna den totala längden genom att lägga till längderna på alla bitar.
OBS: När delar av det sensoriska epitelet saknas i ett cochleärt stycke, interpolera linjen. - För att definiera de cochleära platser som ska analyseras i en enskild snäcka, beräkna deras motsvarande avstånd från toppen med hjälp av ekvationen som ges av Müller25. Markera dessa platser, till exempel på en utskrift av cochlea-bitarna.
6. Bildförvärv med ett konfokalmikroskop
- Använd ett konfokalmikroskop med ett oljedykningsmål på 40x (numerisk bländare 1.3) och lämplig olja för högupplöst avbildning.
OBS: Om konfokalmikroskopet har en inverterad ljusväg måste bilden placeras upp och ner. Ge i så fall provet cirka 30 minuter att sjunka och vila stabilt på täckglaset innan du påbörjar den slutliga skanningen. Alternativt kan du använda ett monteringsmedium som är flytande under hela dissektionsperioden men stelnar senare och samtidigt bevarar fluorescensen. - Aktivera lämpliga lasrar: två optiskt pumpade halvledarlasrar med våglängderna λ = 488 nm och λ = 522 nm och en diodlaser med våglängden λ = 638 nm används i detta protokoll. Välj utsläppsområdet för fluorescenstaggarna (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). När en hybriddetektor räknar de frigjorda fotonerna, placera laserlinjen minst 10 nm från emissionskurvan.
OBS: Det är viktigt att utföra preliminära kontroller med enkelmärkt vävnad för att säkerställa att de valda detektorbandbredderna separerar färgkanalerna rent (dvs. inte leder till kanalöverhörning). Radiovågor stör hybriddetektorn, vilket resulterar i maximalt fotonantal och orsakar därmed artefaktiska ränder i stapeln. Undvik därför att använda en mobiltelefon nära mikroskopet. - Zooma in på vävnaden tills bilden sträcker sig över 10 IHC. Välj upplösning på bilden enligt Nyquist sampling, som vanligtvis är ~40-60 nm/pixel. Ställ in stegstorleken i z-riktningen till 0,3 μm och bildhastigheten till 400-700 Hz.
Båda dessa inställningar (stegstorlek och bildhastighet) är kompromisser mellan att använda optimala bildparametrar och spara skanningstid. - Utför dubbelriktad provtagning för att förkorta avbildningstiden. Ackumulera ramen för 488 nm och 638 nm kanal 3x och för 522 nm kanal 6x; dessutom, genomsnitt linjerna 3x för varje kanal. Välj början och slutet av stapeln i z-dimensionen.
- Ställ in förstärkningen på 100 när du använder hybriddetektorn (räkningsläge) för att undvika minskat signal-brusförhållande. Ställ in lasereffekten så att ingen pixel är mättad i det intressanta området men strukturerna täcker mestadels hela 8-bitarsområdet. Börja med en låg lasereffekt på 0,5% och öka den tills strukturerna är synliga.
OBS: Bra färgning behöver vanligtvis en lasereffekt mellan 0.1% och 5%. - Använd dekonvolutionsprogramvara för post hoc-bearbetning av bildstaplarna för att ta bort suddig halo runt små fluorescerande strukturer med hjälp av en teoretisk punktspridningsfunktion. Använd samma inställningar för varje stack i ett experiment. Spara de dekonvolverade bilderna som .tif eller .ics.
OBS: MyoVIIa-etiketten (IHC) drar inte nytta av dekonvolution och kan utelämnas för att spara tid. Programvaran använder metadata för bildfilerna; emellertid måste flera parametrar som ljusvägen, inbäddningsmediet eller nedsänkningsmediet anges.
7. Synapskvantifiering
- Öppna en kopia av de dekonvolverade stackarna i den fritt tillgängliga programvaran ImageJ med ytterligare Biovoxxel-plugin, som också finns på deras webbplats.
- Justera färgerna på enskilda kanaler genom att dela kanalerna (Bild | Färg | Dela kanaler) och sammanslagning (bild | Färg | Slå samman kanaler) dem igen och tilldela olika färger. Konvertera bilden till en RGB-stack (Bild | Färg | Stapla till RGB) och justera ljusstyrkan och kontrasten (| Justera | Ljusstyrka/| antingen Auto eller skjutreglage angående Maximum), om det behövs, så att de pre- och postsynaptiska strukturerna och IHC-etiketten skiljer sig behagligt från bakgrunden.
- Välj fem IHC och märk dem med textverktyget (IHC1-IHC5) genom att klicka på önskad plats i stapeln. Öppna ROI-hanteraren (Analysera | Verktyg | ROI-chef); aktivera kryssrutan Etiketter för att märka punkterna med ett nummer. Zooma in på IHC av intresse.
- Använd punkt-/flerpunktsverktyget i flerpunktsläge (högerklicka på verktyget för att välja mellan punkt- eller flerpunktsläge). Klicka på en funktionell bandsynaps (dvs. ett presynaptiskt band i nära anslutning till en postsynaptisk glutamatplåster) medan du bläddrar genom z-dimensionen.
Beroende på hur mycket överlappning de har och vilken färg som valts för varje kanal visas de delade pixlarna i blandad färg. Vanligtvis är skillnaden mellan enskilda funktionella synapser enkel eftersom de är tillräckligt avlägsna från varandra. - När alla strukturer av intresse är markerade klickar du på Lägg till i ROI-chefens grafiska användargränssnitt. Klicka på det godtyckliga namnet och välj Byt namn.
Punktetiketterna stannar fortfarande kvar genom alla plan i stapeln när kryssrutan Visa alla är markerad i punktverktygets alternativmeny (dubbelklicka på punktverktygsikonen ), vilket hjälper till att undvika att räkna samma bandsynaps flera gånger. - När du väljer nästa IHC att räkna, undvik att oavsiktligt lägga till räkningar genom att justera bilden så att nästa IHC visas helt med handverktyget. Byt från flerpunktsverktyg till punktverktyg för att undvika att lägga till mer puncta till tidigare lagrade data. Klicka på en struktur av intresse inom nästa IHC och ändra tillbaka till multipoint-verktyget. Upprepa steg 7.4 till 7.5 tills alla IHC: er av intresse har utvärderats.
- För att spara data, klicka på en datauppsättning i ROI-hanteraren och sedan på mått. Vänta tills ett nytt fönster visas med en lista över mätdatapunkterna. Spara den här listan som en kalkylbladsfil (File | Spara som). Spara bilden genom att aktivera Visa alla i ROI-hanteraren. Klicka på Platta ut för att permanent lägga till punktetiketterna i stapeln. När du stänger bildstacken godkänner du att spara ändringarna.
8. Analys av synapsvolym och position på hårcellen
OBS: Författarna använde en anpassad programmerad procedur baserad på Matlab. Eftersom den inte är allmänt tillgänglig beskrivs den här endast i stora drag (se även7). Kontakta motsvarande författare om du är intresserad av att använda den. Proceduren förväntar sig en trippelmärkt (IHC, pre- och postsynaptisk) bildstack i TIFF-format som indata, guidar användaren genom de olika analysstegen via ett grafiskt gränssnitt och ger omfattande utdata av resultaten i kalkylbladsformat.
- Normalisera positionen för de synaptiska strukturerna till ett 3D-koordinatsystem som definieras av den enskilda IHC: s utsträckning på den pelarmodiolära axeln och den cochleära apikal-basala axeln och IHC: s övre (kutikulära platta) till botten (synaptisk pol) axel.
OBS: Volymerna av synaptiska element (både pre- och postsynaptiska och den kombinerade volymen av funktionella synapser) tillhandahålls i μm3 och normaliseras till respektive medianvärde3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cochleae skördades antingen efter kardiovaskulär perfusion med fixering av hela djuret eller dissekerades snabbt efter avlivning av djuret och nedsänkningsfixerade. Med den senare metoden stannade IHC: erna på plats under dissektion, medan i fall av misslyckad perfusion och därmed otillräckligt fixerad vävnad förstördes det sensoriska epitelet ofta. Observera att författarna stötte på fall där fixering av cochleae efter transkardiell perfusion var otillräcklig medan fixering av hjärnan fortfarande var tillräcklig. Vävnad från en sämre perfusion kan fortfarande räddas genom att öppna hål i den cochleära toppen och basen och efterfixera cochleae genom nedsänkning i 4% PFA i 2 dagar.
Längdbestämning av hela snäckan utfördes enligt Müller25 för att utvärdera IHC och deras synapser vid specifika cochleära positioner, motsvarande distinkta karakteristiska frekvenser (tabell 1). För detta beräknades de önskade cochleära positionerna som procentandelar av basilär membranlängd från cochleärbasen. Medianvärdet för cochleär längd på 13 cochleae från unga vuxna gerbiler var 11,3 mm (interkvartilintervall: 11,02-11,52 mm). Medianvärdet för cochleaär längd på 24 cochleae från åldrade gerbiler var 11,5 mm (interkvartilintervall: 11,24-11,73 mm). Det fanns ingen signifikant skillnad mellan längden på unga vuxna och åldrade cochleae (Mann-Whitney U-test: U = -1,62, p = 0,105); den totala medianen var 11,48 mm. Man kan hävda att denna variation i längden på enskilda snäckor var liten och att använda fasta längdlägen (i mm) är tillräcklig. Platsfrekvensfunktionen är emellertid icke-linjär. Därför orsakar en avvikelse från medianlängden ett större fel för basala cochleära platser än för relativt mer apikala cochleära platser. Till exempel, för den cochleära platsen som motsvarar en frekvens på 1 kHz, beräknad baserat på median cochleärlängden (dvs. 11,48 mm), varierade motsvarande frekvens från 1,16 kHz till 0,91 kHz för den kortaste (10,36 mm) respektive den längsta cochlea (12,28 mm) i detta prov. För en basalt placerad frekvens (t.ex. 32 kHz) var frekvensområdet 51,62 kHz till 23,97 kHz, för den kortaste respektive längsta snäckan. Därför är det lämpligt att beräkna de enskilda platserna på varje snäcka, särskilt när man undersöker basala cochleära platser.
Figur 1 visar maximal intensitet z-dimension projektioner av cochleae från en ung vuxen (10 månader, figur 1A) och en åldrad gerbil (38 månader, figur 1B), som är exempel på ideala immunetiketter. På bilden som föreställer den unga vuxna gerbilens snäcka står de myoVIIa-märkta IHC: erna, här visade i blått, i skarp kontrast till den svarta bakgrunden. Därför är enskilda IHC: er lätt detekterbara. De pre- och postsynaptiska strukturerna är tydligt synliga som gröna respektive röda element. De antas bilda en funktionell synaps när de befinner sig i nära varandra (figur 1A',B'). Det fanns sällan oparade presynaptiska strukturer (föräldralösa band) som var uppenbara i cochleae av åldrade gerbiler. Snäckan från den gamla gerbilen (figur 1B) behandlades med autofluorescenssläckaren. IHC-etiketten verkar svagare, även om laserkraften som användes i detta prov var tre gånger högre än den som användes för snäckan från den unga vuxna gerbilen. Ändå skiljer sig IHC fortfarande från bakgrunden. De pre- och postsynaptiska strukturerna är tydligt synliga, och laserkraften som användes för båda dessa kanaler var liknande eller till och med under den för det unga vuxna provet. Vävnad från åldriga djur visade vanligtvis betydligt mer ospecifik fluorescerande signal. Därför är den största skillnaden i protokollet för ungt vuxen och åldrat material behandlingen med en autofluorescenssläckare. Observera att detta utfördes efter immunfärgningen med fluorescensmärkta antikroppar och i princip också kan påverka den avsedda antikroppsetiketten. Behandlingen minskade emellertid effektivt främmande fluorescens av ospecifikt ursprung, samtidigt som den lämnade tillräcklig signal om den specifika etiketten för strukturerna av intresse (jämför figur 1B med figur 2B). Preliminära resultat indikerade dock att främmande fluorescens i stria vascularis inte manifesterades i prover från åldrade gerbiler.
Exempel på staplar som bearbetats suboptimalt visas i figur 2. Figur 2A visar den maximala intensiteten z-projektion av en stapel från en gammal gerbil (36 månader), där IHC: erna, som också antingen var onaturligt böjda eller slet isär, inte skannades i sin helhet. Som ett resultat är endast de apikala och basala polerna av IHC synliga i denna skanning. Det kan inte uteslutas att fler synapser var belägna i den saknade mittdelen av IHC: erna och därför är en tillförlitlig analys inte möjlig. Således är det avgörande att alla utvärderade IHC skannas helt i konfokalstacken. Figur 2B visar den maximala intensiteten z-projektion av en stack som provtagits i en åldrad gerbil (38 månader). Fluorescensen av oklart ursprung är hög eftersom autofluorescenssläckaren inte användes i detta fall. Den främmande fluorescensen var emellertid till stor del begränsad till den (röda) kanalen associerad med GluA2-etiketten, vilket är ganska typiskt. I sådana fall kan det fortfarande vara möjligt att räkna funktionella synapser om CtBP2-etiketten för banden är relativt ren och specifik. Figur 2C visar den maximala intensiteten z-projektion av en stapel erhållen från en åldrad gerbil (42 månader). Här kan synapserna inte tilldelas enskilda IHC: er eftersom IHC: erna till stor del sönderdelades; Det är faktiskt svårt att vara säker på hur många IHC som är representerade. I exemplet som visas i figur 3A användes en mobiltelefon i närheten av konfokalmikroskopet under skanningen. Ränder är synliga i den blå kanalen (IHC-etikett). Lyckligtvis påverkade detta i detta fall inte de synaptiska kanalerna och påverkade endast den övre delen av IHC: erna, så en analys var fortfarande livskraftig.
Figur 3 visar maximal intensitet z-projektioner av staplar tagna från samma bit cochlea från en ung vuxen gerbil, förvärvad 3 månader (figur 3A,A') och 29,5 månader (figur 3B,B') efter immunfärgning. För att förbli jämförbara togs bilderna inte från exakt samma plats (som kan ha blekts från den tidigare skanningen) utan från samma cochleära bit. För skanningen som togs vid den senare tidpunkten måste lasereffekten ökas ~ 2- till 3-faldig. Ändå är de märkta strukturerna fortfarande tydliga. Signal-brusförhållandet hade minskat, särskilt i kanalerna som visade postsynaptiska och IHC-strukturer, medan kanalen med den presynaptiska etiketten påverkades mindre. Kvantifiering av funktionella synapser per IHC är fortfarande möjlig.
Typiska resultat för analys av synapsvolym och position på IHC illustreras i figur 4 med hjälp av konfokalstacken som visas i figur 1A. Individuellt definierade IHC visas grafiskt som rutnätsrekonstruktioner i olika färger, med eller utan de funktionella synapserna (definierade genom samlokalisering av pre- och postsynaptiska etiketter) som tilldelas var och en. Denna skärm kan roteras fritt i 3D för att få olika betraktningsvinklar (figur 4A, B). IHC kan också väljas ut för grafisk visning (figur 4B). Ett stort antal datagrafer, som illustrerar olika aspekter av fördelningen av synaptiska volymer inom det IHC-centrerade koordinatsystemet, produceras (exempel i figur 4C-E). De råa kvantitativa data för varje IHC och varje synaptiskt element finns också som kalkylblad som sedan till exempel kan kombineras över flera konfokala stackar för vidare statistisk analys.
Bild 1: Exempel på framgångsrikt bearbetade snäckor. Maximal intensitet z-projektioner av konfokala stackar från (A) en ung vuxen gerbil (10 månader), erhållen på en cochleär plats motsvarande 1 kHz, och (B) en åldrad gerbil (38 månader, panel B), erhållen på en cochleär plats motsvarande 500 Hz. IHC färgades med en antikropp mot myoVIIa (blå), presynaptiska band märktes med anti-CtBP2 (grön), och postsynaptiska glutamatplåster märktes med anti-GluA2 (röd). Cochlea hos den åldrade gerbilen behandlades med en autofluorescenssläckare efter immunfärgningen. För tydlighetens skull indikeras IHC: s konturer med streckade linjer. Panelerna (A') och (B') visar en utvidgning av de områden som skisseras av rutorna i motsvarande snäckor från panelerna (A) och (B). Gula pilspetsar pekar på funktionella synapser. Kanalerna som visar de pre- och postsynaptiska strukturerna (men inte IHC-kanalen) genomgick dekonvolution. Skalstaplar = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Förkortningar: IHC = inre hårcell; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindande protein 2; GluA2 = jonotrop glutamatreceptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Exempel på suboptimalt bearbetade cochleae. Maximal intensitet z-projektioner av konfokala stackar för vilka bearbetningen var suboptimal, från gerbiler som var (A) 36 månader och (B, C) 38 månader gamla och från cochleära platser motsvarande 16 kHz, 8 kHz respektive 32 kHz. Gerbiler från vilka snäckorna i panelerna (A) och (C) härleddes transkardiellt perfuserades, och snäckan från panel (C) postfixerades dessutom i 3 dagar i 4% PFA. Snäckan från (B) var nedsänkningsfixerad i 4% PFA i 2 dagar. Cochleae från (A) och (C) behandlades med autofluorescenssläckaren. IHC färgades med en antikropp mot myoVIIa (blå), presynaptiska band märktes med anti-CtBP2 (grön) och postsynaptiska glutamatplåster märktes med anti-GluA2 (röd). Alla kanaler var dekonvolverade. Ljusstyrka och kontrast justerades ytterligare efter konfokalskanningen. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: PFA = paraformaldehyd; IHC = inre hårcell; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindande protein 2; GluA2 = jonotrop glutamatreceptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunolabelns stabilitet efter långvarig lagring. Maximal intensitet z-projektioner av konfokala stackar från en ung vuxen gerbil (10 månader), tagna på 16 kHz cochleär plats, (A) 3 månader efter färgning och (B) på en något mer basal cochleär plats på samma cochleastycke 29,5 månader efter färgning. Snäckan var nedsänkningsfixerad i 4% PFA i 2 dagar. För tydlighetens skull zoomar (A') och (B') in på endast några få funktionella synapser från de områden som indikeras med kvadrater i (A) respektive (B). IHC färgades med en antikropp mot myoVIIa (blå), presynaptiska band märktes med anti-CtBP2 (grön) och postsynaptiska glutamatplåster märktes med anti-GluA2 (röd). Lasereffekten för IHC-kanalerna var 1,3% och 3%, för de presynaptiska kanalerna 0,4% och 1,1% och för de postsynaptiska kanalerna 1,1% respektive 2% i (A) och (B). Observera att i (A) är blå ränder synliga i den övre delen av IHC: erna, vilket är resultatet av användningen av en mobiltelefon i närheten av konfokalmikroskopet. Skalstaplar = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Förkortningar: PFA = paraformaldehyd; IHC = inre hårcell; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindande protein 2; GluA2 = jonotrop glutamatreceptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa resultat av kvantifieringen av synapsvolymen (A) Tio IHC visas som olikfärgade rutnätsrekonstruktioner baserade på myoVIIa-immunolabeln. Deras associerade funktionella synapser, definierade av samlokaliserade CtBP2-(grön) och GluA2-märkta element (röd), visas tillsammans med IHC: erna, och även separat nedan, för tydlighetens skull. Observera att synvinkeln valdes för att vara vinkelrät mot IHC: s långa axel och därmed skiljer sig från den ursprungliga konfokala bilden (figur 1A). (B) En av IHC:erna utpekad och visad roterad 90°. Det svarta planet definierades manuellt av användaren och bisekterar IHC längs dess pelarmodiolära axel. (C) Bubbeldiagram som visar placeringen av alla funktionella synapser i denna konfokala stack, i förhållande till de normaliserade tre axlarna i deras respektive IHC. symbolernas storlek är proportionell mot volymen på det presynaptiska elementet. Observera att synvinkeln valdes för att likna panel (B). (D) Boxplot av de normaliserade volymerna av synaptiska element, separat för de presynaptiska (vänstra 2 lådorna) och postsynaptiska (höger 2 lådor) partnerna i funktionella synapser och ytterligare separerade enligt deras position i modiolar- eller pelarhalvan av deras respektive IHC (olika färger). Rutor representerar interkvartilintervall, med medianerna markerade med linjer. Streckade whiskers indikerar 1,5 gånger interkvartilområdet, och korsen indikerar avlägsna värden utöver det. (E) Scatterplot av de normaliserade volymerna av pre- kontra postsynaptiska partners av funktionella synapser. Olika symboler indikerar positionen i modiolar- eller pelarhalvan av deras respektive IHC. Förkortningar: IHC = inre hårcell; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindande protein 2; GluA2 = jonotrop glutamatreceptor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Avstånd från toppen som motsvarar specifika målfrekvenser i snäckor av olika längd. De ekvivalenta bästa frekvenserna beräknades baserat på ekvationen som gavs av Müller25. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den metod som beskrivs i detta protokoll är det möjligt att immunmärka IHC och synaptiska strukturer i cochleae från unga vuxna och äldre gerbiler, identifiera förmodade funktionella synapser genom samlokalisering av pre- och postsynaptiska element, fördela dem till enskilda IHC och kvantifiera deras antal, volym och plats. Antikropparna som användes i detta tillvägagångssätt märkte också yttre hårceller (OHC; myoVIIa) och deras presynaptiska band. Dessutom är ett livskraftigt alternativ för immunmärkning av både IHC och OHC en antikropp mot otoferlin, med OHC som verkar mycket svagare än IHC.
Perfusion kan utföras med två olika inställningar. 1) Ett tyngdkraftsmatat dropplinjesystem där en enda flaska som matar en kommersiell droppledning är upphängd på ett remhjul cirka 1,5 m över djuret. Vätskor införs successivt efter sänkning av flaskan, som är öppen på toppen. 2) Ett system som använder en digital peristaltisk pump med variabel hastighet, med ett tunt, långt rör öppet i ena änden för att ta in vätskan och en nål som enkelt kan fästas i andra änden. Båda fungerar lika bra, och de subtila skillnaderna kommer inte att utvecklas här. Författarna rekommenderar dock specifikt en arbetsbänk i neddragsstil, med djuret på en perforerad plattform och ångorna som dras av nedan. Detta möjliggör god åtkomst till operationsområdet utan att kompromissa med avgasfunktionen (till skillnad från att arbeta i ett öppet dragskåp).
Korrekt fixering av vävnaden är av avgörande betydelse, eftersom annars kommer det sensoriska epitelet att lossna och sönderfalla under dissektion. I gerbilen är mer långvarig exponering för fixeringsmedlet nödvändig än vad som vanligtvis används (t.ex. för möss 17,27,13 eller marsvin28). Den föredragna metoden för gerbiler är snabb extraktion av cochlea efter djurets död och nedsänkningsfixering i minst 1,5 dagar. Om kardiovaskulär perfusion är att föredra är det avgörande att fixeringen sätter in inom några minuter och fortskrider bra. Eftersom det kan vara svårt att i slutändan betygsätta fixeringskvaliteten under perfusion, rekommenderas det att rutinmässigt postfixera cochleae enligt beskrivningen.
Det är viktigt att följa tvättstegen, varigenom det sista tvättsteget (steg 2.7) är det viktigaste. Om den inte tvättas tillräckligt är vävnaden klibbig och fäster vid dissektionsinstrumenten, vilket gör dissektionen svår. Det rekommenderas också att använda en autofluorescenssläckare i cochleae skördad från åldrade gerbiler för att minska ospecifik fluorescens. Autofluorescens kan härröra från lipofuscin, som är vanligt i vävnad från åldrade djur 29,30,31, och verkar vara i stort sett upphetsad och i stort sett emitterande. Vid excitering med en våglängd i UV-spektrumet (λ = 364 nm) har lipofuscin ett brett emissionsområde (λ = 400-700 nm, med ett maximum vid ~ λ = 568 nm)32. I human myokardvävnad är lipofuscin synligt med en excitation av λ = 555 nm och utsläpp av λ = 605 nm33. På samma sätt märkte författarna i IHC: erna för gerbiler en ökning av ospecifik fluorescens mest framträdande i kanalen som används för AF568-antikroppen, vilket tyder på autofluorescens från lipofuscingranuler. En allmän rekommendation vid arbete med vävnad från djur är alltså att använda excitationsbandbredden runt 550-600 nm för den minst kritiska immunmärkningen.
Mätning av total cochleär längd och korrekt identifiering av specifika cochleära positioner är endast möjlig om hela dess längd bevaras. Om delar av det sensoriska epitelet går förlorat i dissektion, rekommenderas att du fortfarande monterar den återstående delen eller till och med bara spiral ganglionstycket och håller detaljerade anteckningar. Det är då vanligtvis möjligt att uppskatta det saknade avsnittet med rimlig noggrannhet. Om de apikala delarna av cochlea är helt bevarade, men basaländen saknas, kan specifika cochleära platser på den apikala delen definieras genom att beräkna positionerna baserat på median cochleärlängden inom den använda gerbilpopulationen eftersom avvikelsen från det verkliga värdet är liten.
En viktig begränsning av synapsvolymkvantifieringen är att de resulterande absoluta volymerna inte är jämförbara mellan olika konfokala stackar. Det kritiska steget som bestämmer de resulterande volymerna av synaptiska element är valet av intensitetströskeln för initial detektion. Valet av denna intensitetströskel görs dock subjektivt av användaren i det aktuella protokollet och många andra 3,27,34. Dessutom beror ljusstyrkan hos immunofluorescensen i konfokalbilden på många faktorer, som är mycket svåra att standardisera över prover, såsom vävnadstjocklek, vävnadsorientering i förhållande till den optiska vägen, varaktighet för laserexponering och exakta konfokala och dekonvolutionsinställningar. Alla dessa försiktighetsåtgärder förvärras om sällsynt material förvärvas under en avsevärd tid, vilket är typiskt för åldrande gerbiler. Tillsammans innebär detta att fördomar är mycket svåra att utesluta i poolade data, och det bästa scenariot är en datauppsättning med hög varians. Det rekommenderas därför att rutinmässigt normalisera synaptiska volymer till respektive medianvolym för den enskilda konfokala stacken, som introducerades av Liberman et al.3. Den uppenbara nackdelen är att synaptiska volymer då bara är jämförbara inom en given bildstack, t.ex. mellan olika platser på IHC men inte mellan olika cochleära platser eller provåldrar.
Den dubbla märkningen av pre- och postsynaptiska strukturer och kravet på samlokalisering möjliggör en mer tillförlitlig uppskattning av antalet funktionella synapser än att använda någon av etiketterna ensam. Om endast en etikett är möjlig rekommenderas det att använda den presynaptiska anti-CtBP2, kopplad till AF488 eller fluorescerande taggar med liknande våglängdsdetaljer, av två skäl. För det första verkar föräldralösa band, det vill säga CtBP2-märkta element utan en samlokaliserad postsynaptisk etikett, vara sällsynta17, och författarna bekräftade detta för åldrade gerbiler. Således är felet som introduceras genom att inte kunna verifiera samlokalisering med en postsynaptisk partner liten. Det bör dock noteras att detta blir en viktigare fråga vid undersökning av bullerutsatta öron (t.ex.,28). För det andra, i fall med hög fluorescenssignal av oklart ursprung, påverkade bruset vanligtvis kanalen med en excitationsvåglängd runt 568 nm i största utsträckning (exempel i figur 2B, som representerar GluA2-etiketten). Åtminstone en del av detta buller kan, i vävnad från äldre djur, vara lipofuscin autofluorescens. För att maximera chansen för en ren, enda anti-CtBP2-etikett är det därför lämpligt att undvika denna våglängdskanal. Slutligen visades det att med rätt svala och mörka lagringsförhållanden är immunmärkningen som används här stabil under långa tidsperioder, upp till minst 2,5 år (figur 3B), vilket gör det möjligt att omvärdera värdefull vävnad, såsom från åldrade gerbiler.
Kvantifieringen av IHC-afferent synapstal har blivit ett viktigt mått för att utvärdera tillståndet för det perifera hörselsystemet i många sammanhang, bland dem åldersrelaterad hörselnedsättning. Det finns olika protokoll publicerade nu (t.ex. gerbiler21, möss17,13, marsvin10,28 och människor35). Metoden som beskrivs här är i detalj specifik för unga vuxna och äldre gerbiler, men vissa allmänna rekommendationer har härletts som kan vara till nytta även för andra arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Författarna erkänner Lichun Zhang för att ha hjälpt till att etablera metoden och Fluorescensmikroskopi serviceenheten, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, för användning av bildbehandlingsanläggningarna. Denna forskning finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) under Tysklands Excellensstrategi -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
