Summary
Ganaspis brasiliensis - ein Larvenparasitoid von Drosophila suzukii (ein globaler invasiver Obstkulturpest) - wurde zur biologischen Bekämpfung dieses Schädlings in Europa und den Vereinigten Staaten zugelassen oder wird für die Einführung in Europa und die Vereinigten Staaten in Betracht gezogen. Dieser Artikel enthält Protokolle für die Aufzucht dieses parasitoiden Parasitoids in kleinem und großem Maßstab.
Abstract
Die in Ostasien beheimatete Fleckenflügeldrosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), hat sich in den letzten zehn Jahren in Amerika, Europa und Teilen Afrikas weit verbreitet und ist in ihren überfallenen Regionen zu einem verheerenden Schädling verschiedener weichhäutiger Früchte geworden. Es wird erwartet, dass die biologische Bekämpfung, insbesondere durch selbsterhaltende und spezialisierte Parasitoide, eine praktikable Option für ein nachhaltiges flächendeckendes Management dieses hochmobilen und polyphagen Schädlings sein wird. Ganaspis brasiliensis Ihering (Hymenoptera: Figitidae) ist ein Larvenparasitoid, das in Ostasien weit verbreitet ist und sich als einer der wirksamsten Parasitoiden von D. suzukii erwiesen hat.
Nach strengen Bewertungen ihrer Wirksamkeit und potenzieller Nichtzielrisiken vor der Einführung wurde kürzlich eine der wirtsspezifischeren genetischen Gruppen dieser Art (G1 G. brasiliensis) für die Einführung und Freisetzung in den USA und Italien zugelassen. Eine andere genetische Gruppe (G3 G. brasiliensis), von der auch häufig festgestellt wurde, dass sie D. suzukii in Ostasien angreift, könnte für die Einführung in naher Zukunft in Betracht gezogen werden. Derzeit besteht ein enormes Interesse an der Aufzucht von G. brasiliensis für die Forschung oder an der Massenproduktion zur Freisetzung von Freisetzungen gegen D. suzukii. Dieses Protokoll und der zugehörige Videoartikel beschreiben effektive Aufzuchtmethoden für dieses Parasitoid, sowohl in kleinem Maßstab für die Forschung als auch in großem Maßstab für die Massenproduktion und Freisetzung im Freiland. Diese Methoden könnten der weiteren langfristigen Erforschung und Verwendung dieses in Asien geborenen Parasitoids als vielversprechendes biologisches Bekämpfungsmittel für diesen globalen invasiven Schädling zugute kommen.
Introduction
Die in Ostasien beheimatete Fleckenflügeldrosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), hat sich in Amerika, Europa und Teilen Afrikas weit verbreitet 1,2. Die Fliege ist extrem polyphag und kann verschiedene kultivierte und wilde Früchte mit weichen und dünnen Häuten in ihren einheimischen und eingedrungenen Regionen 1,2,3 verwenden. Die derzeitigen Managementstrategien für diesen Schädling beruhen stark auf dem häufigen Einsatz von Insektiziden, die auf erwachsene Fliegen in Feldern abzielen, wenn anfällige Früchte reifen. Wiederholte Sprays werden oft verwendet, möglicherweise aufgrund des konsequenten Übergreifens von Lagerstättenfliegenpopulationen aus Nicht-Erntehabitaten und des Mangels an effektiven natürlichen Feinden in den überfallenen Regionen 1,4. Die biologische Bekämpfung, insbesondere durch selbsterhaltende spezialisierte Parasitoide, kann dazu beitragen, Fliegenpopulationen auf Landschaftsebene zu unterdrücken und eine entscheidende Rolle für eine nachhaltige flächendeckende Bewirtschaftung dieses hochmobilen und polyphagen Schädlingsspielen 4,5,6.
In den letzten zehn Jahren haben sich die Forscher darauf konzentriert, gemeinsam entwickelte Parasitoide von Drosophila suzukii in den natürlichen Verbreitungsgebieten der Fliege in Ostasien 7,8,9 sowie wirksame, aber neu assoziierte Parasitoide in den befallenen Regionen der Fliege in Amerika und Europa zu entdecken 4,5,6. In den neu eingedrungenen Regionen der Fliege können sich häufig vorkommende Larven-Drosophila-Parasitoide wie Asobara c.f. tabida (Nees) (Hymenoptera: Braconidae), Leptopilina boulardi (Barbotin et al.) und L. heterotoma (Thompson) (Hymenoptera: Figitidae) aufgrund der starken Immunresistenz der Fliege nicht aus D. suzukii entwickeln oder niedrige Parasitismuswerte aufweisen10. Nur einige kosmopolitische und generalistische Puppenparasitoide wie Pachycrepoideus vindemiae (Rondani) (Hymenoptera: Pteromalidae) und Trichopria drosophilae (Perkins) (Hymenoptera: Diapriidae) in Nordamerika und Europa und Trichopria anastrephae Lima in Südamerika können sich leicht aus dieser Fliegeentwickeln 4. Im Gegensatz dazu haben Erkundungen in Ostasien eine Reihe von Larvenparasitoiden aus D. suzukii 4,5,6 entdeckt. Unter ihnen sind Asobara japonica Belokobylskij, Ganaspis brasiliensis Ihering und Leptopilina japonica Novković & Kimura die dominierenden Larvenparasitoiden 7,8,9,11. Insbesondere die beiden Figitiden (L. japonica und G. brasiliensis) waren die wichtigsten Parasitoiden, die hauptsächlich in frischen Früchten vorkommen, die von D. suzukii und/oder anderen eng verwandten Drosophiliden in der natürlichen Vegetation befallen sind 7,8,9. Diese drei asiatischen Larvenparasitoide wurden in Quarantäneeinrichtungen in den USA und Europa importiert und auf ihre relative Effizienz 12,13,14,15,16,17, ihre klimatische Anpassungsfähigkeit18, ihre potenziellen interspezifischen Wettbewerbsinteraktionen 19 und vor allem ihre Wirtsspezifität8,20,21 untersucht. ,22.
Quarantäne-Auswertungen zeigten, dass Ganaspis brasiliensis für Drosophila suzukii wirtsspezifischer war als andere getestete asiatische Larvenparasitoide, obwohl es wahrscheinlich aus verschiedenen Biotypen oder kryptischen Arten mit unterschiedlicher Wirtsspezifität 8,21,22,23,24 besteht. Nomano et al.22 gruppierten Ganaspis-Individuen aus verschiedenen geografischen Regionen in fünf genetische Gruppen (genannt G1-G5), basierend auf molekularen Analysen des mitochondrialen Cytochromoxidase-I-Genfragments. Die G2- und G4-Gruppen werden nur von einigen südasiatischen tropischen Standorten gemeldet, und die G5-Gruppe wurde aus Asien und anderen Regionen (z. B. Argentinien, Brasilien, Hawaii und Mexiko) von unbekannten Hosts (Buffington, persönliche Beobachtung) gemeldet. Feldsammlungen von Wildfrüchten, die von D. suzukii in Südkorea7, China8 und Japan 9,23,25 befallen wurden, fanden G1 allein oder eine Mischung von Exemplaren, die die Gruppen G1 und G3 repräsentieren. Die beiden Gruppen scheinen sympatrisch zu sein und koexistieren auf den gleichen Wirtspflanzen, die von D. suzukii und anderen eng verwandten Wirtsfliegen bewohnt werden. Nichtsdestotrotz wurden einige Unterschiede zwischen den beiden Gruppen beobachtet, wobei G1 anscheinend einen höheren Grad an Wirts- oder Wirtshabitat-Spezifität als D. suzukii als G3 aufweist, obwohl beide in den Quarantänetests eine Reihe eng verwandter Arten angreifen21,22. Weitere detaillierte molekulare Analysen können helfen, den Artenstatus zu bestimmen, insbesondere für die Gruppen G1 und G3. Diese Studie bezieht sich auf sie als G1 G. brasiliensis und G3 G. brasiliensis. Einige frühe Studien nannten auch die G1 G. brasiliensis als G. Vgl. Brasiliensis 14,21,22. Die G1 G. brasiliensis wurde kürzlich für die Feldfreigabe gegen D. suzukii in den USA und Italien zugelassen (mehrere andere europäische Länder erwägen derzeit auch ihre Einführung), während die G3 G. brasiliensis in naher Zukunft für die Freisetzung in Betracht gezogen werden könnte. Jüngste Umfragen ergaben auch abenteuerliche Populationen von L. japonica und G1 G. brasiliensis in British Columbia, Kanada26, und Washington State, USA (Beers et al., unveröffentlichte Daten) und adventive L. japonica Populationen in der Provinz Trient, Italien27.
Angesichts des erheblichen Interesses an der Entwicklung biologischer Bekämpfungsprogramme für das Management von Drosophila suzukii und des erheblichen biologischen Bekämpfungspotenzials der adventiven und absichtlichen Einführung von Ganaspis brasiliensis besteht die Notwendigkeit, effiziente Aufzuchtmethoden für dieses Larvenparasitoid für zukünftige Langzeitforschung und/oder Freisetzung im Feld zu entwickeln. Dieses Protokoll und der zugehörige Videoartikel beschreiben zwei Sätze von Aufzuchtmethoden für dieses Parasitoid: (1) kleine Laboraufzucht in Kolben mit einer Mischung aus Wirtsfrüchten (Blaubeere) und künstlicher Diät für die Kultur von D. suzukii. Die Methoden wurden unter Verwendung von G3-Material entwickelt, das ursprünglich aus Kunming, China, gesammeltwurde 8. (2) Massenaufzucht zur Feldfreisetzung in großen Käfigen mit Wirtsfrüchten (Heidelbeere) für die Kultur von D. suzukii. Die genetische Gruppe, die für die großflächige Aufzucht verwendet wurde, war der G1-Bestand mit Ursprung in Tokio, Japan 9,22. Andere Skalen der Aufzuchtmethoden, wie die Verwendung von Fläschchen oder kleinen Behältern für beide Gruppen, werden ebenfalls kurz diskutiert.
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Protocol
1. Methoden zur kleinräumigen Laboraufzucht von G3 Ganaspis brasiliensis
- Bereiten Sie die Ernährung des Gastgebers vor.
- Fügen Sie 600 ml destilliertes Wasser in einen 1.500 ml Glasbehälter hinzu und erhitzen Sie das Wasser auf einer Kochplatte.
- Fügen Sie 88,6 g handelsübliche Trockendiät (aus Agar, Bierhefe, Maismehl, Methylparaben und Saccharose) hinzu oder bereiten Sie die Diät mit der von Dalton et al.28 veröffentlichten Formel zu (siehe Schritt 2.1.2).
- Fügen Sie 300 ml destilliertes Wasser in die trockene Diät hinzu und rühren Sie die Diätmischung gründlich um.
- Fügen Sie die Mischung zu dem kochenden Wasser hinzu.
- Lassen Sie die flüssige Diät auf der heißen Platte 10 Minuten kochen, während Sie die Mischung regelmäßig umrühren, um zu verhindern, dass sie anbrennt.
- Lassen Sie die Diät 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen, während Sie sie gelegentlich rühren, um die Wärmefreisetzung gleichmäßig zu verteilen und zu verhindern, dass sich die Diät auf der Oberfläche verfestigt.
- Messen Sie 6,7 ml 95% EtOH in einem Behälter und 3,5 ml 1 M Propionsäurelösung in einem anderen Behälter.
- Sobald die Diät abgekühlt ist, fügen Sie das EtOH und dann die Propionsäurelösung hinzu und rühren Sie nach jeder Zugabe gründlich um.
- Bereiten Sie Blaubeeren (gekauft vom lokalen Markt) vor, indem Sie sie in kaltem Wasser, dann in einer Natriumhypochlorit-Bleichlösung (verdünnt auf 5%) und wieder kaltem Wasser spülen.
- Trocknen Sie die Früchte mit einem Papiertuch und zerdrücken Sie sie manuell, bis die Haut jeder Frucht gebrochen ist und die Säfte und das Fruchtfleisch freigelegt sind.
- Fügen Sie 25-30 g Blaubeerpüree zu jedem 250 ml Kolben hinzu. Klopfen Sie auf die Seiten des Kolbens, um sicherzustellen, dass der innere Boden des Kolbens mit einer gleichmäßigen Schicht pürierter Blaubeeren bedeckt ist.
- Gießen Sie die vorbereitete Diät in jede Flasche, so dass sie nur die Oberseite der pürierten Blaubeeren bedeckt.
- Fügen Sie Schaumstoffstopfen zu den Hälsen der Kolben hinzu und lassen Sie die Diät bei Raumtemperatur erstarren (Abbildung 1).
- Sobald sich die Diät verfestigt hat, sofort anwenden oder bis zu 3 Wochen bei 5 °C lagern.
- Hinterer Wirt Drosophila suzukii.
- Nehmen Sie die gelagerte Diät aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie sich zur Umgebungstemperatur des Raumes ausgleichen, oder verwenden Sie frisch zubereitete Diät.
- Schneiden Sie ein Stück saugfähiges Papiertuch (z. B. 5 cm x 20 cm) und drehen Sie es in der Mitte. Legen Sie den verdrehten Mittelteil des Papiertuchs in den Kolben (Abbildung 1).
- Befeuchten Sie das Papiertuch und die Oberfläche der Diät mit destilliertem Wasser, um Feuchtigkeit zu speichern.
- Übertragen Sie geschlechtsreife erwachsene Fliegen aus den aktuellen Koloniefliegenflaschen in einen neuen Diätkolben, indem Sie den Stopfen auf dem alten Kolben vorsichtig entfernen und den Kolben schnell umkehren und die Öffnung des alten Kolbens mit dem neuen Kolben ausrichten.
- Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des alten Kolbens, um die Fliegen dazu zu bringen, in den neuen Kolben zu fallen. Stellen Sie sicher, dass sich ~ 25-30 Paarungspaare von D. suzukii im neuen Kolben befinden. Sobald sich genügend Fliegen im neuen Kolben befinden, drehen Sie den alten Kolben schnell aufrecht um und ersetzen Sie die Stopfen an beiden Kolben.
- Wiederholen Sie die Transfers von Fliegen, bis keine Fliegen mehr in den alten Kolben übrig sind. Kombinieren oder sammeln Sie bei Bedarf Fliegen aus mehr als einem alten Kolben in einem neuen Kolben, um sicherzustellen, dass genügend Fliegen (20-30 Paare) pro Flasche vorhanden sind.
- Halten Sie die neuen Kolben nach einer Woche Exposition gegenüber erwachsenen Fliegen unter geeigneten Bedingungen (21 ° C, 16 l: 8 D Photoperiode, 60% -80% relative Luftfeuchtigkeit [RH%]) in einer Umweltkammer für 3 Wochen für das Auftauchen von Fliegen.
- Setzen Sie Wirtslarven Parasitoiden aus.
- Nehmen Sie einen Kolben (siehe Schritt 1.2.7) mit Fliegeneiern und Larven mit, nachdem Sie alle erwachsenen Fliegen und das verdrehte Papiertuch aus der Flasche entfernt haben.
- Falten Sie ein Stück saugfähiges Papiertuch in zwei Hälften und legen Sie es in den Kolben als Verpuppungssubstrat für parasitäre Larven.
- Aspirieren Sie sechs weibliche und männliche Paare von G3 G. brasiliensis in jeden Kolben (Abbildung 1). Streichen Sie eine dünne Schicht Honig auf den Boden des Schaumstoffstopfens.
- Lassen Sie die Parasitoide für 5 Tage im Kolben.
- Entfernen Sie nach einer 5-tägigen Exposition die Parasitoide und halten Sie die Kolben unter den oben beschriebenen Bedingungen 35 Tage lang in einer Umweltkammer, bis die erwartete Wespe auftaucht.
- Sammeln und lagern Sie erwachsene Parasitoide.
- Überprüfen Sie während der zweiten und dritten Woche der Inkubation wöchentlich die Kolben auf ein frühes Auftreten des Wirts und entfernen Sie die erwachsenen Fliegen.
- Sobald erwachsene Parasitoide auftauchen, saugen Sie sie dreimal pro Woche ab und halten Sie sie in Drosophila-Fläschchen (z. B. 2,5 cm x 9,5 cm) (Abbildung 1).
- Legen Sie ein kleines Stück Papiertuch, angefeuchtet, aber nicht gesättigt, mit destilliertem Wasser auf den Boden der Durchstechflasche.
- Fügen Sie ~ 60 Parasitoide zu jeder Durchstechflasche hinzu und beschriften Sie die Durchstechflasche mit den Entstehungsdaten. Streichen Sie zweimal pro Woche eine dünne Schicht Honig auf den Boden des Schaumstoffstopfens. Lagern Sie die Durchstechflaschen mit erwachsenen Parasitoiden unter den oben beschriebenen Bedingungen bis zu einem Monat in der Umweltkammer, wenn sie nicht früher verwendet werden.
- Befeuchten Sie das Papier in der Durchstechflasche einmal alle 4-7 Tage oder ersetzen Sie das Papiertuch, wenn Anzeichen von Schimmel auftreten.
2. Methoden für die großflächige Aufzucht von G1 Ganaspis brasiliensis
- Implementieren Sie eine großflächige Aufzucht von Wirt Drosophila suzukii.
- Hintere D. suzukii in großen, mit Maschen überzogenen Strickkäfigen (z. B. 50 cm x 50 cm x 100 cm) mit jeweils 1.500-2.000 geschlechtsreifen erwachsenen Fliegen (Geschlechterverhältnis 50:50) (Abbildung 2).
- Bereiten Sie das Standard Drosophila Medium (SDM) vor, indem Sie alle Zutaten (6 g bakteriologisches Agar, 75 g Maismehl, 17 g Nährhefe, 15 g Saccharose, 10 g Sojabohnenmehl, 10 ml Propionsäure) in 1 l destilliertem Wasser für 10 min kochen, während Sie die Mischung regelmäßig umrühren, um zu verhindern, dass sie28 brennt.
- Die Mischung 5 min abkühlen lassen und 5 g Ascorbinsäure hinzufügen.
- Gießen Sie das frisch gekochte SDM in 9 cm Petrischalen und lassen Sie das Medium bei Raumtemperatur erstarren, bevor Sie die Teller schließen.
- Die SDM Petrischalen stapeln, mit Alufolie umwickeln und bis zu 2 Wochen bei 4 °C lagern.
- Stellen Sie in jedem Aufzuchtkäfig einen Teller mit wassergetränkter Baumwolle und vier bis sechs Petrischalen mit SDM (Abbildung 2).
- Ersetzen Sie zweimal pro Woche die verseuchten SDM Petrigerichte durch frische.
- Legen Sie die befallenen SDM-Petrischalen ohne Deckel einzeln in Plastikbecher (13,3 cm Durchmesser oder 800 ml), schließen Sie jede Tasse mit einer Abdeckung aus Feinmaschen (<0,5 mm) und inkubieren Sie sie 12-15 Tage lang bei 23 °C und 75 % RH (Abbildung 2).
- Bringen Sie die frisch geschlüpften D. suzukii-Erwachsenen von den Plastikbechern in die Aufzuchtkäfige.
- Bereiten Sie Wirtslarven vor.
- Spülen Sie die Blaubeeren in kaltem Wasser für 1 min und weichen Sie die Früchte in einem Becken ein, das mit einer Bleichlösung (verdünnt auf 5%) für 3 min.
- Lassen Sie die Bleichlösung abtropfen und füllen Sie das Becken mit kaltem Wasser, um die Blaubeeren zu spülen. Mindestens 30 s von Hand vorsichtig mischen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2.2 mit Süßwasser mindestens dreimal, um Bleichmittelrückstände und andere Arthropoden (z. B. Milben, Thripse) zu entfernen, die auf der Frucht vorhanden sein können.
- Legen Sie die Früchte auf ein Tablett mit mehreren Schichten saugfähiger Papiertücher und kippen Sie das Tablett vorsichtig hin und her, rollen Sie die Beeren herum, um sie zu trocknen.
- Bereiten Sie mehrere 9 cm große Petrischalen zu (entweder die obere oder die untere Hälfte, mit dem Gesicht nach oben) und füllen Sie jede mit den gewaschenen Blaubeeren (15-25 Früchte pro Teller je nach Fruchtgröße).
- In den späten Nachmittagsstunden setzen Sie die Petrischalen geschlechtsreifen erwachsenen Fliegen in den Wirtsaufzuchtkäfigen aus (siehe Schritt 2.1) und lassen Sie sie über Nacht liegen.
- Entfernen Sie am nächsten Morgen die Petrischalen aus den Wirtsaufzuchtkäfigen, indem Sie sie vorsichtig blasen oder klopfen, um die Fliegen auf den Früchten zu entfernen, und verwenden Sie die befallenen Früchte für die Aufzucht von Parasitoiden (siehe Schritt 2.4).
- Implementieren Sie eine großflächige parasitoide Aufzucht.
- Verwenden Sie zwei Arten von Käfigen, um den Parasitoiden aufzuziehen: einen für Parasitismus und einen anderen für das Auftauchen von Wespen.
- Stellen Sie sicher, dass der Parasitismuskäfig kubisch ist (z. B. 45 cm pro Seite) mit einer durchsichtigen Kunststoffplatte auf der Vorderseite zur Beobachtung der Insektenaktivität, zwei 18 cm langen Hülsenöffnungen in der Frontplatte zum Hinzufügen oder Entfernen von Insekten und zum Austausch von Lebensmittelmaterial und feinem Polyesternetz (z. B. 96 x 26 Netz) an der Oberseite und an den Seiten zur Belüftung.
- Machen Sie den Auslaufkäfig kleiner (z. B. 30 cm pro Seite), mit einer einzigen Hülsenöffnung auf zwei gegenüberliegenden Seiten und einer durchsichtigen Kunststoffplatte auf der Vorderseite für die Sichtbarkeit (Abbildung 2).
- Stellen Sie sicher, dass beide Käfigtypen über eine dünne Schnur verfügen, die unter der Decke hängt und an der ein bis mehrere Feeder aufgehängt werden können (Abbildung 2).
HINWEIS: Ein Feeder besteht aus einem großen zylindrischen Schaumstopfen (9 cm Durchmesser), der mit verstreuten Honigtröpfchen bedeckt ist und auf dem Käfigboden platziert oder an der Käfigdecke aufgehängt werden kann (Abbildung 2). - Geben Sie in jedem Käfig alle 5-7 Tage Wasser in einer Durchstechflasche mit gerader Wand (2,5 cm x 9,5 cm) an, die je nach RH alle 5-7 Tage mit einem Celluloseacetat-Pfropfen (2,5 cm Durchmesser) verschlossen ist. Hängen Sie die Durchstechflasche kopfüber an die Käfigdecke (Abbildung 2).
- Setzen Sie die Wirtslarven den Parasitoiden aus.
- Setzen Sie die wirtsbefallenen Früchte in den Petrischalen G1 G. brasiliensis unmittelbar nach dem nächtlichen Befall von D. suzukii aus (siehe Schritt 2.2.7).
- Lassen Sie die 10-15 Petrischalen mit befallenen Früchten 2-3 Tage im Parasitierungskäfig mit 1.500-2.000 Wespen.
- Verwenden Sie Plastikbecher (13,3 cm Durchmesser oder 800 ml) mit Schichten saugfähigem Papier auf der Unterseite, um die Früchte zu sammeln, die die parasitierten Wirte enthalten (Abbildung 2).
- Legen Sie die offenen Becher in den Eklosionskäfig und inkubieren Sie sie mindestens 28 Tage lang bei 21 °C und 65 % RH (Abbildung 2).
- Überprüfen Sie den Käfig während der zweiten und dritten Woche der Inkubation wöchentlich auf eine frühe Wirtseklosion und entfernen Sie die erwachsenen Fliegen, um die sukzessive Sammlung von Parasitoiden zu erleichtern.
- Fügen Sie am Ende der vierten Woche der Inkubation einen Feeder und eine Wasserquelle zum Käfig hinzu.
- Sammeln und lagern Sie die erwachsenen Parasitoiden.
- Sobald die parasitoide Entstehung beginnt, sammeln Sie einen Teil (10% -15%) der Erwachsenen und bringen Sie sie zurück in den Parasitismuskäfig, um alte unproduktive Individuen zu ersetzen.
- Sammeln und lagern Sie die verbleibenden Parasitoide in Plastikbechern (13,3 cm Durchmesser oder 800 ml) (Abbildung 3A).
- Legen Sie ein mit Wasser gefülltes und mit einer Zahnbaumwollrolle (1 cm x 3,8 cm) versiegeltes Röhrchen (2 ml) auf den Boden der Tasse (Abbildung 3A).
- Schließen Sie den Becher mit einem modifizierten Deckel, der mit einem abnehmbaren Schaumstoffstopfen (3,5 cm Durchmesser) als Zuführsubstrat und einem netzüberzogenen Loch zur Belüftung ausgestattet ist (Abbildung 3B).
- Fügen Sie bis zu 700 Erwachsene zu jeder Tasse hinzu (Geschlechterverhältnis 50:50), beschriften Sie die Tasse mit dem Entstehungsdatum und lagern Sie sie bis zur Verwendung oder bis zu 1 Monat in einer Umgebungskammer (17 ° C; 65 % RH) (Abbildung 3B).
- Versenden Sie die erwachsenen Parasitoiden.
- Verwenden Sie konische Röhren (50 ml), um die erwachsenen Parasitoiden zu versenden.
- Durchbohren Sie ein Belüftungsloch (8 mm Durchmesser) auf die Kappe und decken Sie es mit einem feinmaschigen Netz ab (Abbildung 3C).
- Fügen Sie an der Innenseite der Kappe einen Zelluloseacetat-Fütterungsring hinzu (Abbildung 3C).
- Bereiten Sie eine gesättigte Saccharoselösung mit destilliertem Wasser vor, tragen Sie ein paar Tropfen auf den Fütterungsring auf und lassen Sie ihn die Flüssigkeit aufnehmen.
- Legen Sie ein fächerförmiges Stück saugfähiges Papiertuch in das Rohr (Abbildung 3D).
- Fügen Sie ~ 200 erwachsene Parasitoide zu jeder Röhre hinzu und legen Sie die Röhren zusammen mit Eisbeuteln in einen isolierten Versandbehälter.
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Representative Results
Abbildung 4 zeigt repräsentative Ergebnisse der kleinräumigen Laboraufzucht von G3 Ganaspis brasiliensis unter Verwendung von zwei verschiedenen parasitoiden Dichten (sechs oder 10 Paare) und zwei verschiedenen Expositionszeiten (5 oder 10 Tage) in der Quarantäneeinrichtung der USDA-ARS Beneficial Insects Introduction Unit (Newark, Delaware). Es gab 14 Replikate für jede Kombination von parasitoider Dichte und Expositionszeit. Insgesamt produzierten die 64 Kolben 4.018 Wespen (71,7 ± 4,9 Nachkommen pro Kolben) mit 49,5% ± 1,9% weiblichen Nachkommen. Bei 21 °C traten erwachsene Parasitoide etwa 30-35 Tage nach der Eiablage auf. Die parasitoide Dichte und die Expositionszeit hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Gesamtzahl der pro Replikat (Kolben) produzierten Nachkommen (Einweg-ANOVA, F 3,52 = 0,379, P = 0,769) und hatten nur einen marginalen Einfluss auf den Prozentsatz der weiblichen Nachkommen (Einweg-ANOVA, die Daten wurden vor der Analyse logittransformiert, wie es zur Stabilisierung der Variation erforderlich war, F3,52 = 2,796, P = 0,049), obwohl die Produktionseffizienz pro Kopf weiblich (Einweg-ANOVA, F 3,52 = 3,576, P = 0,020) bei der hohen parasitoiden Dichte abnahm. Eine Belichtungszeit von mehr als 5 Tagen schien die Produktivität nicht zu erhöhen. Eine erhöhte parasitoide Dichte schien die Produktivität ebenfalls nicht zu erhöhen. Daher scheint die Kombination von sechs Paaren und 5-tägigen Belichtungszeiten am besten für die Laboraufzucht geeignet zu sein.
Abbildung 5 zeigt einen 6-monatigen Produktivitätstrend der großflächigen Aufzucht von G1 Ganaspis brasiliensis in der Quarantäneeinrichtung der Edmund Mach Foundation (Trient, Italien) im Jahr 2021. Die Aufzucht wurde mit 150 drei Tage alten, verpaarten weiblichen Wespen begonnen, die aus einer Kleinaufzucht im Quarantänelabor von CABI in Delémont, Schweiz, stammen. Weitere Wespen aus der Aufzucht wurden allmählich dem Parasitismuskäfig hinzugefügt, bis sie in Woche 5 1.500-2.000 Individuen (Geschlechterverhältnis 50: 50) erreichten. Die Belegung des Parasitismuskäfigs wurde danach auf dem gleichen Niveau gehalten, indem neue Wespen hinzugefügt wurden, die in der großflächigen Aufzucht selbst produziert wurden. Während der gesamten Periode wurde der Parasitismuskäfig alle 2-3 Tage mit frisch befallenen Früchten versorgt. Die Frucht (Blaubeeren) wurde G1 G. brasiliensis unmittelbar nach der nächtlichen Exposition gegenüber Drosophila suzukii angeboten. Die parasitoide Produktion begann 5 Wochen nach der ersten Wirtsexposition (Abbildung 5A). Von Woche 8 bis Woche 22 war die parasitoide Produktion proportional zur Menge der exponierten Früchte und betrug durchschnittlich 0,44 ± 0,03 g/parasitoid (Mittelwert ± SE; Abbildung 5B). Insgesamt wurden 53.736 Parasitoide gesammelt, mit einer durchschnittlichen weiblichen Nachkommenschaft von 45,9% (Bereich: 32,4% -79,0%).
Abbildung 1: Ein Flussdiagramm für kleine Laboraufzuchtverfahren von Drosophila suzukii und G3 Ganaspis brasiliensis. Die linke Seite zeigt die Aufzuchtverfahren der Wirtsfliegen, während die rechte Seite den parasitoiden Aufzuchtzyklus veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ein Flussdiagramm für die großflächigen Aufzuchtverfahren von Drosophila suzukii und G1 Ganaspis brasiliensis. Die linke Seite zeigt die Aufzuchtverfahren der Wirtsfliegen, während die rechte Seite den parasitoiden Aufzuchtzyklus veranschaulicht. Abkürzung: SDM = Standard Drosophila medium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Container und Rohre zur Lagerung und Verschiffung von G1 Ganaspis brasiliensis aus der Großaufzucht. (A) eine horizontale Ansicht des Vorratsbehälters mit einem Wasserrohr im Behälter, (B) eine vertikale Ansicht des Behälters mit einem belüfteten Deckel und einem Schaumstoffstopfen und (C) einem belüfteten Deckel und einem Stück saugfähigem Papier für (D) das Versandrohr. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentatives Beispiel für die kleinräumige Laboraufzucht von G3 Ganaspis brasiliensis. (A) Anzahl der pro Kolben produzierten Nachkommen, (B) Anzahl der pro weiblicher Wespe produzierten Nachkommen und (C) Prozentsatz der weiblichen Nachkommen unter zwei verschiedenen parasitoiden Dichten und Expositionszeiten. Die Werte sind Mittelwert ± SE, und Balken mit unterschiedlichen Buchstaben unterscheiden sich signifikant (ANOVA, Tukey's HSD, P < 0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Produktivitätsentwicklung der großflächigen Aufzucht von Beginn bis Woche 23. (A) Balken geben die Anzahl der G1 Ganaspis brasiliensis-Nachkommen an, die wöchentlich aus den Eklosionskäfigen gesammelt werden, um alte Individuen im Parasitismuskäfig zu ersetzen (dunkelgrün) und gelagert oder versandt zu werden (hellgrün). Die orangefarbene Linie zeigt die Menge an wirtsbefallenen Früchten (kg Blaubeeren) an, die den Parasitoiden innerhalb des Parasitismuskäfigs jede Woche zur Verfügung gestellt werden. (B) Wochenverhältnis des Gewichts der vom Wirt befallenen Früchte zur Anzahl der parasitoiden Nachkommen, die 5 Wochen nach der Exposition produziert werden (d. h. Gramm Obst, die zur Herstellung eines einzelnen erwachsenen Parasitoiden benötigt werden). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Langfristige Forschung und anschließende Freisetzungen eines biologischen Bekämpfungsmittels hängen von der Verfügbarkeit effektiver und wirtschaftlicher Aufzuchttechniken ab. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden haben sich als effiziente Protokolle sowohl für die kleinräumige als auch für die großflächige Aufzucht von Ganaspis brasiliensis erwiesen. Das kleine Aufzuchtprotokoll wurde über mehrere Jahre entwickelt, um den Arbeitsaufwand zu optimieren und die spezielle Ausrüstung zu reduzieren, die zur gleichzeitigen Aufrechterhaltung der parasitoiden und der Wirtskolonien erforderlich ist. Es eignet sich für die Pflege einer Kolonie für Laborforschung oder Bioassays. Ähnliche Methoden wurden von den Autoren verwendet, um dieses Parasitoid für Quarantänebewertungen dieses Parasitoids aufzuziehen. Das groß angelegte Aufzuchtprotokoll wird es ermöglichen, eine große Anzahl von Wespen für die Freisetzung auf dem Feld zu produzieren, wie es kürzlich in Italien durchgeführt wurde. Diese Technologien können in naher Zukunft leicht auf andere Labore, Produzenten oder Unternehmen für die großflächige Aufzucht übertragen werden und dienen als Grundlage für weitere Verbesserungen der Methoden.
Diese Protokolle können auch verwendet werden, um Leptopilina japonica aufzuziehen, da sowohl Ganaspis brasiliensis als auch L. japonica in Bezug auf ihre Wirtshabitatpräferenz7,8, Wirtsstufenpräferenz oder Reproduktionsbiologie 15, thermische Leistung 18 und Futtersucheffizienz in Laborbioassays13,15 sowie Verhaltensreaktionen auf wirtsassoziierte Hinweise 12 ähnlich sind, mit der Ausnahme, dass L. japonica scheint ein breiteres Wirtsspektrum zu haben als das von G3 G. brasiliensis20. Beide Parasitoide wurden mit ähnlichen Methoden wie hierin beschrieben gezüchtet. Für die Kleinaufzucht können beide Parasitoide auch in Drosophila-Fläschchen aufgezogen werden, typischerweise indem 20 junge (1-2 Tage alte) Drosophila suzukii-Larven in ein Drosophila-Fläschchen übertragen werden, das mit 2 cm künstlicher Diät gefüllt ist, oder zwei befallene Früchte mit jeweils 5-10 jungen D. suzukii-Larven platziert und sie 2-3 Tage lang zwei verpaarten weiblichen Wespen aussetzen. beide produzieren ~ 10 Nachkommen pro Fläschchen13,15,22.
Wie oben beschrieben, können sich die in diesem Protokoll verwendeten G1- und G3-Ganaspis brasiliensis geringfügig in einigen Wirtssuchverhalten und der Wirtsspezifitätunterscheiden 21,22. Girod et al.21 berichten, dass die japanische G1 G. brasiliensis strenger spezifisch für Drosophila suzukii war und in rein künstlicher Ernährung in Fläschchen im Vergleich zu ihrer Leistung bei Wirtsfrüchten nicht gut zu funktionieren schien. Matsuura et al.25 berichteten auch, dass G1 G. brasiliensis-Populationen, die von D. suzukii-befallenen Kirschen in Japan gesammelt wurden, auf D. suzukii spezialisiert sind. Die kleinteilige Aufzuchtmethode mit Diät gemischt mit Blaubeeren wurde ursprünglich für die Aufzucht von G3 G. brasiliensis entwickelt, da G1 G. brasiliensis zu dieser Zeit nicht verfügbar war. Später stellte sich heraus, dass diese Methode für die Aufzucht von G1 G. brasiliensis nicht gut funktioniert (Wang et al. unveröffentlichte Daten).
Daher wird für die Kleinaufzucht von G1 G. brasiliensis vorgeschlagen, das Wirtssubstrat zu modifizieren, indem (1) die Fliegen direkt Blaubeeren (oder anderen Wirtsfrüchten) ausgesetzt werden, um Wirtslarven in der Frucht zu sammeln, und (2) exponierte Früchte in ein Standard-Drosophila-Kulturmedium übertragen werden, damit sich die Larven in einer wettbewerbsarmen Umgebung entwickeln können, indem die befallenen Früchte, die die Wirtslarven enthalten, in den Kolben auf die Nahrung aufgenommen werden, um den Parasitoiden ausgesetzt zu werden. Dies ermöglicht es den parasitierten Larven, sich von der Nahrung zu ernähren, insbesondere bei hohen Wirtsdichten, und die parasitierten Wirtspuppen können aus dem Papiertuch gesammelt werden. Alternativ kann G1 G. brasiliensis auf Früchten direkt in Plastikbehältern (verschiedene Größen) aufgezogen werden, indem 5-10 weibliche Wespen 4-5 Tage lang 10-20 befallenen Blaubeeren ausgesetzt werden, die je nach Wirtsdichte bis zu 80 Nachkommen pro Behälter produzierten (Wang et al., unveröffentlichte Daten). Für diese Methode wird empfohlen, die befallenen Früchte auf ein erhöhtes Metallnetz ("Hardware-Tuch") zu legen, damit die Parasitoiden aus allen Richtungen auf die befallenen Früchte zugreifen können, insbesondere wenn zu viele Früchte in einen Behälter gegeben werden. Idealerweise sollten für diese Aufzuchtmethode eine oder zwei Schichten befallener Früchte in jeden Behälter gelegt werden. Diese alternativen kleinräumigen Methoden sollten auch für die Aufzucht von G3 G. brasiliensis gut funktionieren.
Unabhängig von den Aufzuchtmethoden und -schuppen (Durchstechflasche, Kolben, Behälter oder Käfig) ist es wichtig, geeignete Temperatur, Feuchtigkeit sowie Kontrolle des Alters, der Dichte und der Expositionszeit des Wirts oder der weiblichen Wespe für die Aufzucht von G1 Ganaspis brasiliensis und G3 G. brasiliensis aufrechtzuerhalten. Drosophila suzukii Larven entwickelten sich in etwa 1 Woche unter normalen Laborbedingungen (z.B. 22 ± 2 °C) 15. Das Weibchen G. brasiliensis zog es vor, jüngere (1-2 Tage alte) als ältere (3-4 Tage alte) Wirtslarven anzugreifen, obwohl verschiedene Alter von Wirtslarven15 angegriffen werden konnten. Bei 22 ± 2 °C traten G. brasiliensis-Weibchen mit einem wesentlich hohen Anteil (~50%) ihrer lebenslangen Ergänzung an reifen Eiern auf, und die reife Eibelastung erreichte nach 2-3 Tagen einen Höhepunkt15. Erwachsene Weibchen überlebten ~ 20 Tage, als sie unbegrenzten Zugang zu den Wirten erhielten, und begannen innerhalb von 2 Tagen nach dem Auftauchen mit der Eiablage, erreichten innerhalb von 5-10 Tagen einen Höhepunkt der Eiablage und reduzierten danach allmählich die Eiablage15. Daher sollten junge (<10 Tage alte) weibliche Wespen in der Aufzucht verwendet werden, aber weibliche Wespen könnten für die Aufzucht wiederverwendet werden, wenn sie knapp sind. Das Parasitoid konnte sich leicht bei 21-25 ° C entwickeln, aber Temperaturen unter 17,2 ° C schienen eine fakultative Diapause17 auszulösen. Es wird daher empfohlen, einen Temperaturbereich von 21-25 °C für eine optimale Entwicklung sowohl der Fliege als auch des Parasitoiden zu verwenden.
Darüber hinaus wird eine Expositionszeit von mehr als 5 Tagen die Produktivität des Parasitoiden wahrscheinlich nicht erhöhen. Erhöhte parasitoide Dichte basierend auf der kleinräumigen Aufzucht für G3 G. brasiliensis scheint die Produktivität nicht zu erhöhen, möglicherweise aufgrund gegenseitiger Interferenz zwischen wespinnenweiblichen Wespen. Sechs männlich-weibliche Paare und eine 5-tägige Expositionszeit scheinen eine ideale Kombination für die Laboraufzucht in kleinem Maßstab zu sein, obwohl die Aufzuchtmethoden in Zukunft verbessert werden können, indem das Verhältnis von Wirt zu Parasitoid weiter optimiert wird. Ein Hauptmortalitätsfaktor für das Parasitoid scheint mit der niedrigen Luftfeuchtigkeit zusammenzuhängen, da beobachtet wurde, dass viele Parasitoide nicht in der Lage waren, mit trockenen Substratbedingungen zu schließen. Das Hinzufügen eines saugfähigen Papiertuchs unter der Frucht absorbiert nicht nur Säfte, wenn die Frucht abgebaut wird, sondern liefert auch ein Substrat, das gedämpft werden kann, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen oder ein Verpuppungssubstrat für die Fliege bereitzustellen.
Für die kleinräumige Aufzucht kann ein Kolben die Feuchtigkeit besser aufrechterhalten als ein Fläschchen, da erstere einen schmalen Hals hat. Es wurde auch in dieser Studie gefunden, dass frische Blaubeeren, die mit einem Staub von aktiver Trockenhefe überzogen waren, dazu beitrugen, die Bildung von Schimmel zu verhindern und die Anziehungskraft der Früchte auf die Fliegen zu erhöhen. Andere Aspekte der parasitoiden Aufzucht, die noch erforscht werden müssen, sind (1) die Möglichkeit, dieses Parasitoid auf alternativen Wirten oder Wirtsfrüchten aufzuziehen und wie alternative Wirte oder Wirtsfrüchte die Effizienz des Parasitoiden beeinflussen würden, (2) Faktoren, die die Fitness und das Geschlechterverhältnis der Nachkommen des Parasitoiden beeinflussen, (3) die Fähigkeit dieses Parasitoiden (sowohl G1 als auch G3), sich an künstliche Ernährungsbedingungen anzupassen, und (4) die genetischen oder Verhaltensänderungen, die bei der Anpassung auftreten können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken Lukas Seehausen und Marc Kenis (CABI, Schweiz) für die freundliche Bereitstellung von G1 G. brasiliensis. Die Finanzierung in Italien wurde von der Provincia Autonoma di Trento, Trient, Italien, und in den USA vom National Institute of Food and Agriculture, dem USDA Specialty Crops Research Initiative Award (# 2020-5118-32140), dem USDA Animal and Plant Health Inspection Service (Farm Bill, Fonds 14-8130-0463) und den USDA ARS CRIS Basisfonds (Projekt 8010-22000-033-00D) bereitgestellt. Das USDA ist ein Anbieter von Chancengleichheit und Arbeitgeber und unterstützt keine in dieser Veröffentlichung genannten Produkte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Fleischmanns Yeast, Cincinatti, OH, USA | None | Used to cover fruit to reduce mold growth and enhance the frui attraction to the flies |
| Bacteriological agar | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | A1296 - 5KG | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Bleach solution | Clorox Company, Oakland, CA, USA | None | Used to disinfect flesh fruit |
| Blue stopper | Azer Scientific, Morgantown, PA, USA | ES3837 | Used for sealing the tube while allowing ventilation for insects |
| Blueberries | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as host fruit for the flies (various other fruit can also be used) |
| BugDorm insect rearing cage (W24.5 x D24.5 x H63.0 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E3030 | Used for rearing parasitoids (parasitism cage) |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4590 | Used for rearing flies |
| BugDorm insect rearing cage (W32.5 x D32.5 x H32.5 cm) | Mega View Science Co. Ltd., Taichung, Taiwan | 4E4545 | Used for rearing parasitoids (eclosion cage) |
| Chicken wire (0.64 cm, 19 gauge) | Everbilt, OH, USA | 308231EB | Used to lift up the fruit to allow maximum parasitoid oviposition |
| Cornmeal | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Dental cotton roll (1 x 3.8 cm) | Gima S.p.A., Gessate, MI, Italy | 35000 | Used for providing water to the parasitoids within the storage container |
| Drosophila diet | Frontier Scientific, Newark, DE, USA | TF1003 | Custom diet used to rear flies |
| Drosophila vial narrow, Polystirene (2.5 x 9.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 75813-160 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Drosophila vial plugs, Cellulose acetate (2.5 cm) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | 89168-886 | Used for providing water to the parasitoids within the cage |
| Erlenmeyer flask (250 mL) | Carolina Biological, Burlington, NC, USA | 731029 | Used for rearing flies and parasitoids |
| Falcon-style centrifuge tube (50 mL) | VWR International, LLC., Radnor, PA, US | VWRI525-0611 | Modified to ship adult parasitoids |
| Foam stopper | Jaece Industries, North Tanawanda, NY, USA | L800-C | Used for sealing the flasks while allowing ventilation for insects |
| Honey | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as food for parasitoids |
| Identi-Plug plastic foam stopper | Fisher Scientific Company, L.L.C., Pittsburg, PA, US | 14-127-40E | Used as feeder for parasitoids and to seal the storage container |
| Industrial paper towel | Grocery Store, Newark, DE, USA | None | Provided as a pupation substrate for pupae and mitigated moisture |
| Micron mesh fabric (250 mL) | Industrial Netting, Maple Grove, MN, USA | WN0250-72 | Used to make ventilation lid for insects |
| Nutritional yeast (flakes) | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Paper coaster (10.2 cm) | Hoffmaster, WI, USA | 35NG26 | Porvided as pupation substrate for flies and parsitized pupae |
| Plastic cup (Ø 13.3 cm, 800 mL) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | Unipak 5134 | Modified to store adult parasitoids |
| Plastic lid (Ø 13.3 cm) | Berry Superfos, Taastrup, Denmark | PP 2830 | Modified to store adult parasitoids |
| Propionic acid | Merk Life Science S.r.l., Milan, Italy | P1386 - 1L | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Saccharose | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| Soup cup with lid (475 mL) | StackMan, Vietnam | DC1648 | Used for parasitized larvae to pupate |
| Soybean flour | Grocery Store, Trento, TN, Italy | None | Used to prepare the Standard Drosophila Medium |
| White felt washer (0.64 cm thick, 5 mm ID x 20 mm OD) | Quiklok, Lincoln, NH, US | WFW/.25 x 5 x 20 mm | Used as feeding ring for parasitoids |
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