Summary
यहां, हम पानी से एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के अलगाव और पहचान और उनके एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन (एआरजी) के आणविक लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संस्कृति-आधारित और गैर-संस्कृति-आधारित (मेटाजेनोमिक विश्लेषण) तकनीकों का उपयोग कुल जीवाणु विविधता और मुंबई, भारत से ताजे पानी में मौजूद विभिन्न एआरजी के कुल पूल के बारे में पूरी जानकारी प्रदान करता है।
Abstract
मीठे पानी के निकायों से जुड़े माइक्रोबायोटा के माध्यम से एंटीबायोटिक प्रतिरोध (एआर) का विकास और प्रसार एक प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य चिंता है। वर्तमान अध्ययन में, ताजे पानी के नमूने एकत्र किए गए थे और पारंपरिक संस्कृति-आधारित तकनीकों और एक उच्च-थ्रूपुट संस्कृति-स्वतंत्र मेटाजेनोमिक दृष्टिकोण दोनों का उपयोग करके कुल जीवाणु विविधता और एआर जीन (एआरजी) के संबंध में विश्लेषण किया गया था। यह पेपर मीठे पानी के नमूनों से कुल और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी कल्चरेबल बैक्टीरिया की गणना और खेती योग्य आइसोलेट्स में फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक प्रतिरोध के निर्धारण के लिए एक व्यवस्थित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, हम गैर-संवर्धन योग्य बैक्टीरिया सहित समग्र जीवाणु विविधता की पहचान के लिए ताजे पानी के नमूने से निकाले गए कुल मेटाजेनोमिक डीएनए के पूरे मेटाजेनोमिक विश्लेषण के उपयोग की रिपोर्ट करते हैं, और जल निकाय में विभिन्न एआरजी (रेसिस्टोम) के कुल पूल की पहचान करते हैं। इन विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद, हमने 9.6 × 10 5-1.2 × 109 सीएफयू / एमएल की सीमा में एक उच्च एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया लोड देखा। अधिकांश आइसोलेट्स कई परीक्षण किए गए एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी थे, जिनमें सेफोटैक्सिम, एम्पीसिलिन, लिवोफ़्लॉक्सासिन, क्लोरैम्फेनिकॉल, सेफ्ट्रिएक्सोन, जेंटामाइसिन, नियोमाइसिन, ट्राइमेथोप्रिम और सिप्रोफ्लोक्सासिन शामिल थे, जिसमें ≥0.2 के कई एंटीबायोटिक प्रतिरोध (एमएआर) इंडेक्स थे, जो आइसोलेट्स में प्रतिरोध के उच्च स्तर का संकेत देते हैं। 16 एस आरआरएनए अनुक्रमण ने संभावित मानव रोगजनकों की पहचान की, जैसे कि क्लेबसिएला निमोनिया, और अवसरवादी बैक्टीरिया, जैसे कि कोमामोनास एसपीपी, माइक्रोकोकस एसपीपी, आर्थ्रोबैक्टर एसपीपी, और एरोमोनास एसपीपी। आइसोलेट्स के आणविक लक्षण वर्णन ने विभिन्न एआरजी की उपस्थिति दिखाई, जैसे कि ब्लाटेम, ब्लासीटीएक्स-एम (β-लैक्टम), एएडीए, एएसी (6')-आईबी (एमिनोग्लाइकोसाइड), और डीएफआर 1 (ट्राइमेथोप्रिम्स), जिसकी पुष्टि पूरे मेटाजीनोमिक डीएनए विश्लेषण द्वारा भी की गई थी। मेटाजीनोमिक डीएनए में एंटीबायोटिक एफ्लक्स पंप-एमटीआरए, मैकबी, एमडीटीए, एसीआरडी, β-लैक्टामेस-एसएमबी -1, वीआईएम -20, सीसीआरए, एएमपीसी, बीएलएजेड, क्लोरैम्फेनिकॉल एसिटाइलट्रांसफेरेज़ जीन कैटबी 10, और रिफैम्पिसिन प्रतिरोध जीन आरपीएचबी के लिए एन्कोडिंग के उच्च प्रसार का भी पता चला था। इस अध्ययन में चर्चा किए गए प्रोटोकॉल की मदद से, हमने विविध एआर फेनोटाइपिक और जीनोटाइपिक लक्षणों के साथ जलजनित एमएआर बैक्टीरिया की उपस्थिति की पुष्टि की। इस प्रकार, पूरे मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण का उपयोग जल निकाय की समग्र एआर स्थिति निर्धारित करने के लिए पारंपरिक संस्कृति-आधारित तकनीकों के पूरक तकनीक के रूप में किया जा सकता है।
Introduction
रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) को सबसे अधिक दबाव वाली वैश्विक समस्याओं में से एक के रूप में पहचाना गया है। एएमआर का तेजी से विकास और इसका विश्वव्यापी प्रसार मानव स्वास्थ्यऔर वैश्विक अर्थव्यवस्था के लिए सबसे बड़े खतरों में से एक है। एंटीबायोटिक दवाओं के अति प्रयोग और दुरुपयोग से एआर में वृद्धि हुई है। यह कोविड-19 महामारी द्वारा उजागर किया गया है, जिसके दौरान कई मामलों में संबंधित माध्यमिक संक्रमणों के उपचार सेप्रभावित रोगियों में एएमआर के कारण भारी समझौता किया गया था। मनुष्यों द्वारा एंटीबायोटिक दवाओं के प्रत्यक्ष उपयोग/दुरुपयोग के अलावा, कृषि और पशुपालन में एंटीबायोटिक दवाओं का अति प्रयोग और दुरुपयोग और जल निकायों सहित पर्यावरण में उनका अनुचित निर्वहन एकप्रमुख चिंता का विषय है। बैक्टीरिया में नए प्रतिरोध लक्षणों और मल्टीड्रग प्रतिरोध का उदय तत्काल एआर के विकास और इसके प्रसार के लिए अग्रणी कारकों की बेहतर समझ की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। कई एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी बैक्टीरिया, जो अक्सर प्लास्मिड जैसे मोबाइल आनुवंशिक तत्वों पर कई एआर जीन (एआरजी) ले जाते हैं, इन प्रतिरोध जीनों को गैर-प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों में स्थानांतरित कर सकते हैं, जिसमें संभावित मानव रोगजनक भी शामिल हैं, इस प्रकार सुपरबग्स का उद्भव होता है जो अंतिम-उपाय एंटीबायोटिक दवाओं के साथ भी इलाज योग्य नहींहैं। ये कई एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया, यदि पानी के पारिस्थितिक तंत्र में मौजूद हैं, तो मछली, केकड़ों और मोलस्क जैसे दूषित पानी आधारित खाद्य पदार्थों की खपत के माध्यम से सीधे मानव आंत में प्रवेश कर सकते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि स्वाभाविक रूप से होने वाली जल प्रणालियों में एआर बैक्टीरिया का प्रसार पीने के पानी सहित अन्य पानी की आपूर्ति तक भी पहुंच सकता है, और इस प्रकार, मानव खाद्य श्रृंखला 5,6,7 में प्रवेश कर सकता है।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य मुंबई, भारत में एक जल निकाय में मौजूद कुल जीवाणु विविधता और विभिन्न एआरजी के कुल पूल के बारे में पूरी जानकारी प्राप्त करने के लिए संस्कृति-आधारित और गैर-संस्कृति-आधारित (संपूर्ण मेटाजेनोमिक विश्लेषण) तकनीकों के संयोजन का उपयोग करके एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। परंपरागत रूप से, जल निकायों में जीवाणु विविधता का अध्ययन करने के लिए संस्कृति-आधारित तकनीकों का उपयोग किया गया है। चूंकि खेती योग्य सूक्ष्मजीव किसी भी आला में कुल माइक्रोबायोटा का केवल एक छोटा प्रतिशत बनाते हैं, जीवाणु विविधता की समग्र स्थिति और किसी भी नमूने में प्रचलित विभिन्न प्रतिरोधी लक्षणों की बेहतर समझ रखने के लिए, विभिन्न संस्कृति-आधारित और संस्कृति-स्वतंत्र तकनीकों का उपयोग किया जाना चाहिए। ऐसी एक मजबूत और विश्वसनीय संस्कृति-स्वतंत्र तकनीक संपूर्ण मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण है। इस उच्च-थ्रूपुट विधि का उपयोग बैक्टीरिया विविधता या विभिन्न एआरजी 8,9 के कार्यात्मक एनोटेशन पर विभिन्न अध्ययनों में सफलतापूर्वक किया गया है। यह तकनीक विभिन्न विश्लेषणों के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में मेटाजीनोम (एक नमूने में कुल आनुवंशिक सामग्री) का उपयोग करती है और इसलिए, संस्कृति-स्वतंत्र है। वर्तमान अध्ययन में प्रोटोकॉल का उपयोग पूरे मेटाजीनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए किया जा सकता है ताकि पानी के नमूनों में कुल जीवाणु विविधता और विभिन्न एआरजी (रेसिस्टोम) के बारे में जानकारी प्राप्त की जा सके।
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Protocol
1. नमूना संग्रह और प्रसंस्करण
- नमूना संग्रह
- बाँझ नमूना कंटेनर (ओं) में पानी के नमूने की उचित मात्रा एकत्र करें, यह सुनिश्चित करें कि कंटेनर का 3/4 से अधिक नहीं भरा है।
- नमूनों को संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में प्रयोगशाला में ले जाएं और तुरंत उन्हें संसाधित करें।
- नमूना प्रसंस्करण
- किसी भी कण पदार्थ को हटाने के लिए बाँझ मलमल कपड़े के माध्यम से पानी के नमूने को सड़न से फ़िल्टर करें।
- आगे के विश्लेषण के लिए फ़िल्टर किए गए पानी के उचित सीरियल कमजोर पड़ने का कार्य करें।
2. कुल जीवाणु भार और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया गिनती का अनुमान
- कुल जीवाणु भार का निर्धारण
- 18.12 ग्राम आर 2 ए आगर, 1,000 एमएल डबल-डिस्टिल्ड पानी में संशोधित पाउडर को निलंबित करें, और मिश्रण को गर्म करके घोल दें। 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआई पर घुलित मिश्रण को 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें। बाँझ पेट्री प्लेटों में आटोक्लेव मिश्रण की उचित मात्रा डालकर आर 2 ए आगर, संशोधित प्लेटें तैयार करें (उदाहरण के लिए, 90 मिमी बाँझ पेट्री प्लेट में लगभग 20 एमएल ऑटोक्लेव बाँझ माध्यम जोड़ें)।
- आर 2 ए एगर पर फ़िल्टर किए गए पानी के नमूने के उपयुक्त कमजोर पड़ने के 100 μL को समान रूप से फैलाएं, मध्यम जमने के बाद संशोधित प्लेट। डुप्लिकेट में प्रयोग करें।
- उपरोक्त सभी प्लेटों को 48 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया के आधार पर तापमान और इनक्यूबेशन समय को अलग-अलग करें)।
- समीकरण (1) का उपयोग करके कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों प्रति मिलीलीटर (सीएफयू / एमएल) के संदर्भ में कुल जीवाणु भार को व्यक्त करें:
(1)
- एआर जीवाणु गणना का निर्धारण
- चरण 2.1.1-2.1.4 का पालन करें। हालांकि, आर 2 ए ए एगर के बजाय, संशोधित प्लेटों का उपयोग करें, आर 2 ए एगर का उपयोग करें, संशोधित प्लेटों को व्यक्तिगत रूप से पांच अलग-अलग एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जाता है, अर्थात् सेफोटैक्सिम (3 μg / mL), सिप्रोफ्लोक्सासिन (0.5 μg / mL), एरिथ्रोमाइसिन (20 μg / mL), कनामाइसिन (15 μg / mL), और वैनकोमाइसिन (3 μg / mL)।
- चरण 2.2.1 में उल्लिखित अंतिम एंटीबायोटिक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं को 20 एमएल बाँझ पिघला हुआ आर 2 ए आगर, संशोधित (पिघला हुआ आर 2 ए आगर के तापमान के साथ, ≤40 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित) युक्त ट्यूबों में अलग से जोड़ें।
- आगर जमने से पहले मिश्रण के लिए भी घुमाएं और बाँझ पेट्री प्लेटों पर डालें। डुप्लिकेट में प्रयोग करें।
- उपरोक्त सभी प्लेटों को 48 घंटे के लिए 35-37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (यदि एक अलग मीडिया का उपयोग करके, तापमान और इनक्यूबेशन समय भिन्न हो सकता है)।
- गुणवत्ता नियंत्रण और एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता की जांच के लिए, एस्चेरिचिया कोलाई एटीसीसी 25922 और स्टेफिलोकोकस ऑरियस एटीसीसी 29213 उपभेदों के जीवाणु निलंबन के 100 μL को उनके संबंधित एंटीबायोटिक युक्त R2A Agar, संशोधित प्लेटों पर फैलाएं (सुनिश्चित करें कि टीकाकरण के लिए उपयोग की जाने वाली ताजा संस्कृति का घनत्व OD = 0.5 600 nm है)।
- चरण 2.1.4 में वर्णित सीएफयू / एमएल के संदर्भ में एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीवाणु गणना निर्धारित करें।
- आइसोलेट्स के ग्लिसरॉल स्टॉक
- रूपात्मक रूप से अलग एआर कॉलोनियों का चयन करें।
- बाँझ लुरिया-बर्टानी शोरबा के 2 एमएल में एक एकल पृथक कॉलोनी को निलंबित करें जिसमें संबंधित एंटीबायोटिक हो (उदाहरण के लिए, यदि एक कॉलोनी को सेफोटैक्सिम युक्त प्लेट से चुना गया था, तो बाँझ लुरिया-बर्टानी शोरबा में चरण 2.3.1 से कॉलोनी को टीका लगाएं, जिसमें इसकी संबंधित एकाग्रता पर सेफोटैक्सिम होता है)।
- 80 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर टीका ट्यूबों को तब तक इनक्यूबेट करें जब तककि ओडी 600 0.5 तक न पहुंच जाए।
- सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में चरण 2.3.3 से 250 μL बाँझ 100% ग्लिसरॉल में कल्चर सस्पेंशन के 750 μL को मिलाकर आइसोलेट्स के ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार करें।
- ग्लिसरॉल स्टॉक को आगे के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: ग्लिसरॉल स्टॉक से संस्कृतियों के पुनरुद्धार के लिए, ग्लिसरॉल स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर पिघलाएं। इस स्टॉक के एक लूप को 2 एमएल बाँझ लुरिया-बरतानी शोरबा में टीका लगाएं जिसमें संबंधित एंटीबायोटिक हो और बढ़ने की अनुमति दें।
(1)3. 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण द्वारा संवर्धन योग्य बैक्टीरिया की पहचान
- पीसीआर के लिए आइसोलेट्स से डीएनए टेम्पलेट तैयार करना
नोट: बैक्टीरिया से कच्चे डीएनए के अलगाव के लिए पीसीआर के लिए डीएनए टेम्पलेट की तैयारी के लिए वर्णित प्रोटोकॉल कार्लसन एट अल.10 द्वारा दिया गया है।- एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करके, पेट्री प्लेट पर बढ़ने वाले आइसोलेट की एक एकल, पृथक, शुद्ध कॉलोनी लें। जीवाणु कॉलोनी को बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बाँझ डबल-डिस्टिल्ड पानी के 100 μL में निलंबित करें और 10 मिनट के लिए उबालें।
- मलबे को पेलेट करने के लिए 2 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें, और कच्चे डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग के लिए सुपरनैटेंट को एक ताजा बाँझ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 16 एस आरआरएनए जीन और अनुक्रमण के वी 3 क्षेत्र का लक्षित पीसीआर प्रवर्धन
- जैसा कि तालिका 1 में उल्लेख किया गया है, पीसीआर प्रवर्धन के लिए पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण का 40 μL तैयार करें।
नोट: संदूषण की संभावना को कम करते हुए डीएनए तैयारी एक बर्फ ब्लॉक पर की जानी चाहिए (अभिकर्मकों को संभालते समय दस्ताने पहनें, और 70% इथेनॉल के साथ काम की सतह को अच्छी तरह से साफ करें)। - ट्यूब को थर्मल ब्लॉक में रखें, और पीसीआर थर्मल साइकिलर में उपयुक्त कार्यक्रम चलाएं। मानकीकृत पीसीआर साइक्लिंग स्थितियों के लिए तालिका 2 और 16 एस आरआरएनए जीन के वी 3 क्षेत्रों के प्रवर्धन के लिए प्राइमर जानकारी देखें।
- एम्प्लिकॉन और विज़ुअलाइज़ेशन को हल करने के लिए, एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (एजीई) करें। प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद के 10 μL और 6x जेल लोडिंग बफर के 2 μL को मिलाएं (तालिका 3), और इस मिश्रण को 1.5% अगारोस जेल पर कुओं में लोड करें (1x TAE बफर [तालिका 3]) के 100 एमएल में 1.5 ग्राम अगारोस पाउडर घोलें) जिसमें 10 मिलीग्राम / एमएल एथिडियम ब्रोमाइड (ईटीबीआर) के 5 μL से 100 मिलीग्राम /
चेतावनी: ईटीबीआर एक शक्तिशाली कार्सिनोजेन है। ईटीबीआर और ईटीबीआर युक्त जैल को संभालते समय दस्ताने हर समय पहने जाने चाहिए। - एम्प्लिकॉन के आकार के आकलन के लिए डीएनए सीढ़ी जोड़ें।
- 80-100 वी पर टीएई टैंक बफर में जेल के वैद्युतकणसंचलन करें।
- एक बार जब ट्रैकिंग डाई जेल के 3/4 चलती है, तो वैद्युतकणसंचलन को रोकें, और यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर के तहत एम्प्लिकॉन बैंड की कल्पना करें।
- आइसोलेट की पहचान करने के लिए 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पाद (एम्प्लिकॉन) का उपयोग करें।
- समीकरण (2) का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण के अधीन करके एम्प्लिकॉन की मात्रा निर्धारित करें।
(2) - डीएनए की शुद्धता की जांच करने के लिए, A260/A280 के अनुपात की गणना करें।
नोट: आदर्श रूप से, यह संख्या 1.5 से ऊपर होनी चाहिए और अधिमानतः, 1.8 और 2.0 के बीच होनी चाहिए। - आइसोलेट्स की पहचान करने के लिए, उपयुक्त संरेखण खोज उपकरण का उपयोग करके अनुक्रम डेटाबेस के साथ प्राप्त अनुक्रमों की तुलना करें।
- जैसा कि तालिका 1 में उल्लेख किया गया है, पीसीआर प्रवर्धन के लिए पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया मिश्रण का 40 μL तैयार करें।
(2)4. एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण का उपयोग करके आइसोलेट्स में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाना
नोट: यह प्रोटोकॉल डिस्क प्रसार द्वारा एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) के लिए विधि का वर्णन करता है। निम्नलिखित एंटीबायोटिक डिस्क का उपयोग किया गया था: सेफोटैक्सिम (5 μg), एम्पीसिलीन (10μg), लिवोफ़्लॉक्सासिन (5 μg), क्लोरैम्फेनिकॉल (30μg), टिगेसाइक्लिन (15μg), ceftriaxone (30 μg), इमिपेनेम (10μg), gentamicin (10 μg), नियोमाइसिन (10 μg), trimethoprim (5μg), trimethoprim (5 μg), 30μg), इमिपेनेम (10μg), gentamicin (10 μg), trimethoprim (5 μg), trimethoprim (5 μg), trimethoprim (5 μg), 30μg)
- एएसटी के लिए इनोकुलम की तैयारी
- एक बाँझ गैर-चयनात्मक माध्यम, जैसे कि लुरिया-बर्टानी शोरबा (बिना किसी एंटीबायोटिक के) के 2 एमएल में बाँझ लूप का उपयोग करके एक एकल, पृथक, शुद्ध एआर कॉलोनी को टीका लगाया जाता है, और रात भर 80 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है।
- ताजा गैर-चयनात्मक लुरिया-बर्टानी शोरबा माध्यम के 2 एमएल में रात भर विकसित संस्कृति (लगभग, ओडी600 = 1.8-2.0) के 100-150 μL लेने से पुन: निलंबित किया जाता है और 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है (जब तककि OD 600 0.4-0.5 तक नहीं पहुंच जाता)।
- बाँझ 0.85% खारा घोल का उपयोग करके इस ताजा उगाए गए संस्कृति निलंबन को पतला करें जैसे कि संस्कृति का घनत्व 0.5 मैकफारलैंड मानक (लगभग, ओडी600 = 0.1 ) के बराबर है, जो मोटे तौर पर 1-2 × 108 कोशिकाओं / एमएल से मेल खाता है।
- धीरे से एक समान सेल वितरण के लिए जीवाणु निलंबन मिलाएं।
- कमजोर पड़ने के 15 मिनट के भीतर उपरोक्त निलंबन का उपयोग करें।
- आगर प्लेटों का टीकाकरण
- 1,000 एमएल डबल-डिस्टिल्ड पानी में एमएचए के 38 ग्राम को मिलाकर एएसटी करने के लिए मुलर-हिंटन आगर (एमएचए) प्लेटें तैयार करें, और मिश्रण को गर्म करके घोल दें। घुलित मिश्रण को 121 डिग्री सेल्सियस, 15 पीएसआई पर 15 मिनट के लिए ऑटोक्लेव करें।
- सुनिश्चित करें कि प्लेटों में एमएचए की गहराई 4 मिमी (प्रति प्लेट 25 एमएल मध्यम) है।
- इसके साथ ही, फ्रीजर से एंटीबायोटिक डिस्क को हटा दें और उन्हें कमरे के तापमान पर गर्म करें।
नोट: डिस्क पर संक्षेपण के किसी भी संभावित खतरे को कम करने के लिए शुरू में डिस्क को 4 डिग्री सेल्सियस और बाद में कमरे के तापमान पर पिघलाकर एंटीबायोटिक डिस्क को धीरे-धीरे पिघलाया जाना चाहिए, जो बाद में अवरोध के क्षेत्र (जेडओआई) को प्रभावित कर सकता है। - सड़न रोकनेवाली परिस्थितियों में, चरण 4.1 में तैयार इनोकुलम में एक बाँझ कपास के फाहे को डुबोएं, और प्लेटों के अति-टीकाकरण से बचने के लिए अतिरिक्त निलंबन को हटा दें।
- संस्कृति को प्लेटों पर समान रूप से फैलाएं, एमएचए प्लेट के शीर्ष से शुरू करें और किनारे से किनारे तक आगे और पीछे जाएं। स्वैबिंग करते समय प्लेट को 60° से घुमाएं।
- एंटीबायोटिक डिस्क का अनुप्रयोग
- लौ-निष्फल बल की मदद से, एंटीबायोटिक डिस्क को टीकाकृत एमएचए प्लेटों पर स्थानांतरित करें, और एगर के साथ पूर्ण स्तर के संपर्क को सुनिश्चित करने के लिए डिस्क को धीरे से दबाएं।
नोट: यह प्रक्रिया प्लेटों पर संस्कृति के टीकाकरण के 15 मिनट के भीतर की जानी चाहिए। - निषेध के क्षेत्रों के अतिव्यापी होने से बचने के लिए जीव, उपयोग किए गए एंटीबायोटिक और प्लेट के आकार को ध्यान में रखते हुए आगर प्लेट पर एंटीबायोटिक डिस्क की उचित संख्या रखें।
नोट: चार से पांच डिस्क को 90 मिमी गोलाकार प्लेट पर समायोजित किया जा सकता है।
- लौ-निष्फल बल की मदद से, एंटीबायोटिक डिस्क को टीकाकृत एमएचए प्लेटों पर स्थानांतरित करें, और एगर के साथ पूर्ण स्तर के संपर्क को सुनिश्चित करने के लिए डिस्क को धीरे से दबाएं।
- प्लेटों की इनक्यूबेशन
- एंटीबायोटिक डिस्क के आवेदन के 15 मिनट के भीतर, प्लेटों को उलट दें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- परिणामों की व्याख्या
- मिलीमीटर (मिमी) में ZOI व्यास को मापें, और EUCAST11 द्वारा दिए गए ब्रेकपॉइंट मानों के अनुसार व्याख्या करें। नीचे दिए गए दो उदाहरण देखें।
- एंटरोबैक्टेरल के लिए सिप्रोफ्लोक्सासिन एंटीबायोटिक डिस्क (5 μg) के लिए ज़ोन व्यास ब्रेकपॉइंट (mm) S ≥ 25 और R < 22 है, जिसका अर्थ है कि इसे संवेदनशील (S) माना जाता है यदि ZOI 25 मिमी ≥ है, जबकि यह प्रतिरोधी (R) है यदि ZOI 22 मिमी <। यदि ZOI व्यास 22 और 25 के बीच गिरता है, तो आइसोलेट को मध्यवर्ती (I) माना जाता है।
- स्टेफिलोकोकस एसपीपी के लिए क्लोरैम्फेनिकॉल एंटीबायोटिक डिस्क (30 μg) के लिए ज़ोन व्यास ब्रेकपॉइंट (मिमी) एस ≥ 18 और आर < 18 है, जिसका अर्थ है कि इसे संवेदनशील माना जाता है यदि जेडओआई 18 मिमी ≥ है, जबकि यह प्रतिरोधी है यदि जेडओआई 18 मिमी <।
- एंटीबायोटिक दवाओं की संख्या के अनुपात को खोजकर एकाधिक एंटीबायोटिक प्रतिरोध (एमएआर) सूचकांक निर्धारित करें, जिसके लिए आइसोलेट एंटीबायोटिक दवाओं की कुल संख्या के लिए प्रतिरोधी है, जिसके लिए आइसोलेट उजागर होता है।
नोट: गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, ई कोलाई एटीसीसी 25922 और एस। ऑरियस एटीसीसी 29213 का उपयोग चरण 4 में प्रोटोकॉल का पालन करते हुए संदर्भ उपभेदों के रूप में किया जाता है।
- मिलीमीटर (मिमी) में ZOI व्यास को मापें, और EUCAST11 द्वारा दिए गए ब्रेकपॉइंट मानों के अनुसार व्याख्या करें। नीचे दिए गए दो उदाहरण देखें।
5. आइसोलेट्स में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का पीसीआर-आधारित पता लगाना
- आइसोलेट्स में एआरजी की पहचान के लिए एक मानक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करें। चरण 3.1 में दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीएनए टेम्पलेट तैयार करें।
नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पीसीआर साइकिलिंग स्थितियां 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस थीं, इसके बाद 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, उचित तापमान पर 30 सेकंड के लिए एनीलिंग (जैसा कि प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए मानकीकृत है), 40 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार, और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार। प्रतिक्रिया मिश्रण तालिका 4 में वर्णित है। एआरजी, प्राइमर और एनीलिंग तापमान की सूची तालिका 5 में दी गई है। - एम्प्लिकॉन की शुद्धता को हल करने, विज़ुअलाइज़ करने और जाँचने के लिए, चरण 3.2.3-3.2.10 का पालन करें।
6. कुल जीवाणु विविधता की पहचान और मेटाजीनोम में एआरजी का पता लगाने के लिए संपूर्ण मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण
- पानी के नमूने से कुल डीएनए (मेटाजीनोम) का निष्कर्षण
- फ़िल्टर किए गए पानी के नमूनों से मेटाजेनोमिक डीएनए निकालें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए संदर्भित डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए पानी के नमूनों से मेटाजेनोमिक डीएनए (कुल डीएनए) निकाला गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। - निकाले गए मेटाजीनोमिक डीएनए के 3 μL को 0.8% अगारोस जेल पर लोड करके डीएनए की गुणवत्ता की जांच करें, और लगभग 30 मिनट के लिए जेल को 80-110 V पर चलाएं।
- एकल बरकरार बैंड की उपस्थिति की जांच करें।
- फ्लोरोमीटर का उपयोग करके डीएनए एकाग्रता की जांच करें।
- फ़िल्टर किए गए पानी के नमूनों से मेटाजेनोमिक डीएनए निकालें।
- पूरे मेटाजेनोमिक डीएनए अनुक्रमण का उपयोग करके बैक्टीरिया विविधता का निर्धारण और एआरजी का पता लगाना
- पुस्तकालय की तैयारी और पीसीआर प्रवर्धन:
- संदर्भित डीएनए लाइब्रेरी प्रेप किट का उपयोग करके एक युग्मित-अंत अनुक्रमण लाइब्रेरी तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- 200 एनजी डीएनए लेकर एडाप्टर लिगेशन के लिए डीएनए तैयार करें और यांत्रिक रूप से इसे छोटे टुकड़ों में काट दें, इसके बाद अंत-मरम्मत का एक निरंतर चरण होता है जिसमें 3 ' सिरों में एक "ए" जोड़ा जाता है।
- अनुक्रमण के लिए उपयोग किए जाने वाले मंच के आधार पर, डीएनए टुकड़ों के दोनों सिरों पर विशिष्ट एडेप्टर लागू करते हैं।
नोट: अनुक्रमण के लिए प्रवाह सेल में दोहरे-बारकोडेड पुस्तकालयों को बांधने के लिए महत्वपूर्ण अनुक्रम इन एडाप्टर में मौजूद हैं। यह एडाप्टर-लिगेटेड टुकड़ों के पीसीआर प्रवर्धन और मानक अनुक्रमण प्राइमरों को बांधने की अनुमति देता है। - गुणवत्ता और मात्रा की जांच करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार उच्च संवेदनशीलता डीएनए चिप का उपयोग करके प्रवर्धित पुस्तकालय का विश्लेषण करें।
- क्लस्टर उत्पादन और अनुक्रमण:
- क्लस्टर उत्पादन और बाद के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त अनुक्रमण मंच पर प्रवर्धित पुस्तकालय लोड करें।
नोट: लाइब्रेरी अणु युग्मित-अंत प्रवाह सेल पर पूरक एडाप्टर ऑलिगोस से बंधते हैं। अनुक्रमण के दौरान, रिवर्स स्ट्रैंड के पुनर्संश्लेषण के बाद आगे के स्ट्रैंड को चुनिंदा रूप से छोड़ दिया जाता है। इस कॉपी किए गए रिवर्स स्ट्रैंड को तब टुकड़े के विपरीत छोर से अनुक्रमित किया जाता है।
- क्लस्टर उत्पादन और बाद के अनुक्रमण के लिए उपयुक्त अनुक्रमण मंच पर प्रवर्धित पुस्तकालय लोड करें।
- जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण:
- उपयुक्त मंच का उपयोग करके उच्च गुणवत्ता वाले डेटा से मचान उत्पन्न करें।
- इन मचानों को टैक्सोनोमिक वर्गीकरण और एआरजी की पहचान के लिए जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के अधीन करें।
नोट: कुल जीवाणु विविधता की पहचान और मेटाजीनोम में एआरजी का पता लगाने के लिए पूरे मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो चित्रा 1 में दिया गया है। पांडुलिपि में वर्णित पूरी पद्धति की एक फ्लोशीट चित्रा 2 में दी गई है।
- पुस्तकालय की तैयारी और पीसीआर प्रवर्धन:
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Representative Results
कुल जीवाणु भार और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी (एआर) बैक्टीरिया गिनती
कुल जीवाणु भार की गणना आर 2 ए आगर, संशोधित माध्यम पर पानी के नमूनों के 10-4 से 10-6 गुना कमजोर पड़ने के द्वारा की गई थी। एआर बैक्टीरिया गिनती की गणना के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं वाले मीडिया प्लेटों पर 10−3 से 10-6 गुना कमजोर पड़ने का प्रसार किया गया था (चित्रा 3)। कुल और एआर बैक्टीरिया की गणना सीएफयू / एमएल के रूप में की गई थी, और सभी चढ़ाना प्रयोग डुप्लिकेट में किए गए थे। उपरोक्त प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, वर्तमान अध्ययन ने कुल बैक्टीरिया की गिनती 3.0 × 109 सीएफयू / एमएल दिखाया। एआर बैक्टीरियल लोड 9.6 × 10 5-1.2 × 109 सीएफयू / एमएल (तालिका 6) की सीमा में अधिक पाया गया था।
16S rRNAgene अनुक्रमण द्वारा संवर्धन योग्य बैक्टीरिया की पहचान
प्रत्येक आइसोलेट से कच्चे डीएनए का उपयोग 16 एस आरआरएनए जीन-विशिष्ट पीसीआर करने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया था। अनुक्रमित कुल 15 एआर आइसोलेट्स में से 10 एंटरोबैक्टीरिया परिवार से संबंधित थे, जिनमें से अधिकांश एस्चेरिचिया कोलाई और क्लेबसिएला निमोनिया थे। दुर्लभ अवसरवादी बैक्टीरिया जैसे कि कोमामोनास एसपीपी परिवार से संबंधित कोमामोनाडेसी, माइक्रोकोकस एसपीपी और आर्थ्रोबैक्टर एसपीपी। परिवार से संबंधित माइक्रोकोकेसी, और एयरोमोनास एसपीपी परिवार से संबंधित एरोमोनाडेसी को भी पानी के नमूने से पहचाना गया था (तालिका 7)।
एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण का उपयोग करके खेती योग्य बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाना
उपरोक्त पहचाने गए आइसोलेट्स की एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रोफ़ाइल डिस्क प्रसार विधि (चित्रा 4) का उपयोग करके एएसटी करके उत्पन्न की गई थी। परीक्षण किए गए 15 आइसोलेट्स में से 8 में ≥0.2 का एमएआर इंडेक्स था, जो उच्च स्तर के प्रतिरोध का संकेत देता है। इसके अलावा, कई आइसोलेट्स ने सह-प्रतिरोध प्रोफाइल (एंटीबायोटिक दवाओं के एक ही सेट के लिए प्रतिरोध) दिखाया। हालांकि, कोमामोनास एसपीपी और आर्थ्रोबैक्टर एसपीपी जैसे आइसोलेट्स ने परीक्षण किए गए किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध नहीं दिखाया (तालिका 8)।
संवर्धन योग्य बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का पता लगाना और पहचान करना
पीसीआर का उपयोग करके एआरजी की उपस्थिति के लिए कुल 10 एआर आइसोलेट्स की जांच की गई। संवर्धन योग्य आइसोलेट्स में सबसे प्रचलित एआरजी β-लैक्टामेज के लिए बीएलएटीईएम एन्कोडिंग था, इसके बाद एमिनोग्लाइकोसाइड प्रतिरोध जीन एडीए था। अन्य प्रवर्धित एआरजी क्रमशः β-लैक्टम, ट्राइमेथोप्रिम और एमिनोग्लाइकोसाइड्स के प्रतिरोध को प्रदान करने वाले blaCTX-M, dfr1, और aac (6')-IB थे। एआरजी के प्रवर्धन के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 5 में दिखाए गए हैं। अधिकांश पहचाने गए आइसोलेट्स के लिए, पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिक एआर प्रोफाइलिंग के माध्यम से आणविक स्तर पर फेनोटाइपिक प्रतिरोध (एएसटी) की पुष्टि की गई थी।
मेटाजेनोमिक डीएनए में कुल जीवाणु विविधता की पहचान
सभी संभावित बैक्टीरिया (दोनों कृषि योग्य और गैर-संवर्धन योग्य) की उपस्थिति की जांच करने और उनके सापेक्ष बहुतायत की पहचान करने के लिए, कुल जीवाणु विविधता के लिए एक मेटाजीनोमिक डीएनए विश्लेषण किया गया था। उच्च-थ्रूपुट अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एचटी-एनजीएस) दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, कुल अनुक्रम पढ़ने का ~ 96.94% प्राप्त किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप उच्च कवरेज हुआ। वर्गीकरण एनोटेशन को फ़ाइलम से जीनस स्तर तक विभिन्न टैक्सोनोमिक समूहों में वर्गीकृत करने के लिए किया गया था (चित्रा 6 और चित्रा 7)। मेटाजीनोम में कुल 50 फ़ाइला की पहचान की जा सकती है, जो पानी के नमूने में उच्च जीवाणु विविधता का संकेत देती है। प्रोटियोबैक्टीरिया सबसे प्रमुख फाइलम था, जिसमें अल्फाप्रोटियोबैक्टीरिया, बीटाप्रोटियोबैक्टीरिया और गामाप्रोटियोबैक्टीरिया वर्ग शामिल थे। ऑर्डर स्तर पर, बर्कहोल्डरियाल्स बीटाप्रोटियोबैक्टीरिया वर्ग से संबंधित सबसे प्रचलित क्रम था। स्यूडोमोनास, एसिनेटोबैक्टर, पेडोबैक्टर, प्रोस्थेकोबैक्टीरियम, लिमनोहाबिटन्स, फ्लेवोबैक्टीरियम और कोमामोनास पानी के नमूने में पाए जाने वाले कुछ प्रचुर मात्रा में जेनेरा थे।
मेटाजेनोमिक डीएनए से एआरजी का पता लगाना
पानी के नमूने के मेटाजीनोम में एआरजी के कुल पूल को समझने के लिए, पूरे मेटाजेनोमिक अनुक्रमण किया गया था, इसके बाद उपयुक्त जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करके एआरजी की पहचान की गई थी। मेटाजेनोमिक दृष्टिकोण यह सुनिश्चित करता है कि नमूने में कृषि योग्य और गैर-संवर्धन योग्य सूक्ष्मजीवों दोनों में मौजूद एआरजी का पता लगाया जाता है। β-लैक्टम (एसएमबी -1, एएमपीसी 1, वीआईएम -20, सीसीआरए, एनएमसीआर, एआरएल -1, बीएलएजेड) के प्रतिरोध को प्रदान करने वाले विभिन्न प्रकार के जीन; एमिनोजिलकोसाइड्स (एएसी (6')-34); क्विनोलोन (qnrs6, qnrVC5); एंटीबायोटिक एफ्लक्स पंप-प्रतिरोध-नोडुलेशन-सेल डिवीजन (आरएनडी) (ईवीजीए, एमटीआरए, एमडीटीए, एसीआरडी), एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) (ओएलसी, मैकबी, पीएटीए, बीसीआरए), और प्रमुख सुविधाकर्ता सुपरफैमिली (एमएफएस) (एबीएक्यू); ट्राइमेथोप्रिम प्रतिरोधी डायहाइड्रोफोलेट रिडक्टेस (डीएफआरडी, डीएफआरए 20); रिफैम्पिन फॉस्फोट्रांसफेरेज़ (आरपीएचबी); और मेटाजीनोम में क्लोरैम्फेनिकॉल एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (कैट) (कैटबी 10) का पता लगाया गया था। पीसीआर के माध्यम से पाए जाने वाले एआरजी (बीएलएटीईएम, बीएलएसीटीएक्स-एम, एडीए, एएसी (6')-आईबी, डीएफआर 1) को पूरे मेटाजीनोमिक अनुक्रमण द्वारा भी पता लगाया गया था, इस प्रकार पानी के नमूने में उनकी उपस्थिति की पुष्टि की गई थी। पूरे मेटाजीनोमिक डीएनए विश्लेषण का उपयोग करके मेटाजीनोम में पहचाने गए एआरजी के प्रतिनिधि परिणाम तालिका 9 में दिए गए हैं।
चित्रा 1: पूरे मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो। कुल जीवाणु विविधता की पहचान और मेटाजीनोम से एआरजी का पता लगाने के लिए चरणवार वर्कफ़्लो प्रस्तुत किया गया है। समग्र चरणों में मेटाजेनोमिक डीएनए तैयारी, प्रवर्धन और पहचान शामिल है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: पूरी कार्यप्रणाली की फ्लोशीट। वर्तमान अध्ययन में प्रयुक्त पद्धति का चरणबद्ध वर्कफ़्लो। बैक्टीरिया की विविधता और पानी के नमूने में मौजूद एआरजी की पहचान के बारे में पूरी जानकारी प्राप्त करने के लिए संस्कृति-आधारित और गैर-संस्कृति-आधारित तकनीकों दोनों के संयोजन का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एंटीबायोटिक युक्त आर 2 ए आगर, संशोधित प्लेटों पर पृथक कॉलोनियों की प्रतिनिधि छवियां। पानी के नमूने सेफोटैक्सिम (3 μg / mL) पर चढ़ाए जाते हैं - जिसमें R2A Agar, संशोधित प्लेटें होती हैं। नमूना को क्रमिक रूप से पतला किया गया था और डुप्लिकेट-ए 1, ए 2: 10−4 में चढ़ाया गया था; बी 1, बी 2: 10−5; सी 1, सी 2: 10−6। उपयुक्त इनक्यूबेशन अवधि के बाद, अलग-थलग कॉलोनियां बी 1, बी 2, सी 1 और सी 2 प्लेटों पर दिखाई दे रही थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: डिस्क प्रसार विधि द्वारा एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण। एस्चेरिचिया कोलाई आइसोलेट के लिए डिस्क प्रसार विधि द्वारा एएसटी की प्रतिनिधि छवियां। एएसटी डुप्लिकेट-ए 1, ए 2: सीटीएक्स, आईपीएम, सीआईपी, सीआईपी में किया गया था; बी 1, बी 2: एलई, टीजीसी, एएमपी, जेन; सी 1, सी 2: टीआर, एन, के, सीटीआर। जेडओआई के व्यास को मिलीमीटर (मिमी) में मापा गया था। यह व्याख्या करने के लिए कि क्या आइसोलेट प्रतिरोधी है या उपयोग किए गए एंटीबायोटिक के लिए अतिसंवेदनशील है, जेडओआई की तुलना नवीनतम ईयूकास्ट तालिकाओं के साथ की गई थी। संक्षेप: एएसटी = एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण; सीटीएक्स = सेफोटैक्सिम; आईपीएम = इमिपेनेम; सी = क्लोरैम्फेनिकॉल; सीआईपी = सिप्रोफ्लोक्सासिन; एलई = लेवोफ़्लॉक्सासिन; टीजीसी = टिगेसाइक्लिन; एएमपी = एम्पीसिलीन; जेन = जेंटामाइसिन; टीआर = ट्राइमेथोप्रिम; एन = नियोमाइसिन; के = कनामाइसिन; सीटीआर = सेफ्ट्रियाक्सोन; ZOI = निषेध का क्षेत्र; ईयूकास्ट = एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण पर यूरोपीय समिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: संवर्धन योग्य बैक्टीरिया से एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन का पीसीआर प्रवर्धन। आइसोलेट्स में एआरजी की उपस्थिति की जांच के लिए प्रवर्धित बैंड के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन पोस्ट पीसीआर किया गया था। जेल पर पीसीआर एम्प्लिकॉन के अलग-अलग बैंड देखे जा सकते हैं। व्यक्तिगत पीसीआर एम्प्लिकॉन के आकार की तुलना एक उपयुक्त डीएनए मार्कर के साथ की जाती है। लेन एल 1: 100 बीपी डीएनए सीढ़ी; लेन 1-5: 1: डीएफआर 1 (425 बीपी); लेन 2: blaTEM (310 bp); लेन 3: blaCTX-M (500 bp); लेन 4: एएसी (6') -आईबी (395 बीपी); लेन 5: एएडीए (624 बीपी)। संक्षिप्त नाम: एआरजी = एंटीबायोटिक-प्रतिरोध जीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 6: फाइलम और वर्ग स्तरों के लिए वर्गीकरण वर्गीकरण। (ए) बार चार्ट पानी के नमूने में बैक्टीरियल मेटाजीनोम के फाइलम-स्तरीय टैक्सोनोमिक बहुतायत वितरण को दर्शाता है। मेटाजेनोमिक विश्लेषण द्वारा कुल 50 बैक्टीरियल फ़ाइला की पहचान की गई थी। बैक्टीरिया के पहले 12 प्रमुख फ़ाइला दिखाए गए हैं। (बी) बार चार्ट पानी के नमूने में बैक्टीरियल मेटाजीनोम के वर्ग-स्तरीय टैक्सोनोमिक बहुतायत वितरण को दर्शाता है। मेटाजेनोमिक विश्लेषण द्वारा कुल 50 जीवाणु वर्गों की पहचान की गई थी। बैक्टीरिया के पहले 15 प्रमुख वर्ग दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 7: क्रम और जीनस स्तरों के लिए वर्गीकरण वर्गीकरण। (A) बार चार्ट पानी के नमूने में जीवाणु मेटाजीनोम के क्रम-स्तरीय टैक्सोनोमिक बहुतायत वितरण को दर्शाता है। मेटाजेनोमिक विश्लेषण द्वारा कुल 50 जीवाणु आदेशों की पहचान की गई थी। बैक्टीरिया के पहले 14 प्रमुख आदेशों को आंकड़े में दिखाया गया है। (बी) बार चार्ट पानी के नमूने में बैक्टीरियल मेटाजीनोम के जीनस-स्तरीय टैक्सोनोमिक बहुतायत वितरण को दर्शाता है। मेटाजेनोमिक विश्लेषण द्वारा कुल 50 जीवाणु जेनेरा की पहचान की गई थी। बैक्टीरिया के पहले 15 प्रमुख जेनेरा को चित्र में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| पीसीआर अभिकर्मक | Volume (μL) |
| 2x Taq मास्टर मिक्स | 20 |
| फॉरवर्ड प्राइमर (10 पिको मोल) | 1.5 |
| रिवर्स प्राइमर (10 पिको मोल) | 1.5 |
| क्रूड डीएनए टेम्पलेट | 1.5 |
| बाँझ आणविक जीव विज्ञान पानी | 15.5 |
| कुल आयतन | 40 |
तालिका 1: पीसीआर मास्टरमिक्स घटक। विभिन्न पीसीआर अभिकर्मकों की प्रतिक्रिया मिश्रण संरचना।
| दिशा | प्राइमर अनुक्रम 5 ' – 3 ' | पीसीआर की स्थिति | चक्रों की संख्या |
| आगे | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 10 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस | 1 |
| 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण | 35 | ||
| 30 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग | |||
| 40 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार | |||
| उल्टा | CTACCGGGGTATCTAATCC | 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम विस्तार | 1 |
तालिका 2: 16 एस आरआरएनए जीन के प्रवर्धन के लिए पीसीआर चक्र की स्थिति। 16 एस आरआरएनए जीन प्रवर्धन के लिए आवश्यक पीसीआर चक्र स्थितियों को दिखाया गया है। चरणों में एक प्रारंभिक विकृतीकरण चरण शामिल है, इसके बाद विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार के 35 चक्र और एक अंतिम विस्तार चरण है।
| 6x लोडिंग जेल | |
| सामग्री | परिमाण |
| ब्रोमोफेनॉल नीला | 25 मिलीग्राम |
| 85% ग्लिसरॉल | 7.06 एमएल |
| मिली-क्यू पानी | 2.94 एमएल |
| कुल आयतन | 10 mL |
| 50x Tris-एसीटेट-EDTA (TAE) स्टॉक बफर संरचना | |
| सामग्री | परिमाण |
| Tris base | डबल-डिस्टिल्ड पानी के 700 एमएल में 242 ग्राम |
| ग्लेशियल एसिटिक एसिड (जीएए) | 57.1 mL |
| 0.5 एम (ईडीटीए) पीएच 8.0 | 100 mL |
| पीएच को 8.5 में समायोजित करें और डबल आसुत जल के साथ मात्रा को 1000 एमएल तक बनाएं | |
| 1x TAE के लिए: 50x TAE बफर का 20 mL + 980 mL डबल-डिस्टिल्ड पानी | |
तालिका 3: 6x जेल लोडिंग बफर और 50x Tris-एसीटेट-EDTA स्टॉक बफर की संरचना। 6x जेल लोडिंग बफर को अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन पर चलाए जाने वाले नमूने के साथ मिलाया जाता है। इसमें ट्रैकिंग डाई के रूप में ब्रोमोफेनॉल ब्लू होता है। ग्लिसरॉल कुओं में उचित लोडिंग के लिए लोड किए जा रहे नमूने के घनत्व को बढ़ाता है। 50xTAE स्टॉक बफर की तैयारी के लिए आवश्यक विभिन्न अभिकर्मकों की संरचना भी दिखाई गई है। टीएई बफर एजीई के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम बफर में से एक है, और यह पीएच को 8.5 पर बनाए रखता है और एजीई के दौरान प्रवर्धित डीएनए के प्रवास को सक्षम बनाता है। संक्षिप्तरूप: टीएई = ट्रिस-एसीटेट-ईडीटीए; एजीई = एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन।
| पीसीआर अभिकर्मक | Volume (μL) |
| 2x Taq मास्टर मिक्स | 5 |
| फॉरवर्ड प्राइमर (10 पिको मोल) | 0.5 |
| रिवर्स प्राइमर (10 पिको मोल) | 0.5 |
| क्रूड डीएनए टेम्पलेट | 1.5 |
| बाँझ आणविक जीव विज्ञान-ग्रेड पानी | 2.5 |
| कुल आयतन | 10 |
तालिका 4: एआरजी की पहचान के लिए पीसीआर मास्टरमिक्स संरचना। पीसीआर प्रयोग करने के लिए आवश्यक विभिन्न पीसीआर अभिकर्मकों की प्रतिक्रिया मिश्रण संरचना।
| सीनियर नहीं। | लक्ष्य जीन | का प्रतिरोध | प्रवेशिका | प्राइमर अनुक्रम (5'-3') | एम्प्लिकॉन आकार (बीपी) | एनीलिंग तापमान (°C) | संदर्भ | ||||
| 1 | dfr एक | Trimethopim | आगे | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | रेसविक्ज़ एट अल। | ||||
| उल्टा | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β - लैक्टम | आगे | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | गेब्रेयेस, ठाकुर20 | ||||
| उल्टा | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β - लैक्टम | आगे | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | ली एट अल। | ||||
| उल्टा | CGGCTTTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | Aac(6') -Ib | Aminoglycosides | आगे | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| उल्टा | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | aad एक | Aminoglycosides | आगे | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | 23 साल की उम्र में | ||||
| उल्टा | GCCGACTACC टीटीजीजीटीजीएटीसीटीसी |
||||||||||
तालिका 5: संवर्धन योग्य बैक्टीरिया में एआरजी के पीसीआर के लिए प्राइमर। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए विभिन्न एआरजी को उनके संबंधित प्राइमर अनुक्रमों के साथ दिखाया गया है। एम्प्लिकॉन का अपेक्षित आकार आधार जोड़े में दिया गया है। प्रत्येक प्राइमर सेट के एनीलिंग तापमान का भी उल्लेख किया गया है।
| प्रतिजैविक | एंटीबायोटिक की सांद्रता (μg / mL) | CFU/ |
| - | - | 3.0 x 109 |
| CTX | 3 | 4.5 x 107 |
| सीआईपी | 0.5 | 3.2 x 108 |
| K | 15 | 9.6 x 105 |
| E | 20 | 1.6 x 108 |
| वीए | 3 | 1.2 x 109 |
तालिका 6: कुल और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया गिनती है। पानी के नमूने से एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया के प्रारंभिक अलगाव के लिए पांच एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया गया था। कुल बैक्टीरिया की गिनती (एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) और एआर बैक्टीरिया की गिनती प्रति मिलीलीटर कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू / एमएल) के संदर्भ में प्रस्तुत की जाती है। संक्षेप: एआर = एंटीबायोटिक प्रतिरोधी; सीएफयू = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां; सीटीएक्स = सेफोटैक्सिम; सीआईपी = सिप्रोफ्लोक्सासिन; के = कनामाइसिन; ई = एरिथ्रोमाइसिन; वीए = वैनकोमाइसिन।
| कोड अलग करें | सूक्ष्मजीवों | परिवार |
| 1 | एस्चेरिचिया कोलाई | Enterobacteriaaceae |
| 2 | एस्चेरिचिया कोलाई | Enterobacteriaaceae |
| 3 | एस्चेरिचिया कोलाई | Enterobacteriaaceae |
| 4 | एस्चेरिचिया कोलाई | Enterobacteriaaceae |
| 5 | एस्चेरिचिया कोलाई | Enterobacteriaaceae |
| 6 | एस्चेरिचिया कोलाई | Enterobacteriaaceae |
| 7 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | Enterobacteriaaceae |
| 8 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | Enterobacteriaaceae |
| 9 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | Enterobacteriaaceae |
| 10 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | Enterobacteriaaceae |
| 11 | कोमामोनास एसपीपी। | Comamonadaceae |
| 12 | कोमामोनास एसपीपी। | Comamonadaceae |
| 13 | माइक्रोकोकस एसपीपी। | Micrococcaceae |
| 14 | आर्थ्रोबैक्टर एसपीपी। | Micrococcaceae |
| 15 | एरोमोनास एसपीपी। | एरोमोनाडेसी |
तालिका 7: 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण द्वारा एंटीबायोटिक प्रतिरोधी आइसोलेट्स की पहचान। कॉलोनी पीसीआर 16 एस आरआरएनए जीन-विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके प्रत्येक आइसोलेट के लिए किया गया था। प्राप्त एम्प्लिकॉन को तब अनुक्रमित किया गया और उचित जैव सूचना विज्ञान उपकरणों का उपयोग करके पहचाना गया।
| अलग-अलग नंबर। | अलग | CTX | एएमपी | LE | C | TGC | सीटीआर | आईपीएम | जनरल | N | एन | सीआईपी | मार्च | एमएआर सूचकांक | ||
| 1 | एस्चेरिचिया कोलाई | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | 20S | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | एस्चेरिचिया कोलाई | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19S | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | एस्चेरिचिया कोलाई | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | एस्चेरिचिया कोलाई | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | एस्चेरिचिया कोलाई | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | एस्चेरिचिया कोलाई | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | 30S | 32S | 19S | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | 30S | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | 30S | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | क्लेबसिएला न्यूमोनिया | 33S | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19S | 20S | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | कोमामोनास एसपीपी। | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | कोमामोनास एसपीपी। | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | माइक्रोकोकस एसपीपी। | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | 20S | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | आर्थ्रोबैक्टर एसपीपी। | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | एरोमोनास एसपीपी। | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
तालिका 8: एएसटी द्वारा विश्लेषण किए गए बैक्टीरियल आइसोलेट्स के एंटीबायोटिक प्रतिरोध फेनोटाइप। डिस्क प्रसार विधि का उपयोग करके आइसोलेट्स में फेनोटाइपिक प्रतिरोध का विश्लेषण किया गया था। संख्याएं मिलीमीटर (मिमी) में जेडओआई को इंगित करती हैं। एमएआर सूचकांक के लिए, संख्या एंटीबायोटिक दवाओं की कुल संख्या को इंगित करती है जिसके लिए एक आइसोलेट प्रतिरोधी है। संक्षेप: एएसटी = एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण; सीटीएक्स = सेफोटैक्सिम; एएमपी = एम्पीसिलीन; एलई = लेवोफ़्लॉक्सासिन; सी = क्लोरैम्फेनिकॉल; टीजीसी = टिगेसाइक्लिन; सीटीआर = सेफ्ट्रियाक्सोन; आईपीएम = इमिपेनेम; जेन = जेंटामाइसिन; एन = नियोमाइसिन; टीआर = ट्राइमेथोप्रिम; सीआईपी = सिप्रोफ्लोक्सासिन; आर = प्रतिरोधी; एस = संवेदनशील; एमएआर = एकाधिक एंटीबायोटिक प्रतिरोध; ZOI = निषेध का क्षेत्र।
| एएमआर जीन परिवार | जीन (एस) |
| एसएमबी बीटा-लैक्टामेज | SMB-1 |
| एएमपीसी-प्रकार बीटा-लैक्टामेज | ampC1 |
| वीआईएम बीटा-लैक्टामेज | VIM-20 |
| CcrA बीटा-लैक्टामेस | ccrA |
| एनएमसीए बीटा-लैक्टामेज | nmcR |
| एआरएल बीटा-लैक्टामेज | ARL-1 |
| blaZ बीटा-लैक्टामेस | blaZ |
| blaTEM बीटा-लैक्टामेस | blaTEM* |
| blaCTX बीटा-लैक्टामेस | blaCTX |
| एएसी (6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| एएनटी (3') | AadA |
| क्विनोलोन प्रतिरोध प्रोटीन (qnr) | qnrS6, qnrVC5 |
| प्रतिरोध-नोडुलेशन-सेल डिवीजन (आरएनडी) एंटीबायोटिक एफ्लक्स पंप | evga, mtrA, mdta, acrD |
| एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) एंटीबायोटिक एफ्लक्स पंप | oleC, macB, PATA, bcrA |
| प्रमुख सुविधाप्रदाता सुपरफैमिली (एमएफएस) एंटीबायोटिक एफ्लक्स पंप | abaQ |
| ट्राइमेथोप्रिम प्रतिरोधी डायहाइड्रोफोलेट रिडक्टेस डीएफआर | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| रिफैम्पिन फॉस्फोट्रांसफेरेज़ | rphB |
| अनडेकैप्रेनिल पाइरोफॉस्फेट से संबंधित प्रोटीन | bcrC |
| मेथिसिलिन प्रतिरोधी पीबीपी 2 | mecD |
| वैनजे झिल्ली प्रोटीन | vanJ |
| टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोधी राइबोसोमल संरक्षण प्रोटीन | tetT |
| क्लोरैम्फेनिकॉल एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (सीएटी) | catB10 |
| एआरएम 23 एस राइबोसोमल आरएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ | erm (37) |
| ग्लाइकोपेप्टाइड प्रतिरोध जीन क्लस्टर | vanRB, vanRE, vanRD |
| एमसीआर फॉस्फोएथेनॉलमाइन ट्रांसफेरेज | mcr-9 |
| सल्फोनामाइड प्रतिरोधी sul | sul3 |
| * संवर्धन योग्य सूक्ष्मजीवों में रेखांकित जीन का भी पता लगाया गया था | |
तालिका 9: एआरजी को पूरे मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण का उपयोग करके पहचाना गया। पानी के नमूने के कुल मेटाजीनोम का उपयोग पूरे मेटाजीनोमिक अनुक्रमण के लिए किया गया था, और प्राप्त अनुक्रमों को उपयुक्त एआरजी डेटाबेस का उपयोग करके एनोटेट किया गया था। मेटाजेनोमिक डीएनए में पहचाने गए कुछ महत्वपूर्ण एआरजी के प्रतिनिधि परिणाम दिखाए गए हैं। रेखांकित जीन ों को कृषि योग्य सूक्ष्मजीवों में भी पाया गया था। संक्षिप्त नाम: एआरजी = एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीन।
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Discussion
नमूना संग्रह और प्रसंस्करण एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और अध्ययन के परिणामों और व्याख्या को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, नमूनों में परिवर्तनशीलता का पता लगाने के लिए, अध्ययन किए जा रहे मीठे पानी के शरीर के कई स्थानों पर नमूना करण करना महत्वपूर्ण है। ऐसे नमूनों को संभालते समय उचित सड़न रोकनेवाला पर्यावरणीय परिस्थितियों को बनाए रखने से संदूषण को रोका जा सकता है। इसके अलावा, बैक्टीरिया की संरचना में परिवर्तन को रोकने के लिए जो निकाले गए न्यूक्लिक एसिड की गुणवत्ता और मात्रा को प्रभावित कर सकता है, पारगमन स्थितियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए, नमूना संग्रह के बिंदु से बाद के प्रसंस्करण तक न्यूनतम समय अंतराल के साथ। कई अध्ययनों ने इस बात पर प्रकाश डाला है कि नमूना संग्रह और प्रसंस्करण के बीच यह अंतरिम अवधि विश्लेषण के बाद के चरणों के दौरान परिवर्तनीय परिणाम दे सकती है यदि सावधानीसे नहीं कियाजाता है।
प्लेटिंग के लिए कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला का उपयोग यह सुनिश्चित करता है कि कॉलोनियां न तो एक साथ टकराती हैं और न ही गिनती करने के लिए बहुत कम कॉलोनियां हैं। डुप्लिकेट में प्रयोगों को निष्पादित करना सीएफयू / एमएल में भिन्नताओं के लिए आवश्यक है जो पाइपिंग / हैंडलिंग त्रुटियों के कारण उत्पन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, नियंत्रण प्लेटों को हर प्रयोग के लिए बनाए रखा जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उपयोग किए गए एंटीबायोटिक्स प्रभावी ढंग से काम कर रहे हैं और झूठे-सकारात्मक परिणाम समाप्त हो जाते हैं। इसलिए, नियंत्रण प्लेटों में कोई दिखाई देने वाली कॉलोनी वृद्धि नहीं होनी चाहिए। यह उपयोग किए गए एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता को इंगित करता है।
एएसटी के दौरान, इनोकुलम संस्कृति घनत्व और एगर प्लेट की मोटाई जेडओआई के व्यास को प्रभावित कर सकती है और इसलिए, परिणामों की व्याख्या। इसलिए, एएसटी प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय इन दो कारकों को एक समान रखने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। सबसे महत्वपूर्ण पहलू इनोकुलम में मौजूद जीवाणु कोशिकाओं की संख्या है। आम तौर पर, 1 × 108-2 × 108 सीएफयू / एमएल कोशिकाओं का उपयोग इनोकुलम के रूप में किया जाता है, जो 0.5 मैकफारलैंड मानक14 के बराबर है। परिणामों में किसी भी भिन्नता से बचने के लिए इनोकुलम की इस एकाग्रता को स्थिर रखा जाना चाहिए। आवश्यक सांद्रता से अधिक या कम किसी भी एकाग्रता को बाँझ खारा की मदद से पतला किया जाना चाहिए और 15 मिनट के भीतर टीकाकरण के लिए तुरंत उपयोग किया जाना चाहिए। आगर प्लेटों पर इनोकुलम फैलाते समय, इनोकुलम की अत्यधिक मात्रा से बचने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। अतिरिक्त इनोकुलम को एमएचए प्लेट में इंजेक्ट करने से पहले बैक्टीरियल सस्पेंशन ट्यूब के किनारों पर स्वैब दबाकर हटाया जा सकता है। मानक एएसटी प्रक्रिया से कोई भी विचलन ऐसे प्रोटोकॉल11,15 से प्राप्त डेटा को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है। एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि ≥0.2 का एमएआर सूचकांक मूल्य आइसोलेट्स16 में उच्च प्रतिरोध को इंगित करता है। चूंकि एएसटी के परिणामों की व्याख्या जेडओआई पर आधारित है, इसलिए संस्कृति के कम टीकाकरण या अति-टीकाकरण से बचा जाना चाहिए।
पीसीआर के लिए, सामग्री के क्षरण और एंजाइम की गतिविधि के नुकसान की संभावना को कम करने के लिए मास्टरमिक्स को एक बर्फ ब्लॉक पर तैयार किया जाना चाहिए। प्रतिक्रिया स्थापित करते समय दस्ताने पहनने से बाहरी संदूषण की संभावना कम होजाती है। एजीई के दौरान वोल्टेज बहुत अधिक नहीं होना चाहिए, क्योंकि इससे लोड किए गए नमूनों का हीटिंग प्रभाव और गिरावट हो सकती है। इष्टतम वोल्टेज पर एजीई का प्रदर्शन यह सुनिश्चित करता है कि बैंड अच्छी तरह से अलग हो गए हैं और बिना किसी खींचने या दबाने वाले प्रभाव के तेज हैं।
पिछले कुछ दशकों में किए गए अध्ययनों ने विभिन्न सूक्ष्मजीवों की पहचान के लिए 16 एस आरआरएनए जीन एम्प्लिकॉन अनुक्रमण के उपयोग का प्रदर्शन किया है। 16 एस आरआरएनए जीन अनुक्रमण के लिए, टेम्पलेट डीएनए के निष्कर्षण के लिए विधि का विकल्प पूर्वाग्रह पैदा कर सकता है, जो बदले में, डाउनस्ट्रीम विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है। ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया में एक मोटी पेप्टिडोग्लाइकन सेल की दीवार होती है जो न्यूक्लिक एसिड को निकालना मुश्किल बना सकती है। इसलिए, निष्कर्षण विधि का विकल्प ऐसा होना चाहिए कि यह प्रभावी रूप से सभी प्रकार के माइक्रोबियल डीएनए को पकड़ ले। कच्चे टेम्पलेट डीएनए को निकालने के लिए पारंपरिक उबलने की विधि सेल की सामग्री को निकालने के लिए एक ऐसी कुशल विधि है, इस प्रकार परिणामों में पूर्वाग्रहों को कम करती है।
जल निकाय के पूर्ण जीवाणु समुदाय को समझने के लिए, इस अध्ययन में उच्च-थ्रूपुट अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एचटी-एनजीएस) तकनीक का उपयोग किया गया था। संपूर्ण मेटाजेनोमिक डीएनए विश्लेषण किसी दिए गए नमूने के पूरे मेटाजीनोम के अध्ययन की अनुमति देता है। संस्कृति-आधारित तकनीकमुख्य रूप से जीवाणु भार की एरोबिक गिनती देती है, जो एक नमूने की सूक्ष्मजीवविज्ञानी गुणवत्ता का संकेत देती है। हालांकि, खेती योग्य सूक्ष्मजीव कुल सूक्ष्मजीवों का केवल 1% हिस्सा बनाते हैं। शेष माइक्रोफ्लोरा, जिसमें एनारोब सहित प्रजातियों की एक विविध श्रृंखला शामिल है, को खराब विशेषता है और अक्सर अनदेखा किया जाता है। ये सूक्ष्मजीव एआर लक्षण ले सकते हैं। इसके अलावा, कॉमेंसल सूक्ष्मजीव एआर जीन का एक भंडार हैं जिन्हें विभिन्न आनुवंशिक विनिमय घटनाओं के माध्यम से रोगजनकों में प्रेषित किया जा सकताहै। इनमें से कई कॉमेंसल गैर-संवर्धन योग्य हैं और एचटी-एनजीएस से जुड़े मेटाजेनोमिक दृष्टिकोण द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, जो किसी भी नमूने में विविध माइक्रोफ्लोरा की पहचान के लिए बड़ा कवरेज प्रदान करता है। मेटाजेनोमिक विश्लेषण का उपयोग करके, बैक्टीरियल टैक्सा की एक विस्तृत प्रोफ़ाइल प्राप्त की गई, जो संवर्धन योग्य डेटा को पूरक करती थी। इसके अलावा, इस तरह के पूरक दृष्टिकोण अध्ययन के तहत जल निकाय की समग्र एआर स्थिति का एक विचार प्रदान कर सकते हैं।
वर्तमान अध्ययन में, पारंपरिक संस्कृति-आधारित और गैर-संस्कृति-आधारित मेटाजेनोमिक तकनीकों दोनों के संयोजन का उपयोग करके, हम कुल जीवाणु विविधता, विभिन्न एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी बैक्टीरिया और जल-जनित एआरजी के कुल पूल की पहचान करने में सक्षम थे। इस अध्ययन में वर्णित पद्धति को किसी भी अन्य जल स्रोत-तटीय जल, प्राकृतिक जल और मानव निर्मित पेयजल में एआर रोगजनकों की पहचान के लिए दोहराया और अनुकूलित किया जा सकता है। इसका उपयोग जलजनित नोसोकोमियल रोगजनकों के संचरण को ट्रैक करने और सिंक, शौचालय, बाथटब और ह्यूमिडिफायर जैसे जल स्रोतों के माध्यम से अस्पताल और क्लिनिक सेटिंग्स में अस्पताल से जुड़े संक्रमणों की निगरानी के लिए भी किया जा सकता है। इससे एएमआर की निगरानी और पानी आधारित एएमआर हॉटस्पॉट की पहचान करने में मदद मिलेगी।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई परस्पर विरोधी हित नहीं हैं।
Acknowledgments
इस काम को आंशिक रूप से मुंबई विश्वविद्यालय के विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग-विश्वविद्यालय अनुसंधान और वैज्ञानिक उत्कृष्टता संवर्धन (डीएसटी-पर्स) योजना से वित्तीय अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। देविका घड़ीगांवकर ने इस योजना के तहत प्रोजेक्ट फेलो के रूप में काम किया। विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग-विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (डीएसटी-एसईआरबी) परियोजना संख्या: सीआरजी/2018/003624 के तहत वरिष्ठ रिसर्च फेलो हर्षाली शिंदे द्वारा प्रदान की गई तकनीकी सहायता को स्वीकार किया जाता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
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