Summary
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en identificatie van antibioticaresistente bacteriën uit water en de moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen (ARGs). Het gebruik van op cultuur gebaseerde en niet-cultuurgebaseerde (metagenomische analyse) technieken biedt volledige informatie over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in zoet water uit Mumbai, India.
Abstract
De ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie (AR) via microbiota geassocieerd met zoetwaterlichamen is een groot wereldwijd gezondheidsprobleem. In de huidige studie werden zoetwatermonsters verzameld en geanalyseerd met betrekking tot de totale bacteriële diversiteit en AR-genen (ARGs) met behulp van zowel conventionele op cultuur gebaseerde technieken als een high-throughput cultuuronafhankelijke metagenomische benadering. Dit artikel presenteert een systematisch protocol voor de inventarisatie van de totale en antibioticaresistente kweekbare bacteriën uit zoetwatermonsters en de bepaling van fenotypische en genotypische resistentie in de kweekbare isolaten. Verder rapporteren we het gebruik van hele metagenomische analyse van het totale metagenomische DNA geëxtraheerd uit het zoetwatermonster voor de identificatie van de algehele bacteriële diversiteit, inclusief niet-kweekbare bacteriën, en de identificatie van de totale pool van verschillende ARGs (resistoom) in het waterlichaam. Volgens deze gedetailleerde protocollen hebben we een hoge antibioticaresistente bacteriebelasting waargenomen in het bereik van 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml. De meeste isolaten waren resistent tegen de meerdere geteste antibiotica, waaronder cefotaxime, ampicilline, levofloxacine, chlooramfenicol, ceftriaxon, gentamicine, neomycine, trimethoprim en ciprofloxacine, met meerdere antibioticaresistentie (MAR) -indexen van ≥0,2, wat wijst op hoge niveaus van resistentie in de isolaten. De 16S rRNA-sequencing identificeerde potentiële menselijke pathogenen, zoals Klebsiella pneumoniae, en opportunistische bacteriën, zoals Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. en Aeromonas spp. De moleculaire karakterisering van de isolaten toonde de aanwezigheid van verschillende ARGs, zoals blaTEM, blaCTX-M (β-lactams), aadA, aac (6')-Ib (aminoglycosiden) en dfr1 (trimethoprims), wat ook werd bevestigd door de hele metagenomische DNA-analyse. Een hoge prevalentie van andere ARGs die coderen voor antibioticum effluxpompen-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, het chlooramfenicol acetyltransferase gen catB10 en het rifampicineresistentiegen rphB- werd ook gedetecteerd in het metagenomisch DNA. Met behulp van de protocollen die in deze studie zijn besproken, hebben we de aanwezigheid van watergedragen MAR-bacteriën met verschillende AR-fenotypische en genotypische eigenschappen bevestigd. Zo kan hele metagenomische DNA-analyse worden gebruikt als een aanvullende techniek voor conventionele op cultuur gebaseerde technieken om de algehele AR-status van een waterlichaam te bepalen.
Introduction
Antimicrobiële resistentie (AMR) is geïdentificeerd als een van de meest urgente wereldwijde problemen. De snelle ontwikkeling van AMR en de wereldwijde verspreiding ervan vormen een van de grootste bedreigingen voor de menselijke gezondheid en de wereldeconomie in termen van de gezondheidskosten die ermee gepaard gaan1. Het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica hebben geleid tot een toename van AR. Dit is benadrukt door de COVID-19-pandemie, waarbij de behandeling van geassocieerde secundaire infecties in veel gevallen enorm werd aangetast als gevolg van AMR bij de getroffen patiënten2. Naast het directe gebruik/misbruik van antibiotica door mensen, zijn het overmatig gebruik en misbruik van antibiotica in de landbouw en de veehouderij en hun ongepaste lozing in het milieu, met inbegrip van waterlichamen, een grote zorg3. De opkomst van nieuwe resistentiekenmerken en multidrugresistentie bij bacteriën benadrukt dringend de behoefte aan een beter begrip van de factoren die leiden tot de ontwikkeling van AR en de verspreiding ervan. Meerdere antibioticaresistente bacteriën, die vaak meerdere AR-genen (ARG's) dragen op mobiele genetische elementen zoals plasmiden, kunnen deze resistentiegenen overbrengen naar niet-resistente micro-organismen, waaronder potentiële menselijke pathogenen, wat leidt tot de opkomst van superbacteriën die onbehandelbaar zijn met zelfs laatste redmiddel antibiotica4. Deze meerdere antibioticaresistente bacteriën, indien aanwezig in waterecosystemen, kunnen rechtstreeks de menselijke darm binnendringen via de consumptie van besmet voedsel op waterbasis, zoals vissen, krabben en weekdieren. Eerdere studies hebben aangetoond dat de verspreiding van AR-bacteriën in natuurlijk voorkomende watersystemen ook andere watervoorraden kan bereiken, waaronder drinkwater, en dus in de menselijke voedselketen kan terechtkomen 5,6,7.
Het doel van deze studie is om een uitgebreid protocol te bieden met behulp van een combinatie van op cultuur gebaseerde en niet-op cultuur gebaseerde (hele metagenomische analyse) technieken om volledige informatie te verkrijgen over de totale bacteriële diversiteit en de totale pool van verschillende ARGs aanwezig in een waterlichaam in Mumbai, India. Conventioneel zijn op cultuur gebaseerde technieken gebruikt om de bacteriële diversiteit in waterlichamen te bestuderen. Aangezien kweekbare micro-organismen slechts een klein percentage van de totale microbiota in elke niche uitmaken, moeten verschillende op cultuur gebaseerde en cultuuronafhankelijke technieken tegelijkertijd worden gebruikt om een beter begrip te krijgen van de algehele status van bacteriële diversiteit en de verschillende resistente eigenschappen die in elk monster voorkomen. Een van die robuuste en betrouwbare cultuuronafhankelijke technieken is hele metagenomische DNA-analyse. Deze high-throughput methode is met succes gebruikt in verschillende studies over bacteriële diversiteit of de functionele annotaties van verschillende ARGs 8,9. Deze techniek gebruikt het metagenoom (het totale genetische materiaal in een monster) als uitgangsmateriaal voor verschillende analyses en is dus cultuuronafhankelijk. De protocollen in deze studie kunnen worden gebruikt voor hele metagenomische DNA-analyse om informatie te verkrijgen over de totale bacteriële diversiteit en verschillende ARGs (resistoom) in watermonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monsterverzameling en -verwerking
- Monsterverzameling
- Verzamel het juiste volume van het watermonster in steriele monstercontainer(s) en zorg ervoor dat niet meer dan 3/4 van de recipiënt is gevuld.
- Transporteer de monsters zo snel mogelijk na het verzamelen onder aseptische omstandigheden naar het laboratorium en verwerk ze onmiddellijk.
- Monsterverwerking
- Filter het watermonster aseptisch door een steriele mousselinedoek om eventuele deeltjes te verwijderen.
- Voer passende seriële verdunningen van het gefilterde water uit voor verdere analyse.
2. Schatting van de totale bacteriële belasting en het aantal antibioticaresistente bacteriën
- Bepaling van de totale bacteriële belasting
- Suspensie 18,12 g R2A Agar, gemodificeerd poeder in 1.000 ml dubbel gedestilleerd water en los het mengsel op door verhitting. Autoclaaf het opgeloste mengsel bij 121 °C, 15 psi gedurende 20 minuten. Bereid R2A Agar, Gemodificeerde platen voor door de juiste hoeveelheid van het geautoclaveerde mengsel in steriele petriplaten te gieten (voeg bijvoorbeeld ongeveer 20 ml geautoclaveerd steriel medium toe aan een steriele petriplaat van 90 mm).
- Verdeel gelijkmatig 100 μL van de juiste verdunningen van het gefilterde watermonster op de R2A Agar, gemodificeerde plaat zodra het medium stolt. Voer het experiment in tweevoud uit.
- Incubeer alle bovenstaande platen bij 35-37 °C gedurende 48 uur (varieer de temperatuur en incubatietijd afhankelijk van de media die voor isolatie worden gebruikt).
- Druk de totale bacteriële belasting uit in termen van kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/ml) met behulp van vergelijking (1):
(1)
- Bepaling van het aantal AR-bacteriën
- Volg de stappen 2.1.1-2.1.4. Gebruik echter in plaats van R2A Agar, gemodificeerde platen, R2A Agar, gemodificeerde platen afzonderlijk aangevuld met vijf verschillende antibiotica, namelijk cefotaxime (3 μg / ml), ciprofloxacine (0,5 μg / ml), erytromycine (20 μg / ml), kanamycine (15 μg / ml) en vancomycine (3 μg / ml).
- Voeg de antibiotica afzonderlijk toe in buisjes met 20 ml steriel gesmolten R2A Agar, Gemodificeerd (met de temperatuur van de gesmolten R2A Agar, Gewijzigd bij ≤40 °C) om de uiteindelijke antibioticaconcentratie zoals vermeld in stap 2.2.1 te bereiken.
- Draai voor gelijkmatig mengen en giet op steriele petriplaten voordat de agar stolt. Voer het experiment in tweevoud uit.
- Incubeer alle bovenstaande platen bij 35-37 °C gedurende 48 uur (bij gebruik van een ander medium kunnen de temperatuur en incubatietijd variëren).
- Voor kwaliteitscontrole en het controleren van de werkzaamheid van de antibiotica, verspreidt u 100 μL bacteriële suspensies van de Escherichia coli ATCC 25922 en Staphylococcus aureus ATCC 29213 stammen op hun respectieve antibioticabevattende R2A Agar, gemodificeerde platen (zorg ervoor dat de dichtheid van de verse cultuur die wordt gebruikt voor de inenting OD = 0,5 bij 600 nm is).
- Bepaal het antibioticaresistente aantal bacteriën in termen van CFU/ml zoals beschreven in stap 2.1.4.
- Glycerolvoorraden van de isolaten
- Selecteer morfologisch verschillende AR-kolonies.
- Suspensie een enkele geïsoleerde kolonie in 2 ml steriele Luria-Bertani-bouillon die het respectieve antibioticum bevat (bijv. Als een kolonie is geselecteerd uit een plaat met cefotaxime, ent u de kolonie vanaf stap 2.3.1 in steriele Luria-Bertani-bouillon die cefotaxime bevat in de respectieve concentratie).
- Incubeer de geënte buizen bij 37 °C bij 80 tpm totdat de OD600 0,5 bereikt.
- Bereid glycerolvoorraden van de isolaten door 750 μL van de kweeksuspensie uit stap 2.3.3 te mengen in 250 μL steriele 100% glycerol onder aseptische omstandigheden.
- Bewaar de glycerolvoorraden bij −80 °C tot verdere analyse.
OPMERKING: Voor de heropleving van de culturen uit de glycerolbestanden, ontdooi de glycerolvoorraden bij 4 °C. Ent een lusvol van deze bouillon in 2 ml steriele Luria-Bertani-bouillon met het betreffende antibioticum en laat groeien.
(1)3. Identificatie van kweekbare bacteriën door 16S rRNA-gensequencing
- Voorbereiding van DNA-sjabloon uit de isolaten voor PCR
OPMERKING: Het beschreven protocol voor de voorbereiding van DNA-sjabloon voor PCR voor de isolatie van ruw DNA uit de bacteriën wordt gegeven door Carlson et al.10.- Gebruik een steriele tandenstoker en neem een enkele, geïsoleerde, zuivere kolonie van het isolaat dat op een petriplaat groeit. Suspensie de bacteriekolonie in 100 μL steriel dubbel gedestilleerd water in een steriele microcentrifugebuis en kook gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer de suspensie bij 10.000 × g gedurende 2 minuten om het vuil te pelleteren en breng het supernatant over naar een verse steriele microcentrifugebuis voor gebruik als de ruwe DNA-sjabloon.
- Gerichte PCR-amplificatie van het V3-gebied van het 16S-rRNA-gen en sequencing
- Bereid 40 μL van het reactiemengsel in een PCR-buis voor PCR-amplificatie, zoals vermeld in tabel 1.
OPMERKING: Het DNA-preparaat moet worden uitgevoerd op een ijsblok terwijl de kans op besmetting wordt geminimaliseerd (draag handschoenen tijdens het hanteren van de reagentia en reinig het werkoppervlak grondig met 70% ethanol). - Plaats de buis in het thermische blok en voer het juiste programma uit in de PCR thermische cycler. Zie tabel 2 voor de gestandaardiseerde PCR-cyclusomstandigheden en de primerinformatie voor de amplificatie van de V3-regio's van de 16S-rRNA-genen.
- Voor het oplossen van de amplicons en visualisatie, voer agarose gel elektroforese (AGE) uit. Meng 10 μL van het versterkte PCR-product en 2 μL 6x gellaadbuffer (tabel 3) en laad dit mengsel in putjes op 1,5% agarosegel (los 1,5 g agarosepoeder op in 100 ml 1x TAE-buffer [tabel 3]) met 5 μL ethidiumbromide (EtBr) tot een eindconcentratie van 0,5 μg/ml EtBr in 100 ml van de agarosegel.
LET OP: EtBr is een krachtige kankerverwekkende stof. Handschoenen moeten te allen tijde worden gedragen tijdens het hanteren van EtBr en gels die EtBr bevatten. - Voeg DNA-ladder toe voor de schatting van de grootte van de amplicons.
- Voer elektroforese van de gel uit in een TAE-tankbuffer bij 80-100 V.
- Zodra de trackingkleurstof 3/4 van de gel loopt, stopt u de elektroforese en visualiseert u de ampliconbanden onder een UV-transilluminator.
- Gebruik het PCR-product (amplicon) voor 16S rRNA-gensequencing om het isolaat te identificeren.
- Kwantificeer het amplicon door het te onderwerpen aan spectrofotometrische analyse met behulp van vergelijking (2).
(2) - Om de zuiverheid van het DNA te controleren, berekent u de verhouding van A260 / A280.
OPMERKING: Idealiter moet dit aantal hoger zijn dan 1,5 en bij voorkeur tussen 1,8 en 2,0. - Om de isolaten te identificeren, vergelijkt u de sequenties die worden verkregen met sequentiedatabases met behulp van een geschikte zoekfunctie voor uitlijning.
- Bereid 40 μL van het reactiemengsel in een PCR-buis voor PCR-amplificatie, zoals vermeld in tabel 1.
(2)4. Detectie van antibioticaresistentie in de isolaten met behulp van antibioticagevoeligheidstests
OPMERKING: Dit protocol beschrijft de methode voor antibioticagevoeligheidstests (ASAT) door schijfdiffusie. De volgende antibioticaschijven werden gebruikt: cefotaxime (5 μg), ampicilline (10 μg), levofloxacine (5 μg), chlooramfenicol (30 μg), tigecycline (15 μg), ceftriaxon (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicine (10 μg), neomycine (10 μg), trimethoprim (5 μg) en ciprofloxacine (5 μg).
- Bereiding van het entmateriaal voor de AST
- Ent op aseptische wijze een enkele, geïsoleerde, gezuiverde AR-kolonie in met behulp van een steriele lus in 2 ml van een steriel niet-selectief medium, zoals Luria-Bertani-bouillon (zonder antibioticum), en incubeer bij 37 °C bij 80 rpm 's nachts.
- Resuspenderen door 100-150 μL van de 's nachts gekweekte cultuur (ongeveer OD600 = 1,8-2,0) in 2 ml verse niet-selectieve Luria-Bertani bouillonmedium in te nemen en gedurende 2-4 uur incubeer (totdat de OD600 0,4-0,5 bereikt).
- Verdun deze vers gekweekte kweeksuspensie met steriele 0,85% zoutoplossing, zodat de dichtheid van de cultuur gelijk is aan de 0,5 McFarland-standaard (ongeveer OD600 = 0,1), wat ongeveer overeenkomt met 1-2 × 108 cellen / ml.
- Meng voorzichtig de bacteriële suspensie voor een gelijkmatige celverdeling.
- Gebruik de bovenstaande suspensie binnen 15 minuten na verdunning.
- Inenting van de agarplaten
- Bereid Mueller-Hinton Agar (MHA) platen voor het uitvoeren van de AST door 38 g MHA te mengen in 1.000 ml dubbel gedestilleerd water en los het mengsel op door verhitting. Autoclaaf het opgeloste mengsel bij 121 °C, 15 psi gedurende 15 min.
- Zorg ervoor dat de diepte van MHA in de platen 4 mm is (25 ml medium per plaat).
- Verwijder tegelijkertijd de antibioticaschijven uit de vriezer en verwarm ze tot kamertemperatuur.
OPMERKING: De antibioticaschijven moeten geleidelijk worden ontdooid door de schijven in eerste instantie bij 4 °C en later bij kamertemperatuur te ontdooien om het mogelijke gevaar van condensatie op de schijven te verminderen, wat vervolgens de remzone (ZOI) kan beïnvloeden. - Dompel onder aseptische omstandigheden een steriel wattenstaafje in het in stap 4.1 bereide entmateriaal en verwijder overtollige suspensie om overinenting van de platen te voorkomen.
- Verdeel de cultuur gelijkmatig over de platen, beginnend vanaf de bovenkant van de MHA-plaat en heen en weer gaand van rand naar rand. Draai de plaat 60° tijdens het vegen.
- Toepassing van de antibioticaschijven
- Breng met behulp van vlam-gesteriliseerde tangen aseptisch de antibioticaschijven over op de geënte MHA-platen en druk zachtjes op de schijven om volledig contact met de agar te garanderen.
OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd binnen 15 minuten na de inenting van de cultuur op de platen. - Plaats het juiste aantal antibioticaschijven op de agarplaat door rekening te houden met het organisme, het gebruikte antibioticum en de grootte van de plaat om overlapping van de remzones te voorkomen.
OPMERKING: Vier tot vijf schijven kunnen worden ondergebracht op een ronde plaat van 90 mm.
- Breng met behulp van vlam-gesteriliseerde tangen aseptisch de antibioticaschijven over op de geënte MHA-platen en druk zachtjes op de schijven om volledig contact met de agar te garanderen.
- Incubatie van de platen
- Binnen 15 minuten na het aanbrengen van de antibioticaschijven keert u de platen om en incubeert u bij 37 °C 's nachts.
- Interpretatie van de resultaten
- Meet de ZOI-diameter in millimeters (mm) en interpreteer volgens de breekpuntwaarden van EUCAST11. Zie de twee voorbeelden hieronder.
- Het breekpunt met de zonediameter (mm) voor een ciprofloxacine-antibioticaschijf (5 μg) voor Enterobacterales is S ≥ 25 en R < 22, wat betekent dat het als gevoelig (S) wordt beschouwd als ZOI 25 mm ≥, terwijl het resistent (R) is als ZOI 22 mm <. Als de ZOI-diameter tussen 22 en 25 valt, wordt het isolaat als intermediair (I) beschouwd.
- Het breekpunt met de zonediameter (mm) voor een chlooramfenicolantibioticumschijf (30 μg) voor Staphylococcus spp. is S ≥ 18 en R < 18, wat betekent dat het als gevoelig wordt beschouwd als ZOI 18 mm ≥, terwijl het resistent is als ZOI 18 mm <.
- Bepaal de multipele antibioticaresistentie (MAR) index door de verhouding te vinden van het aantal antibiotica waaraan het isolaat resistent is tot het totale aantal antibiotica waaraan het isolaat wordt blootgesteld.
OPMERKING: Voor kwaliteitscontrole, E. coli ATCC 25922 en S. Aureus ATCC 29213 worden gebruikt als referentiestammen volgens het protocol zoals in stap 4.
- Meet de ZOI-diameter in millimeters (mm) en interpreteer volgens de breekpuntwaarden van EUCAST11. Zie de twee voorbeelden hieronder.
5. PCR-gebaseerde detectie van antibioticaresistentiegenen in de isolaten
- Gebruik een standaard PCR-protocol voor de identificatie van ARGs in de isolaten. Bereid het DNA-sjabloon voor met behulp van het protocol in stap 3.1.
OPMERKING: De PCR-cyclusomstandigheden die in dit onderzoek werden gebruikt, waren 94 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, gloeien gedurende 30 s bij de juiste temperatuur (zoals gestandaardiseerd voor elke primerset), verlenging bij 72 °C gedurende 40 s en een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 minuten. Het reactiemengsel is beschreven in tabel 4. De lijst met ARG's, primers en gloeitemperaturen is weergegeven in tabel 5. - Volg de stappen 3.2.3-3.10 om de zuiverheid van de amplicons op te lossen, te visualiseren en te controleren.
6. Volledige metagenomische DNA-analyse voor de identificatie van de totale bacteriële diversiteit en de detectie van ARG's in het metagenoom
- Extractie van het totale DNA (metagenoom) uit het watermonster
- Haal het metagenomisch DNA uit de gefilterde watermonsters.
OPMERKING: In de huidige studie werd het metagenomische DNA (totaal DNA) geëxtraheerd uit de gefilterde watermonsters met behulp van de DNA-isolatiekit waarnaar wordt verwezen volgens het protocol van de fabrikant (zie de tabel met materialen). - Controleer de kwaliteit van het DNA door 3 μL van het geëxtraheerde metagenomische DNA op een 0,8% agarose-gel te laden en laat de gel ongeveer 30 minuten op 80-110 V lopen.
- Controleer op de aanwezigheid van een enkele intacte band.
- Controleer de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer.
- Haal het metagenomisch DNA uit de gefilterde watermonsters.
- Bepaling van bacteriële diversiteit en detectie van ARG's met behulp van hele metagenomische DNA-sequencing
- Bibliotheekvoorbereiding en PCR-versterking:
- Bereid een paired-end sequencing-bibliotheek voor met behulp van de dna-bibliotheekvoorbereidingskit waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel).
- Bereid het DNA voor op adapterligatie door 200 ng DNA te nemen en het mechanisch in kleinere fragmenten te scheren, gevolgd door een continue stap van eindreparatie waarbij een "A" wordt toegevoegd aan de 3 'uiteinden.
- Afhankelijk van het platform dat wordt gebruikt voor sequencing, ligate specifieke adapters aan beide uiteinden van de DNA-fragmenten.
OPMERKING: Sequenties die cruciaal zijn voor het binden van bibliotheken met dubbele streepjescode aan een stroomcel voor sequencing zijn aanwezig in deze adapters. Dit maakt PCR-versterking van de adapter-geligeerde fragmenten mogelijk en bindt de standaard sequencing primers. - Om de kwaliteit en kwantiteit te controleren, analyseert u de versterkte bibliotheek met behulp van een zeer gevoelige DNA-chip volgens de instructies van de fabrikant.
- Clustergeneratie en -volgorde:
- Laad de versterkte bibliotheek op het juiste sequencingplatform voor clustergeneratie en daaropvolgende sequencing.
OPMERKING: De bibliotheekmoleculen binden aan de complementaire adapter oligo's op de gepaarde stroomcel. Tijdens de sequencing worden de voorwaartse strengen selectief gesplitst na de resynthese van de omgekeerde streng. Deze gekopieerde omgekeerde streng wordt vervolgens gesequenced vanaf het andere uiteinde van het fragment.
- Laad de versterkte bibliotheek op het juiste sequencingplatform voor clustergeneratie en daaropvolgende sequencing.
- Bioinformatische analyse:
- Genereer steigers uit de hoogwaardige gegevens met behulp van het juiste platform.
- Onderwerp deze steigers aan bioinformatica-analyse voor de taxonomische classificatie en identificatie van de ARGs.
OPMERKING: De workflow voor de gehele metagenomische DNA-analyse voor de identificatie van de totale bacteriële diversiteit en de detectie van ARG's in het metagenoom is weergegeven in figuur 1. Een stroomschema van de volledige methodologie beschreven in het manuscript is weergegeven in figuur 2.
- Bibliotheekvoorbereiding en PCR-versterking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totale bacteriële belasting en antibioticaresistente (AR) bacterietelling
De inventarisatie van de totale bacteriële belasting werd uitgevoerd door 10−4 tot 10−6 maal verdunningen van de watermonsters te verspreiden op R2A Agar, gemodificeerd medium. Voor de inventarisatie van het aantal AR-bacteriën werden 10−3 tot 10−6-6-voudige verdunningen verspreid op mediaplaten die antibiotica bevatten (figuur 3). De totale en AR-bacterietellingen werden berekend als CFU / ml en alle platingexperimenten werden in duplicaat uitgevoerd. Volgens de bovenstaande protocollen toonde de huidige studie aan dat het totale aantal bacteriën 3,0 × 109 CFU / ml was. De AR-bacteriële belasting bleek hoog te zijn, in het bereik van 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml (tabel 6).
Identificatie van kweekbare bacteriën door 16S rRNAgene sequencing
Ruw DNA van elk isolaat werd gebruikt als een sjabloon om 16S rRNA-genspecifieke PCR uit te voeren. In het totaal van 15 AR-isolaten gesequenced, behoorden er 10 tot de Enterobacteriaceae-familie , waarvan de meeste Escherichia coli en Klebsiella pneumoniae waren. Zeldzame opportunistische bacteriën zoals Comamonas spp. behorend tot de familie Comamonadaceae, Micrococcus spp. en Arthrobacter spp. behorend tot de familie Micrococcaceae en Aeromonas spp. behorend tot de familie Aeromonadaceae werden ook geïdentificeerd uit het watermonster (tabel 7).
Detectie van antibioticaresistentie in de kweekbare bacteriën met behulp van antibioticagevoeligheidstests
Het antibioticaresistentieprofiel van de bovengenoemde isolaten werd gegenereerd door ASAT uit te voeren met behulp van de schijfdiffusiemethode (figuur 4). Van de 15 geteste isolaten hadden er 8 een MAR-index van ≥0,2, wat wijst op een hoge mate van weerstand. Bovendien vertoonden veel van de isolaten co-resistentieprofielen (resistentie tegen dezelfde set antibiotica). Isolaten zoals Comamonas spp. en Arthrobacter spp. vertoonden echter geen resistentie tegen een van de geteste antibiotica (tabel 8).
Detectie en identificatie van antibioticaresistentiegenen in de kweekbare bacteriën
In totaal werden 10 AR-isolaten gescreend op de aanwezigheid van ARGs met behulp van PCR. Het meest voorkomende ARG in de kweekbare isolaten was blaTEM-codering voor β-lactamase, gevolgd door het aminoglycoside-resistentiegen aadA. Andere versterkte ARGs waren blaCTX-M, dfr1 en aac(6')-Ib die respectievelijk resistentie tegen β-lactams, trimethoprim en aminoglycosiden verleenden. De representatieve resultaten van de versterking van de ARGs zijn weergegeven in figuur 5. Voor de meeste geïdentificeerde isolaten werd fenotypische resistentie (ASAT) op moleculair niveau bevestigd via PCR-gebaseerde genotypische AR-profilering.
Identificatie van de totale bacteriële diversiteit in het metagenomisch DNA
Om te controleren op de aanwezigheid van alle mogelijke bacteriën (zowel kweekbaar als niet-kweekbaar) en om hun relatieve abundanties te identificeren, werd een metagenomische DNA-analyse voor de totale bacteriële diversiteit uitgevoerd. Met behulp van de high-throughput next-generation sequencing (HT-NGS) benadering werd ~ 96,94% van de totale sequentie reads verkregen, wat resulteerde in een hoge dekking. Taxonomische annotatie werd uitgevoerd om de reads in verschillende taxonomische groepen in te delen, van het phylum tot het geslachtsniveau (figuur 6 en figuur 7). In totaal konden 50 phyla worden geïdentificeerd in het metagenoom, wat wijst op de hoge bacteriële diversiteit in het watermonster. Proteobacteria was het meest dominante fylum, bestaande uit de klassen Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria en Gammaproteobacteria. Op ordeniveau was Burkholderiales de meest voorkomende orde, behorend tot de Betaproteobacteria-klasse. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium en Comamonas waren enkele van de overvloedige geslachten die in het watermonster werden aangetroffen.
Detectie van ARG's uit het metagenomisch DNA
Om de totale pool van ARG's in het metagenoom van het watermonster te begrijpen, werd een hele metagenomische sequencing uitgevoerd, gevolgd door de identificatie van ARG's met behulp van geschikte bioinformatica-instrumenten. De metagenomische benadering zorgt ervoor dat de ARG's die aanwezig zijn in zowel kweekbare als niet-kweekbare micro-organismen in het monster worden gedetecteerd. Een verscheidenheid aan genen die resistentie verlenen tegen β-lactams (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylcosiden (aac(6')-34); chinolonen (qnrS6, qnrVC5); antibioticum effluxpompen-resistentie-nodulatie-celdeling (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP-binding cassette (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA), en major facilitator superfamily (MFS) (abaQ); trimethoprim-resistent dihydrofolaatreductase (dfrD, dfrA20); rifampicinefotransferase (rphB); en chlooramfenicolacetyltransferase (CAT) (catB10) werden gedetecteerd in het metagenoom. De ARG's die via PCR in de kweekbare isolaten (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) werden gedetecteerd, werden ook gedetecteerd door hele metagenomische sequencing, waardoor hun aanwezigheid in het watermonster werd bevestigd. De representatieve resultaten van de IN HET METAGENOOM geïdentificeerde ARG's met behulp van volledige metagenomische DNA-analyse zijn weergegeven in tabel 9.
Figuur 1: Workflow voor hele metagenomische DNA-analyse. De stapsgewijze workflow voor de identificatie van de totale bacteriële diversiteit en de detectie van de ARG's uit het metagenoom wordt gepresenteerd. De algemene stappen omvatten metagenomische DNA-voorbereiding, amplificatie en identificatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stroomschema van de volledige methodologie. De stapsgewijze workflow van de methodologie die in deze studie wordt gebruikt. Een combinatie van zowel op cultuur gebaseerde als niet-op cultuur gebaseerde technieken wordt gebruikt om volledige informatie te krijgen over de bacteriële diversiteit en de identiteit van de ARGs die in het watermonster aanwezig zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van geïsoleerde kolonies op antibioticabevattende R2A Agar, gemodificeerde platen. Watermonsters verguld op cefotaxime (3 μg/ml)-bevattende R2A Agar, gemodificeerde platen. Het monster werd serieel verdund en verguld in duplicaat-A1, A2: 10−4; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10−6. Na de juiste incubatietijd waren de geïsoleerde kolonies zichtbaar op de B1-, B2-, C1- en C2-platen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Antibioticagevoeligheidstest volgens de schijfdiffusiemethode. Representatieve beelden van ASAT door de schijfdiffusiemethode voor een Escherichia coli-isolaat . AST werd uitgevoerd in duplicate-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. De diameters van de ZOI's werden gemeten in millimeters (mm). Om te interpreteren of het isolaat resistent of vatbaar is voor het gebruikte antibioticum, werd de ZOI vergeleken met de meest recente EUCAST-tabellen. Afkortingen: ASAT = antibiotica gevoeligheidstest; CTX = cefotaxime; IPM = imipenem; C = chlooramfenicol; CIP = ciprofloxacine; LE = levofloxacine; TGC = tigecycline; AMP = ampicilline; GEN = gentamicine; TR = trimethoprim; N = neomycine; K = kanamycine; CTR = ceftriaxon; ZOI = remmingszone; EUCAST = Europees Comité voor antibioticagevoeligheidstests. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: PCR-amplificatie van antibioticaresistentiegenen van kweekbare bacteriën. Agarose gel elektroforese na PCR werd uitgevoerd voor de visualisatie van versterkte banden om te controleren op de aanwezigheid van ARGs in de isolaten. Gescheiden banden van PCR-amplicons zijn te zien op de gel. De grootte van de individuele PCR-amplicons wordt vergeleken met een geschikte DNA-marker. Baan L1: 100 bp DNA ladder; Rijstroken 1-5: 1: dfr1 (425 bp); Baan 2: blaTEM (310 bp); Baan 3: blaCTX-M (500 bp); Baan 4: aac(6')-Ib (395 bp); Baan 5: aadA (624 bp). Afkorting: ARGs = antibioticaresistentiegenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Taxonomische classificatie voor de fylum- en klasseniveaus. (A) Staafdiagram met de taxonomische abundantieverdeling op fylumniveau van het bacteriële metagenoom in het watermonster. In totaal werden 50 bacteriële phyla geïdentificeerd door de metagenomische analyse. De eerste 12 dominante phyla van bacteriën worden getoond. (B) Staafdiagram met de taxonomische abundantieverdeling op klasseniveau van het bacteriële metagenoom in het watermonster. In totaal werden 50 bacteriële klassen geïdentificeerd door de metagenomische analyse. De eerste 15 dominante klassen van bacteriën worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Taxonomische classificatie voor de orde- en geslachtsniveaus. (A) Staafdiagram met de taxonomische abundantieverdeling op ordeniveau van het bacteriële metagenoom in het watermonster. In totaal werden 50 bacteriële orden geïdentificeerd door de metagenomische analyse. De eerste 14 dominante ordes van bacteriën worden weergegeven in de figuur. (B) Staafdiagram met de taxonomische abundantieverdeling op geslachtsniveau van het bacteriële metagenoom in het watermonster. In totaal werden 50 bacteriële geslachten geïdentificeerd door de metagenomische analyse. De eerste 15 dominante geslachten van bacteriën worden getoond in de figuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| PCR-reagentia | Volume (μL) |
| 2x Taq Master Mix | | 20 |
| Voorwaartse primer (10 pico mol) | 1.5 |
| Omgekeerde primer (10 pico mol) | 1.5 |
| Ruw DNA-sjabloon | 1.5 |
| Steriel moleculair biologisch water | 15.5 |
| Totaal volume | 40 |
Tabel 1: PCR-mastermixbestanddelen. De samenstelling van het reactiemengsel van verschillende PCR-reagentia.
| Richting | Primer Sequentie 5' – 3' | PCR voorwaarden | Aantal cycli |
| Voorwaarts | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C gedurende 10 min | 1 |
| Denaturatie bij 94 °C gedurende 30 s | 35 | ||
| Gloeien bij 50 °C gedurende 30 s | |||
| Verlenging bij 72 °C gedurende 40 s | |||
| Omkeren | CTACCGGGGTATCTAATCC | Laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min | 1 |
Tabel 2: PCR-cyclusomstandigheden voor amplificatie van het 16S-rRNA-gen. De PCR-cyclusomstandigheden die vereist zijn voor 16S rRNA-genversterking worden weergegeven. De stappen omvatten een eerste denaturatiestap, gevolgd door 35 cycli van denaturatie, gloeien en extensie, en een laatste uitbreidingsstap.
| 6x laadgel | |
| Inhoud | Hoeveelheid |
| Broomfenol blauw | 25 mg |
| 85% glycerol | 7,06 ml |
| Milli-Q water | 2,94 ml |
| Totaal volume | 10 ml |
| 50x Tris-acetaat-EDTA (TAE) voorraadbuffersamenstelling | |
| Inhoud | Hoeveelheid |
| Tris basis | 242 g in 700 ml dubbel gedestilleerd water |
| Ijsazijn (GAA) | 57,1 ml |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 ml |
| Stel de pH in op 8,5 en vul het volume aan tot 1000 ml met dubbel gedestilleerd water | |
| Voor 1x TAE: 20 ml 50x TAE-buffer + 980 ml dubbel gedestilleerd water | |
Tabel 3: Samenstelling van de 6x gellaadbuffer en 50x Tris-acetaat-EDTA voorraadbuffer. De 6x gellaadbuffer wordt gemengd met het monster dat moet worden uitgevoerd op agarose gel-elektroforese. Het bevat broomfenolblauw als de trackingkleurstof. Glycerol verhoogt de dichtheid van het monster dat wordt geladen voor een goede lading in de putten. De samenstelling van de verschillende reagentia die nodig zijn voor de bereiding van de 50xTAE-voorraadbuffer wordt ook weergegeven. TAE-buffer is een van de meest voorkomende buffers die worden gebruikt voor AGE, en het handhaaft de pH op 8,5 en maakt de migratie van versterkt DNA tijdens AGE mogelijk. Afkortingen: TAE = Tris-acetaat-EDTA; AGE = agarose gel elektroforese.
| PCR-reagentia | Volume (μL) |
| 2x Taq Master Mix | | 5 |
| Voorwaartse primer (10 pico mol) | 0.5 |
| Omgekeerde primer (10 pico mol) | 0.5 |
| Ruw DNA-sjabloon | 1.5 |
| Steriel water van moleculaire biologiekwaliteit | 2.5 |
| Totaal volume | 10 |
Tabel 4: PCR-mastermixsamenstelling voor de identificatie van ARG's. De samenstelling van het reactiemengsel van verschillende PCR-reagentia die nodig zijn voor het uitvoeren van het PCR-experiment.
| Zr. Nr. | Doelgen | Weerstand tegen | Abc | Primervolgorde (5'-3') | Amplicon grootte (bp) | Gloeitemperatuur (°C) | Verwijzingen | ||||
| 1 | DFR Een | Trimethoprim | Voorwaarts | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al., 19 | ||||
| Omkeren | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | BlaTEM | β – lactams | Voorwaarts | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Omkeren | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | BlaCTX-M | β – lactams | Voorwaarts | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li et al. 21 | ||||
| Omkeren | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglycosiden | Voorwaarts | Tatgagtggc TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| Omkeren | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | Aad Een | Aminoglycosiden | Voorwaarts | Accgtaaggc TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 Zoekertjes | ||||
| Omkeren | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabel 5: Primers voor de PCR van ARG's in kweekbare bacteriën. De verschillende ARGs die in deze studie worden gebruikt, samen met hun respectieve primersequenties, worden weergegeven. De verwachte grootte van het amplicon wordt gegeven in basenparen. Ook de gloeitemperatuur van elke primerset wordt vermeld.
| Antibioticum | Concentratie van antibioticum (μg/ml) | CFU/ml |
| - | - | 3,0 x 109 |
| Ctx | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabel 6: Totaal aantal en antibioticaresistente bacteriën. Vijf antibiotica werden gebruikt voor de eerste isolatie van de antibioticaresistente bacteriën uit het watermonster. De totale bacterietellingen (zonder antibiotica) en de AR-bacterietellingen worden gepresenteerd in termen van kolonievormende eenheden per milliliter (CFU/ml). Afkortingen: AR = antibioticaresistent; CFU = kolonievormende eenheden; CTX = cefotaxime; CIP = ciprofloxacine; K = kanamycine; E = erytromycine; VA = vancomycine.
| Code isoleren | Microorganisms | Familie |
| 1 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 2 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 3 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 4 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 5 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 6 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcaceae |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcaceae |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tabel 7: Identificatie van antibioticaresistente isolaten door 16S rRNA-gensequencing. Colony PCR werd uitgevoerd voor elk isolaat met behulp van 16S rRNA-genspecifieke primers. De verkregen amplicons werden vervolgens gesequenced en geïdentificeerd met behulp van geschikte bioinformatica-hulpmiddelen.
| Isoleer Nr. | Isoleren | Ctx | AMP | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | TR | CIP | MAR | MAR-index | ||
| 1 | Escherichia coli | 13e | 0r | 0r | 28s | 23s | 11e | 39s | Jaren 20 | 18s | 0r | 0r | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31s | 0r | 12e | 29s | 23s | 32s | 37s | 19s | 16s | 0r | 14e | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14e | 0r | 14e | 14e | 21s | 10e ronde | 34s | 17s | 11e | 24s | 16e | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28s | 13e | 18e | 26s | 21s | 28s | 32s | 16e | 11e | 24s | 19e | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11e | 0r | 12e | 26s | 21s | 10e ronde | 31s | 17s | 16s | 22s | 11e | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27s | 0r | 12e | 12e | 22s | Jaren 30 | 32s | 19s | 11e | 0r | 14e | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28s | 0r | 17e | 27s | 22s | Jaren 30 | 32s | 18s | 22s | 0r | 16e | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29s | 11e | 26s | 24s | 22s | Jaren 30 | 28s | 17s | 16s | 24s | 23s | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29s | 13e | 25s | 24s | 22s | 28s | 29s | 18s | 17s | 24s | 25s | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33s | 14s | 26s | 28s | 22s | 31s | 32s | 19s | Jaren 20 | 24s | 29s | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23s | - | - | 37s | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27s | - | - | 42s | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25s | 17e | 24s | 32s | 22s | 34s | 28s | Jaren 20 | - | 21s | 26s | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45s | 57s | 28s | 26s | 34s | 27s | 39s | 26s | - | 28s | 28s | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20e ronde | - | - | - | - | - | - | - | 20e ronde | 2 | 1 | ||
Tabel 8: Fenotype antibioticaresistentie van de bacteriële isolaten geanalyseerd door ASAT. Fenotypische resistentie in de isolaten werd geanalyseerd met behulp van de schijfdiffusiemethode. De cijfers geven de ZOI aan in millimeters (mm). Voor de MAR-index geven de cijfers het totale aantal antibiotica aan waartegen een isolaat resistent is. Afkortingen: ASAT = antibiotica gevoeligheidstest; CTX = cefotaxime; AMP = ampicilline; LE = levofloxacine; C = chlooramfenicol; TGC = tigecycline; CTR = ceftriaxon; IPM = imipenem; GEN = gentamicine; N = neomycine; TR = trimethoprim; CIP = ciprofloxacine; R = resistent; S = gevoelig; MAR = meervoudige antibioticaresistentie; ZOI = zone van remming.
| AMR GEN FAMILIE | GEN(EN) |
| SMB beta-lactamase | MKB-1 |
| ampC-type beta-lactamase | AmpC1 |
| VIM bèta-lactamase | VIM-20 |
| CCRA bèta-lactamase | CCRA |
| NmcA bèta-lactamase | NMCR |
| ARL Beta-lactamase | ARL-1 |
| blaZ beta-lactamase | BlaZ |
| blaTEM beta-lactamase | BlaTEM* |
| blaCTX bèta-lactamase | BlaCTX |
| OC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| ANT(3'') | AADA |
| chinolonresistentie-eiwit (qnr) | qnrS6, qnrVC5 |
| resistentie-nodulatie-celdeling (RND) antibioticum efflux pomp | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP-binding cassette (ABC) antibioticum efflux pomp | oleC, macB, patA, bcrA |
| grote facilitator superfamilie (MFS) antibioticum efflux pomp | AbaQ |
| trimethoprim resistent dihydrofolaat reductase dfr | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampicinefotransferase | rphB |
| undecaprenyl pyrofosfaat gerelateerde eiwitten | BCRC |
| methicilline resistent PBP2 | MECD |
| vanJ membraan eiwit | van J |
| tetracycline-resistent ribosomaal beschermingseiwit | TetT |
| chlooramfenicol acetyltransferase (CAT) | CatB10 |
| Erm 23S ribosomaal RNA methyltransferase | Erm(37) |
| glycopeptide resistentie gen cluster | VanRB, vanRE, vanRD |
| MCR fosfoethanolamine transferase | MCR-9 |
| sulfonamide resistente sul | Sul3 |
| *onderstreepte genen werden ook gedetecteerd in de kweekbare micro-organismen | |
Tabel 9: ARGs geïdentificeerd met behulp van hele metagenomische DNA-analyse. De totale metagenoom van het watermonster werd gebruikt voor de hele metagenomische sequencing en de verkregen sequenties werden geannoteerd met behulp van de juiste ARG-database. De representatieve resultaten van enkele van de belangrijke ARG's geïdentificeerd in het metagenomisch DNA worden getoond. De onderstreepte genen werden ook gedetecteerd in de kweekbare micro-organismen. Afkorting: ARG = antibioticumresistent gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De monsterverzameling en -verwerking spelen een belangrijke rol en kunnen van invloed zijn op de resultaten en interpretatie van het onderzoek. Om variabiliteit in de monsters uit te sluiten, is het daarom belangrijk om monsters uit te voeren op meerdere locaties van het zoetwaterlichaam dat wordt bestudeerd. Het handhaven van de juiste aseptische omgevingsomstandigheden bij het hanteren van dergelijke monsters kan besmetting voorkomen. Om veranderingen in de bacteriële samenstelling te voorkomen die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerde nucleïnezuren, moeten de doorvoeromstandigheden bovendien op 4 °C worden gehandhaafd, met een minimale tijdsverloop vanaf het punt van monsterverzameling tot de daaropvolgende verwerking. Verschillende studies hebben aangetoond dat deze tussentijdse periode tussen monsterverzameling en verwerking variabele resultaten kan opleveren tijdens latere stadia van analyse als deze niet zorgvuldig wordt uitgevoerd12,13.
Het gebruik van een reeks verdunningen voor beplating zorgt ervoor dat kolonies niet samenklonteren en dat er niet te weinig kolonies zijn om te tellen. Het uitvoeren van de experimenten in tweevoud is noodzakelijk om rekening te houden met variaties in CFU / ml die kunnen ontstaan als gevolg van pipetteer- / verwerkingsfouten. Bovendien worden voor elk experiment controleplaten bijgehouden om ervoor te zorgen dat de gebruikte antibiotica effectief werken en dat vals-positieve resultaten worden geëlimineerd. Daarom mogen de controleplaten geen zichtbare koloniegroei hebben. Dit geeft de werkzaamheid van de gebruikte antibiotica aan.
Tijdens AST kunnen de dichtheid van de entcultuur en de dikte van de agarplaat de diameter van de ZOI en dus de interpretatie van de resultaten beïnvloeden. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat deze twee factoren uniform blijven bij het uitvoeren van de AST-experimenten. Het meest kritische aspect is het aantal bacteriële cellen dat aanwezig is in het entmateriaal. Over het algemeen worden 1 × 108-2 × 108 CFU / ml cellen gebruikt als het entmateriaal, wat gelijk is aan de 0,5 McFarland-standaard14. Deze concentratie van het entmateriaal moet constant worden gehouden om elke variatie in de resultaten te voorkomen. Elke concentratie die hoger of lager is dan de vereiste concentratie moet worden verdund met behulp van steriele zoutoplossing en onmiddellijk worden gebruikt voor inenting binnen 15 minuten. Tijdens het verspreiden van het entmateriaal op de agarplaten, moet ervoor worden gezorgd dat een overmatige hoeveelheid entmateriaal wordt vermeden. Overtollig entmateriaal kan worden verwijderd door op het wattenstaafje aan de zijkanten van de bacteriële suspensiebuis te drukken voordat het op de MHA-plaat wordt ingeënt. Elke afwijking van de standaard AST-procedure kan een aanzienlijke invloed hebben op de gegevens die uit dergelijke protocollen worden verkregen11,15. Een eerdere studie toonde aan dat een MAR-indexwaarde van ≥0,2 duidt op een hoge weerstand in de isolaten16. Aangezien de interpretatie van de resultaten van de AST gebaseerd is op de ZOI, moet onderinenting of overinenting van de cultuur worden vermeden.
Voor de PCR moet de mastermix op een ijsblok worden bereid om de kans op afbraak van de ingrediënten en verlies van activiteit van het enzym te minimaliseren. Het dragen van handschoenen tijdens het instellen van de reactie minimaliseert de kans op externe besmetting17. De spanning tijdens de AGE mag niet te hoog zijn, omdat dit kan leiden tot een verwarmend effect en degradatie van de geladen monsters. Het uitvoeren van de AGE op een optimale spanning zorgt ervoor dat de banden goed gescheiden zijn en scherp zijn zonder slepende of vlekkende effecten.
Studies uitgevoerd in de afgelopen decennia hebben het gebruik van 16S rRNA-gen amplicon sequencing aangetoond voor de identificatie van verschillende micro-organismen. Voor 16S rRNA-gensequencing kan de keuze van de methode voor de extractie van het sjabloon-DNA vooroordelen veroorzaken, die op hun beurt de downstream-analyse kunnen beïnvloeden. Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaan celwand die het moeilijk kan maken om het nucleïnezuur te extraheren. Daarom moet de keuze van de extractiemethode zodanig zijn dat deze effectief alle soorten microbieel DNA vastlegt. De traditionele kookmethode om ruw sjabloon-DNA te extraheren is zo'n efficiënte methode om de inhoud van de cel te extraheren, waardoor vooroordelen in de resultaten worden verminderd.
Om de volledige bacteriële gemeenschap van het waterlichaam te begrijpen, werd in deze studie de high-throughput next-generation sequencing (HT-NGS) techniek gebruikt. Volledige metagenomische DNA-analyse maakt de studie van het hele metagenoom van een bepaald monster mogelijk. Op cultuur gebaseerde technieken geven voornamelijk een aerobe telling van de bacteriële belasting, wat de microbiologische kwaliteit van een monster aangeeft. Kweekbare micro-organismen vormen echter slechts 1% van de totale micro-organismen. De resterende microflora, die een breed scala aan soorten omvat, waaronder anaëroben, zijn slecht gekarakteriseerd en worden vaak genegeerd. Deze micro-organismen kunnen AR-eigenschappen dragen. Bovendien zijn commensale micro-organismen een reservoir van AR-genen die via verschillende genetische uitwisselingsgebeurtenissen op pathogenen kunnen worden overgedragen18. Veel van deze commensalen zijn niet-cultureerbaar en kunnen worden bestudeerd door een metagenomische benadering met HT-NGS, waardoor een grotere dekking wordt geboden voor de identificatie van diverse microflora in elk monster. Met behulp van metagenomische analyse werd een gedetailleerd profiel van de bacteriële taxa verkregen, dat de cultureerbare gegevens aanvulde. Bovendien kunnen dergelijke complementaire benaderingen een idee geven van de algehele AR-status van het waterlichaam dat wordt bestudeerd.
In de huidige studie, met behulp van een combinatie van zowel conventionele op cultuur gebaseerde als niet-op cultuur gebaseerde metagenomische technieken, waren we in staat om de totale bacteriële diversiteit, verschillende antibioticaresistente bacteriën en de totale pool van door water overgedragen ARG's te identificeren. De methodologie die in deze studie wordt beschreven, kan worden gerepliceerd en aangepast voor de identificatie van AR-pathogenen in elk ander waterbron-kustwater, natuurlijk water en door de mens gemaakt drinkwater. Het kan ook worden gebruikt voor het volgen van de overdracht van door water overgedragen nosocomiale pathogenen en voor het monitoren van ziekenhuisgerelateerde infecties in ziekenhuis- en kliniekomgevingen via waterbronnen zoals gootstenen, toiletten, badkuipen en luchtbevochtigers. Dit zal helpen bij het toezicht op AMR en de identificatie van AMR-hotspots op waterbasis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door financiële subsidies van het Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme van de Universiteit van Mumbai. Devika Ghadigaonkar werkte als Project Fellow onder de regeling. De technische hulp van Harshali Shinde, Senior Research Fellow onder het Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Projectnummer: CRG/2018/003624, wordt erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B.
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
