Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för isolering och identifiering av antibiotikaresistenta bakterier från vatten och molekylär karakterisering av deras antibiotikaresistensgener (ARG). Användningen av kulturbaserade och icke-kulturbaserade (metagenomisk analys) tekniker ger fullständig information om den totala bakteriemångfalden och den totala poolen av olika ARG som finns i sötvatten från Mumbai, Indien.
Abstract
Utvecklingen och spridningen av antibiotikaresistens (AR) genom mikrobiota associerad med sötvattenförekomster är ett stort globalt hälsoproblem. I den aktuella studien samlades och analyserades sötvattenprover med avseende på den totala bakteriemångfalden och AR-gener (ARG) med hjälp av både konventionella odlingsbaserade tekniker och ett kulturoberoende metagenomiskt tillvägagångssätt med hög genomströmning. Detta dokument presenterar ett systematiskt protokoll för uppräkning av de totala och antibiotikaresistenta odlingsbara bakterierna från sötvattenprover och bestämning av fenotypisk och genotypisk resistens i de odlingsbara isolaten. Vidare rapporterar vi användningen av hela metagenomisk analys av det totala metagenomiska DNA som extraherats från sötvattenprovet för identifiering av den övergripande bakteriemångfalden, inklusive icke-odlingsbara bakterier, och identifiering av den totala poolen av olika ARG (resistom) i vattenkroppen. Efter dessa detaljerade protokoll observerade vi en hög antibiotikaresistent bakteriebelastning i intervallet 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU/ml. De flesta isolat var resistenta mot flera testade antibiotika, inklusive cefotaxim, ampicillin, levofloxacin, kloramfenikol, ceftriaxon, gentamicin, neomycin, trimetoprim och ciprofloxacin, med flera antibiotikaresistensindex (MAR) på ≥0,2, vilket indikerar höga resistensnivåer i isolaten. 16S rRNA-sekvenseringen identifierade potentiella mänskliga patogener, såsom Klebsiella pneumoniae, och opportunistiska bakterier, såsom Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp., och Aeromonas spp. Den molekylära karakteriseringen av isolaten visade närvaron av olika ARG, såsom blaTEM, blaCTX-M (β-laktamer), aadA, aac (6')-Ib (aminoglykosider) och dfr1 (trimetoprimer), vilket också bekräftades av hela metagenomiska DNA-analysen. En hög prevalens av andra ARG som kodar för antibiotika efflux pumpar-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-laktamaser-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, kloramfenikolacetyltransferasgenen catB10 och rifampicinresistensgenen rphB-detekterades också i metagenomiskt DNA. Med hjälp av de protokoll som diskuteras i denna studie bekräftade vi förekomsten av vattenburna MAR-bakterier med olika AR-fenotypiska och genotypiska egenskaper. Således kan hela metagenomisk DNA-analys användas som en kompletterande teknik till konventionella odlingsbaserade tekniker för att bestämma den totala AR-statusen för en vattenkropp.
Introduction
Antimikrobiell resistens har identifierats som ett av de mest akuta globala problemen. Den snabba utvecklingen av antimikrobiell resistens och dess globala spridning är ett av de största hoten mot människors hälsa och den globala ekonomin när det gäller de hälso- och sjukvårdskostnader som är förknippade med den1. Överanvändning och missbruk av antibiotika har lett till en ökning av AR. Detta har belysts av COVID-19-pandemin, under vilken behandlingen av associerade sekundära infektioner i många fall äventyrades enormt på grund av AMR hos de drabbade patienterna2. Förutom människors direkta användning/missbruk av antibiotika är överanvändning och missbruk av antibiotika inom jordbruk och djurhållning och deras olämpliga utsläpp i miljön, inklusive vattendrag, ett stort problem3. Ökningen av nya resistensegenskaper och multiresistans hos bakterier belyser snarast behovet av en bättre förståelse för de faktorer som leder till utvecklingen av AR och dess spridning. Flera antibiotikaresistenta bakterier, som ofta bär flera AR-gener (ARG) på mobila genetiska element som plasmider, kan överföra dessa resistensgener till icke-resistenta mikroorganismer, inklusive potentiella mänskliga patogener, vilket leder till uppkomsten av superbugs som inte kan behandlas med även sista utväg antibiotika4. Dessa flera antibiotikaresistenta bakterier, om de finns i vattenekosystem, kan direkt komma in i människans tarm via konsumtion av förorenade vattenbaserade livsmedel som fisk, krabbor och blötdjur. Tidigare studier har visat att spridningen av AR-bakterier i naturligt förekommande vattensystem också kan nå andra vattenförsörjningar, inklusive dricksvatten, och därmed kan komma in i den mänskliga livsmedelskedjan 5,6,7.
Syftet med denna studie är att tillhandahålla ett omfattande protokoll med hjälp av en kombination av kulturbaserade och icke-kulturbaserade (hela metagenomisk analys) tekniker för att få fullständig information om den totala bakteriemångfalden och den totala poolen av olika ARG som finns i en vattenkropp i Mumbai, Indien. Konventionellt har kulturbaserade tekniker använts för att studera bakteriemångfalden i vattendrag. Eftersom odlingsbara mikroorganismer endast utgör en liten andel av den totala mikrobiotan i någon nisch, för att få en bättre förståelse för den övergripande statusen för bakteriell mångfald och de olika resistenta egenskaperna som förekommer i alla prov, måste olika kulturbaserade och kulturoberoende tekniker användas tillsammans. En sådan robust och pålitlig odlingsoberoende teknik är hela metagenomisk DNA-analys. Denna metod med hög genomströmning har framgångsrikt använts i olika studier om bakteriell mångfald eller funktionella kommentarer av olika ARGs 8,9. Denna teknik använder metagenomet (det totala genetiska materialet i ett prov) som utgångsmaterial för olika analyser och är därför kulturoberoende. Protokollen i den aktuella studien kan användas för hela metagenomisk DNA-analys för att få information om den totala bakteriemångfalden och olika ARG (resistom) i vattenprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Insamling och bearbetning av prover
- Insamling av prover
- Samla upp lämplig volym av vattenprovet i sterila provbehållare och se till att högst 3/4 av behållaren är fylld.
- Transportera proverna till laboratoriet under aseptiska förhållanden så snart som möjligt efter insamlingen och bearbeta dem omedelbart.
- Bearbetning av prover
- Filtrera vattenprovet aseptiskt genom en steril muslinduk för att avlägsna eventuella partiklar.
- Utför lämpliga seriella utspädningar av det filtrerade vattnet för vidare analys.
2. Uppskattning av den totala bakteriebelastningen och antalet antibiotikaresistenta bakterier
- Bestämning av den totala bakteriebelastningen
- Suspendera 18,12 g R2A Agar, modifierat pulver i 1 000 ml dubbeldestillerat vatten och lös upp blandningen genom upphettning. Autoklavera den upplösta blandningen vid 121 °C, 15 psi i 20 minuter. Bered R2A Agar, modifierade plattor genom att hälla lämplig mängd av den autoklaverade blandningen i sterila petriplattor (tillsätt t.ex. cirka 20 ml autoklaverat sterilt medium till en 90 mm steril petriplatta).
- Jämnt fördelad 100 μl av lämpliga utspädningar av det filtrerade vattenprovet på R2A Agar, modifierad platta när mediet stelnat. Utför experimentet i dubblett.
- Inkubera alla ovanstående plattor vid 35–37 °C i 48 timmar (variera temperatur och inkubationstid beroende på vilket medium som används för isolering).
- Uttryck den totala bakteriebelastningen i termer av kolonibildande enheter per milliliter (CFU/ml) med hjälp av ekvation (1):
(1)
- Bestämning av AR-bakterieantalet
- Följ steg 2.1.1–2.1.4. Men istället för R2A Agar, modifierade plattor, använd R2A Agar, modifierade plattor kompletterade individuellt med fem olika antibiotika, nämligen cefotaxim (3 μg / ml), ciprofloxacin (0,5 μg / ml), erytromycin (20 μg / ml), kanamycin (15 μg / ml) och vankomycin (3 μg / ml).
- Tillsätt antibiotika separat i rör som innehåller 20 ml steril smält R2A-agar, modifierad (med temperaturen på den smälta R2A-agarn, modifierad vid ≤40 °C) för att uppnå den slutliga antibiotikakoncentrationen enligt steg 2.2.1.
- Virvla för jämn blandning och häll på sterila petriplattor innan agarn stelnar. Utför experimentet i dubblett.
- Inkubera alla ovanstående plattor vid 35–37 °C i 48 timmar (om du använder ett annat medium kan temperaturen och inkubationstiden variera).
- För kvalitetskontroll och kontroll av antibiotikans effekt, sprid 100 μL bakteriesuspensioner av stammarna Escherichia coli ATCC 25922 och Staphylococcus aureus ATCC 29213 på deras respektive antibiotikainnehållande R2A Agar, modifierade plattor (se till att densiteten hos den färska kulturen som används för ympningen är OD = 0,5 vid 600 nm).
- Bestäm antalet antibiotikaresistenta bakterier i termer av CFU/ml enligt beskrivningen i steg 2.1.4.
- Glycerollager av isolaten
- Välj morfologiskt distinkta AR-kolonier.
- Suspendera en enda isolerad koloni i 2 ml steril Luria-Bertani-buljong som innehåller respektive antibiotikum (t.ex. om en koloni valdes från en platta som innehåller cefotaxim, inokulera kolonin från steg 2.3.1 i steril Luria-Bertani-buljong innehållande cefotaxim vid respektive koncentration).
- Inkubera de inokulerade rören vid 37 °C vid 80 rpm tills OD600 når 0,5.
- Bered glycerollagren av isolaten genom att blanda 750 μl av odlingssuspensionen från steg 2.3.3 till 250 μl steril 100 % glycerol under aseptiska förhållanden.
- Förvara glycerollagren vid −80 °C tills vidare analys.
OBS: För att återuppliva kulturerna från glycerolbestånden, tina glycerollagren vid 4 °C. Inokulera en slinga av detta bestånd i 2 ml steril Luria-Bertani-buljong som innehåller respektive antibiotikum och låt växa.
(1)3. Identifiering av odlingsbara bakterier genom 16S rRNA-gensekvensering
- Beredning av DNA-mall från isolaten för PCR
OBS: Protokollet som beskrivs för beredning av DNA-mall för PCR för isolering av rå-DNA från bakterierna ges av Carlson et al.10.- Använd en steril tandpetare och ta en enda, isolerad, ren koloni av isolatet som växer på en petriplatta. Suspendera bakteriekolonin i 100 μl sterilt dubbeldestillerat vatten i ett sterilt mikrocentrifugrör och koka i 10 min.
- Centrifugera suspensionen vid 10 000 × g i 2 minuter för att pelletera skräpet och överför supernatanten till ett nytt sterilt mikrocentrifugrör för användning som rå-DNA-mall.
- Riktad PCR-förstärkning av V3-regionen av 16S rRNA-genen och sekvensering
- Bered 40 μl av reaktionsblandningen i ett PCR-rör för PCR-förstärkning, enligt tabell 1.
OBS: DNA-preparatet bör utföras på ett isblock samtidigt som risken för kontaminering minimeras (använd handskar när du hanterar reagenserna och rengör arbetsytan noggrant med 70% etanol). - Placera röret i det termiska blocket och kör lämpligt program i PCR-termisk cykler. Se tabell 2 för de standardiserade PCR-cykelförhållandena och primerinformationen för förstärkning av V3-regionerna i 16S rRNA-generna.
- För att lösa amplikonerna och visualiseringen, utför agarosgelelektrofores (AGE). Blanda 10 μL av den förstärkta PCR-produkten och 2 μL 6x gelladdningsbuffert (tabell 3) och ladda blandningen i brunnar på 1,5% agarosgel (lös upp 1,5 g agarospulver i 100 ml 1x TAE-buffert [tabell 3]) innehållande 5 μl 10 mg/ml etidiumbromid (EtBr) till en slutlig koncentration av 0,5 μg/ml EtBr i 100 ml av agarosgelen.
VARNING: EtBr är ett potent cancerframkallande ämne. Handskar ska alltid bäras vid hantering av EtBr och geler som innehåller EtBr. - Lägg till DNA-stege för uppskattning av amplikonernas storlek.
- Utför elektrofores av gelén i en TAE-tankbuffert vid 80-100 V.
- När spårningsfärgen körs 3/4 av gelén, stoppa elektroforesen och visualisera ampliconbanden under en UV-transilluminator.
- Använd PCR-produkten (amplicon) för 16S rRNA-gensekvensering för att identifiera isolatet.
- Kvantifiera amplikonen genom att utsätta den för spektrofotometrisk analys med ekvation (2).
(2) - För att kontrollera DNA: s renhet, beräkna förhållandet mellan A260 / A280.
OBS: Helst bör detta nummer vara över 1,5 och helst mellan 1,8 och 2,0. - För att identifiera isolaten, jämför sekvenserna som erhålls med sekvensdatabaser med hjälp av ett lämpligt justeringssökningsverktyg.
- Bered 40 μl av reaktionsblandningen i ett PCR-rör för PCR-förstärkning, enligt tabell 1.
(2)4. Detektion av antibiotikaresistens i isolaten med hjälp av antibiotikakänslighetstest
OBS: Detta protokoll beskriver metoden för antibiotikakänslighetstestning (AST) genom skivdiffusion. Följande antibiotikaskivor användes: cefotaxim (5 μg), ampicillin (10 μg), levofloxacin (5 μg), kloramfenikol (30 μg), tigecyklin (15 μg), ceftriaxon (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicin (10 μg), neomycin (10 μg), trimetoprim (5 μg) och ciprofloxacin (5 μg).
- Beredning av inokulatet för AST
- Aseptiskt inokulera en enda, isolerad, renad AR-koloni med en steril slinga i 2 ml av ett sterilt icke-selektivt medium, såsom Luria-Bertani-buljong (utan antibiotikum), och inkubera vid 37 ° C vid 80 rpm över natten.
- Återsuspendera genom att ta 100-150 μL av den odlade kulturen över natten (ungefär OD 600 = 1,8-2,0) i 2 ml färskt icke-selektivt Luria-Bertani-buljongmedium och inkubera i 2-4 timmar (tills OD600 når 0,4-0,5).
- Späd denna nyodlade odlingssuspension med steril 0,85% saltlösning så att kulturens densitet är lika med 0,5 McFarland-standard (ungefär OD600 = 0,1), vilket ungefär motsvarar 1-2 × 108 celler / ml.
- Blanda försiktigt bakteriesuspensionen för en jämn cellfördelning.
- Använd ovanstående suspension inom 15 min efter utspädning.
- Inokulering av agarplattorna
- Förbered Mueller-Hinton Agar (MHA)-plattorna för att utföra AST genom att blanda 38 g MHA i 1 000 ml dubbeldestillerat vatten och lös upp blandningen genom upphettning. Autoklavera den upplösta blandningen vid 121 °C, 15 psi i 15 minuter.
- Se till att MHA-djupet i plattorna är 4 mm (25 ml medium per platta).
- Ta samtidigt bort antibiotikaskivorna från frysen och värm dem till rumstemperatur.
OBS: Antibiotikaskivorna bör gradvis tinas genom att först tina skivorna vid 4 °C och senare vid rumstemperatur för att minska eventuell risk för kondens på skivorna, vilket senare kan påverka hämningszonen (ZOI). - Under aseptiska förhållanden, doppa en steril bomullspinne i ympkulturen som framställts i steg 4.1 och ta bort överflödig suspension för att undvika överinokulering av plattorna.
- Sprid kulturen jämnt på plattorna, börja från toppen av MHA-plattan och gå fram och tillbaka från kant till kant. Vrid plattan med 60 ° medan du svabbar.
- Applicering av antibiotikaskivorna
- Med hjälp av flamsteriliserade pincett överför du aseptiskt antibiotikaskivorna till de inokulerade MHA-plattorna och trycker försiktigt på skivorna för att säkerställa fullständig nivåkontakt med agar.
OBS: Denna procedur måste göras inom 15 minuter efter inokuleringen av kulturen på plattorna. - Placera lämpligt antal antibiotikaskivor på agarplattan genom att ta hänsyn till organismen, det använda antibiotikumet och plattans storlek för att undvika överlappning av hämningszonerna.
OBS: Fyra till fem skivor kan rymmas på en 90 mm cirkulär platta.
- Med hjälp av flamsteriliserade pincett överför du aseptiskt antibiotikaskivorna till de inokulerade MHA-plattorna och trycker försiktigt på skivorna för att säkerställa fullständig nivåkontakt med agar.
- Inkubation av plattorna
- Inom 15 minuter efter appliceringen av antibiotikaskivorna, vänd på plattorna och inkubera vid 37 °C över natten.
- Tolkning av resultaten
- Mät ZOI-diametern i millimeter (mm) och tolka enligt brytpunktsvärdena i EUCAST11. Se de två exemplen nedan.
- Zondiameterns brytpunkt (mm) för en ciprofloxacin-antibiotikaskiva (5 μg) för Enterobacterales är S ≥ 25 och R < 22, vilket innebär att den anses vara känslig (S) om ZOI ≥ 25 mm, medan den är resistent (R) om ZOI < 22 mm. Om ZOI-diametern faller mellan 22 och 25 anses isolatet vara mellanliggande (I).
- Brytpunkten för zondiametern (mm) för en kloramfenikolantibiotikumskiva (30 μg) för Staphylococcus spp. är S ≥ 18 och R < 18, vilket innebär att den anses vara känslig om ZOI ≥ 18 mm, medan den är resistent om ZOI < 18 mm.
- Bestäm indexet för multipel antibiotikaresistens (MAR) genom att hitta förhållandet mellan antalet antibiotika som isolatet är resistent mot det totala antalet antibiotika som isolatet utsätts för.
OBS: För kvalitetskontroll, E. coli ATCC 25922 och S. Aureus ATCC 29213 används som referensstammar enligt protokollet som i steg 4.
- Mät ZOI-diametern i millimeter (mm) och tolka enligt brytpunktsvärdena i EUCAST11. Se de två exemplen nedan.
5. PCR-baserad detektion av antibiotikaresistensgener i isolaten
- Använd ett standard PCR-protokoll för identifiering av ARG i isolaten. Förbered DNA-mallen med hjälp av protokollet som ges i steg 3.1.
OBS: PCR-cykelförhållandena som användes i denna studie var 94 ° C i 10 minuter, följt av 35 cykler på 94 ° C i 30 s, glödgning i 30 s vid lämplig temperatur (som standardiserad för varje primeruppsättning), förlängning vid 72 ° C i 40 s och en slutlig förlängning vid 72 ° C i 5 minuter. Reaktionsblandningen beskrivs i tabell 4. Listan över ARG, primers och glödgningstemperaturer ges i tabell 5. - För att lösa, visualisera och kontrollera renheten hos amplikonerna, följ steg 3.2.3-3.2.10.
6. Hela metagenomisk DNA-analys för identifiering av den totala bakteriemångfalden och detektion av ARG i metagenomet
- Extraktion av det totala DNA (metagenomet) från vattenprovet
- Extrahera metagenomiskt DNA från de filtrerade vattenproverna.
OBS: I den aktuella studien extraherades det metagenomiska DNA (totalt DNA) från de filtrerade vattenproverna med hjälp av det refererade DNA-isoleringssatsen enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckningen). - Kontrollera DNA-kvaliteten genom att ladda 3 μL av det extraherade metagenomiska DNA:t på en 0,8% agarosgel och kör gelén vid 80-110 V i cirka 30 minuter.
- Kontrollera om det finns ett enda intakt band.
- Kontrollera DNA-koncentrationen med en fluorometer.
- Extrahera metagenomiskt DNA från de filtrerade vattenproverna.
- Bestämning av bakteriell mångfald och detektion av ARG med hjälp av hela metagenomisk DNA-sekvensering
- Biblioteksförberedelse och PCR-förstärkning:
- Förbered ett sekvenseringsbibliotek med parat slut med hjälp av det refererade förberedelsepaketet för DNA-bibliotek (se materialförteckningen).
- Förbered DNA för adapterligering genom att ta 200 ng DNA och mekaniskt klippa det i mindre fragment, följt av ett kontinuerligt steg av slutreparation där ett "A" läggs till i 3'-ändarna.
- Beroende på vilken plattform som används för sekvensering, ligate specifika adaptrar till båda ändarna av DNA-fragmenten.
Sekvenser som är avgörande för att binda dubbelstreckade bibliotek till en flödescell för sekvensering finns i dessa adaptrar. Detta möjliggör PCR-förstärkning av de adapter-ligerade fragmenten och bindning av standardsekvenseringsprimrarna. - För att kontrollera kvalitet och kvantitet, analysera det förstärkta biblioteket med ett högkänsligt DNA-chip enligt tillverkarens instruktioner.
- Klustergenerering och sekvensering:
- Läs in det förstärkta biblioteket på lämplig sekvenseringsplattform för klustergenerering och efterföljande sekvensering.
OBS: Biblioteksmolekylerna binder till de komplementära adapteroligoerna på den parade ändflödescellen. Under sekvenseringen klyvs de främre strängarna selektivt efter omsyntesen av den omvända strängen. Denna kopierade omvända sträng sekvenseras sedan från den motsatta änden av fragmentet.
- Läs in det förstärkta biblioteket på lämplig sekvenseringsplattform för klustergenerering och efterföljande sekvensering.
- Bioinformatisk analys:
- Generera ställningar från högkvalitativa data med hjälp av lämplig plattform.
- Utsätta dessa ställningar för bioinformatisk analys för taxonomisk klassificering och identifiering av ARG.
OBS: Arbetsflödet för hela metagenomisk DNA-analys för identifiering av den totala bakteriemångfalden och detektion av ARG i metagenomet ges i figur 1. Ett flödesblad över den fullständiga metodiken som beskrivs i manuskriptet ges i figur 2.
- Biblioteksförberedelse och PCR-förstärkning:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Total bakteriebelastning och antal antibiotikaresistenta (AR) bakterier
Uppräkningen av den totala bakteriebelastningen utfördes genom att sprida 10−4 till 10−6 gånger utspädningar av vattenproverna på R2A Agar, modifierat medium. För uppräkningen av antalet AR-bakterier spreds 10−3 till 10−6-faldiga utspädningar på medieplattor innehållande antibiotika (figur 3). Det totala antalet bakterier och AR-bakterier beräknades som CFU/ml, och alla pläteringsexperiment utfördes i två exemplar. Efter ovanstående protokoll visade den aktuella studien att det totala antalet bakterier var 3,0 × 109 CFU/ml. AR-bakteriebelastningen visade sig vara hög, i intervallet 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU/ml (tabell 6).
Identifiering av odlingsbara bakterier genom 16S rRNAgensekvensering
Rå-DNA från varje isolat användes som en mall för att utföra 16S rRNA-genspecifik PCR. I de totalt 15 AR-isolat som sekvenserades tillhörde 10 Enterobacteriaceae-familjen, varav de flesta var Escherichia coli och Klebsiella pneumoniae. Sällsynta opportunistiska bakterier som Comamonas spp. som tillhör familjen Comamonadaceae, Micrococcus spp. tillhör familjen Micrococcaceae och Aeromonas spp. som tillhör familjen Aeromonadaceae identifierades också från vattenprovet (tabell 7).
Detektion av antibiotikaresistens hos odlingsbara bakterier med hjälp av antibiotikakänslighetstestning
Antibiotikaresistensprofilen för de ovan identifierade isolaten genererades genom att utföra ASAT med hjälp av skivdiffusionsmetoden (figur 4). Av de 15 testade isolaten hade 8 ett MAR-index på ≥0,2, vilket indikerar en hög grad av resistens. Dessutom visade många av isolaten co-resistensprofiler (resistens mot samma uppsättning antibiotika). Isolat som Comamonas spp. och Arthrobacter spp. visade dock inte resistens mot något av de testade antibiotika (tabell 8).
Detektion och identifiering av antibiotikaresistensgener i odlingsbara bakterier
Totalt 10 AR-isolat screenades för förekomst av ARG med PCR. Den vanligaste ARG i odlingsisolaten var blaTEM-kodning för β-laktamas, följt av aminoglykosidresistensgenen aadA. Andra förstärkta ARG var blaCTX-M, dfr1 och aac (6') -Ib som gav resistens mot β-laktamer, trimetoprim respektive aminoglykosider. De representativa resultaten av förstärkningen av ARG visas i figur 5. För de flesta av de identifierade isolaten bekräftades fenotypisk resistens (AST) på molekylär nivå via PCR-baserad genotypisk AR-profilering.
Identifiering av den totala bakteriemångfalden i det metagenomiska DNA:t
För att kontrollera förekomsten av alla möjliga bakterier (både odlingsbara och icke-odlingsbara) och för att identifiera deras relativa överflöd genomfördes en metagenomisk DNA-analys för den totala bakteriediversiteten. Med hjälp av HT-NGS-metoden (high-throughput next-generation sequencing) erhölls ~ 96,94% av de totala sekvensläsningarna, vilket resulterade i hög täckning. Taxonomisk anteckning utfördes för att klassificera läsningarna i olika taxonomiska grupper från fylumet till släktnivån (figur 6 och figur 7). Totalt 50 phyla kunde identifieras i metagenomet, vilket indikerar den höga bakteriediversiteten i vattenprovet. Proteobakterier var den mest dominerande fylumet, bestående av klasserna Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria och Gammaproteobacteria. På ordernivå var Burkholderiales den vanligaste ordningen, som tillhörde Betaproteobacteria-klassen. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium och Comamonas var några av de rikliga släktena som hittades i vattenprovet.
Detektion av ARG från metagenomiskt DNA
För att förstå den totala poolen av ARG i vattenprovets metagenom utfördes hela metagenomisk sekvensering, följt av identifiering av ARG med hjälp av lämpliga bioinformatikverktyg. Det metagenomiska tillvägagångssättet säkerställer att de ARG som finns i både odlingsbara och icke-odlingsbara mikroorganismer i provet detekteras. En mängd olika gener som ger resistens mot β-laktamer (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogylkosider (AAC(6')-34); kinoloner (qnrS6, qnrVC5); antibiotika efflux pumpar-resistens-nodulering-celldelning (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP-bindande kassett (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) och major facilitator superfamily (MFS) (abaQ); trimetoprimresistent dihydrofolatreduktas (dfrD, dfrA20); rifampinfosfotransferas (rphB); och kloramfenikolacetyltransferas (CAT) (catB10) detekterades i metagenomet. De ARG som detekterades via PCR i de odlingsbara isolaten (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) detekterades också genom hel metagenomisk sekvensering, vilket bekräftade deras närvaro i vattenprovet. De representativa resultaten av de ARG som identifierats i metagenomet med hjälp av hela metagenomisk DNA-analys anges i tabell 9.
Figur 1: Arbetsflöde för hela metagenomisk DNA-analys. Det stegvisa arbetsflödet för identifiering av den totala bakteriemångfalden och detektering av ARG från metagenomet presenteras. De övergripande stegen involverar metagenomisk DNA-beredning, förstärkning och identifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flödesschema för den fullständiga metoden. Det stegvisa arbetsflödet för den metod som används i denna studie. En kombination av både kulturbaserade och icke-kulturbaserade tekniker används för att få fullständig information om bakteriediversiteten och identiteten hos de ARG som finns i vattenprovet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Representativa bilder av isolerade kolonier på antibiotikainnehållande R2A-agar, modifierade plattor. Vattenprover pläterade på cefotaxim (3 μg/ml)-innehållande R2A Agar, modifierade plattor. Provet späddes seriellt och pläterades i duplikat-A1, A2: 10-4; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10–6. Efter lämplig inkubationsperiod var de isolerade kolonierna synliga på B1-, B2-, C1- och C2-plattorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Test av antibiotikakänslighet med skivdiffusionsmetoden. Representativa bilder av AST med skivdiffusionsmetoden för ett Escherichia coli-isolat . AST utfördes i duplikat-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Diametrarna för ZOI: erna mättes i millimeter (mm). För att tolka om isolatet är resistent eller mottagligt för det använda antibiotikumet jämfördes ZOI med de senaste EUCAST-tabellerna. Förkortningar: AST = antibiotikakänslighetstest; CTX = cefotaxim; IPM = imipenem; C = kloramfenikol; CIP = ciprofloxacin; LE = levofloxacin; TGC = tigecyklin; AMP = ampicillin; GEN = gentamicin; TR = trimetoprim; N = neomycin; K = kanamycin; CTR = ceftriaxon; ZOI = hämningszon; EUCAST = Europeiska kommittén för antibiotikakänslighetstestning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: PCR-förstärkning av antibiotikaresistensgener från odlingsbara bakterier. Agarosgelelektrofores efter PCR utfördes för visualisering av förstärkta band för att kontrollera förekomsten av ARG i isolaten. Separerade band av PCR-amplikoner kan ses på gelén. Storleken på de enskilda PCR-amplikonerna jämförs med en lämplig DNA-markör. Lane L1: 100 bp DNA-stege; Banor 1-5: 1: dfr1 (425 bp); Bana 2: blaTEM (310 bp); Bana 3: blaCTX-M (500 bp); Körfält 4: aac(6')-Ib ( 395 bp); Bana 5: aadA (624 bp). Förkortning: ARG = antibiotikaresistensgener. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Taxonomisk klassificering för fylum- och klassnivåer . (A) Stapeldiagram som visar den taxonomiska överflödsfördelningen på fylumnivå för bakteriemetagenomet i vattenprovet. Totalt 50 bakteriella phyla identifierades genom den metagenomiska analysen. De första 12 dominerande phyla av bakterier visas. (B) Stapeldiagram som visar den taxonomiska överflödsfördelningen på klassnivå för bakteriemetagenomet i vattenprovet. Totalt 50 bakterieklasser identifierades genom den metagenomiska analysen. De första 15 dominerande klasserna av bakterier visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Taxonomisk klassificering för ordnings- och genusnivåerna . (A) Stapeldiagram som visar den taxonomiska överflödsfördelningen på ordernivå för bakteriemetagenomet i vattenprovet. Totalt 50 bakteriella order identifierades genom den metagenomiska analysen. De första 14 dominerande ordningarna av bakterier visas i figuren. (B) Stapeldiagram som visar den taxonomiska överflödsfördelningen på genusnivå för bakteriemetagenomet i vattenprovet. Totalt identifierades 50 bakteriesläkten genom den metagenomiska analysen. De första 15 dominerande släktena av bakterier visas i figuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PCR-reagenser | Volym (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| Framåt primer (10 pico mol) | 1.5 |
| Omvänd primer (10 pico mol) | 1.5 |
| Rå DNA-mall | 1.5 |
| Sterilt molekylärbiologiskt vatten | 15.5 |
| Total volym | 40 |
Tabell 1: Beståndsdelar i PCR-mastermix. Reaktionsblandningens sammansättning av olika PCR-reagenser.
| Riktning | Primersekvens 5' – 3' | PCR-villkor | Antal cykler |
| Framåt | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C i 10 min | 1 |
| Denaturering vid 94 °C i 30 s | 35 | ||
| Glödgning vid 50 °C i 30 s | |||
| Förlängning vid 72 °C i 40 s | |||
| Omvända | CTACCGGGGTATCTAATCC | Slutlig förlängning vid 72 °C i 5 min | 1 |
Tabell 2: PCR-cykelförhållanden för förstärkning av 16S rRNA-genen. De PCR-cykelförhållanden som krävs för 16S rRNA-genförstärkning visas. Stegen inkluderar ett första denatureringssteg, följt av 35 cykler av denaturering, glödgning och förlängning, och ett sista förlängningssteg.
| 6x laddar gel | |
| Innehåll | Kvantitet |
| Bromofenol blå | 25 mg |
| 85% glycerol | 7,06 ml |
| Milli-Q vatten | 2,94 ml |
| Total volym | 10 ml |
| 50x Tris-acetat-EDTA (TAE) lagerbuffertsammansättning | |
| Innehåll | Kvantitet |
| Tris bas | 242 g i 700 ml dubbeldestillerat vatten |
| Isättika (GAA) | 57,1 ml |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 ml |
| Justera pH-värdet till 8,5 och fyll på volymen till 1000 ml med dubbeldestillerat vatten | |
| För 1x TAE: 20 ml 50x TAE-buffert + 980 ml dubbeldestillerat vatten | |
Tabell 3: Sammansättning av 6x gelbelastningsbuffert och 50x Tris-acetat-EDTA-lagerbuffert. 6x gelbelastningsbufferten blandas med provet som ska köras på agarosgelelektrofores. Den innehåller bromfenolblått som spårningsfärgämne. Glycerol ökar densiteten hos provet som laddas för korrekt laddning i brunnarna. Sammansättningen av de olika reagenser som krävs för framställning av 50xTAE-lagerbufferten visas också. TAE-buffert är en av de vanligaste buffertarna som används för AGE, och den håller pH-värdet vid 8,5 och möjliggör migration av förstärkt DNA under AGE. Förkortningar: TAE = Tris-acetat-EDTA; ÅLDER = agarosgelelektrofores.
| PCR-reagenser | Volym (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| Framåt primer (10 pico mol) | 0.5 |
| Omvänd primer (10 pico mol) | 0.5 |
| Rå DNA-mall | 1.5 |
| Sterilt molekylärbiologiskt vatten | 2.5 |
| Total volym | 10 |
Tabell 4: PCR-mastermixsammansättning för identifiering av ARG. Reaktionsblandningskompositionen av olika PCR-reagens som krävs för att utföra PCR-experimentet.
| Sr. Nej. | Målgen | Motstånd mot | Abc-bok | Primersekvens (5'-3') | Amplicon storlek (bp) | Glödgningstemperatur (°C) | Referenser | ||||
| 1 | DFR A | Trimetoprim | Framåt | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz m.fl., 19 | ||||
| Omvända | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – laktamer | Framåt | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Omvända | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – laktamer | Framåt | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li m.fl. 21 | ||||
| Omvända | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglykosider | Framåt | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers m.fl. 22 | ||||
| Omvända | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | AAD A | Aminoglykosider | Framåt | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 | ||||
| Omvända | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabell 5: Primers för PCR av ARG i odlingsbara bakterier. De olika ARG:erna som används i denna studie tillsammans med deras respektive primersekvenser visas. Den förväntade storleken på amplicon ges i baspar. Glödgningstemperaturen för varje primeruppsättning nämns också.
| Antibiotikum | Koncentration av antibiotika (μg/ml) | CFU/ml |
| - | - | 3,0 x 109 |
| CTX | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabell 6: Totalt antal och antibiotikaresistenta bakterier. Fem antibiotika användes för den första isoleringen av de antibiotikaresistenta bakterierna från vattenprovet. Det totala antalet bakterier (utan antibiotika) och antalet AR-bakterier presenteras i termer av kolonibildande enheter per milliliter (CFU/ml). Förkortningar: AR = antibiotikaresistent; CFU = kolonibildande enheter; CTX = cefotaxim; CIP = ciprofloxacin; K = kanamycin; E = erytromycin; VA = vankomycin.
| Isolera kod | Mikroorganismer | Familj |
| 1 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 2 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 3 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 4 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 5 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 6 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcaceae |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcaceae |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tabell 7: Identifiering av antibiotikaresistenta isolat genom 16S rRNA-gensekvensering. Koloni-PCR utfördes för varje isolat med användning av 16S rRNA-genspecifika primers. De erhållna amplikonerna sekvenserades sedan och identifierades med hjälp av lämpliga bioinformatiska verktyg.
| Isolera nr. | Isolera | CTX | AMPERE | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | TR | CIP | FÖRDÄRVA | MAR-index | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | 20-TALET | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19S | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | 30-TALET | 32S | 19S | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | 30-TALET | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | 30-TALET | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33S | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19S | 20-TALET | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | 20-TALET | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tabell 8: Antibiotikaresistensfenotyp av bakterieisolat analyseras av AST. Fenotypisk resistans i isolaten analyserades med hjälp av skivdiffusionsmetoden. Siffrorna anger ZOI i millimeter (mm). För MAR-indexet anger siffrorna det totala antalet antibiotika som ett isolat är resistent mot. Förkortningar: AST = antibiotikakänslighetstest; CTX = cefotaxim; AMP = ampicillin; LE = levofloxacin; C = kloramfenikol; TGC = tigecyklin; CTR = ceftriaxon; IPM = imipenem; GEN = gentamicin; N = neomycin; TR = trimetoprim; CIP = ciprofloxacin; R = resistent; S = känslig; MAR = multipel antibiotikaresistens; ZOI = hämningszon.
| AMR-GENFAMILJ | GEN(AR) |
| SMB beta-laktamas | SMB-1 |
| ampC-typ beta-laktamas | ampC1 |
| VIM beta-laktamas | VIM-20 |
| CcrA beta-laktamas | ccrA |
| NmcA beta-laktamas | nmcR |
| ARL beta-laktamas | ARL-1 |
| blaZ beta-laktamas | blaZ |
| blaTEM beta-laktamas | blaTEM* |
| blaCTX beta-laktamas | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| MYR(3'') | aadA |
| Kinolonresistensprotein (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| resistens-nodulationscelldelning (RND) antibiotika effluxpump | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP-bindande kassett (ABC) antibiotika effluxpump | oleC, macB, patA, bcrA |
| major facilitator superfamily (MFS) antibiotika efflux pump | abaQ |
| Trimetoprimresistent dihydrofolatreduktas DFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampinfosfotransferas | rphB |
| undekaprenylpyrofosfatrelaterade proteiner | bcrC |
| meticillinresistent PBP2 | mecD |
| vanJ membran protein | vanJ |
| tetracyklinresistent ribosomalt skyddsprotein | tetT |
| kloramfenikolacetyltransferas (CAT) | kattB10 |
| Erm 23S ribosomalt RNA-metyltransferas | ERM(37) |
| glykopeptidresistens genkluster | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR-fosfoetanolamintransferas | MCR-9 |
| sulfonamid resistent sul | sul3 |
| *understrukna gener upptäcktes också i de odlingsbara mikroorganismerna | |
Tabell 9: ARG identifierade med hjälp av hela metagenomisk DNA-analys. Vattenprovets totala metagenom användes för hel metagenomisk sekvensering, och de erhållna sekvenserna kommenterades med hjälp av lämplig ARG-databas. De representativa resultaten av några av de viktiga ARGs som identifierats i metagenomiskt DNA visas. De understrukna generna upptäcktes också i de odlingsbara mikroorganismerna. Förkortning: ARG = antibiotikaresistent gen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Provtagningen och bearbetningen spelar en viktig roll och kan påverka studiens resultat och tolkning. För att utesluta variabilitet i proverna är det därför viktigt att utföra provtagning på flera platser i den sötvattenförekomst som studeras. Att upprätthålla korrekta aseptiska miljöförhållanden vid hantering av sådana prover kan förhindra kontaminering. För att förhindra förändringar i bakteriesammansättningen som kan påverka kvaliteten och kvantiteten av extraherade nukleinsyror bör transitförhållandena dessutom bibehållas vid 4 °C, med en minimal tidsfördröjning från provtagningsplatsen till den efterföljande bearbetningen. Flera studier har belyst att denna övergångsperiod mellan provtagning och bearbetning kan ge varierande resultat under senare analysstadier om den inte görs noggrant12,13.
Att använda en rad utspädningar för plätering säkerställer att kolonier varken klumpar ihop sig eller finns det för få kolonier att räkna. Att utföra experimenten i duplikat är nödvändigt för att ta hänsyn till variationer i CFU / ml som kan uppstå på grund av pipettering / hanteringsfel. Dessutom upprätthålls kontrollplattor för varje experiment för att säkerställa att de antibiotika som används fungerar effektivt och att falskt positiva resultat elimineras. Därför bör kontrollplattorna inte ha någon synlig kolonitillväxt. Detta indikerar effekten av de använda antibiotika.
Under AST kan inokulumodlingstätheten och tjockleken på agarplattan påverka diametern på ZOI och därmed tolkningen av resultaten. Därför bör man se till att dessa två faktorer är enhetliga när AST-experimenten utförs. Den mest kritiska aspekten är antalet bakterieceller som finns i inokulumet. I allmänhet används 1 × 10 8-2 × 108 CFU / ml celler som inokulum, vilket är lika med 0.5 McFarland-standarden14. Denna koncentration av inokulatet måste hållas konstant för att undvika variationer i resultaten. Varje koncentration som är högre eller lägre än den erforderliga koncentrationen måste spädas med hjälp av steril saltlösning och användas omedelbart för ympning inom 15 minuter. Vid spridning av ympkulturen på agarplattorna måste man se till att undvika en överdriven mängd inokulum. Överskott av inokulum kan avlägsnas genom att trycka på pinnen på sidorna av bakteriens suspensionsrör innan den ympas till MHA-plattan. Varje avvikelse från det vanliga AST-förfarandet kan avsevärt påverka de data som erhållits från sådana protokoll11,15. En tidigare studie visade att ett MAR-indexvärde på ≥0,2 indikerar hög resistans i isolaten16. Eftersom tolkningen av resultaten av AST är baserad på ZOI, bör underinokulering eller överinokulering av kulturen undvikas.
För PCR bör mastermixen beredas på ett isblock för att minimera risken för nedbrytning av ingredienserna och förlust av enzymets aktivitet. Att bära handskar när du ställer in reaktionen minimerar risken för yttre kontaminering17. Spänningen under AGE bör inte vara för hög, eftersom detta kan leda till en uppvärmningseffekt och nedbrytning av de laddade proverna. Genom att utföra AGE med optimal spänning säkerställer du att banden är väl separerade och är skarpa utan några dragande eller smetande effekter.
Studier som genomförts under de senaste decennierna har visat användningen av 16S rRNA-genampliconsekvensering för identifiering av olika mikroorganismer. För 16S rRNA-gensekvensering kan valet av metod för extraktion av mall-DNA orsaka förspänningar, vilket i sin tur kan påverka nedströmsanalysen. Grampositiva bakterier har en tjock peptidoglykancellvägg som kan göra det svårt att extrahera nukleinsyran. Därför bör valet av extraktionsmetod vara sådant att det effektivt fångar alla typer av mikrobiellt DNA. Den traditionella kokningsmetoden för att extrahera råmall-DNA är en sådan effektiv metod för att extrahera innehållet i cellen, vilket minskar förspänningar i resultaten.
För att förstå vattenkroppens fullständiga bakteriegemenskap användes HT-NGS-tekniken (high-throughput next-generation sequencing) i denna studie. Hel metagenomisk DNA-analys möjliggör studier av hela metagenomet för ett givet prov. Kulturbaserade tekniker ger huvudsakligen ett aerobt antal bakteriebelastningen, vilket indikerar den mikrobiologiska kvaliteten på ett prov. Odlingsbara mikroorganismer utgör emellertid endast 1% av de totala mikroorganismerna. Den återstående mikrofloran, som omfattar ett varierat utbud av arter, inklusive anaerober, är dåligt karakteriserade och ignoreras ofta. Dessa mikroorganismer kan bära AR-egenskaper. Dessutom är kommensala mikroorganismer en reservoar av AR-gener som kan överföras till patogener via olika genetiska utbyteshändelser18. Många av dessa kommensaler är icke-odlingsbara och kan studeras med ett metagenomiskt tillvägagångssätt som involverar HT-NGS, vilket ger större täckning för identifiering av olika mikroflora i vilket prov som helst. Med hjälp av metagenomisk analys erhölls en detaljerad profil av bakterietaxan, som kompletterade odlingsbara data. Dessutom kan sådana kompletterande tillvägagångssätt ge en uppfattning om den övergripande AR-statusen för den vattenförekomst som studeras.
I den aktuella studien, med hjälp av en kombination av både konventionella odlingsbaserade och icke-kulturbaserade metagenomiska tekniker, kunde vi identifiera den totala bakteriemångfalden, olika antibiotikaresistenta bakterier och den totala poolen av vattenburna ARG. Metoden som beskrivs i denna studie kan replikeras och anpassas för identifiering av AR-patogener i alla andra vattenkällor - kustvatten, naturligt vatten och konstgjord dricksvatten. Det kan också användas för att spåra överföringen av vattenburna nosokomiala patogener och för att övervaka sjukhusrelaterade infektioner i sjukhus- och klinikinställningar genom vattenkällor som handfat, toaletter, badkar och luftfuktare. Detta kommer att bidra till övervakningen av antimikrobiell resistens och identifieringen av vattenbaserade hotspots för antimikrobiell resistens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga motstridiga intressen att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ekonomiska bidrag från institutionen för vetenskap och teknik-främjande av universitetsforskning och vetenskaplig excellens (DST-PURSE) -systemet vid University of Mumbai. Devika Ghadigaonkar arbetade som Project Fellow under systemet. Den tekniska hjälp som tillhandahålls av Harshali Shinde, Senior Research Fellow under Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB) Projekt nr: CRG/2018/003624, erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B.
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
