Multi-Stream Perfusion Bioreactor geïntegreerd met Outlet Fractionation voor dynamische celcultuur

Summary

Dit artikel presenteert een methode om een goedkoop, meerkanaals perfusiecelkweeksysteem te construeren en te gebruiken voor het meten van de dynamiek van secretie en absorptiesnelheden van opgeloste stoffen in cellulaire processen. Het systeem kan cellen ook blootstellen aan dynamische stimulusprofielen.

Abstract

Bepaalde cel- en weefselfuncties werken binnen de dynamische tijdschaal van minuten tot uren die slecht worden opgelost door conventionele kweeksystemen. Dit werk heeft een goedkoop perfusiebioreactorsysteem ontwikkeld waarmee kweekmedium continu kan worden doordrenkt in een celkweekmodule en gefractioneerd in een downstream-module om de dynamiek op deze schaal te meten. Het systeem is bijna volledig opgebouwd uit in de handel verkrijgbare onderdelen en kan worden geparallelliseerd om tegelijkertijd onafhankelijke experimenten uit te voeren in conventionele multi-well celkweekplaten. Dit videoartikel demonstreert hoe de basisopstelling moet worden samengesteld, waarvoor slechts een enkele meerkanaals spuitpomp en een gemodificeerde fractiecollector nodig zijn om tot zes culturen parallel te laten doordringen. Er worden ook nuttige varianten op het modulaire ontwerp gepresenteerd die een gecontroleerde stimulatiedynamiek mogelijk maken, zoals opgeloste pulsen of farmacokinetisch-achtige profielen. Belangrijk is dat als opgeloste signalen door het systeem reizen, ze worden vervormd als gevolg van opgeloste dispersie. Verder wordt een methode beschreven voor het meten van de verblijftijdverdelingen (RTD's) van de componenten van de perfusieopstelling met behulp van MATLAB. RTD's zijn nuttig om te berekenen hoe opgeloste signalen worden vervormd door de stroom in het systeem met meerdere compartimenten. Dit systeem is zeer robuust en reproduceerbaar, zodat basisonderzoekers het gemakkelijk kunnen gebruiken zonder dat er gespecialiseerde fabricagefaciliteiten nodig zijn.

Introduction

Veel belangrijke biologische processen vinden plaats in cel- en weefselculturen op de tijdschaal van minuten tot uren ^1,2,3. Hoewel sommige van deze verschijnselen op een geautomatiseerde manier kunnen worden waargenomen en vastgelegd met behulp van time-lapse microscopie⁴, bioluminescentie¹ of andere methoden, worden experimenten met het verzamelen van cultuursupernatantmonsters voor chemische analyse vaak handmatig uitgevoerd in statische celculturen. Handmatige bemonstering beperkt de haalbaarheid van bepaalde onderzoeken vanwege het ongemak van frequente of na sluitingstijdstips. Verdere tekortkomingen van statische kweekmethoden omvatten experimenten met gecontroleerde, voorbijgaande blootstelling aan chemische stimuli. In statische culturen moeten stimuli handmatig worden toegevoegd en verwijderd, en stimulusprofielen zijn beperkt tot stapsgewijze veranderingen in de loop van de tijd, terwijl mediumveranderingen ook andere mediumcomponenten toevoegen en verwijderen, die cellen op een ongecontroleerde manier kunnen beïnvloeden⁵. Fluidic-systemen kunnen deze uitdagingen overwinnen, maar bestaande apparaten stellen andere uitdagingen. Microfluïdische apparaten komen met de onbetaalbare kosten van gespecialiseerde apparatuur en training om te produceren en te gebruiken, vereisen microanalytische methoden om monsters te verwerken en cellen zijn moeilijk te herstellen van de apparaten na perfusie⁶. Er zijn weinig macrofluïdische systemen gemaakt voor de soorten experimenten die hier worden beschreven 7,8,9,10, en ze zijn gebouwd van meerdere aangepaste onderdelen die in eigen huis zijn gemaakt en vereisen meerdere pompen of fractiecollectoren. Bovendien zijn de auteurs niet op de hoogte van commercieel verkrijgbare macrofluïdische perfusiecelkweeksystemen anders dan geroerde tankbioreactoren voor suspensiecultuur, die nuttig zijn voor biomanufacturing, maar niet zijn ontworpen voor het modelleren en bestuderen van fysiologie.

De auteurs rapporteerden eerder over het ontwerp van een goedkoop perfusiebioreactorsysteem dat bijna volledig bestaat uit in de handel verkrijgbare delen¹¹. De basisversie van het systeem maakt het mogelijk om meerdere culturen in een putplaat in een CO_2-incubator te bewaren en continu te doordrenken met medium van een spuitpomp, terwijl de effluentmediumstromen uit de culturen in de loop van de tijd automatisch in monsters worden gefractioneerd met behulp van een fractiecollector met een aangepaste modificatie. Dit systeem maakt dus geautomatiseerde bemonstering van kweekmedium supernatant en continue opgeloste input naar de culturen in de loop van de tijd mogelijk. Het systeem is macrofluïdisch en modulair en kan eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van nieuwe experimentontwerpen.

Het algemene doel van de hier gepresenteerde methode is om een perfusiecelkweeksysteem te construeren, karakteriseren en gebruiken dat experimenten mogelijk maakt waarbij de secretie- of absorptiesnelheden van stoffen door cellen in de loop van de tijd worden gemeten en / of cellen worden blootgesteld aan nauwkeurige, voorbijgaande opgeloste signalen. In dit videoartikel wordt uitgelegd hoe u de basisopstelling samenstelt, die in staat is om tot zes celculturen tegelijkertijd te perfuseren met behulp van een enkele spuitpomp en een gemodificeerde fractiecollector. Twee nuttige varianten op het basissysteem die gebruik maken van extra pompen en onderdelen om experimenten mogelijk te maken die cellen blootstellen aan voorbijgaande opgeloste concentratiesignalen, waaronder korte pulsen en farmacokinetisch-achtige profielen¹², worden ook gepresenteerd, weergegeven in figuur 1.

Figuur 1: Drie variaties op het ontwerp van het perfusiesysteem. (Boven) Het basisperfusiesysteem. (Midden) Het perfusiesysteem met een stopkraan voor meerdere mediumbronnen. (Onder) Het perfusiesysteem met een geroerde tank om een goed gemengd distributievolume na te bootsen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Door dispersie en diffusie binnen de stroming worden de opgeloste signalen vervormd of "besmeurd" terwijl ze door het stromingssysteem reizen. Deze vervorming kan worden gekwantificeerd door het gebruik van verblijftijdverdelingen (OTO's)¹³. In dit artikel wordt uitgelegd hoe tracerexperimenten kunnen worden uitgevoerd op onderdelen van het perfusiesysteem (afbeelding 2) en worden MATLAB-scripts gebruikt om RTD's te genereren op basis van gemeten gegevens. Een gedetailleerde uitleg van deze analyse is te vinden in het vorige artikel¹¹ van de auteurs. Aanvullende MATLAB-scripts passen geschikte functies toe aan de RTD's en extraheren fysieke parameters, en voeren signaalconvolutie uit met behulp van RTD's om te voorspellen hoe opgeloste signaalinvoer door de gebruiker zich zal verspreiden en vervormen door het perfusiesysteem¹⁴.

Figuur 2: Verblijftijdverdelingen. De RTD's van componenten van het stromingssysteem, zoals deze lengte van de buizen, worden gemeten door een puls tracer in het systeem in te voeren en te meten hoe het "uitstrijkt" tegen de tijd dat het de verzamelde fracties verlaat. Dit cijfer is aangepast van Erickson et ^al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Bereid onderdelen voor op de perfusie van de putplaat

1. Buizen voorbereiden
   1. Snijd twee lengtes siliconen slang (1,6 mm binnendiameter) voor elke celcultuur die moet worden doordrenkt. Zorg ervoor dat het stuk dat als stroomopwaartse buis wordt gebruikt lang genoeg is om van de spuitpomp naar de celcultuur in de incubator te reiken en dat het stroomafwaartse stuk van de celcultuur naar de verste verlengde positie van de fractiecollector kan reiken.
   2. Geef elk stuk buis een uniek label aan beide uiteinden met gelabelde tape.
2. Maak stoppers klaar voor de putplaat
   1. Verkrijg één siliconen stop voor elke put van de putplaat die moet worden doordrenkt, met een geschikte diameter om knus in de putten te passen met een luchtdichte afdichting.
   2. Snijd overtollig materiaal van de bodems van de stop af, zodat ze in de putjes passen en laat binnen ruimte voor lucht boven het beoogde vloeistofniveau.
   3. Duw twee stompe naalden van 18 G door elke stop, naar boven en naar buiten vanaf de onderkant om te dienen als de inlaat en uitlaat voor de stroom door de put, diametraal tegenover elkaar om de afstand tussen hun uiteinden in de put te maximaliseren.
   4. Pas de hoogten van de naalden in de aangesloten put aan, omdat de hoogte van de uitlaatnaald de stabiele hoogte van het vloeistofniveau in de put tijdens de perfusie bepaalt.
      OPMERKING: Als de perfusie wordt gestart met de uitlaatnaald boven het vloeistofniveau, zal de vloeistof zich ophopen in de put totdat het niveau de naald bereikt. Als de perfusie wordt gestart met de uitlaatnaald onder het vloeistofniveau, blijft het vloeistofniveau stabiel, tenzij er luchtbellen in de put stromen, waardoor de vloeistofhoogte daalt totdat deze dezelfde hoogte heeft als de uitlaatnaald.
3. Verzamel extra onderdelen
   1. Verkrijg één steriele spuit voor elke celcultuur die moet worden toegediend en die groot genoeg is om voldoende medium te bevatten voor de hele perfusie, plus een extra hoeveelheid medium om in eerste instantie de slang te vullen.
   2. Voor elke cultuur die moet worden doordrenkt, verkrijgt u één female-to-barb en twee male-to-barb Luer-connectoren, evenals twee vrouwelijke en twee mannelijke Luer-caps.
4. Onderdelen reinigen en steriliseren
   1. Als onderdelen eerder zijn gebruikt, reinig ze dan door ze te perfuseren met 0,1 N NaOH, gevolgd door een spoeling met gedeïoniseerd water.
   2. Door autoclaveren of anderszins, zorg voor de steriliteit van alle hierboven genoemde onderdelen.

2. Lasergesneden de multi-head dispenser en bevestig deze aan een fractiecollector

1. Maak het multi-head dispensermodel uit figuur 3 opnieuw in een computerondersteund ontwerpprogramma of download het meegeleverde DXF-modelbestand (supplementair bestand 1).
2. Gebruik een lasersnijder om het ontwerp uit een 1/8 in acrylplaat te snijden.
3. Verwijder de drie schroeven die de doseerkop aan de bewegende basis van de fractiecollector bevestigen.
4. Lijn de drie kleinste gaatjes in de multikopdispenser uit met de schroefgaten in de bewegende basis en schroef de schroeven terug door de gaten om te bevestigen.
5. Pas de dichtheid van de drie schroeven aan om de multikopdispenser op en neer te zetten totdat de rij doseergaten is uitgelijnd met de opvangbuizen eronder.
6. Plaats voorzichtig 300 μL pipetpunten door de gewenste gaten om als doseerpunten te dienen.
   OPMERKING: De fractiecollector kan worden gebruikt zonder de multi-head dispenser om een enkele celcultuur te perfuseren.

3. Meet component RTD's en voer signaalconvolutie uit

1. Stel pompen en spuiten in voor tracerpuls zoals weergegeven in figuur 2.
   1. Verkrijg twee eenkanaals of meerkanaals spuitpompen.
   2. Kies een achtergrondoplossing om het medium weer te geven dat in het stroomsysteem zal worden gebruikt tijdens celkweekexperimenten. Zorg ervoor dat de achtergrondoplossing vergelijkbare massaoverdrachtseigenschappen heeft als het medium. In veel gevallen is gedeïoniseerd water een geschikte keuze.
   3. Kies een tracerstof om de opgeloste stof weer te geven die van belang zal zijn tijdens celkweekexperimenten. Zorg ervoor dat de tracer vergelijkbare massaoverdrachtseigenschappen heeft als de opgeloste stof van belang en dat de concentratie ervan kan worden gemeten. In veel gevallen is voedselkleurstof een geschikte keuze.
   4. Los de tracerstof op in de achtergrondoplossing om de traceroplossing te maken.
   5. Vul één spuit met een achtergrondoplossing en laad deze in één spuitpomp. Vul een andere spuit met traceroplossing en laad deze in de tweede spuitpomp.
   6. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan met behulp van Luer-connectoren.
   7. Sluit de stopkraan bij de achtergrondoplossing en pomp de traceroplossing in de stopkraan totdat deze uit de open poort begint te druppelen. Stop de pomp en stel de spuit niet verder af.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de bewegende staaf van de spuitpomp tegen de zuigers van de spuit wordt geduwd voordat de getimede delen van het experiment beginnen. Hierdoor kan de stroom onmiddellijk beginnen wanneer de pomp wordt gestart. Anders kan de pomp worden gestart, maar de stroom zal pas echt beginnen als de bewegende stang de positie van de zuiger inhaalt.
   8. Sluit de stopkraan bij de traceroplossing en pomp de achtergrondoplossing in de stopkraan totdat alle resterende traceroplossing uit de open poort is gespoeld. Stop de pomp en stel de spuit niet verder af.
2. De interessante stroomsysteemcomponent en de fractiecollector instellen
   1. Stel de gewenste stroomsysteemcomponent in voor RTD-analyse. Zorg ervoor dat het te meten onderdeel eindigt met een stuk stroomafwaartse buis van geschikte lengte en flexibiliteit om de fractiecollector tijdens bedrijf te bereiken.
   2. Plaats het uiteinde van de stroomafwaartse buis in een pipetpuntdispenser in de multi-head dispenser, zodat deze nauw aansluit.
   3. Bevestig de open poort van de vierwegstopkraan aan de inlaat van het te meten onderdeel. Pomp de achtergrondoplossing door het onderdeel totdat het volledig is gevuld zoals tijdens een celkweekexperiment en het begint uit de fractiecollector te druppelen. Stop de pomp.
3. Injecteer tracerpuls, verzamel fracties en meet tracer
   1. Stel de pomp voor de traceroplossing in op het gewenste debiet. Sluit de stopkraan bij de achtergrondoplossing en start de stroom van de traceroplossing. Start tegelijkertijd de breukcollector.
   2. Ga gedurende een korte periode door met de stroom van de traceroplossing om een impulsinvoer van de tracer te benaderen. Een pulsduur van 10 minuten bleek goed te werken voor RTD's bij een stroomsnelheid van 1 ml / h.
      OPMERKING: Als de tracerpuls te kort is, komt er niet genoeg tracer in de stroom om meetbaar te zijn. Als de puls te lang is, zal deze niet langer een impuls benaderen en de vorm van de RTD veranderen.
   3. Stop aan het einde van de traceroplossingspulsperiode de traceroplossingspomp. Sluit de stopkraan snel bij de traceroplossing en start de stroom van de achtergrondoplossing met hetzelfde debiet.
   4. Laat de achtergrondoplossing stromen en fracties worden verzameld totdat alle tracer door het systeem en in de verzamelde fracties is gegaan.
   5. Stop het systeem en meet de tracerconcentratie in de fracties. Neem alleen fracties op die volledig zijn verstrekt. Als de verzameling halverwege de verzameling van een breuk wordt gestopt, neem die fractie dan niet op.
4. Bereken de verblijftijdverdeling (RTD) op basis van gemeten gegevens in MATLAB
   OPMERKING: Een schriftelijke uitleg van de analyse die door dit MATLAB-script wordt uitgevoerd, is te vinden in de vorige publicatie van de auteurs¹¹, en discussies over de theorie zijn op grote schaal beschikbaar in literatuur¹³.
   1. Maak een .xlsx bestand met de concentratiegegevens in de indeling van de example_tracer_data.xlsx spreadsheet in aanvullend bestand 2. Voer de concentratiewaarden van de tracer in de fracties (eventuele eenheden) in chronologische volgorde in van links naar rechts in rij 2. Voer de tijd in die is verstreken vanaf het begin van de puls tot het einde van de laatste fractie in cel A5 en voer de lengte van de tracerpuls in minuten in cel A8 in.
   2. Sla het .xlsx bestand op in de map MATLAB.
   3. Open het script RTD_From_Data.m, uit Aanvullend bestand 3, in de MATLAB-editor.
   4. Vervang de naam van het .xlsx-bestand tussen haakjes in de eerste regel van de sectie Gegevens laden van het script door de naam van het nieuwe .xlsx gegevensbestand, volgens de instructies in het scriptbestand. Voer het script uit.
   5. Zorg ervoor dat het script OTO-analyse 13 met succes uitvoert, waarbij een plot van de^RTD wordt geproduceerd en de waarde van de numerieke integraal over de RTD gelijk is aan 1. Zoek de tijdvector (t) en de bijbehorende RTD-waardenvector (Et) die door het script is opgeslagen in de MATLAB-map.
5. Een modelfunctie aanpassen aan de RTD in MATLAB
   1. Open het script Fit_RTD_Function.m. in de MATLAB-editor vanuit Aanvullend bestand 4.
   2. Kies een van de drie becommentarieerde modelfuncties die passen bij de RTD: het axiale dispersiemodel¹³, dat rtd's past voor laminaire stroming in cilindrische buizen; het CSTR-model¹³, dat goed geroerde tanks past; en het n-CSTR model¹⁵, dat ongeveer past op grotere putplaten. Als u een ander model wilt gebruiken dat hier niet is opgenomen, voegt u het toe aan het script in dezelfde indeling.
   3. Verwijder de opmerkingen in het gedeelte van het script met het model dat is gekozen voor aanpassing.
   4. Wijzig de waarden van de eerste schattingen voor de parameters in de waarden die geschikt zijn voor de RTD.
   5. Voer het script uit om een plot van de fit-functie over de RTD-gegevens te maken en om de fit-parameterwaarden voor de functie af te drukken. Als de pasvorm erg slecht is of als er fouten optreden, wijzigt u de eerste schattingen van de parameter en voert u het script opnieuw uit.
6. Voer signaalconvolutie uit in MATLAB
   1. Kies één signaal en één RTD of twee RTD's om te convoleren.
   2. Open het script Signal_Convolution.m, uit Supplemental File 5, in de MATLAB-editor.
   3. Definieer voor elk van de twee signalen die moeten worden samengevoegd (d.w.z. één signaal en één RTD, of twee RTD's), één vector van gelijkmatig verdeelde tijdspunten in de gewenste eenheden en een overeenkomstige vector van signaalwaarden op die momenten.
      OPMERKING: De vectoren van de twee signalen moeten hetzelfde aantal elementen en tijdstappen van dezelfde grootte hebben. Daarom is het handig om de RTD als een continue functie te hebben die kan worden bemonsterd voor een willekeurig aantal punten op elk tijdsinterval.
   4. Voer de twee signalen in MATLAB in en voer het script uit om de tijd- en signaalvectoren van het uitgangssignaal te verkrijgen.

4. Stel het basisperfusiesysteem in met cellen in een putplaat

1. Bereid de putplaat voor
   1. Zorg ervoor dat de putplaatcultuur de juiste gemiddelde diepte heeft voor het perfusie-experiment. Voer alle laatste mediumveranderingen, stimulaties of andere stappen uit zoals gewenst voordat u met de perfusie begint. Als suspensiecellen worden doordrenkt, centrifugeer dan de plaat om ervoor te zorgen dat ze zich op de bodem bevinden.
   2. Onder steriele omstandigheden steekt u de stoppen met naalden in de putplaatculturen met de naalden omhoog getrokken. Nadat de stop op zijn plaats is, verlaagt u de naalden tot de gewenste hoogte voor perfusie, omdat de hoogte van de uitlaatnaald het stabiele vloeistofniveau bepaalt.
   3. Sluit de naalden af met mannelijke Luer-doppen en bewaar de hele putplaat in een couveuse tot gebruik.
2. Bereid de spuiten en stroomopwaartse slang voor
   1. Vul onder steriele omstandigheden één spuit voor elke cultuur die moet worden doordrenkt met voldoende medium voor de gewenste duur van de perfusie, plus voldoende extra medium om de stroomopwaartse slang te vullen.
   2. Bevestig de stroomopwaartse slang aan de spuit met behulp van een female-to-barb Luer-connector. Plaats aan het andere uiteinde van de buis een male-to-barb Luer-connector.
   3. Doseer medium uit de spuit totdat de stroomopwaartse buis volledig gevuld is met medium.
   4. Sluit het open uiteinde van de buis af met een vrouwelijke Luer-dop.
      OPMERKING: Alle replicaatspuiten moeten op dit punt precies hetzelfde volume hebben. Als hun volumes niet gelijk zijn, zullen hun plunjers zich in verschillende posities bevinden en passen ze niet allemaal goed in een enkele meerkanaals spuitpomp.
3. Onder steriele omstandigheden steekt u een male-to-barb Luer-connector in het ene uiteinde van de stroomafwaartse buis en sluit u deze af met een vrouwelijke Luer-dop.
4. Breng zorgvuldig alle voorbereide slangen, spuiten en de putplaat naar de incubator die zal worden gebruikt voor perfusie.
5. Plaats de spuitpomp en fractiecollector op de gewenste plaatsen in de buurt van de incubator. Plaats de spuitpomp bovenop of in de buurt van de incubator en plaats de fractiecollector naast de incubator, in de buurt van de poort.
6. Bundel de afgedekte uiteinden van alle stroomopwaartse en stroomafwaartse buizen en duw ze van de buitenkant van de incubator naar binnen door de poort.
7. Laad de spuiten in de spuitpomp en steek de open uiteinden van de stroomafwaartse buizen in de doseerpipetpunten van de multikopdispenser van de fractiecollector.
8. Trek in de incubator zoveel mogelijk speling van de stroomopwaartse buizen in de incubator om de lengte van de buizen te maximaliseren waardoor het stromende medium warmte en CO2 uit de incubatorlucht kan ontvangen. Terwijl u deze op hun plaats houdt, trekt u de stroomafwaartse buizen uit de incubator, net genoeg zodat ze het verste verlengde punt op de fractiecollector kunnen bereiken terwijl de afgedekte uiteinden nog steeds in de incubator worden gehouden.
9. Voor elke aangesloten put, maak snel de naalden en de upstream en downstream buizen voor die put los en bevestig ze aan elkaar met hun Luer-connectoren.
10. Zodra alle onderdelen zijn aangesloten, laat u de spuitpomp kort op een relatief hoge snelheid draaien om ervoor te zorgen dat alle stromen goed stromen.
11. Op dit punt, als het gewenst is om het experiment te beginnen met de stroomafwaartse buizen vol met het medium, blijft de pomp draaien totdat ze allemaal zijn gevuld. Stop anders de pomp.
12. Stel het debiet van de spuitpomp en de frequentie van het verzamelen van fracties in en start beide machines tegelijkertijd om het experiment te starten. Verzamel breuken voor de gewenste experimentduur.

5. Stel het perfusiesysteem in met een stopkraan voor meerdere mediumbronnen

1. Voer alle substappen van stap 4.1 hierboven uit.
2. Bereid de twee media voor die in de perfusie moeten worden gebruikt en label het medium dat als eerste wordt afgegeven als 1 en het andere als medium 2.
3. Voor elke cultuur die moet worden toegediend, vult u één spuit met voldoende medium 1 voor de duur van de dispensatie, plus voldoende volume om het perfusiesysteem in eerste instantie te vullen. Vul een tweede spuit met voldoende medium 2 voor de duur van de dispensatie.
4. Sluit beide spuiten aan op twee van de drie poorten van een vierwegstopkraan.
   OPMERKING: Een lengte van de slang om de spuiten op de stopkranen aan te sluiten, kan nodig zijn.
5. Bereid de stopkraan en spuiten op dezelfde wijze als stap 3.1.7-3.1.8 hierboven door de stopkraan te sluiten tot medium 1 en medium 2 in de stopkraan te doseren totdat deze net uit de open poort begint te druppelen.
6. Sluit de stopkraan op medium 2 en doseer medium 1 in de stopkraan totdat al het resterende medium 2 uit de open poort is gespoeld.
7. Bevestig de upstream-buis aan de open stopkraanpoort met behulp van een female-to-barb Luer-connector. Plaats aan het andere uiteinde van de buis een male-to-barb Luer-connector.
8. Doseer medium 1 uit de spuit totdat de stroomopwaartse buis volledig gevuld is met medium.
9. Ga verder met de stappen 4.3-4.11 hierboven, laad beide spuiten in afzonderlijke spuitpompen en doseermedium 1.
10. Stel het debiet van de spuitpomp in voor medium 1 en de frequentie van het verzamelen van breuken en start beide machines tegelijkertijd om het experiment te starten.
11. Wanneer de mediumbron moet worden vervangen, stopt u snel de spuitpomp voor medium 1, draait u de stopkraan dicht op medium 1 en start u de spuitpomp voor medium 2. Schakel de bron indien gewenst later op een vergelijkbare manier terug naar medium 1.
12. Verzamel breuken voor de gewenste experimentduur.

6. Stel het perfusiesysteem in met een geroerde tank om de farmacokinetiek na te bootsen

1. Verkrijg farmacokinetische gegevens voor het geneesmiddel van belang en zorg ervoor dat het bestaat uit een concentratiepiek gevolgd door een exponentieel verval.
2. Nadat u de piek op tijd 0 hebt ingesteld en gegevenspunten vóór de piek hebt verwijderd, gebruikt u het script van Stirred_Tank_Fit.m (Supplemental File 6) om de geroerde tank RTD-vergelijking op de gegevens aan te passen. Input v (het gewenste perfusiedebiet) en de gegevens die als een paar vectoren rechtstreeks in het script moeten worden ingepast, samen met t en C voor respectievelijk tijdwaarden en concentratiewaarden. Voer het script uit om de parameter V af te drukken, het vereiste geroerde tankvolume.
3. Plan een lay-out voor het perfusiesysteem met twee spuitpompen en een platenschudder stroomopwaarts van de incubator.
4. Meet de RTD's van de componenten van het perfusiesysteem voorbij de stopkraan en voer signaalconvolutie van de RTD's uit met verschillende pulsduur en concentraties van geneesmiddelen om een geschikt farmacokinetisch profiel te vinden. Gebruik de fit roerde tank RTD-vergelijking in deze berekening.
5. Ga verder met de stappen 5.1-5.8 hierboven.
6. Gebruik een extra putplaat van de juiste grootte als de geroerde tank voor de opstelling. Elke put kan dienen als een geroerde tank voor één doordrenkte cultuur. Vul de put met het vereiste volume medium, V, en sluit de put met de naalden die in eerste instantie omhoog worden getrokken, vervolgens naar de bodem van de put worden geduwd en de naalden doppen.
7. Plaats de spuiten in de spuitpompen en sluit de slang van de spuiten snel aan op de afgedekte inlaatnaalden van de geroerde tanks. Sluit vervolgens de celcultuur stroomopwaartse buisinlaten aan op de uitlaatnaalden van de geroerde tanks.
8. Ga verder met stap 5.9-5.10.
9. Schakel op het gewenste tijdstip over op doseermedium 2 dat het geneesmiddel bevat, zoals beschreven in stap 5.11. Schakel terug naar medium 1 wanneer de infusie van het geneesmiddel is voltooid.
10. Ga verder met stap 5.12.

Figuur 3: De multi-head dispenser. Ontwerp voor de lasergesneden multi-head dispenser. Dit cijfer is aangepast van Erickson et ^al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Het perfusiesysteem met meerdere mediumbronnen uit sectie 5 van het protocol werd gebruikt om de expressiedynamiek te meten van een reportergen aangedreven door de nucleaire factor kappa-light-chain-enhancer van geactiveerde B-cellen (NF-κB) transcriptiefactor in menselijke embryonale nier 293 (HEK293) cellen in reactie op een 1,5 h puls van tumornecrosefactor alfa (TNF-α). HEK293-cellen werden stabiel getransduceerd met behulp van lentivirale vectoren met een genconstruct dat Gaussia luciferase (GLuc) bevat, aangedreven door een promotor genaamd NFKB die het NF-κB-responselement bevat om NFKB-GLuc HEK293-cellen te creëren, die werden gesorteerd via fluorescentie-geactiveerde cellensortering (FACS) om getransduceerde cellen te isoleren. Gesorteerde cellen werden gecryopreserveerd tot gebruik.

Voor elke geperfuseerde cultuur omvatte de perfusie-opstelling een stroomopwaartse sectie van 1 m buis die leidde tot een aangesloten 48-well plaat met de cellen, gevolgd door 1 m stroomafwaartse buizen die naar de multi-head fractiecollector leidden, met een stroomsnelheid van 0,5 ml / h (0,0083 ml / min). De RTD's van de 1 m buis alleen en van de volledige opstelling (1 m buis + 48-well plaat + 1 m buis) werden gemeten met behulp van een debiet van 0,5 ml / h met een puls van 20 minuten tracer. De achtergrondoplossing was gedeïoniseerd water, met een traceroplossing van blauwe voedselkleurstof verdund in gedeïoniseerd water, en fracties werden verzameld met een snelheid van 1 fractie / h met behulp van de multi-head dispenser. Tracerconcentraties in 100 μL-monsters van de fracties werden gemeten in een plaatlezer via absorptie bij 628 nm.

De tracerconcentratiegegevens werden verwerkt in MATLAB om RTD's voor beide opstellingen te produceren. Eerst werden de RTD's van de twee opstellingen berekend op basis van de gegevens met behulp van het RTD_from_Data.m script. De OTO-gegevenspunten van de buis van 1 m en de volledige opstelling zijn weergegeven in figuur 4.

Figuur 4: Verblijftijdverdelingen. (Links) OTO voor een buis van 1 m met een debiet van 0,5 ml/h (0,0083 ml/min). (Rechts) RTD van de volledige perfusieopstelling (buis van 1 m + 48 putplaat + buis van 1 m) bij een debiet van 0,5 ml/h. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De RTD van buizen alleen is goed passend bij de axiale dispersiefunctie, die te verwachten is op basis van bestaande literatuur¹³. Meerdere stukken buis in serie passen ook goed bij een enkel axiale dispersiemodel, en het toevoegen van de 48-well plaat in-line veroorzaakt een verwaarloosbare afwijking van dit model, dus de buis van 1 m alleen en de 1 m buis + 48-well plaat + 1 m buisopstelling werden elk verwacht goed te passen door een axiale dispersiemodel. Het is gebruikelijk dat slechte modelaanpassingen optreden wanneer de eerste gissingen voor de modelparameters te ver van hun werkelijke waarden liggen. Om dit aan te tonen, werd eerst het axiale dispersiemodel aangepast aan de 1 m buisgegevens met behulp van het Fit_RTD_Function.m script, met Pe = 10 en tau = 30 min als de eerste gissingen voor de functieparameters. Figuur 5 laat zien dat deze gissingen resulteerden in slecht passende modellen, uitgezet naast de RTD-gegevens. De schattingen werden gewijzigd in Pe = 10 en tau = 300 min, wat resulteerde in de goede modelaanpassingen in figuur 5, aangezien tau ongeveer gelijk zou moeten zijn aan het volume van het perfusiesysteem gedeeld door het volumetrische debiet. De fitparameters voor de buis van 1 m zijn Pe = 154,3, tau = 317,2 min, terwijl de parameters voor het hele systeem Pe = 396,5, tau = 596,5 min zijn.

Figuur 5: Voorbeelden van goede en slechte modelpassen voor een RTD. Een axiale dispersiemodel was geschikt voor de RTD-gegevens voor een buis van 1 m met een stroomsnelheid van 0,5 ml /h (0,0083 ml / min). (Links) De eerste schattingen voor de modelparameters die in het MATLAB-script werden ingevoerd, waren te ver verwijderd van hun werkelijke waarden, waardoor het script een slechte modelfit retourneerde. (Rechts) Betere parameterwaarden werden ingevoerd in het script, wat resulteerde in een goede model fit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Signaalconvolutie werd uitgevoerd met behulp van deze geschikte RTD-functies in het Signal_Convolution.m-script om te voorspellen hoe een 1,5 uur puls medium met 10 ng / ml TNF-α aan de inlaat van de stroomopwaartse buis zich door het systeem zou verspreiden. Het ingangssignaal werd eerst samengevoegd met de 1 m buis RTD om te bepalen welk TNF-α signaal de putplaat zou binnendringen. Het ingangssignaal werd ook samengevoegd met de RTD van de 1 m buis + 48-well plaat + 1 m buis om te bepalen wat het TNF-α signaal zou zijn aan de uitlaat van het systeem in de verzamelde fracties, waar het zal verschijnen naast de overeenkomstige GLuc-respons van de cellen. Figuur 6 toont de ingang TNF- α pulssignaal wordt weergegeven naast de voorspelde signalen bij de putinlaat en bij de systeemuitlaat.

Figuur 6: Voorspellen van TNF-α concentratiesignalen in het perfusiesysteem. TNF-α-bevattend medium werd gedurende de eerste 90 minuten van de operatie in het perfusiesysteem geïnfundeerd met 10 ng/ml, vertegenwoordigd door het blauwe rechthoekige signaal. (Links) Door het ingangssignaal op te lossen met het fit axiale dispersiemodel van de 1 m buis RTD, werd het TNF-α concentratiesignaal aan de inlaat naar de 48-well plaat voorspeld. (Rechts) Op dezelfde manier werd met behulp van het RTD-model voor het hele systeem het TNF-α signaal aan de uitgang van het systeem voorspeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

NFKB-GLuc HEK293-cellen werden ontdooid en verguld in een 48-well plaat op 1 x 10⁴ cellen / put in 0,4 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), en werden gedurende 1 dag geïncubeerd bij 37 ° C met 5% CO₂, waarna de stappen in sectie 5 van het bovenstaande protocol werden gevolgd om het perfusiesysteem op te zetten met een stopkraan voor meerdere mediumbronnen. Vier beken werden opgezet om vier putten te doorlaten. Eén meerkanaals spuitpomp werd geladen met vier volle spuiten van 60 ml met DMEM als medium 1. Een tweede spuitpomp werd geladen met spuiten van 5 ml met medium 2, waarvan er twee gewone DMEM als controle bevatten en twee DMEM met 10 ng / ml TNF-α als stimulus. Aan het begin van het experiment werden de spuiten van 5 ml met TNF-α of het controlemedium gedurende 1,5 uur bij 0,5 ml/u gedoseerd, waarna de stopkranen werden gewisseld en de 60 ml spuiten met DMEM gedurende de volgende 40 uur werden afgegeven. Na 24 uur en aan het einde van de perfusie werden de fracties uit de vier stromen, die in microcentrifugebuizen werden gedoseerd, geëtiketteerd en ingevroren bij -80 °C, en de fractiecollector werd gereset.

Na de perfusie werden alle monsters ontdooid en werden hun GLuc-concentraties gemeten met behulp van een bioluminescentietest, eerder beschreven^11,16. De luminescentiewaarden werden omgezet in luminescentie/h-snelheden door de luminescentie van elk fractiemonster te delen door de tijdsduur van die fractie, en werden uitgezet als een tijdreeks voor elk van de vier stromen. De tijd van elke GLuc-meting was het middelpunt van het tijdsinterval waarin die fractie werd verzameld, minus de gemiddelde verblijftijd (tau = 317 min) van de stroomafwaartse buis van het perfusiesysteem. Het TNF-α signaal waarvan voorspeld werd dat het zich in de fracties bevond, werd ook in de tijd verschoven door de gemiddelde verblijftijd van de stroomafwaartse buis en werd over de GLuc-gegevens gelegd, wat de stimulus-responsdynamiek NF-κB-gestuurde genexpressie onthulde, weergegeven in figuur 7.

Figuur 7: Stimulus-responsdynamiek gemeten met behulp van het perfusiesysteem. Het perfusiesysteem met twee mediumbronnen werd gebruikt om twee celculturen tijdelijk bloot te stellen aan een puls van TNF-α met twee onbelichte culturen als controles. De HEK293-cellen werden ontworpen om GLuc af te scheiden, aangedreven door een promotor die het NF-κB-responselement bevatte, dat werd verzameld in de effluentfracties. Het experiment onthult een dramatische expressietoename aangedreven door NF-κB na blootstelling aan TNF-α. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De aanwezigheid van geaccumuleerde GLuc in de culturen aan het begin van de perfusie veroorzaakte de schijnbare daling van het GLuc-signaal van de eerste naar de tweede fractie in alle vier de curven. Dit gemeenschappelijke artefact kan worden vermeden in het perfusiesysteem door het medium in de culturen te veranderen onmiddellijk voordat met perfusies wordt begonnen. De twee controleculturen die geen TNF-α, handhaafden een lage GLuc-secretiesnelheid die geleidelijk toenam gedurende de duur van het experiment. Dit resultaat kan de groei van de celpopulatie weerspiegelen. De gestimuleerde culturen hadden aanvankelijk dezelfde GLuc-secretiesnelheid als de controles en vervolgens dramatisch verhoogde secretie omdat NF-κB-gestuurde expressie wordt geactiveerd als reactie op een TNF-α puls. GLuc-secretie piekt ongeveer 9 uur na de eerste aankomst van de TNF-α, waarna deze afneemt met exponentieel verval.

Aanvullend bestand 1: CAD-bestand: Multi-head_Dispenser.DFX: Dit bestand bevat het model voor de multi-head dispenser die met een laser kan worden gesneden en kan worden gebruikt om fractiecollectoren te wijzigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: example_tracer_data.xlsx. Bevat voorbeeldonderzoeksgegevens van tracers die moeten worden gelezen door het MATLAB-script van RTD_from_Data.m. Kan ook worden gebruikt als sjabloon voor nieuwe gegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: MATLAB-bestand: RTD_from_Data Dit script leest tracerexperimentgegevens uit een .xlsx-bestand en retourneert t- en Et-vectoren die de RTD vertegenwoordigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: MATLAB-bestand: Fit_RTD_Function.m. Dit script laadt RTD-vectoren uit het RTD_from_Data.m-script en retourneert een geschikt model voor de RTD. Het type model wordt gekozen door de gebruiker. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: MATLAB-bestand: Signal_Convolution Dit script neemt een door de gebruiker gedefinieerd opgelost signaal en een RTD als ingangen en voorspelt hoe het signaal zal worden veranderd na het passeren van het stroomsysteem met die RTD. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: MATLAB-bestand: Stirred_Tank_Fit Dit script past een CSTR RTD-curve toe aan de farmacokinetische gegevensinvoer door de gebruiker en retourneert het tankvolume dat nodig is om de RTD voor het gegeven debiet te produceren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit werk beschrijft de assemblage en werking van een perfusiecelkweeksysteem met meerdere mediumbronnen aangetoond met een specifiek voorbeeld waarin de dynamiek van NF-κB-gedreven genexpressie als reactie op een voorbijgaande puls van TNF-α werd gemeten. De RTD's van de componenten van het perfusiesysteem werden gemeten en gemodelleerd, en signaalconvolutie werd gebruikt om zowel de blootstelling van de cellen aan de TNF-α-puls als de TNF-α-verdeling in de verzamelde effluentmediumfracties te voorspellen. De cellen werden blootgesteld aan de puls en fracties werden gedurende 40 uur verzameld, waarna de GLuc in de fracties werd gemeten en samen met het voorspelde TNF-α signaal werd uitgezet om de stimulatie-responsdynamiek te onthullen.

Deze perfusiemethode is niet zonder tekortkomingen. Met name brengt het systeem steriliteitsrisico's met zich mee vanwege de kritieke korte stap waarin de buis na installatie in de incubator op de putplaat wordt aangesloten. In de ervaring van de auteurs is besmetting vrij zeldzaam; niettemin kan het besmettingsrisico op de volgende manieren worden beperkt. De eerste is om alle celbehandelingsprocedures en steriele verbindingen in een bioveiligheidskast uit te voeren. Een extra voorzorgsmaatregel die kan worden overwogen om de steriliteit te verbeteren, is de opname van een spuitfilter van 0,22 μm in lijn bij de inlaat van de celculturen. Het gebruik van steriele filtratie zal bacteriën of grotere micro-organismen die in het medium aanwezig zijn vangen voordat ze de celcultuur binnendringen, hoewel het de drukvereisten verhoogt om de stroom te stimuleren en kan verstoppen als gevolg van vervuiling van het membraan. De uitgaande monsters worden ook verzameld in open omgevingen met het risico op besmetting. Verzameling van monsters in een behuizingssysteem, idealiter met luchtfiltratie, voor de fractioneringsmodule zou dit probleem in de toekomstige systeemopbouw elimineren.

Bovendien worden signalen die door cellen worden uitgescheiden, vervormd volgens de RTD van de stroomafwaartse buis voordat ze worden gefractioneerd en gemeten. Gemeten signalen zijn dus uitgesmeerde versies van die welke door cellen worden uitgescheiden. Theoretisch kan dit uitstrijkje ongedaan worden gemaakt door deconvolutie uit te voeren op het gemeten signaal om het effect van de downstream RTD¹⁴ te verwijderen, maar het is moeilijk om deze numerieke techniek met succes toe te passen op niet-ideologische gegevens naarmate signaalruis sterk wordt versterkt. Veel biologische dynamieken van belang ontvouwen zich echter op de tijdschaal van uren tot tientallen uren, en worden dus heel weinig beïnvloed door de smeereffecten van buisvormige RTD's, die in de tijd worden verschoven maar weinig van vorm veranderen. De hier getoonde OTO-meetmethode kan ook worden verbeterd door kortere tracerpulsen te gebruiken en achtergrondoplossingen en tracerstoffen te gebruiken die overeenkomen met die welke zullen worden gebruikt in celkweekexperimenten. Van de hier voorgestelde pulstijden is echter aangetoond dat ze identieke RTD's geven aan alle kortere pulstijden en daarom geschikt zijn voor RTD-metingen, maar naarmate de pulstijden toenemen, veranderen de RTD's significanter en mogen ze dus niet worden gebruikt. De auteurs hebben eerder ontdekt dat zowel voedselkleurstof als GLuc zeer vergelijkbare RTD's op elkaar hebben in zowel water- als kweekmedium¹¹, dus het is onwaarschijnlijk dat de moleculaire soort de RTD veel zal veranderen. Ten slotte werd geen verschil in RTD's waargenomen voor voedselkleurstof in water wanneer gemeten bij 20 °C vs. 37 °C, of in rechte buizen versus sterk opgerolde buizen¹¹. Deze gegevens, en OTO-gegevens voor een reeks geometrieën en stroomsnelheden van perfusiesystemen, zijn te vinden in de vorige publicatie¹¹ van de auteurs, samen met een gedetailleerde uitleg van de bewerkingen die door het RTD-analysescript in dit artikel worden uitgevoerd. Nadere bijzonderheden over OTO-analysetheorie¹³ en voorbeelden van toepassingen van OTO's op bioreactorsystemen 17,18,19,20,21 zijn te vinden in de verstrekte referenties.

Deze veelzijdige methode kan worden gebruikt om de secretie- of absorptiesnelheden van oplosbare stoffen in celculturen te meten, en voorbijgaande opgeloste signalen kunnen aan de culturen worden geleverd door stroomopwaartse mediumbronnen te schakelen. Eenvoudige signalen zoals opgeloste pulsen of stapwisselingen kunnen eenvoudig worden geleverd door de inlaatklep te schakelen. Farmacokinetisch-achtige signalen kunnen worden geproduceerd door een geroerde tank met het juiste vloeistofvolume in de lijn stroomopwaarts van de cultuur te plaatsen en er een opgeloste puls doorheen te leveren. Andere signalen kunnen worden gecreëerd door verschillende combinaties van pulsen, stapveranderingen en componenten met nieuwe RTD's toe te passen om de pulsen in gewenste vormen te vervormen. Bestaande statische celkweekmethoden zijn niet in staat om continu op geautomatiseerde wijze mediummonsters te verzamelen en kunnen niet worden gebruikt om cellen bloot te stellen aan soepel variërende opgeloste signalen. Microfluïdische systemen zijn duur en vereisen expertise, en er bestaan geen commercieel beschikbare macrofluïdische systemen voor deze klasse van experimenten. Het goedkope, eenvoudige systeem kan door laboratoria worden gebruikt om natuurlijk celgedrag, impulsreacties, de effecten van verschillende voorbijgaande opgeloste profielen die geneesmiddelen of endogene opgeloste signaaldynamiek kunnen nabootsen, te bestuderen en kan opnieuw worden geconfigureerd om te voldoen aan de behoeften van nieuwe experimenten. Toekomstige toepassingen van deze techniek en die momenteel aan de gang zijn, zijn onder meer: het meten van de secretiesnelheidsdynamiek van cytokines en exosomen uit een ex vivo celtherapie; het beoordelen van het effect van circadiane kloktijd op cellulaire respons op geneesmiddelen; het meten van de groeisnelheid en het metabolisme van bacteriële biofilms; het produceren van dosis-responscurven voor adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren in vitro; het meten van de dynamische productiesnelheid van lentivirale vectoren uit productiecellen; en het opnemen van farmacokinetische chemotherapie medicijnprofielen in gepersonaliseerde medicijnbiopten voor precisiekankertherapie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines	Grainger	5FVK2
293T Cells	ATCC	CRL-3216	HEK 293T cells used in the Representative Results experiment.
96-Well Clear Bottom Plates, Corning	VWR	89091-010	Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment.
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL	Fisher Scientific	14-829-45
BioFrac Fraction Collector	Bio-Rad	7410002	Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams.
Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8"	McMaster-Carr	4615T93	This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector.
Coelenterazine native	NanoLight Technology	303	Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results.
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells	Millipore Sigma	CLS3548	Used to grow and perfuse 293T cells in representative results.
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells	Fisher Scientific	720081	Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion.
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965126
Epilog Zing 24 Laser	Cutting Edge Systems	Epilog Zing 24	Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used.
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL	Fisher Scientific	14-955-460
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL	Fisher Scientific	14-955-461
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-129	Microcentrifuge tubes for collecting fractions.
Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End	Fisher Scientific	14-961-26	Glass tubes for collecting fractions.
Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered	Fisher Scientific	2707410	300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips.
Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	21600010	Phosphate buffered saline.
Labline 4625 Titer Shaker	Marshall Scientific	Labline 4625 Titer Shaker	Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK	Cole-Parmer	EW-30600-04	Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments.
Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK	Masterflex	UX-45501-28
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16"	Cole-Parmer	EW-45508-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID	Cole-Parmer	EW-45518-00
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK	Masterflex	EW-30800-30
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft	Masterflex	EW-96410-14
MATLAB	MathWorks	R2019b	Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work.
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump	New Era Pump Systems	NE-1600
Rack Set F1	Bio-Rad	7410010	Racks to hold collecting tubes in the fraction collector.
Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF	Bio-Techne	10291-TA-020	Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm	Saint Gobain	DX263015-50	Fits 48-well plates.
Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm	Saint Gobain	DX263027-10	Fits 12-well plates.
Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L	Spectrum Chemicals	S-395-1LT
SolidWorks	Dassault Systems	SolidWorks	CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file.
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0	Plate reader.
Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue	Michaels	10404779	Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm.