Summary
Denna uppsats presenterar en metod för att konstruera och driva ett billigt, flerkanaligt perfusionscellodlingssystem för att mäta dynamiken i utsöndring och absorptionshastigheter hos lösta ämnen i cellulära processer. Systemet kan också utsätta celler för dynamiska stimulansprofiler.
Abstract
Vissa cell- och vävnadsfunktioner fungerar inom den dynamiska tidsskalan på minuter till timmar som är dåligt upplösta av konventionella odlingssystem. Detta arbete har utvecklat ett billigt perfusionsbioreaktorsystem som gör att odlingsmediet kontinuerligt kan perfuseras i en cellodlingsmodul och fraktioneras i en nedströmsmodul för att mäta dynamik i denna skala. Systemet är konstruerat nästan helt av kommersiellt tillgängliga delar och kan parallelliseras för att utföra oberoende experiment i konventionella flerbrunnscellodlingsplattor samtidigt. Den här videoartikeln visar hur man monterar basinställningen, som endast kräver en enda flerkanalig sprutpump och en modifierad fraktionsuppsamlare för att genomsyra upp till sex kulturer parallellt. Användbara varianter på den modulära designen presenteras också som möjliggör kontrollerad stimuleringsdynamik, såsom lösta pulser eller farmakokinetiska profiler. Det är viktigt att när lösta signaler färdas genom systemet förvrängs de på grund av upplösningsdispersion. Vidare beskrivs en metod för att mäta uppehållstidsfördelningar (RTD) för komponenterna i perfusionsinställningen med ett spårämne med MATLAB. RTD-enheter är användbara för att beräkna hur lösta signaler förvrängs av flödet i flerfackssystemet. Detta system är mycket robust och reproducerbart, så grundforskare kan enkelt anta det utan behov av specialiserade tillverkningsanläggningar.
Introduction
Många viktiga biologiska processer förekommer i cell- och vävnadskulturer på tidsskalan minuter till timmar 1,2,3. Medan vissa av dessa fenomen kan observeras och registreras på ett automatiserat sätt med hjälp av time-lapse-mikroskopi4, bioluminescens1 eller andra metoder, utförs experiment som involverar insamling av odlingssupernatantprover för kemisk analys ofta manuellt i statiska cellkulturer. Manuell provtagning begränsar genomförbarheten av vissa studier på grund av besväret med frekventa provtagningstidpunkter eller efter arbetstid. Ytterligare brister i statiska odlingsmetoder inkluderar experiment som involverar kontrollerad, övergående exponering för kemiska stimuli. I statiska kulturer måste stimuli läggas till och tas bort manuellt, och stimulansprofiler är begränsade till stegförändringar över tiden, medan medelstora förändringar också lägger till och tar bort andra medelkomponenter, vilket kan påverka celler på ett okontrollerat sätt5. Fluidiska system kan övervinna dessa utmaningar, men befintliga enheter utgör andra utmaningar. Mikrofluidiska enheter har de oöverkomliga kostnaderna för specialutrustning och utbildning för att producera och använda, kräver mikroanalytiska metoder för att bearbeta prover och celler är svåra att återhämta sig från enheterna efter perfusion6. Få makrofluidiska system har skapats för de typer av experiment som beskrivs här 7,8,9,10, och de är byggda av flera anpassade delar tillverkade internt och kräver flera pumpar eller fraktioner. Dessutom är författarna inte medvetna om några kommersiellt tillgängliga makrofluidiska perfusionscellodlingssystem än omrörda tankbioreaktorer för suspensionskultur, som är användbara för biotillverkning, men som inte är utformade för modellering och studier av fysiologi.
Författarna har tidigare rapporterat om utformningen av ett billigt perfusionsbioreaktorsystem som nästan helt består av kommersiellt tillgängliga delar11. Basversionen av systemet gör det möjligt att hålla flera kulturer i en brunnsplatta i enCO2-inkubator och kontinuerligt perfuseras med medium från en sprutpump, medan avloppsvattenmediumströmmarna från kulturerna automatiskt fraktioneras i prover över tid med hjälp av en fraktionsuppsamlare med en anpassad modifiering. Således möjliggör detta system automatiserad provtagning av odlingsmedium supernatant och kontinuerlig löst inmatning till kulturerna över tiden. Systemet är makrofluidiskt och modulärt och kan enkelt modifieras för att möta behoven hos nya experimentdesigner.
Det övergripande målet med metoden som presenteras här är att konstruera, karakterisera och använda ett perfusionscellodlingssystem som möjliggör experiment där utsöndrings- eller absorptionshastigheterna för ämnen av celler över tid mäts och / eller celler utsätts för exakta, övergående lösta signaler. Den här videoartikeln förklarar hur man monterar basinställningen, som kan perfusera upp till sex cellkulturer samtidigt med en enda sprutpump och modifierad fraktionsuppsamlare. Två användbara varianter på bassystemet som använder ytterligare pumpar och delar för att möjliggöra experiment som utsätter celler för övergående koncentrationssignaler för lösta ämnen, inklusive korta pulser och farmakokinetiska profiler12, presenteras också, som visas i figur 1.
Figur 1: Tre variationer på perfusionssystemets design. (Mitten) Perfusionssystemet med en stoppkran för flera medelstora källor. (Nederst) Perfusionssystemet med en omrörd tank för att efterlikna en välblandad distributionsvolym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På grund av dispersion och diffusion i flödet blir de lösta signalerna förvrängda eller "utsmetade" när de färdas genom flödessystemet. Denna snedvridning kan kvantifieras genom användning av uppehållstidsfördelningar (FoTU)13. Den här artikeln förklarar hur man utför spårningsexperiment på komponenter i perfusionssystemet (figur 2) och tillhandahåller MATLAB-skript för att generera RTD-enheter från uppmätta data. En detaljerad förklaring av denna analys finns i författarnas tidigare artikel11. Ytterligare MATLAB-skript passar lämpliga funktioner till RTD-enheterna och extraherar fysiska parametrar och utför signalkonvolution med RTD-enheter för att förutsäga hur löst signalinmatning av användaren kommer att spridas och förvrängas genom perfusionssystemet14.
Figur 2: Fördelning av uppehållstid. RTD-enheterna för flödessystemkomponenter, såsom denna slanglängd, mäts genom att mata in en puls av spårämne till systemet och mäta hur det "smetar ut" när det går ut i de uppsamlade fraktionerna. Denna siffra har modifierats från Erickson et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbered delar för perfusion av brunnsplattor
- Förbered slangar
- Skär två längder silikonslang (1,6 mm innerdiameter) för varje cellodling som ska perfuseras. Se till att biten som används som uppströmsslang är tillräckligt lång för att nå från sprutpumpen till cellkulturen inuti inkubatorn, och att nedströmsbiten kan nå från cellodlingen till fraktionsuppsamlarens längsta utsträckta läge.
- Ge varje slangbit en unik etikett på båda ändarna med märkt tejp.
- Förbered proppar för brunnsplattan
- Skaffa en silikonpropp för varje brunn på brunnsplattan som ska perfuseras, med en lämplig diameter för att passa snyggt i brunnarna med en lufttät tätning.
- Skär av överflödigt material från proppens botten så att de passar in i brunnarna samtidigt som de lämnar utrymme inuti för luft över den avsedda vätskenivån.
- Tryck två trubbiga 18 G nålar genom varje propp, in i toppen och ut från botten för att fungera som inlopp och utlopp för flödet genom brunnen, diametralt motsatta varandra för att maximera avståndet mellan deras spetsar i brunnen.
- Justera nålarnas höjder i den pluggade brunnen, eftersom utloppsnålens höjd bestämmer den stabila höjden på vätskenivån i brunnen under perfusion.
OBS: Om perfusionen startas med utloppsnålen över vätskenivån, kommer vätskan att ackumuleras i brunnen tills nivån når nålen. Om perfusionen startas med utloppsnålen under vätskenivån kommer vätskenivån att förbli stabil om inte luftbubblor strömmar in i brunnen, vilket gör att vätskehöjden sänks tills den är lika hög som utloppsnålen.
- Samla ytterligare delar
- Skaffa en steril spruta för varje cellodling som ska perfuseras som är tillräckligt stor för att innehålla tillräckligt med medium för hela perfusionen, plus ytterligare en mängd medium för att initialt fylla slangen.
- För att varje kultur ska perfuseras, skaffa en kvinnlig-till-barb och två manliga-till-barb Luer-kontakter, samt två kvinnliga och två manliga Luer-kepsar.
- Rengör och sterilisera delar
- Om delar har använts tidigare, rengör dem genom att perfusera dem med 0,1 N NaOH, följt av en sköljning med avjoniserat vatten.
- Genom autoklavering eller på annat sätt, säkerställa steriliteten hos alla delar som anges ovan.
2. Laserskär flerhuvuddispensern och fäst den på en fraktionssamlare
- Återskapa modellen med flerhuvudsdispenser från figur 3 i ett datorstödt designprogram eller ladda ner den medföljande DXF-modellen (tilläggsfil 1).
- Använd en laserskärare för att skära designen från en 1/8 i akrylplåt.
- Ta bort de tre skruvarna som fäster utmatningshuvudet på fraktionsuppsamlarens rörliga bas.
- Rikta in de tre minsta hålen i flerhuvudsdispensern med skruvhålen i den rörliga basen och skruva tillbaka skruvarna genom hålen för att fästa.
- Justera tätheten på de tre skruvarna för att vinkla flerhuvuddispensern upp och ner tills raden med utmatningshål är i linje med uppsamlingsrören under den.
- Placera försiktigt 300 μL pipettspetsar genom önskade hål för att fungera som doseringsspetsar.
OBS: Fraktionsuppsamlaren kan användas utan flerhuvudsdispensern för att genomsyra en enda cellkultur.
3. Mät komponent-RTD-enheter och utför signalkonvolution
- Ställ in pumpar och sprutor för spårpuls enligt figur 2.
- Skaffa två enkanals- eller flerkanaliga sprutpumpar.
- Välj en bakgrundslösning för att representera mediet som kommer att användas i flödessystemet under cellodlingsexperiment. Se till att bakgrundslösningen har liknande massöverföringsegenskaper som mediet. I många fall är avjoniserat vatten ett lämpligt val.
- Välj ett spårämne för att representera det lösta ämnet som kommer att vara av intresse under cellodlingsexperiment. Se till att spårämnet har liknande massöverföringsegenskaper som det lösta ämnet av intresse, och dess koncentration måste kunna mätas. I många fall är matfärgämne ett lämpligt val.
- Lös upp spårämnet i bakgrundslösningen för att göra spårlösningen.
- Fyll en spruta med en bakgrundslösning och ladda den i en sprutpump. Fyll en annan spruta med spårlösning och ladda den i den andra sprutpumpen.
- Anslut båda sprutorna till två av de tre portarna på en fyrvägs stoppkran med Luer-kontakter.
- Stäng stoppkranen till bakgrundslösningen och pumpa spårlösningen i stoppkranen tills den börjar droppa ut den öppna porten. Stoppa pumpen och justera inte sprutan ytterligare.
OBS: Det är viktigt att sprutpumpens rörliga stång trycks upp mot sprutkolvarna innan de tidsinställda delarna av experimentet börjar. Detta gör att flödet kan börja omedelbart när pumpen startas. Annars kan pumpen startas, men flödet börjar faktiskt inte förrän den rörliga stången kommer ikapp kolvpositionen. - Stäng stoppkranen till spårlösningen och pumpa in bakgrundslösningen i stoppkranen tills all kvarvarande spårlösning har spolats ut ur den öppna porten. Stoppa pumpen och justera inte sprutan ytterligare.
- Ställ in flödessystemkomponenten av intresse och bråkuppsamlaren
- Ställ in den flödessystemkomponent som önskas för RTD-analys. Se till att komponenten som ska mätas slutar med en bit nedströms slang med lämplig längd och flexibilitet för att nå fraktionsuppsamlaren under drift.
- För in änden av nedströmsslangen i en pipettspetsdispenser i flerhuvudsdispensern så att den är tätt ansluten.
- Fäst den öppna porten på fyrvägsstoppkranen vid inloppet till den komponent som ska mätas. Pumpa bakgrundslösning genom komponenten tills den är helt fylld som den skulle vara under ett cellodlingsexperiment, och det börjar droppa ut ur fraktionsuppsamlarens doseringsspets. Stoppa pumpen.
- Injicera spårpuls, samla fraktioner och mät spårämne
- Ställ pumpen för spårlösningen på önskad flödeshastighet. Stäng stoppkranen till bakgrundslösningen och starta flödet av spårlösningen. Starta samtidigt fraktionssamlaren.
- Fortsätt flödet av spårlösning under en kort tidsperiod för att approximera en impulsinmatning av spårämnet. En pulsvaraktighet på 10 min visade sig fungera bra för RTD-enheter med en flödeshastighet på 1 ml/h.
OBS: Om spårpulsen är för kort kommer inte tillräckligt med spårämne att komma in i flödet för att vara mätbart. Om pulsen är för lång kommer den inte längre att approximera en impuls och kommer att ändra rtd-enhetens form. - I slutet av spårlösningspulsperioden, stoppa spårlösningspumpen. Stäng snabbt stoppkranen till spårlösningen och starta flödet av bakgrundslösningen med samma flödeshastighet.
- Låt bakgrundslösningen flöda och fraktioner samlas in tills alla spårämnen har passerat genom systemet och in i de uppsamlade fraktionerna.
- Stoppa systemet och mät spårämneskoncentrationen i fraktionerna. Inkludera endast fraktioner som delades ut helt. Om samlingen stoppas halvvägs genom insamlingen av ett bråk ska du inte inkludera det bråket.
- Beräkna uppehållstidsfördelningen (RTD) från uppmätta data i MATLAB
OBS: En skriftlig förklaring av analysen som utförs av detta MATLAB-skript finns i författarnas tidigare publikation11, och diskussioner om teorin är allmänt tillgängliga i litteratur13.- Skapa en .xlsx fil som innehåller koncentrationsdata i formatet för example_tracer_data.xlsx kalkylbladet i tilläggsfil 2. Ange spårämnets koncentrationsvärden i fraktionerna (eventuella enheter) i kronologisk ordning från vänster till höger på rad 2. Ange den tid som gått från pulsens början till slutet av den sista fraktionen i cell A5 och ange längden på spårpulsen i minuter i cell A8.
- Spara den .xlsx filen i MATLAB-katalogen.
- Öppna skriptet RTD_From_Data.m, från tilläggsfil 3, i MATLAB-redigeraren.
- Ersätt namnet på den .xlsx filen inom parentes på den första raden i avsnittet Läs in data i skriptet med namnet på den nya .xlsx datafilen, enligt anvisningarna i skriptfilen. Kör skriptet.
- Se till att skriptet framgångsrikt utför RTD-analys13, vilket ger ett diagram över FOTU-skivan och returnerar värdet för den numeriska integralen över RTD-enheten som är lika med 1. Hitta tidsvektorn (t) och tillhörande RTD-värden vektor (Et) som sparats av skriptet i MATLAB-katalogen.
- Anpassa en modellfunktion till RTD-enheten i MATLAB
- Öppna skriptet Fit_RTD_Function.m i MATLAB-redigeraren från tilläggsfil 4.
- Välj en av de tre kommenterade modellfunktionerna som passar rtd-enheten: axiell dispersionsmodell13, som passar RTD-enheter för laminärt flöde i cylindriska rör; CSTR-modellen13, som passar välrörda tankar; och n-CSTR modell15, som ungefär passar större brunnsplattor. Om du vill passa en annan modell som inte ingår här lägger du till den i skriptet i samma format.
- Ta bort kommentarerna i avsnittet i skriptet som innehåller den modell som valts för anpassning.
- Ändra värdena för de ursprungliga gissningarna för parametrarna till de som är lämpliga för RTD- enheten.
- Kör skriptet för att skapa ett diagram över funktionen fit som är överlagrad på RTD-data och för att skriva ut fit-parametervärdena för funktionen. Om passningen är mycket dålig eller fel uppstår ändrar du parameterns initiala gissningar och kör skriptet igen.
- Utför signalkonvolution i MATLAB
- Välj antingen en signal och en RTD eller två RTD-enheter som ska växlas.
- Öppna skriptet Signal_Convolution.m, från Tilläggsfil 5, i MATLAB-redigeraren.
- För var och en av de två signaler som ska vara invecklade (dvs. en signal och en RTD, eller två RTD), definiera en vektor med jämnt fördelade tidpunkter i de önskade enheterna och en motsvarande vektor av signalvärden vid dessa tidpunkter.
OBS: Vektorerna för de två signalerna måste ha samma antal element och samma storlek tidssteg. Det är därför det är användbart att ha RTD som en kontinuerlig funktion som kan samplas för ett godtyckligt antal punkter när som helst tidsintervall. - Ange de två signalerna i MATLAB och kör skriptet för att få utsignalens tid och signalvektorer.
4. Ställ in det grundläggande perfusionssystemet med celler i en brunnsplatta
- Förbered brunnsplattan
- Se till att brunnsplattkulturen har lämpligt medeldjup för perfusionsexperimentet. Utför eventuella slutliga mediumförändringar, stimuleringar eller andra steg efter önskemål innan du börjar perfusion. Om suspensionsceller perfuseras, centrifugera plattan för att säkerställa att de är på botten.
- Under sterila förhållanden, sätt in propparna med nålar i brunnsplattkulturerna med nålarna uppdragna. När proppen är på plats, sänk nålarna till önskad höjd för perfusion, eftersom utloppsnålens höjd bestämmer den stabila vätskenivån.
- Täck nålarna med manliga Luer-lock och håll hela brunnplattan i en inkubator tills den används.
- Förbered sprutorna och uppströms slangen
- Under sterila förhållanden fyller du en spruta för varje kultur som ska perfuseras med tillräckligt med medium under önskad varaktighet av perfusionen, plus tillräckligt med ytterligare medium för att fylla uppströms slangen.
- Fäst uppströmsslangen på sprutan med en Luer-kontakt från hona till barb. I den andra änden av röret sätter du in en Hane-till-barb Luer-kontakt.
- Fördela mediet från sprutan tills uppströmsröret är helt fyllt med medium.
- Täck den öppna änden av röret med en kvinnlig Luer-keps.
OBS: Alla replikatsprutor måste ha exakt samma volym vid denna tidpunkt. Om deras volymer inte är lika, kommer deras kolvar att vara i olika positioner, och de passar inte alla bra in i en enda flerkanalig sprutpump.
- Under sterila förhållanden sätter du in en Luer-kontakt från hane till barb i ena änden av nedströms slangen och täcker den med ett kvinnligt Luer-lock.
- Ta försiktigt med alla förberedda slangar, sprutor och brunnsplattan till inkubatorn som ska användas för perfusion.
- Placera sprutpumpen och fraktionsuppsamlaren på önskade platser nära inkubatorn. Placera sprutpumpen ovanpå eller nära inkubatorn och placera fraktionsuppsamlaren bredvid inkubatorn, nära porten.
- Bunta ihop de täckta ändarna på alla uppströms och nedströms rör och skjut dem från utsidan av inkubatorn till insidan genom porten.
- Fyll in sprutorna i sprutpumpen och sätt in de öppna ändarna av nedströmsrören i doseringspipettspetsarna på flerhuvudsdispensern på fraktionsuppsamlaren.
- Inuti inkubatorn, dra så mycket slack av uppströmsrören som möjligt in i inkubatorn för att maximera längden på slangen genom vilken det strömmande mediet kan ta emot värme och CO2 från inkubatorluften. Medan du håller dessa på plats, dra nedströms rören ur inkubatorn, precis tillräckligt så att de kan nå den längsta utsträckta punkten på fraktionsuppsamlaren samtidigt som de behåller de täckta ändarna inuti inkubatorn.
- För varje pluggad brunn, lossa snabbt nålarna och uppströms- och nedströmsrören för den brunnen och fäst dem tillsammans med deras Luer-kontakter.
- När alla delar är anslutna, kör sprutpumpen kort med relativt hög hastighet för att säkerställa att alla strömmar flyter ordentligt.
- Vid denna tidpunkt, om det är önskvärt att börja experimentet med nedströmsrören fulla av mediet, fortsätt att köra pumpen tills alla är fyllda. Annars stoppar du pumpen.
- Ställ in sprutpumpens flödeshastighet och frekvensen för fraktionsuppsamling och starta båda maskinerna samtidigt för att påbörja experimentet. Samla in fraktioner för önskad experimentvaraktighet.
5. Ställ in perfusionssystemet med en stoppkran för flera medelstora källor
- Utför alla delsteg i steg 4.1 ovan.
- Förbered de två medierna som ska användas i perfusionen och märk mediet som kommer att dispenseras först som 1 och det andra som medium 2.
- För att varje kultur ska perfuseras, fyll en spruta med tillräckligt med medium 1 under hela dess dosering, plus tillräckligt med volym för att initialt fylla perfusionssystemet. Fyll en andra spruta med tillräckligt medium 2 under hela dispenseringsperioden.
- Anslut båda sprutorna till två av de tre portarna på en fyrvägs stoppkran.
OBS: En slanglängd för att ansluta sprutorna till stoppkranarna kan krävas. - Förbered stoppkranen och sprutorna på ett liknande sätt som steg 3.1.7-3.1.8 ovan genom att stänga stoppkranen till medium 1 och fördela medium 2 i stoppkranen tills den bara börjar droppa ut den öppna porten.
- Stäng stoppkranen till medium 2 och släpp ut medium 1 i stoppkranen tills allt kvarvarande medium 2 har spolats ut ur den öppna porten.
- Fäst uppströms slangen på den öppna stoppkransporten med en Luer-kontakt från hona till barb. I den andra änden av röret sätter du in en Hane-till-barb Luer-kontakt.
- Fördela medium 1 från sprutan tills uppströmsröret är helt fyllt med medium.
- Fortsätt med steg 4.3-4.11 ovan, fyll båda sprutorna i separata sprutpumpar och späd endast medium 1.
- Ställ in sprutpumpens flödeshastighet för medium 1 och frekvensen för fraktionsuppsamling och starta båda maskinerna samtidigt för att påbörja experimentet.
- När mediumkällan ska bytas, stoppa snabbt sprutpumpen för medium 1, vrid stoppkranen stängd till medium 1 och starta sprutpumpen för medium 2. Om så önskas senare, byt tillbaka källan till medium 1 på ett liknande sätt.
- Samla in fraktioner för önskad experimentvaraktighet.
6. Ställ in perfusionssystemet med en omrörd tank för att efterlikna farmakokinetiken
- Få farmakokinetiska data för läkemedlet av intresse och se till att det består av en koncentrationstopp följt av ett exponentiellt sönderfall.
- När du har ställt in toppen till tid 0 och tagit bort datapunkter före toppen använder du skriptet Stirred_Tank_Fit.m (Tilläggsfil 6) för att anpassa RTD-ekvationen för omrörd tank till data. Indata v (önskad perfusionsflödeshastighet) och de data som ska passas som ett par vektorer direkt i skriptet, tillsammans med t och C för tidsvärden respektive koncentrationsvärden. Kör skriptet för att skriva ut parametern V, som är den önskade omrörda tankvolymen.
- Planera en layout för perfusionssystemet så att det inkluderar två sprutpumpar och en plattskakapparat uppströms inkubatorn.
- Mät RTD-enheterna för perfusionssystemets komponenter bortom stoppkranen och utför signalkonvolution av RTD-enheterna med olika läkemedelspulslängder och koncentrationer för att hitta en lämplig farmakokinetisk profil. Använd RTD-ekvationen för omrörd tank i denna beräkning.
- Fortsätt med steg 5.1-5.8 ovan.
- Använd en extra brunnsplatta av lämplig storlek som den omrörda tanken för installationen. Varje brunn kan fungera som en omrörd tank för en perfuserad kultur. Fyll brunnen med önskad volym medium, V, och anslut brunnen med nålarna som ursprungligen drogs upp, trycks sedan till botten av brunnen och täcker nålarna.
- Fyll in sprutorna i sprutpumparna och anslut snabbt slangen från sprutorna till de omrörda tankarnas täckta inloppsnålar. Anslut sedan cellodlingen uppströms rörinlopp till utloppsnålarna på de omrörda tankarna.
- Fortsätt med steg 5.9-5.10.
- Vid önskad tidpunkt, byt till doseringsmedium 2 innehållande läkemedlet, som beskrivs i steg 5.11. Byt tillbaka till medium 1 när läkemedelsinfusionen är klar.
- Fortsätt med steg 5.12.
Figur 3: Dispensern med flera huvuden. Design för den laserskurna flerhuvuddispensern. Denna siffra har modifierats från Erickson et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Perfusionssystemet med flera medelkällor från avsnitt 5 i protokollet användes för att mäta uttrycksdynamiken hos en reportergen som drivs av kärnfaktorn kappa-light-chain-enhancer av aktiverade B-celler (NF-κB) transkriptionsfaktor i human embryonala njure 293 (HEK293) celler som svar på en 1,5 h puls av tumörnekrosfaktor alfa (TNF-α). HEK293-celler transducerades stabilt med hjälp av lentivirala vektorer med en genkonstruktion innehållande Gaussia luciferas (GLuc), driven av en promotor som kallas NFKB som innehåller NF-κB-svarselementet för att skapa NFKB-GLuc HEK293-celler, som sorterades via fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera transducerade celler. Sorterade celler var kryokonserverade tills de användes.
För varje perfuserad kultur inkluderade perfusionsinställningen en uppströms sektion med 1 m slang som ledde till en pluggad 48-brunnsplatta som innehöll cellerna, följt av 1 m nedströms slang som leder till flerhuvudfraktionsuppsamlaren, med en flödeshastighet på 0,5 ml / h (0,0083 ml / min). RTD-enheterna för enbart 1 m-slangen och för hela installationen (1 m rör + 48-brunnsplatta + 1 m rör) mättes med en flödeshastighet på 0,5 ml/h med en 20 minuters puls av spårämne. Bakgrundslösningen var avjoniserat vatten, med en spårlösning av blått livsmedelsfärgämne utspätt i avjoniserat vatten, och fraktioner samlades upp med en hastighet av 1 fraktion/h med användning av flerhuvuddispensern. Spårämneskoncentrationer i 100 μL prover av fraktionerna mättes i en plattläsare via absorbans vid 628 nm.
Spårkoncentrationsdata bearbetades i MATLAB för att producera RTD-enheter för båda installationerna. Först beräknades RTD-enheterna för de två installationerna från data med hjälp av skriptet RTD_from_Data.m. RTD-datapunkterna för 1 m-röret och den fullständiga inställningen visas i figur 4.
Figur 4: Uppehållstidsfördelningar (vänster) RTD för ett 1 m rör med en flödeshastighet på 0,5 ml/h (0,0083 ml/min). (Höger) RTD för hela perfusionsinställningen (1 m rör + 48-brunnsplatta + 1 m rör) med en flödeshastighet på 0,5 ml / h. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Enbart RTD-enheten för slangar passar bra av den axiella dispersionsfunktionen, vilket kan förväntas baserat på befintlig litteratur13. Flera delar av slangar i serie passar också bra av en enda axiell dispersionsmodell, och att lägga till 48-brunnsplattan in-line orsakar försumbar avvikelse från denna modell, så 1 m rör ensam och 1 m rör + 48-brunnsplatta + 1 m rörinställning förväntades var och en passa bra av en axiell dispersionsmodell. Det är vanligt att dåliga modellpassningar uppstår när de första gissningarna för modellparametrarna är för långt ifrån deras faktiska värden. För att demonstrera detta passades först den axiella dispersionsmodellen till 1 m rördata med hjälp av Fit_RTD_Function.m-skriptet, med Pe = 10 och tau = 30 min som de första gissningarna för funktionsparametrarna. Figur 5 visar att dessa gissningar resulterade i dåligt passande modeller, ritade tillsammans med FoTU-data. Gissningarna ändrades till Pe = 10 och tau = 300 min, vilket resulterade i de goda modellpassningarna som visas i figur 5, eftersom tau bör vara ungefär lika med perfusionssystemets volym dividerat med dess volymetriska flödeshastighet. Passningsparametrarna för 1 m-röret är Pe = 154,3, tau = 317,2 min, medan parametrarna för hela systemet är Pe = 396,5, tau = 596,5 min.
Figur 5: Exempel på bra och dålig modell som passar för en RTD-enhet. En axiell dispersionsmodell anpassades till RTD-data för ett 1 m rör med en flödeshastighet på 0,5 ml/h (0,0083 ml/min). (Vänster) De första gissningarna för modellparametrarnas indata till MATLAB-skriptet var för långt ifrån deras sanna värden, vilket gjorde att skriptet returnerade en dålig modellpassning. (Höger) Bättre parametervärden inmatades till skriptet, vilket resulterade i en bra modellpassning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Signalkonvolution utfördes med hjälp av dessa passande RTD-funktioner i Signal_Convolution.m-skriptet för att förutsäga hur en 1,5-timmars puls av medium innehållande 10 ng / ml TNF-α vid inloppet till uppströms slangen skulle spridas genom systemet. Insignalen var först konvolerad med RTD-enheten på 1 m slang för att bestämma vilken TNF-α signal som skulle komma in i brunnsplattan. Insignalen var också konvolverad med RTD för 1 m-röret + 48-brunnsplattan + 1 m-röret för att bestämma vad TNF-α-signalen skulle vara vid systemets utlopp i de uppsamlade fraktionerna, där den kommer att visas tillsammans med motsvarande GLuc-svar från cellerna. Figur 6 visar ingångs-TNF- α pulssignal visas tillsammans med de förutsagda signalerna vid brunnsinloppet och vid systemuttaget.
Figur 6: Förutsäga TNF-α koncentrationssignaler i perfusionssystemet. TNF-α-innehållande medium infunderades i perfusionssystemet vid 10 ng / ml under de första 90 minuters drift, representerad av den blå rektangulära signalen. (Vänster) Genom att konvolvera insignalen med den passande axiella dispersionsmodellen för RTD-enheten med 1 m rör förutspåddes TNF-α koncentrationssignalen vid inloppet till 48-brunnsplattan. (Höger) På samma sätt förutspåddes TNF-α signalen vid systemets utlopp med hjälp av RTD-modellen för hela systemet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
NFKB-GLuc HEK293-celler tinades och pläterades i en 48-brunnsplatta vid 1 x 104 celler/brunn i 0,4 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och inkuberades i 1 dag vid 37 °C med 5% CO2, varefter stegen i avsnitt 5 i protokollet ovan följdes för att ställa in perfusionssystemet med en stoppkran för flera medelstora källor. Fyra bäckar sattes upp för att genomsyra fyra brunnar. En flerkanalig sprutpump laddades med fyra fulla 60 ml sprutor innehållande DMEM som medium 1. En andra sprutpump laddades med 5 ml sprutor innehållande medium 2, varav två innehöll vanlig DMEM som kontroll och två innehållande DMEM med 10 ng/ml TNF-α som stimulans. I början av experimentet doserades 5 ml sprutor innehållande TNF-α eller kontrollmediet vid 0,5 ml/h i 1,5 timmar, varefter stoppkranarna byttes och 60 ml sprutor innehållande DMEM dispenserades under de kommande 40 timmarna. Vid 24 timmar och i slutet av perfusionen märktes fraktionerna från de fyra strömmarna, som dispenserades i mikrocentrifugrör, och frystes vid -80 ° C och fraktionsuppsamlaren återställdes.
Efter perfusionen tinades alla prover och deras GLuc-koncentrationer mättes med hjälp av en bioluminescensanalys, som tidigare beskrivits11,16. Luminiscensvärdena omvandlades till luminiscens/h-hastigheter genom att dividera luminescensen för varje fraktionsprov med tidslängden för den fraktionen och plottades som en tidsserie för var och en av de fyra strömmarna. Tiden för varje GLuc-mätning var mittpunkten för det tidsintervall under vilket den fraktionen samlades in, minus den genomsnittliga uppehållstiden (tau = 317 min) för perfusionssystemets nedströms slang. TNF-α signalen som förutspåddes finnas inom fraktionerna förskjuts också i tid med den genomsnittliga uppehållstiden för nedströms slangen och överlagrades på GLuc-data, vilket avslöjade stimulans-responsdynamiken NF-κB-driven genuttryck, som visas i figur 7.
Figur 7: Stimulus-responsdynamik mätt med hjälp av perfusionssystemet. Perfusionssystemet med två mediumkällor användes för att övergående utsätta två cellkulturer för en puls av TNF-α med två oexponerade kulturer som kontroller. HEK293-cellerna konstruerades för att utsöndra GLuc som drivs av en promotor som innehåller NF-κB-svarselementet, som samlades in i avloppsfraktionerna. Experimentet avslöjar en dramatisk uttrycksökning som drivs av NF-κB efter TNF-α exponering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Närvaron av ackumulerad GLuc i kulturerna i början av perfusionen orsakade den uppenbara nedgången i GLuc-signalen från den första till den andra fraktionen i alla fyra kurvorna. Denna vanliga artefakt kan undvikas i perfusionssystemet genom att ändra mediet i kulturerna omedelbart innan perfusioner påbörjas. De två kontrollkulturer som inte fick TNF-α upprätthöll en låg GLuc-utsöndringshastighet som gradvis ökade under experimentets varaktighet. Detta resultat kan återspegla tillväxten av cellpopulationen. De stimulerade kulturerna hade initialt samma GLuc-utsöndringshastighet som kontrollerna och ökade sedan dramatiskt utsöndringen när NF-κB-drivet uttryck aktiveras som svar på en TNF-α puls. GLuc-utsöndringen toppar ungefär 9 timmar efter den första ankomsten av TNF-α, varefter den minskar med exponentiellt sönderfall.
Kompletterande fil 1: CAD-fil: Multi-head_Dispenser.DFX: Den här filen innehåller modellen för flerhuvuddispensern som kan laserskäras och användas för att modifiera fraktionssamlare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: example_tracer_data.xlsx. Innehåller exempel på spårningsexperimentdata som ska läsas av matlab-skriptet RTD_from_Data.m. Kan också användas som mall för nya data. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3: MATLAB-fil: RTD_from_Data Det här skriptet läser spårningsexperimentdata från en .xlsx fil och returnerar t- och Et-vektorer som representerar RTD-enheten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: MATLAB-fil: Fit_RTD_Function Det här skriptet läser in RTD-vektorer från RTD_from_Data.m-skriptet och returnerar en passande modell för RTD-enheten. Typ av modell väljs av användaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: MATLAB-fil: Signal_Convolution Detta skript tar en användardefinierad löst signal och en RTD som ingångar och förutsäger hur signalen kommer att ändras efter att ha passerat genom flödessystemet med den RTD-enheten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 6: MATLAB-fil: Stirred_Tank_Fit Detta skript passar en CSTR RTD-kurva till farmakokinetiska data som matas in av användaren och returnerar den tankvolym som krävs för att producera RTD för den givna flödeshastigheten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta arbete beskriver sammansättning och drift av ett perfusionscellodlingssystem med flera mediumkällor demonstrerade med ett specifikt exempel där dynamiken i NF-κB-driven genuttryck som svar på en övergående puls av TNF-α mättes. RTD-enheterna för perfusionssystemets komponenter mättes och modellerades, och signalkonvolution användes för att förutsäga både cellernas exponering för TNF-α pulsen och TNF-α fördelning i de uppsamlade avloppsmediumfraktionerna. Cellerna exponerades för pulsen och fraktioner samlades in i 40 timmar, varefter GLuc mättes i fraktionerna och plottades tillsammans med den förutsagda TNF-α-signalen för att avslöja stimulerings-responsdynamiken.
Denna perfusionsmetod är inte utan brister. Noterbart är att systemet medför sterilitetsrisk på grund av det kritiska korta steget där slangen är ansluten till brunnsplattan efter installation i inkubatorn. Enligt författarnas erfarenhet är förorening ganska sällsynt; Ändå kan föroreningsrisken mildras på följande sätt. Den första är att utföra alla cellhanteringsprocedurer och sterila anslutningar i ett biosäkerhetsskåp. En ytterligare försiktighetsåtgärd som kan övervägas för att förbättra steriliteten är införandet av ett 0,22 μm sprutfilter in-line vid cellkulturernas inlopp. Användningen av steril filtrering kommer att fånga bakterier eller större mikroorganismer som finns i mediet innan de kommer in i cellkulturen, även om det ökar tryckkraven för att driva flöde och kan täppa till på grund av nedsmutsning av membranet. De utgående proverna samlas också in i öppna miljöer med risk för kontaminering. Insamling av prover i ett kapslingssystem, helst med luftfiltrering, för fraktioneringsmodulen skulle eliminera detta problem i framtida systembyggnader.
Dessutom förvrängs signaler som utsöndras av celler enligt RTD-enheten i nedströms slangen innan de fraktioneras och mäts. Således är uppmätta signaler utsmyckade versioner av de som utsöndras av celler. Teoretiskt sett kan denna utsmetning ångras genom att utföra dekonvolution på den uppmätta signalen för att avlägsna effekten av rtd14 nedströms, men det är svårt att tillämpa denna numeriska teknik framgångsrikt på icke-relevanta data eftersom signalbruset förstärks kraftigt. Men många biologiska dynamiker av intresse utvecklas på tidsskalan för timmar till tiotals timmar, och påverkas därför mycket lite av de utsmetande effekterna av slangar RTD, som förskjuts i tid men ändras lite i form. Den FoTU-mätmetod som visas här kan också förbättras genom att använda kortare spårpulser och använda bakgrundslösningar och spårämnen som matchar dem som kommer att användas i cellodlingsexperiment. De pulstider som föreslås här har dock visat sig ge identiska RTD-enheter till alla kortare pulstider och är därför lämpliga för RTD-mätningar, men när pulstiderna ökas förändras RTD-enheterna mer signifikant och bör därför inte användas. Författarna har tidigare funnit att både matfärg och GLuc har mycket liknande RTD-enheter som varandra i både vatten- och odlingsmedium11, så det är osannolikt att den molekylära arten kommer att förändra RTD-enheten mycket. Slutligen observerades ingen skillnad i RTD-färg för livsmedelsfärgämne i vatten när det mättes vid 20 °C jämfört med 37 °C, eller i raka slangar jämfört med högrullade slangar11. Dessa data, och FoTU-data för en rad perfusionssystemgeometrier och flödeshastigheter, finns i författarnas tidigare publikation11, tillsammans med en detaljerad förklaring av de operationer som utförs av RTD-analysskriptet i detta dokument. Mer information om FoTU-analysteori13 och exempel på tillämpningar av FoTU på bioreaktorsystem 17,18,19,20,21 finns i de angivna referenserna.
Denna mångsidiga metod kan användas för att mäta utsöndrings- eller absorptionshastigheterna för lösliga ämnen i cellkulturer, och övergående lösta signaler kan levereras till kulturerna genom att byta uppströms mediumkällor. Enkla signaler som lösta pulser eller stegbyten kan levereras helt enkelt genom att byta inloppsventil. Farmakokinetiska signaler kan produceras genom att placera en omrörd tank med lämplig vätskevolym i linje uppströms kulturen och leverera en löst puls genom den. Andra signaler kan skapas genom att använda olika kombinationer av pulser, stegförändringar och komponenter med nya RTD-enheter för att förvränga pulserna till önskade former. Befintliga statiska cellodlingsmetoder kan inte kontinuerligt samla in medelstora prover på ett automatiserat sätt och kan inte användas för att utsätta celler för smidigt varierande lösta signaler. Mikrofluidiska system är dyra och kräver expertis, och det finns inga kommersiellt tillgängliga makrofluidiska system för denna klass av experiment. Det billiga, enkla systemet kan antas av laboratorier för att studera naturligt cellbeteende, impulssvar, effekterna av olika övergående lösta profiler som kan efterlikna läkemedel eller endogen löst signaldynamik och kan omkonfigureras för att möta behoven hos nya experiment. Framtida tillämpningar av denna teknik och de som för närvarande pågår inkluderar: mätning av utsöndringshastighetsdynamiken hos cytokiner och exosomer från en ex vivo-cellterapi ; bedöma effekten av cirkadisk klocktid på cellulärt svar på läkemedel; mätning av tillväxthastigheten och metabolismen av bakteriella biofilmer; producera dos-responskurvor för adenoassocierade virusvektorer (AAV) in vitro; mätning av den dynamiska produktionshastigheten för lentivirala vektorer från producentceller, och införliva farmakokinetiska kemoterapiläkemedelsprofiler i personliga medicinbiopsier för precisionscancerbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna forskning genomfördes med stöd under Grant Nos. R01EB012521, R01EB028782 och T32 GM008339 från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 Gauge 1 1/2- in Disposable Probe Needle For Use With Syringes and Dispensing Machines | Grainger | 5FVK2 | |
| 293T Cells | ATCC | CRL-3216 | HEK 293T cells used in the Representative Results experiment. |
| 96-Well Clear Bottom Plates, Corning | VWR | 89091-010 | Plates for measuring dye concentrations in RTD experiments and GLuc in representative results experiment. |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Fraction collector that can be used for a single stream, or modified using our method to enable collection from multiple streams. |
| Clear High-Strength UV-Resistant Acrylic 12" x 12" x 1/8" | McMaster-Carr | 4615T93 | This sheet is cut using a laser cutter according to the DXF file in the supplemental materials to produce the multi-head dispenser that can be attached to the BioFrac fraction collector. |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate used in Gaussia luciferase bioluminescence assay in representative results. |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, size 48 wells, polystyrene plate, flat bottom wells | Millipore Sigma | CLS3548 | Used to grow and perfuse 293T cells in representative results. |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, size 12 wells | Fisher Scientific | 720081 | Can be plugged and used as a stirred tank to produce pharmacokinetic profiles in perfusion. Can also contain cells for perfusion. |
| DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 11965126 | |
| Epilog Zing 24 Laser | Cutting Edge Systems | Epilog Zing 24 | Laser cutter used to produce multi-head dispenser from acrylic sheet. Other laser cutters may be used. |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use, Luer-Lock, 60 mL | Fisher Scientific | 14-955-461 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | Microcentrifuge tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand Round Bottom Disposable Borosilicate Glass Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-26 | Glass tubes for collecting fractions. |
| Fisherbrand SureOne Micropoint Pipette Tips, Universal Fit, Non-Filtered | Fisher Scientific | 2707410 | 300 ul pipette tips that best fit the multi-head dispenser and tubing to act as dispensing tips. |
| Gibco DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 21600010 | Phosphate buffered saline. |
| Labline 4625 Titer Shaker | Marshall Scientific | Labline 4625 Titer Shaker | Orbital shaker used to keep stirred tanks mixed. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile; 10/PK | Cole-Parmer | EW-30600-04 | Used to join multiple inlet streams for RTD experiments and cell culture experiments. |
| Masterflex Fitting, Polycarbonate, Straight, Female Luer x Cap; 25/PK | Masterflex | UX-45501-28 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hosebarb Adapters, 1/16" | Cole-Parmer | EW-45508-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Hosebarb Adapter, 1/16" ID | Cole-Parmer | EW-45518-00 | |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer Lock to Plug Adapter; 25/PK | Masterflex | EW-30800-30 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 14; 25 ft | Masterflex | EW-96410-14 | |
| MATLAB | MathWorks | R2019b | Version R2019b. Newer versions may also be used. Some older versions may work. |
| NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1600 | |
| Rack Set F1 | Bio-Rad | 7410010 | Racks to hold collecting tubes in the fraction collector. |
| Recombinant Human TNF-alpha (HEK293-expressed) Protein, CF | Bio-Techne | 10291-TA-020 | Cytokine used to stimulate 293T cells in representative results. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 00, Bottom 10.5mm | Saint Gobain | DX263015-50 | Fits 48-well plates. |
| Saint Gobain Solid Stoppers, Versilic Silicone, Size: 4 Bottom 21mm | Saint Gobain | DX263027-10 | Fits 12-well plates. |
| Sodium Hydroxide, 10.0 N Aqueous Solution APHA; 1 L | Spectrum Chemicals | S-395-1LT | |
| SolidWorks | Dassault Systems | SolidWorks | CAD software used to create the multi-head dispenser DXF file. |
| Varioskan LUX multimode microplate reader | ThermoFisher Scientific | VL0000D0 | Plate reader. |
| Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue | Michaels | 10404779 | Blue food dye containing Brilliant Blue FCF, used as a tracer in RTD experiments. Absorbance spectrum peaks at 628 nm. |
References
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).
- Talaei, K., et al. A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153 (2021).
- Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume. FASEB Journal. 35 (3), 21305 (2021).
- Muzzey, D., van Oudenaarden, A. Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).
- Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals. Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).
- Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. An outlook on microfluidics: the promise and the challenge. Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).
- Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (117), e54673 (2016).
- Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells. Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).
- Watanabe, T., et al. Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells. Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).
- Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems. Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).
- Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion. Analytical Biochemistry. 625, 114213 (2021).
- Saltzman, W. M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. , Oxford University Press. (2001).
- Fogler, H. S. Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).
- Conesa, J. A. Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications. , Wiley. (2019).
- Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing). Processes. 7 (9), 615 (2019).
- Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay. FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).
- Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests. Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).
- Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber. Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).
- Gaida, L. B., et al. Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle. HAL Open Science. , (2008).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution. New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).
- Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).
