Summary
このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。
Abstract
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンから骨格筋への信号伝達に役立つ複雑な構造であり、シナプス前運動軸索末端、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)の3つの重要な組織学的構成要素からなる。NMJの形態学的特徴を実証するために、ラット内側腓腹筋を標的組織として選択し、運動神経線維およびそのシナプス前末端のためのニューロフィラメント200(NF200)および小胞アセチルコリントランスポーター(VAChT)、シナプス後ニコチン性AchRsのためのα−バンガロトキシン(α−BTX)を含む様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色を用いて調べ、 PSC の場合は S100 です。本試験では、第1群ではNF200、VAChT、およびα-BTXで染色し、第2群ではNF200、α-BTX、S100で染色した。両方のプロトコルがNMJの詳細な構造を効果的に実証できることが示された。共焦点顕微鏡を用いて、シナプス前末端、シナプス後受容体、PSCの形態学的特徴が見られ、それらのZスタック画像を3次元パターンで再構成し、異なる標識間の空間的相関をさらに解析した。方法論の観点から、これらのプロトコールは、生理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を調査するための貴重な基準を提供し、末梢神経損傷および再生などのNMJの病理学的変化を評価するのにも適している可能性がある。
Introduction
神経筋接合部(NMJ)1,2,3,4の3つの必須構造成分として、シナプス前運動軸索末端の形態学的側面、ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)を含むシナプス後膜が広範囲に研究されている。骨格筋の薄切片および全マウント標本は、電子顕微鏡5,6、共焦点顕微鏡7,8、および光シート顕微鏡9,10などの異なる組織学的技術を用いて検査されてきた。NMJの形態学的特徴は、異なる側面からこれらの技術によって実証されているが、比較として、共焦点顕微鏡はNMJの詳細な形態のイメージングのための理想的な選択肢である。
近年、NMJの構造成分を示すための多くの新しい技術が開発されている。例えば、thy1−YFPトランスジェニック蛍光マウスは、インビボおよびインビトロで運動軸索および運動エンドプレートを観察するために直接使用されている10、11。さらに、蛍光α-BTXの静脈内注射は、光シート顕微鏡による検査に組織光学クリアリング処理を使用することにより、野生型およびトランスジェニック蛍光マウスの全マウント骨格筋におけるモーターエンドプレートの空間分布を明らかにするために適用されている9,12。しかし、これらの高度な方法で見ることができるシナプス前部とシナプス後部の要素に加えて、PSCを同時に実証することはできません。
蓄積された証拠は、末梢グリア細胞としてのPSCが、NMJの発達および安定性、生理学的条件下でのNMJのシナプス活性の調節、および神経損傷後のNMJの再生に寄与するシナプス前末端と密接に関連していることを示している13、14、15.NMJの細胞構造を考慮すると、このプロトコルは、シナプス前部およびシナプス後部の要素であるPSCを同時に標識するための適切な候補であり、正常および病理学的条件下でのNMJの完全性および可塑性を評価するために潜在的に使用される。例えば、NMJの強度、シナプス後運動エンドプレートの形態および体積、NMJの神経支配および脱神経、ならびに生理学的および病理学的状態の筋肉におけるPSCの数を比較する。
腓腹筋はふくらはぎの膨らみを形成する最大の筋肉で、手足から皮膚や大腿二頭筋を取り除くことで簡単に解剖されます。筋肉は、しばしば、筋萎縮、神経筋変性、筋肉性能、および運動単位力をエキソビボまたはインビボで評価するために選択される16、17、18。しかし、この技術は、様々な骨格筋からNMJの形態学的特徴を明らかにするのにも適している。同時に、太い筋肉切片は、細い切片7、8およびからかわれた筋線維19と比較して、NMJのより完全な形態および量を明らかにすることができる。
これらの研究に沿って、ラット内側腓腹筋を本研究の標的組織として選択し、NMJの構造成分に従って様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色のために厚さ80μmでスライスした。ここで、ニューロフィラメント200(NF200)20、21、小胞性アセチルコリントランスポーター(VAChT)22、α−バンガロトキシン(α−BTX)23、24、およびS100 25,26を用いて、神経線維、シナプス前終末、シナプス後部AchRs、およびPSCをそれぞれ標識した。さらに、筋肉組織および細胞核の背景を、ファロイジンおよびDAPIでさらに対比染色した。
本研究では、NMJの細胞構造とそれに対応するバイオマーカーを、より厚い固定標本上で同時に染色するための洗練されたプロトコールを開発することが期待されており、これは共焦点顕微鏡での使用がより便利であり、PSCの詳細な構造、シナプス前部およびシナプス後部の要素、ならびにそれらの相互の空間的相関に関するより多くの情報を得るのに役立つ。方法論の観点から、このプロトコールは、正常および病理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を評価するのに有益であり得る。
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Protocol
本研究は、中国中国医学科学院鍼灸研究所倫理委員会により承認されました(承認番号2021-04-15-1)。すべての手順は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(National Academy Press、ワシントンD.C.、1996)に従って実施されました。3匹の成体雄ラット(Sprague-Dawley、体重230±15g)を使用した。ラットは、温度と湿度を制御し、食物と水に自由にアクセスできる12時間の明暗サイクルで飼育されました。この研究のための機器と材料を 図1に示します。
1. 灌流
- 250mg/kgのトリブロモエタノール溶液を腹腔内に注入し、ラットの安楽死を誘導する。
- 呼吸が止まったら、胸腔を開き、はさみと鉗子を使って心臓にアクセスします。左心室から大動脈に向かって静脈内カテーテルを挿入し、右耳介を切断する。
- フード内の実験ラットを灌流する。右耳介から出る血液が透明になるまで100mLの0.9%正常生理食塩水で灌流することから始め、次に尾が曲がりにくくなるまで約10分間、0.1Mリン酸緩衝液(PB、pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒド250〜300mLを灌流し続けます。
2. 地域解剖学
- 灌流後、手術刃を用いて両側後肢の皮膚を除去し(図2A)、両側坐骨神経および内側腓腹筋(図2B)を露出させる。
- 刃を用いて両側内側腓腹筋を後肢から注意深く解剖し(図2C)、筋肉全体を10mLの4%パラホルムアルデヒド中0.1M PBに2時間固定する。
- 溶液から筋肉を取り出し、筋肉が溶液に完全に浸漬されるまで、0.1M PB中の25%スクロース10mL中の筋肉を4°Cで1日間凍結保護する。
3.筋肉の凍結切除
- 筋肉組織が溶液に浸漬されたら、凍結切片培地を用いてスライドミクロトームシステムの凍結段階に固定する。筋肉を80μmの厚さで筋肉の長軸に沿って水平にスライスする。
- ブラシを使用して、10 mL の 0.1 M PB (pH 7.4) を含む 6 ウェルの培養プレートに、ウェルあたり 7 つのクライオ切片を整然と配置します。
注:セクションは、異なるウェル内のセクションが隣接するように順番に配置されているため、異なる汚れに使用されるセクションの一貫性が向上します。
4. NF200、VAChT、α-BTX、およびPhaによる多重蛍光染色
注:NF200、VAChT、α-BTX、およびPhaによる複数の蛍光染色を適用して、それぞれ神経線維、シナプス前終末、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体、および筋肉線維を明らかにした。
- 1ウェルあたり4つの切片を、75 μLの10%Triton X-100(0.5%)および45 μLの正常ロバ血清(3%)を含む0.1 M PBの1.5 mLを、20 rpmのオービタルシェーカー上で30分間インキュベートします。
- 切片をウサギ抗NF200(1:1,000)、ヤギ抗VAChT(1:500)を0.1M PB(pH 7.4)に1%正常ロバ血清、および0.5%Triton X-100を含む一次抗体の混合溶液1.5mLに移し、4°Cで一晩インキュベートする。 翌日、切片を20rpmのオービタルシェーカー上で0.1M PB(pH 7.4)でそれぞれ5分間3倍洗浄する。
- ロバ抗ウサギAF488(1:500)およびロバ抗ヤギAF546(1:500)ならびにα-BTX、AF647(1:500)、およびファロイジン350(1:500)のバイオマーカーを含む二次抗体の混合溶液1.5mLに、1%の正常ロバ血清および0.5%Triton X-100を含む0.1M PB(pH 7.4)中の1.5mLの混合溶液中で切片を室温で1時間インキュベートする。光から守る。
- 0.1 M PB(pH 7.4)でそれぞれ3倍5分間洗浄した後、切片を顕微鏡スライドにマウントします。観察のために蒸留水中の50%グリセリンを使用して切片にカバーガラスを塗布する。
5. NF200、S100、α-BTX、およびDAPIによる多重蛍光染色
メモ: 手順は手順 4 の手順と似ています。主な違いは、一次抗体とそれに対応する二次抗体との間のものである。
- 以下の一次抗体を使用する:ステップ4.2のニワトリ抗NF200(1:6,000)、ウサギ抗S100(1:2,500)、およびそれらに対応する二次抗体:ロバ抗ニワトリAF488(1:500)およびロバ抗ウサギAF546(1:500)、ならびにステップ4.3のα-BTX AF647(1:500)およびDAPI(1:50000)のバイオマーカー。
6. 観察と分析
- 試料を観察し、対物レンズ(NA0.75の20倍レンズ、NA0.95の40倍レンズ)を備えた共焦点イメージングシステムを用いて画像を撮影する。
- 多重蛍光染色に対応する励起および発光波長は、350 nm(Pha)、488 nm(NF200)、546 nm(VAChTおよびS100)、647 nm(α-BTX)、またはDAPIを使用します。画像キャプチャの解像度を 640 x 640 ピクセルに設定します。
注: 640 x 640 ピクセルの解像度が選択されるのは、画像が Z スタックでキャプチャされたためです。1024 x 1024ピクセルの解像度では、Zスタックのイメージングとフォトブリーチングが遅くなります。 - 開始焦点面と終了焦点面を設定します。ステップサイズを 1 μm または 2 μm に設定します。深度パターン、画像キャプチャ、および Z シリーズを選択します。
- 20倍で撮影した低倍率の画像については、105μmのピンホールを使用して、厚さ80μmの各断面から2μmのステップサイズで40枚の画像(Zスタック)をキャプチャします。Z軸上の投影/地形モードと強度投影を選択して、すべての画像を単一の焦点に統合します。
- 40倍で撮影した高倍率の画像の場合は、ズームを2に設定し、ピンホールを105μmに設定して、厚さ80μmの各断面から1μmステップサイズで80枚の画像(Zスタック)をキャプチャします。すべての画像を1つのピントに統合します。
- 27で先に説明したような画像処理システムを用いて3次元パターンの画像を再構成する。
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Representative Results
複数回の蛍光染色後、NF200陽性神経線維、VAChT陽性シナプス前終末、α-BTX陽性シナプス後部AchR、S100陽性PSC、ファロイディン陽性筋線維、およびDAPI標識細胞核を有するラット内側腓腹筋の厚さ80μm切片について、対応する標識が規則正しく実証された(図3 および 図4)。
NF200陽性神経線維が束ねて走り、VAChT陽性シナプス前終末に枝分かれし、α-BTX陽性シナプス後部AchRと鏡のような関係を形成していることが示された(図3)。さらに、シナプス前終末に近いNF200陽性神経線維の周囲にS100陽性PSCが検出された(図4)。
画像再構成を利用することで、神経線維、シナプス前終末、PSC、シナプス後部AchRsの空間的相関が、異なる視点からのNMJの詳細な形態学的特徴を示す3次元パターンでさらに示された(図3C,C1および図4C,C1)。
図1.さまざまなプロトコル・ステップのイメージ。 (A)フードにラットを灌流させる。(B)ラット内側腓腹筋を解剖する。(C)摺動ミクロトーム系の凍結段階で筋肉組織を切断する。(D)組織切片を6ウェルディッシュに整然と集める。(E)シェーカー上での蛍光染色。(F)切片を顕微鏡スライドに取り付けます。(G) 50%グリセリンを含む切片にカバースリップを貼る。(H)共焦点イメージングシステムでサンプルを観察する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.ラット内側腓腹筋を解剖するための局所解剖学の手順。(A)ラット後肢の筋肉の外観。(B)内側腓腹筋とその神経支配の内部図。(C)ラット内側腓腹筋を解剖する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.ラット内側腓腹筋上の神経線維、シナプス前終末、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体、および筋肉線維の空間相関。(a) ニューロフィラメント200(NF200)、水疱性アセチルコリントランスポーター(VAChT)、α-バンガロトキシン(α-BTX)、およびファロイジン(Pha)による多重蛍光染色を示すラット内側腓腹筋からの代表的な画像。(b )パネルA(矢印)からの拡大画像に、各種ラベリングを詳細に示す。B1-B4: パネル B を NF200 (B1)、VAChT (B2)、α-BTX (B3)、および Pha (B4) で別々に表示します。(C)(C)の3Dパターンの正面図と(C1)の背面図を示すフレームを備えたパネルBからの調整画像。B1-B4 のスケール バーは B と同じです 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4.神経線維、シナプス周囲シュワン細胞、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体、およびラット内側腓腹筋上の細胞核の空間相関。(a)ニューロフィラメント200(NF200)、シュワン細胞マーカー(S100)、α−バンガロトキシン(α−BTX)、および細胞核マーカー4',6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)による多重蛍光染色を示すラット内側腓腹筋からの代表的な画像。(b)パネルA(矢印)からの拡大画像に、各種ラベリングを詳細に示す。B1-B4: パネル B を NF200 (B1)、S100 (B2)、α-BTX (B3)、および DAPI (B4) と個別に表示します。(C)(C)では3Dパターンでフレームを付けたパネルBからの調整画像と、(C1)ではS100ラベリングなしのビュー。B1-B4 のスケール バーは B と同じです。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、筋肉スライスの多重染色を成功させるために必要な技術的詳細と、ラット内側腓腹筋の厚い部分におけるNMJの形態学的特徴を明らかにするための蛍光免疫組織化学の使用について説明した。このアプローチを用いることにより、PSCおよびシナプス前後部要素の微細な詳細および空間的相関を共焦点顕微鏡下で分析および評価し、さらに3次元パターンで再構成することができる。ここでは、NMJの形態学的特徴を明らかにするために様々な種類のバイオマーカーを用い、その中で、NF200は有髄軸索20,21上に高発現し、VAChTはシナプス前末端22に蓄積され、α-BTXはシナプス後部AchRs23,24に、S100はPSCs25,26に示されている。.我々の結果と以前の研究の結果を総合すると、これらのバイオマーカーは、NMJの構造要素を互いに空間的関係を評価するための実験計画に従って標識するために自由に組み合わせることができることが示されている1,28,29。
この技術で理想的な撮像を得るためには、固視し過ぎが高バックグラウンドを引き起こす可能性があるため、固定後の時間は注意すべき重要な課題である。したがって、修正ソリューションでは、修正後の時間が 2 時間を超えないようにすることをお勧めします。さらに、筋肉切片でより多くのNMJを観察するためには、NMJにおけるシナプス前末端、シナプス後部AchRs、およびPSCの空間的相関を包括的に実証することができる80μmの厚さで長軸に沿って筋肉を水平にスライスすることが重要である。ここで、スライドミクロトームは筋肉組織をスライスするための便利なツールであることを強調する必要があります。同様に、クライオスタットとビブラトームを使用して、厚いセクションを得ることもできます。
要約すると、NMJの形態学的特徴は、異なる技術を用いて、2次元組織学的切片から3次元全マウント組織まで広く研究されてきた。電子顕微鏡および光シート顕微鏡による検査のための手間と時間のかかる組織処理を考慮すると、より厚い組織切片上の複数の蛍光染色は、共焦点顕微鏡を用いてNMJの立体学的構造を効果的に探索するための便利なアプローチである。
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Disclosures
著者は利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、CACMSイノベーションファンド(No.CI2021A03407)、中国国家自然科学財団(第82004299号)、中央福祉研究所の基礎研究費(第1号。ZZ13-YQ-068;ZZ14-YQ-032;ZZ14-YQ-034;ZZ201914001;ZZ202017006;ZZ202017015)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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