Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Demonstration af sekvensjusteringen for at forudsige følsomhedsværktøj på tværs af arter til hurtig vurdering af proteinbevarelse

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at bruge den nyeste version af US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) værktøj. Denne protokol demonstrerer anvendelsen af onlineværktøjet til hurtigt at analysere proteinbevarelse og give tilpasselige og let fortolkelige forudsigelser af kemisk modtagelighed på tværs af arter.

Abstract

US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) værktøj er en hurtig, frit tilgængelig, online screeningsapplikation, der giver forskere og regulatorer mulighed for at ekstrapolere toksicitetsoplysninger på tværs af arter. For biologiske mål i modelsystemer såsom humane celler, mus, rotter og zebrafisk er der toksicitetsdata tilgængelige for en række kemikalier. Gennem evaluering af proteinmålbevarelse kan dette værktøj bruges til at ekstrapolere data genereret fra sådanne modelsystemer til tusindvis af andre arter, der mangler toksicitetsdata, hvilket giver forudsigelser af relativ iboende kemisk modtagelighed. De seneste udgivelser af værktøjet (version 2.0-6.1) har indarbejdet nye funktioner, der giver mulighed for hurtig syntese, fortolkning og brug af dataene til offentliggørelse plus grafik i præsentationskvalitet.

Blandt disse funktioner er datavisualiseringer, der kan tilpasses, og en omfattende oversigtsrapport, der er designet til at opsummere SeqAPASS-data for at lette fortolkningen. Dette papir beskriver protokollen til at guide brugerne gennem indsendelse af job, navigering i de forskellige niveauer af proteinsekvenssammenligninger og fortolkning og visning af de resulterende data. Nye funktioner i SeqAPASS v2.0-6.0 fremhæves. Desuden beskrives to brugssager med fokus på transthyretin og opioidreceptorproteinbevarelse ved hjælp af dette værktøj. Endelig diskuteres SeqAPASS 'styrker og begrænsninger for at definere domænet for anvendelighed for værktøjet og fremhæve forskellige applikationer til ekstrapolering på tværs af arter.

Introduction

Traditionelt har toksikologiområdet været stærkt afhængig af brugen af forsøg med hele dyr for at tilvejebringe de data, der er nødvendige for kemikaliesikkerhedsvurderinger. Sådanne metoder er typisk dyre og ressourcekrævende. På grund af det store antal kemikalier, der i øjeblikket anvendes, og det hurtige tempo, hvormed nye kemikalier udvikles, er der imidlertid globalt et anerkendt behov for mere effektive metoder til kemisk screening 1,2. Dette behov og det deraf følgende paradigmeskift væk fra dyreforsøg har ført til udviklingen af mange nye tilgangsmetoder, herunder screeningsanalyser med høj kapacitet, transkriptomik med høj kapacitet, næste generations sekventering og beregningsmodellering, som lover alternative teststrategier 3,4.

Evaluering af kemikaliesikkerhed på tværs af mangfoldigheden af arter, der potentielt kan blive påvirket af kemisk eksponering, har været en vedvarende udfordring, ikke kun med traditionelle toksicitetstest, men også med nye tilgangsmetoder. Fremskridt inden for komparativ og prædiktiv toksikologi har givet rammer for forståelse af forskellige arters relative følsomhed, og teknologiske fremskridt inden for beregningsmetoder fortsætter med at øge anvendeligheden af disse metoder. Flere strategier er blevet diskuteret i løbet af det sidste årti, der udnytter eksisterende gen- og proteinsekvensdatabaser sammen med viden om specifikke kemiske molekylære mål til at understøtte forudsigelige tilgange til ekstrapolering på tværs af arter og forbedre kemiske sikkerhedsevalueringer ud over de typiske modelorganismer 5,6,7,8.

For at fremme videnskaben til handling, bygge videre på disse grundlæggende undersøgelser inden for prædiktiv toksikologi, prioritere kemisk testindsats og støtte beslutningstagning, blev US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) værktøj oprettet. Dette værktøj er en offentlig og frit tilgængelig webbaseret applikation, der bruger offentlige lagre af konstant voksende proteinsekvensinformation til at forudsige kemisk modtagelighed på tværs af mangfoldigheden af arter9. Baseret på princippet om, at en arts relative iboende modtagelighed for et bestemt kemikalie kan bestemmes ved at evaluere bevarelsen af de kendte proteinmål for det pågældende kemikalie, sammenligner dette værktøj hurtigt proteinaminosyresekvenser fra en art med kendt følsomhed over for alle arter med eksisterende proteinsekvensdata. Denne evaluering gennemføres gennem tre analyseniveauer, herunder (1) primær aminosyresekvens, (2) funktionelt domæne og (3) kritiske aminosyrerestsammenligninger, der hver kræver mere dybdegående viden om interaktionen mellem kemikalier og protein og giver større taksonomisk opløsning i følsomhedsforudsigelsen. En stor styrke ved SeqAPASS er, at brugerne kan tilpasse og forfine deres evaluering ved at tilføje yderligere bevislinjer mod målbevarelse baseret på, hvor meget information der er tilgængelig vedrørende interaktionen mellem kemisk protein eller protein-protein af interesse.

Den første version blev udgivet i 2016, hvilket gjorde det muligt for brugerne at evaluere primære aminosyresekvenser og funktionelle domæner på en strømlinet måde for at forudsige kemisk modtagelighed og indeholdt minimale datavisualiseringsfunktioner (tabel 1). Individuelle aminosyreforskelle har vist sig at være vigtige determinanter for forskelle på tværs af arter i kemiske proteininteraktioner, hvilket kan påvirke arternes kemiske modtagelighed10,11,12. Derfor blev efterfølgende versioner udviklet til at overveje de kritiske aminosyrer, der er vigtige for direkte kemisk interaktion13. Som svar på feedback fra interessenter og brugere har dette værktøj gennemgået årlige versionsudgivelser med yderligere nye funktioner, der er designet til at imødekomme både forskeres og reguleringssamfunds behov for at tackle udfordringer i ekstrapolering på tværs af arter (tabel 1). Lanceringen af SeqAPASS version 5.0 i 2020 frembragte brugercentrerede funktioner, der indeholder datavisualisering og datasynteseindstillinger, eksterne links, oversigtstabel- og rapportindstillinger og grafiske funktioner. Samlet set forbedrede de nye attributter og muligheder i denne version datasyntese, interoperabilitet mellem eksterne databaser og den lette datafortolkning til forudsigelser af modtagelighed på tværs af arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sådan kommer du i gang

BEMÆRK: Protokollen, der præsenteres her, er fokuseret på værktøjsværktøj og nøglefunktioner. Detaljerede beskrivelser af metoder, funktioner og komponenter findes på webstedet i en omfattende brugervejledning (tabel 1).

Tabel 1: Udvikling af SeqAPASS-værktøjet. En liste over funktioner og opdateringer tilføjet til SeqAPASS-værktøjet fra dets første implementering. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter; ECOTOX = ECOTOXicology vidensbase. Klik her for at downloade denne tabel.

  1. Gå til https://seqapass.epa.gov/seqapass ved hjælp af Chrome. Vælg enten Log ind for at bruge en eksisterende konto, eller følg instruktionerne for at oprette en SeqAPASS-konto, som giver brugerne mulighed for at køre, gemme, få adgang til og tilpasse deres afsluttede job.
  2. Før du foretager en analyse, skal du først identificere et protein af interesse og en målrettet eller følsom art ved at gennemgå den eksisterende litteratur eller allerede eksisterende data (figur 1). Da SeqAPASS indeholder links til eksterne ressourcer for at hjælpe med at identificere forespørgselsproteinet, skal du klikke på rulleknapperne under Identificer et proteinmål for at få adgang til relevante ressourcer.

Figure 1
Figur 1: SeqAPASS problemformulering: skematisk diagram over de foreløbige oplysninger, der er nødvendige for en vellykket analyse. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter; LBD = ligandbindende domæne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: SeqAPASS-interoperabilitet på tværs af databaser. Skematisk diagram over eksterne værktøjer, databaser og ressourcer integreret i SeqAPASS. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter; AOP = negativt resultatforløb; NCBI = Nationalt Center for Bioteknologisk Information; ECOTOX = ECOTOXicology vidensbase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 2: Links, ressourcer og værktøjer integreret i SeqAPASS-værktøjet. En liste over de forskellige datakilder, links og ressourcer, der er udnyttet i SeqAPASS-værktøjet. Forkortelse: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at downloade denne tabel.

2. Udvikling og kørsel af en SeqAPASS-forespørgsel: Niveau 1

BEMÆRK: I en niveau 1-analyse sammenlignes hele den primære aminosyresekvens af et forespørgselsprotein med de primære aminosyresekvenser for alle arter med tilgængelig sekvensinformation. Dette værktøj bruger algoritmer til at udvinde, indsamle og kompilere offentligt tilgængelige data for hurtigt at justere og sammenligne aminosyresekvenser på tværs af arter. Backend gemmer oplysninger fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) databaser og gør strategisk brug af de selvstændige versioner af Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)54 og Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)55.

  1. Under Sammenlign primære aminosyresekvenser skal du klikke på enten Efter art eller efter tiltrædelse. Brug valget Efter art til at skrive eller vælge fra en liste over arter for at vælge proteinmålet af interesse.
  2. Indsend proteintiltrædelser (dvs. NCBI-protein-id) direkte ved at indtaste tiltrædelsen/tiltrædelserne i tekstfeltet Ved tiltrædelse.
  3. Vælg Anmod om kørsel for at sende forespørgslen. Når den er indsendt, skal du vente på, at en meddelelse vises i øverste højre hjørne af browservinduet, der angiver en vellykket indsendelse.
  4. Vælg fanen SeqAPASS Run Status øverst på siden for at få vist en liste over alle SeqAPASS-kørsler, der udføres under den pågældende brugerkonto, og kontroller procentdelen af færdiggørelsen.
    1. Klik på Opdater data , mens den relevante alternativknap er valgt for at kontrollere status for niveau 2- og niveau 3-kørsler.
  5. Vælg fanen Vis SeqAPASS-rapporter øverst på siden for at få adgang til en liste over alle rapporter, der er udført under den pågældende konto.
  6. På fanen Vis SeqAPASS-rapporter skal du vælge det forespørgselsprotein, der er interessant. Klik på Anmod om valgt rapport for at åbne siden Forespørgselsproteinoplysninger på niveau 1 og få vist resultater, datatilpasningsmuligheder, visualiseringer og oversigtsrapporter.
  7. Vælg som standard Vis rapport for at få vist data i webbrowseren. Du kan også vælge Gem rapport for at downloade rådata som en .zip fil.
    BEMÆRK: Den tid, der kræves til en niveau 1-analyse, varierer (gennemsnit på 23 minutter for version 5.1) afhængigt af det globale brugerbehov på det pågældende tidspunkt, antallet af job, der sendes til køen, og mængden af proteinoplysninger, der findes for et indsendt job. Hvis et proteinmål tidligere er afsluttet, vil data være tilgængelige på få sekunder efter indsendelse.

3. Udvikling og kørsel af en SeqAPASS-forespørgsel: Niveau 2

BEMÆRK: Da hele proteinsekvensen ikke er direkte involveret i en kemisk interaktion, sammenligner en niveau 2-analyse kun aminosyresekvensen for det funktionelle domæne for at foretage følsomhedsforudsigelser ved lavere taksonomiske rækker (f.eks. klasse, orden, familie).

  1. På siden Oplysninger om niveau 1-forespørgselsproteiner skal du klikke på plustegnet + ud for niveau 2-overskriften for at udfylde menuen Niveau 2-forespørgsel .
  2. Identificer de(t) relevante domæne(r) i det pågældende protein (forespørgselsprotein).
    1. Hvis et domæne ikke er blevet identificeret, skal du klikke på det integrerede link til NCBI Conserved Domains Database (CDD) (tabel 1), som kan hjælpe med at identificere det relevante domænevalg.
      BEMÆRK: Typisk vælges kun specifikke hitdomæner som forespørgsler på niveau 2.
  3. Klik på feltet Vælg domæne for automatisk at udfylde en liste over funktionelle domæner for forespørgselsproteinet.
  4. Vælg domænetiltrædelsen (e) fra rullelisten, og start niveau 2-forespørgslen ved at klikke på knappen Anmod om domænekørsel . Når den er indsendt, skal du vente på, at der vises en meddelelse, der angiver en vellykket indsendelse.
  5. Klik på Opdater niveau 2 og 3 kørsler for at udfylde niveau 2-data, som vil være tilgængelige inden for få sekunder efter indsendelse.
  6. Under Vis niveau 2-data skal du vælge de(n) fuldførte domænetiltrædelse(r) på rullelisten og klikke på knappen Vis niveau 2-data for at åbne resultaterne på en ny side.

4. Adgang til og forståelse af dataene: SeqAPASS niveau 1 og niveau 2

  1. Rul ned til bunden af siden Forespørgselsproteinoplysninger for at se en rapport over resultaterne - en primær rapport leveres som standard med niveau 1- og 2-analyser. Vælg alternativknappen Fuld rapport for at få vist en mere detaljeret rapport , der indeholder alle sekvenshits og justeringsmålinger. Klik på det relevante tiltrædelses-/ID/navn i begge rapporter for at få adgang til de gennemsigtige oplysninger om proteinjustering og taksonomi i NCBI-databasen.
  2. Rul til højre i resultattabellen for at få vist ECOTOX-kolonnen . Klik på links til ECOTOXicology knowledgebase (ECOTOX) for hurtigt at indsamle tilsvarende toksicitetsdata for arter med følsomhedsforudsigelser.
    BEMÆRK: ECOTOX er en omfattende, offentligt tilgængelig vidensbase, der indeholder data om enkelt kemisk toksicitet for vand- og landplanter og vilde dyr og planter. SeqAPASS v6.0 indeholder en ECOTOX-widget til hurtigere at oprette forbindelse til relevante ECOTOX-data efter kemikalie og arter af interesse.
  3. Klik på Download tabel for at gemme tabellen som en regnearksfil. Klik på knappen Vis oversigtsrapport for at få vist og downloade en oversigtsrapporttabel med data sorteret efter taksonomisk gruppe.
    BEMÆRK: Dataoversigtstabeller er tilgængelige for både primære og fulde rapporter og giver et overblik over forudsigelser for et givet mål.

5. Manipulation af dataindstillinger: SeqAPASS niveau 1 og niveau 2

BEMÆRK: I både niveau 1- og niveau 2-analyser antages det, at jo større proteinligheden er, desto større er sandsynligheden for, at et kemikalie vil interagere med proteinet på samme måde som forespørgselsarten / proteinet, hvilket gør dem modtagelige for potentielle virkninger af kemikalier med dette molekylære mål. På grund af ligheden mellem disse data skitseres trin til forståelse af niveau 1- og 2-data sammen i en enkelt protokol.

  1. Se undermenuerne øverst i Query Protein Information for at få adgang til og manipulere rapportindstillingerne og bruge standardindstillingerne for alle rapportindstillinger til de fleste analyser. Hvis der er videnskabelig begrundelse for at ændre standardindstillingen, skal du følge disse valgfrie trin:
    1. (VALGFRIT) Klik på plustegnet + ud for Følsomhedsafskæring for at se og justere indstillingerne for følsomhedsafskæring i en ny fane. Vælg enten en ny afskæringsværdi på en rulleliste, eller indtast en brugerdefineret afskæringsværdi.
    2. (VALGFRIT) Skift nummeret i feltet E-værdi (antallet af forskellige justeringer, der forventes at forekomme tilfældigt), hvis der ønskes noget andet end standard.
      BEMÆRK: Ethvert protein med en E-værdi, der er større end tallet i boksen, fjernes fra den primære rapport.
    3. (VALGFRIT) Brug indstillingen Sortér efter taksonomisk gruppe til at vælge det taksonomiske hierarkiniveau, der skal vises i kolonnen Filtreret taksonomisk gruppe i resultattabellen.
      BEMÆRK: Ændring af det taksonomiske hierarki vil også ændre forudsigelsen af modtagelighed baseret på arten fra hver filtreret gruppe, der findes over afskæringen.
    4. (VALGFRIT) Skift feltet Fælles domæne (hvor mange almindelige domæner et protein skal dele med forespørgselsproteinet for at blive inkluderet i resultaterne), hvis der ønskes noget andet end standard.
      BEMÆRK: Da standardindstillingen er 1, udelukkes enhver sekvens, der ikke deler mindst et fælles domæne med forespørgselsproteinet.
    5. (VALGFRIT) Vælg Nej under Species Read Across for kun at få følsomhedsforudsigelserne for Y tilbage, hvis procentvis lighed er større end eller lig med cutoff, eller hvis hittet er identificeret som en ortologkandidat.
      BEMÆRK: Denne indstilling er som standard Ja, hvilket betyder, at der rapporteres en følsomhedsforudsigelse af Y for alle ortologkandidater, alle arter, der er anført over følsomhedsafskæringen, og alle arter under afskæringen fra den samme taksonomiske gruppe med en eller flere arter over afskæringen.
  2. Klik på knappen Download aktuelle rapportindstillinger for at downloade en fil, der registrerer de aktuelle indstillinger, der er anvendt.
    BEMÆRK: Det specifikke evalueringsniveau (1, 2 eller 3), der er valgt, dikterer de indstillinger, der præsenteres i rapporten.

6. Visualisering af dataene: SeqAPASS niveau 1 og niveau 2

  1. Klik på plustegnet + ud for Visualisering , og klik på knappen Visualiser data for at åbne en separat fane, der viser de brugerdefinerede oplysninger og muligheden for at vælge en interaktiv graf over resultater.
  2. Klik på Boxplot for at åbne de interaktive kontrolelementer til boxplot og plot, og tillade, at visualiseringen af boxplot aktivt opdateres, så den afspejler ændringer i datatabellen og leverer grafik i publikations- og præsentationskvalitet.
    BEMÆRK: Standardboksen viser artsgrupper på x-aksen og procentvis lighed på y-aksen. Boxplots viser følsomhedsafskæringen (stiplet linje), procentvis lighed på tværs af arter sammenlignet med forespørgselsarterne og middel- og medianværdier for hver taksonomisk gruppe sammen med 25. og 75. percentiler og interkvartilområde. Afhængigt af formålet med analysen og brugerens behov kan mange boxplot-funktioner ændres gennem følgende valgfrie trin.
    1. (VALGFRIT) Hvis du vil tilpasse de viste taksonomiske grupper, skal du se feltet Taksonomiske grupper under afsnittet Kontrolelementer . Fjern grupper ved at rulle hen over navnene og vælge x eller ved hjælp af rullemenuen Taksonomiske grupper .
    2. (VALGFRIT) For at tilføje en forklaring, der vil lokalisere en art af interesse eller specifikke foruddefinerede grupper (f.eks. Truede eller truede arter), skal du holde markøren over et taksonomisk gruppenavn på x-aksen for at aktivere en pop op-boks med de tre bedste arter sorteret efter højeste procentvise lighed. Hold markøren over arter i forklaringen for at generere en pop op-boks med de tilsvarende artsoplysninger. Klik på feltet for en bestemt taksonomisk gruppe for at generere en oversigtstabel, der kan downloades, og som viser arter og forudsigelser.
  3. Klik på Download Boxplot for at vælge en filtype, tilpasse bredde/højdeopløsningen og gemme visualiseringen.

7. Udvikling og drift af en SeqAPASS-analyse: Niveau 3

BEMÆRK: En niveau 3-analyse vurderer brugeridentificerede aminosyrerester inden for forespørgselsproteinet og sammenligner hurtigt bevarelsen af disse rester på tværs af arter. Arter, hvor disse rester er konserveret, antages at være mere tilbøjelige til at interagere med et kemikalie på samme måde som skabelonarten / proteinet. Da niveau 3 fokuserer på individuelle aminosyrer, kan en analyse kun udføres, når der er detaljeret viden om aminosyreresterne, der er kritiske for interaktionen mellem kemisk-protein eller protein-protein.

  1. Klik på plustegnet + ud for niveau 3-overskriften på siden Forespørgselsproteinoplysninger på niveau 1 for at udfylde menuen Niveau 3-forespørgsel.
  2. Klik på plustegnet + ud for Reference Explorer for at åbne referenceopdagelsesværktøjet, som genererer en foruddefineret boolesk streng til at forespørge på den tilgængelige litteratur og hjælper brugerne med at identificere passende litteratur til støtte for identifikationen af kritiske aminosyrer, der skal bruges i niveau 3-evalueringen (tabel 2 og figur 2).
    1. (VALGFRIT) Når forespørgselsproteinet automatisk udfyldes, skal du bruge funktionen Tilføj proteinnavn til at tilføje yderligere proteiner.
  3. Klik på linket Generer Google Scholar for at åbne et pop op-vindue, der indeholder en autogenereret søgestreng, der indeholder relevante søgeord.
  4. Klik på Søg i Google Scholar for at forespørge i litteraturdatabasen ved hjælp af søgestrengen.
    1. Alternativt kan du klikke på Kopier til Udklipsholder og tilpasse søgestrengen ved at tilføje eller fjerne udtryk ved hjælp af funktionerne i Reference Explorer.

8. Identificer kritiske aminosyrerester ved hjælp af identificeret litteratur

  1. Vælg den skabelonsekvens , som brugervalgte arter skal justeres til, i menuen Niveau 3-forespørgsel.
    BEMÆRK: Denne skabelonsekvens vælges almindeligvis baseret på den litteratur, for hvilken de kritiske aminosyrer blev identificeret, og kan være den samme eller en anden art end dem, der forespørges i niveau 1 og niveau 2.
    1. (VALGFRIT) Brug feltet Yderligere sammenligninger til at sammenligne eventuelle tiltrædelser/sekvenser, der ikke vises i tabellerne Primær/Fuld rapport .
  2. Angiv et brugerdefineret navn til niveau 3-kørslen i tekstfeltet Angiv niveau 3-kørselsnavn for at identificere den fuldførte niveau 3-kørsel. Vælg et unikt navn til hver evaluering.
  3. Vælg den taksonomiske interessegruppe i feltet Vælg taksonomisk gruppe(r). Vælg en taksonomisk gruppe for automatisk at filtrere tabellen efter den taksonomiske gruppe.
  4. I resultattabellen skal du manuelt klikke på afkrydsningsfeltet ud for de arter, der skal justeres til skabelonsekvensen.
    BEMÆRK: For at sikre passende justering skal en taksonomisk gruppe ad gangen sammenlignes med skabelonen. Vælg kun lignende kommenterede proteiner til de arter, der er af interesse. Når du vælger sekvenser til sammenligning, er det vigtigt at være opmærksom på bestemte sekvenser (f.eks. Hypotetisk, LAV KVALITET eller delvis). Medmindre der er en gennemsigtig begrundelse for optagelse, er det bedst at udelukke disse sekvenser, da de kan fordreje forudsigelser på grund af ufuldstændige eller upassende sekvensoplysninger.
  5. Gentag trin for at justere alle taksonomiske interessegrupper.
  6. Klik på Opdater niveau 2 og 3 kørsler , når alle arter er blevet justeret for at udfylde menuen Vælg niveau 3-kørselsnavn med de fuldførte niveau 3-job og hente dataene fra en niveau 3-justering med det samme.
  7. Klik på Kombiner niveau 3-data for at kombinere justeringer fra flere taksonomiske grupper.
    1. Hvis du vil have vist en enkelt rapport, skal du også vælge det brugerdefinerede navn under Vælg forespørgsel, der skal vises , og klikke på Vis niveau 3-data.
  8. Vælg den niveau 3-skabelon , der skal bruges som grundlag for sammenligning af aminosyrerester, i menuen Kombiner niveau 3-rapporter , og klik på Næste.
  9. I niveau 3-job skal du vælge afsluttede job til sammenligning og klikke på Næste. Brug funktionen Job på ordreniveau 3 til at omarrangere de taksonomiske grupper, hvis det ønskes. Klik på Vis niveau 3-data for at oprette en niveau 3-rapportside med de kombinerede taksonomiske grupper justeret.
  10. Vælg tidligere identificerede aminosyrepositioner for skabelonarten ved at indtaste aminosyrepositionerne adskilt af kommaer i feltet Indtast aminosyrerestpositioner og derefter vælge Kopier til restliste. Vælg rester i skabelonsekvensen direkte fra shuttleboksen.
  11. Klik på Opdater rapport for at opdatere siden og få vist niveauforudsigelserne for følsomhed.
    BEMÆRK: Niveau 3 bruger et simpelt sæt regler afledt af grundlæggende deskriptorer af sidekædede funktionelle egenskaber (f.eks. Alifatiske, aromatiske) og molekylære dimensioner (molekylvægtforskelle >30 g / mol) for at bestemme, om forskelle på nøglepositioner sandsynligvis vil påvirke proteininteraktioner13.

9. Visualisering af niveau 3 SeqAPASS-data

BEMÆRK: Som i tidligere niveauer er primære og fulde rapporter tilgængelige. Ud over data, der er identiske med dataene i niveau 1 og 2, viser den primære rapport aminosyrepositioner, forkortelser og et ja/nej (Y/N) lignende modtagelighed som skabelonforudsigelsen. Tilsvarende indeholder den fuldstændige rapport oplysninger om aminosyresidekædeklassificering og molekylvægt.

  1. Rul ned til bunden på siden Niveau 3-rapport for at få vist en rapport over resultaterne. Klik på Download tabel nederst i rapporten for at gemme tabellen.
  2. Klik på Vis niveau 3-oversigtsrapport for at få vist og downloade en oversigtsrapporttabel med data sorteret efter taksonomisk gruppe. Klik på plustegnet + ud for Visualisering på siden Niveau 3-rapport for at åbne en separat browserfane, der viser de brugerdefinerede oplysninger og muligheden for at se resultater i form af et interaktivt varmekort.
  3. Klik på Varmekort på siden Visualiseringsoplysninger for at åbne den interaktive grafik og kontrolelementer og tillade, at visualiseringen af varmekortet opdateres aktivt for at afspejle ændringer i datatabellen. Udfør følgende valgfrie trin for at tilpasse varmekortet.
    1. (VALGFRIT) Vælg Rapportindstillinger for at skifte mellem en simpel rapport, der viser aminosyrepositionen, forkortelsen på et bogstav og aminosyreligheden, eller en fuld rapport, der viser detaljerede oplysninger om hver valgt aminosyre.
    2. (VALGFRIT) Vælg Rapportindstillinger for at ændre, hvordan arter vises, enten efter almindeligt navn eller videnskabeligt navn.
      BEMÆRK: I den enkle rapport kategoriseres aminosyrer som en total match (mørkeblå), delvis match (lyseblå, substitutioner, der kun opfylder et kriterium) eller ikke en match (gul, substitutioner, der ikke opfylder nogen af kriterierne) til skabelonaminosyren. Den fulde rapport viser sammenligninger som enten et Samlet match (mørkeblåt) eller Ikke et match (gult).
    3. (VALGFRIT) Vælg Valgfrie valg for at fremhæve nyttige oplysninger såsom ortologkandidater, truede arter, truede arter eller almindelige modelorganismer.
    4. (VALGFRIT) Vælg Indstillinger for varmekort for at vælge yderligere tilpasningsmuligheder, herunder tilføjelse eller fjernelse af kolonner, forklaringer og tekst.
  4. Klik på Download Boxplot for at vælge en filtype og gemme visualiseringen.

10. Fortolkning af SeqAPASS-resultater: Bevislinjer for proteinbevarelse

BEMÆRK: For at lette fortolkningen indeholder dette værktøj en beslutningsoversigtsrapport (DS-rapport), der er designet til at integrere data på tværs af niveauer. DS-rapporten indeholder de resultater (dvs. datatabeller og/eller visualiseringer), som brugeren har valgt, og giver mulighed for hurtig evaluering af følsomhedsforudsigelser på tværs af flere niveauer for flere arter samtidigt.

  1. Klik på Push-niveau # til DS-rapport fra siderne med resultater eller datavisualisering, og vent på, at dataene "skubbes", og fanen DS-rapport bliver aktiv.
    BEMÆRK: Hvis resultater eller ændringer ikke er blevet skubbet til DS-rapporten, forbliver Push Level # til DS Report aktiv, indtil den er valgt. Hvis en indstilling er blevet ændret, vises teksten Klik for at skubbe nye ændringer , indtil ændringerne overføres til rapporten. Visualiseringer kan skubbes til DS-rapporten når som helst under evalueringen.
  2. Vælg fanen DS-rapport når som helst for at få adgang til DS-siden.
    BEMÆRK: For alle arter, der er justeret på niveau 1, indeholder tabellen over den endelige beslutningssammenfattende rapport de vigtige data og forudsigelser om modtagelighed for hver analyse. Hvis en art i DS-tabellen ikke var inkluderet i niveau 3-rapporten, men blev fundet i niveau 1- og/eller niveau 2-job, modtager cellen i tabellen en ikke-relevant (NA) betegnelse for niveau 3-følsomhedsforudsigelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at demonstrere anvendelsen af SeqAPASS-værktøjet og fremhæve nye funktioner beskrives to casestudier, der repræsenterer tilfælde, hvor proteinbevarelse forudsiger, at der er forskelle i kemisk modtagelighed på tværs af arter (humant transthyretin), og at der ikke er nogen forskelle (μ opioidreceptor [MOR]). Det første af disse eksempler omhandler proteinsekvenser/strukturelle sammenligninger for at forudsige anvendelsesområdet for negative udfaldsveje (AOP'er, se tabel 2 for definition), mens det andet er fokuseret på at udvikle forskningshypoteser, der er relevante for følsomhed på tværs af arter for opioider, der er til stede i spildevand. De grundlæggende tilgange, der er beskrevet i disse casestudier, kan anvendes på ethvert kemikalie og demonstrere den brede anvendelighed af dette værktøj til beslutningstagning og forskning.

Skjoldbruskkirtelhormoner er afgørende for normal vækst og udvikling. De syntetiseres i skjoldbruskkirtlen og udskilles i blodbanen, hvor de binder til distributionsproteiner og cirkuleres gennem hele kroppen 14,15,16,17,18. Nylige undersøgelser har vist, at miljøforurenende stoffer, såsom polychlorerede biphenyler (PCB'er), polybromerede diphenylethere (PBDE'er) og per- og polyfluoralkylstoffer (PFAS), konkurrencedygtigt kan binde til distributionsproteinet transthyretin (TTR) og forstyrre normale skjoldbruskkirtelprocesser 19,20,21,22,23,24,25 . Der er udviklet en AOP, der beskriver konkurrencedygtig binding til TTR, der fører til human neurodevelopmental toksicitet (https://aopwiki.org/aops/152). Selv om der er tegn på, at denne årlige vækstpagt også gælder for gnavere, er anvendeligheden på andre taksonomiske grupper endnu ikke defineret. Da TTR-bindende kemikalier er til stede i miljøet, er det vigtigt at forstå den taksonomiske relevans af denne AOP, en udfordring, der delvist kan løses gennem SeqAPASS-analyse. Ved hjælp af værktøjets problemformuleringsstrategi kan formålet med analysen angives som følger: Med viden om, at TTR-bindende forbindelser fører til negative resultater hos mennesker, hvilke taksonomiske grupper forventes at dele lignende modtagelighed?

Det humane transthyretinprotein er godt karakteriseret, og der er flere velundersøgte ligander, der vides at binde på det humane TTR (hTTR) bindingssted, hvilket gør det til et optimalt mål for SeqAPASS-analyse 8,9,13. Ved hjælp af NCBI-tiltrædelsen for humant transthyretin, P02766.1, blev der udført en niveau 1-analyse med standardindstillinger. Resultaterne af niveau 1-analysen satte den procentvise lighedsafskæring til 49%, hvor pattedyr (Mammalia), fugle (Aves), krybdyr (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibier (Amfibier) og de fleste fiskearter (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) falder over denne afskæring (figur 3). Således resulterede alle arter fra disse taksonomiske grupper i en følsomhedsforudsigelse af "Y" (dvs. ja) og er sandsynligvis modtagelige for kemikalier, der vides at interagere med hTTR (figur 3 og supplerende fil 1).

Til niveau 2-vurderingen af funktionelle domæner blev NCBI's database over bevarede domæner anvendt til at identificere TR_THY (tiltrædelse smart00095) som et konserveret domæne, der omfatter den modne kæde af TTR-underenhedsproteinet fra restkoncentrationerne 27 til 147. Da proteinsekvensen af TTR rapporteret i NCBI inkluderer et 20 aminosyre-præsegment, der ikke er relevant for den aktuelle analyse, giver fokusering af sammenligningen på den modne kæde en yderligere, mere specifik bevislinje mod bevarelse af dette protein på tværs af arter. Fra niveau 2-evalueringen blev der rapporteret en procentvis lighedsafskæring på 58%, hvor pattedyr, fugle, krybdyr, padder og de fleste fiskearter igen faldt over denne afskæring (figur 4). SeqAPASS konkluderede derfor en følsomhedsforudsigelse af "Y" (dvs. ja) for arter fra disse taksonomiske grupper, hvilket indikerer, at de sandsynligvis er modtagelige for kemikalier, der interagerer med hTTR-proteinet (figur 4 og supplerende fil 1). Samlet set tyder resultater fra niveau 1- og niveau 2-analyser på, at de fleste hvirveldyrarter deler bevarelse af hTTR og sandsynligvis er modtagelige for kemikalier, der vides at interagere med dette protein.

Figure 3
Figur 3: SeqAPASS niveau 1 analyse af transthyretinbevarelse på tværs af taksonomiske grupper med tilgængelig sekvensinformation i forhold til det humane protein. Procent lighed mellem proteinaminosyresekvensen vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åbne cirkler (○) angiver forespørgselssekvensen, og lukkede cirkler (●) angiver arten inden for den taksonomiske gruppe med den højeste procentvise lighed. Inden for plottet repræsenterer toppen og bunden af hver boks 75. og 25. percentilerne, whiskers strækker sig til 1, 5 gange interkvartilområdet, og middel- og medianværdierne er repræsenteret af vandrette sorte linjer på kassen. Den stiplede linje angiver afskæringen for følsomhedsforudsigelser. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: SeqAPASS niveau 2 analyse af transthyretinreceptorligandbindende domænebevarelse på tværs af taksonomiske grupper med tilgængelig sekvensinformation i forhold til det humane protein LBD. Procent lighed mellem ligandbindingsdomænets aminosyresekvens vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åbne cirkler (○) angiver forespørgselssekvensen, og lukkede cirkler (●) angiver arten inden for den taksonomiske gruppe med den højeste procentvise lighed. Inden for plottet repræsenterer toppen og bunden af hver boks 75. og 25. percentilerne, whiskers strækker sig til 1, 5 gange interkvartilområdet, og middel- og medianværdierne er repræsenteret af vandrette sorte linjer på kassen. Den stiplede linje angiver afskæringen for følsomhedsforudsigelser. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Gennem analysen af molekylær modellering og proteinkrystallografiundersøgelser blev aminosyrer identificeret i bindingsområdet af TTR, der forudsiges at interagere med den endogene ligand 3,3′,5,5′-tetraiodo-L-thyronin (T4, PDB 2ROX) samt tre miljøkemikalier: perfluoroctansulfonat (PFOS, PDB 5JIM), tetrabromobisphenol A (TBBPA, PDB 5HJG) og diethylstilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Aminosyreresterne Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 og Thr139 blev alle identificeret som en nøglerolle i protein-ligand-interaktioner, enten gennem direkte hydrogenbindingsinteraktioner eller van der Waals-interaktioner. Disse seks aminosyrerester blev evalueret i en niveau 3-analyse på tværs af arter ved hjælp af hTTR som skabelonsekvens og eksklusive ikke-homologe, hypotetiske, delvise og lavkvalitetssekvenser (supplerende fil 1). Da det tidligere blev fastslået, at TTR kun bevares på tværs af hvirveldyrarter, blev hvirvelløse arter udelukket fra denne analyse (figur 3 og figur 4). Derudover er det vigtigt at bemærke, at aminosyrepositioner, der er rapporteret i litteraturen, udelukker et 20 aminosyre-præsegment, der er fraværende i det modne hTTR-protein, og af denne grund blev positioner indsendt i niveau 3 justeret fra dem, der blev rapporteret i litteraturen for at sikre nøjagtig justering til det valgte skabelonprotein15 (supplerende fil 1).

I niveau 3-analysen af TTR blev 294 hvirveldyrarter udvalgt til justering (pattedyr, fugle, padder, krybdyr og fisk). Af de evaluerede arter viste 18 forskelle i vigtige aminosyrer, hvilket resulterede i en følsomhedsforudsigelse af "N" (dvs. nej). Interessant nok præsenterede fem arter af havpattedyr en aminosyresubstitution ved position 2 (128A), mens fire fiskearter viste substitutioner på enten position 2 (128A) eller position 6 (139T) (figur 5). Da disse aminosyrer spiller vigtige roller i protein-ligand-interaktioner i TTR's bindingskanal, tyder disse data på, at TTR-ligander kan interagere forskelligt i disse arter og ville resultere i forskellig kemisk modtagelighed i forhold til mennesker.

Figure 5
Figur 5: SeqAPASS niveau 3 analyse af bevarelsen af aminosyrerester, der er vigtige for TTR-kemisk binding. (A) Niveau 3 oversigtstabel, der viser antallet af arter med tilgængelige sekvensdata på tværs af alle taksonomiske grupper, antallet af arter, der forventes at være tilsvarende modtagelige (Y), og antallet af arter, der forventes ikke at være tilsvarende modtagelige (N). (B) Niveau 3 varmekort, der viser udvalgte arter, der forventes ikke at være tilsvarende modtagelige i forhold til det humane transthyretin TTR-protein, og som viser fulde, delvise og ikke-matchende aminosyrer. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som svar på feedback fra interessenter og brugere er nye funktioner blevet designet og indarbejdet i SeqAPASS-værktøjet, herunder muligheden for at oprette forbindelse til empiriske data til forskellige applikationer. Dette værktøjs interoperabilitet med ECOTOX's videnbase (tabel 1) blev opnået ved både at integrere eksterne links i niveau 1- og niveau 2-datatabellerne for tiltrædelser i ECOTOX og ved at oprette en ECOTOX-widget i værktøjet til direkte filtrering til de mest relevante toksicitetsdata i ECOTOX. Via linkene og widgetten kan brugerne hurtigt forespørge ECOTOX og indsamle tilsvarende toksicitetsdata for arter med SeqAPASS-følsomhedsforudsigelser. I øjeblikket er SeqAPASS-forudsigelser forbundet med ECOTOX gennem en kemisk stressor og art; toksicitetsdata er dog endnu ikke knyttet til specifikke gener/proteiner, hvilket ville give mulighed for direkte forbindelser til de specifikke endepunkter/molekylære mål af interesse i SeqAPASS. Mens det ikke er ideelt at forbinde forudsigelser med toksicitetsdata baseret på en kemisk stressor, da data muligvis ikke er specifikke for en given vej, er det første skridt at etablere en forbindelse for at bringe resultater sammen. Som den første iteration af en SeqAPASS-ECOTOX-integration giver den nuværende tilgang brugerne alle tilgængelige toksicitetsdata for den eller de kemiske stressorer og arter på et bredt niveau. Disse data kan, når de kombineres med SeqAPASS-forudsigelser, give kontekst på brede niveauer (hvirveldyr vs. hvirvelløse dyr) og kan overvejes inden for rammerne af AOP-rammen.

TTR er et godt eksempel på at undersøge denne forbindelse, da den eksisterende AOP (AOP 152) giver kontekst til fortolkning af potentielt relevante ECOTOX-toksicitetsdata. Begyndende med de ligander, der blev undersøgt i SeqAPASS niveau 3, blev miljøtoksicitetsdata indsamlet på tværs af arter for fire kemikalier, der vides at interagere med TTR-ligandbindingsdomænet (diethylstilbestrol [DES], perfluorhexansyre [PFHxA], perfluoroctansulfonat [PFOS] og tetrabromobisphenol A [TBBPA])19,21,23,24 . For hvert kemikalie blev ECOTOX forespurgt efter data for vand- og terrestriske data af CAS-nummeret (Chemical Abstracts Service) ved hjælp af brugerdefinerede søgeparametre (supplerende fil 1). Data blev filtreret til artsgrupper af interesse (amfibier, fugle, fisk, hvirvelløse dyr, pattedyr, krybdyr). Inden for de filtrerede forespørgselsresultater blev et gennemsnit af undersøgelsens minimums- og maksimumseffektkoncentrationer beregnet og implementeret som en tilnærmelse til gennemsnittet for eventuelle hits, der ikke rapporterede en koncentrationsværdi for middeleffekt (figur 6A og supplerende fil 1). Inden for rammerne af et enkelt kemikalie blev Kruskal-Wallis-test udført for at sammenligne middeleffektkoncentrationerne i forskellige taksonomiske grupper, da dataene ikke opfyldte ANOVA-testantagelserne. Post-hoc parvise sammenligningstest blev derefter udført ved hjælp af Dunn's Test for alle kemikalier, da de taksonomiske grupper bestod af ulige prøvestørrelser. Akvatiske og terrestriske resultater blev analyseret separat, da data mellem de to typer eksponeringer ikke er direkte sammenlignelige. Inden for COTOKX forelå der data om akvatisk toksicitet for de udvalgte kemikalier for padder, fugle, hvirvelløse dyr og fiskearter (figur 6A). Data om terrestrisk toksicitet for de udvalgte kemikalier var kun tilgængelige for pattedyr og DES (supplerende fil 1).

Figure 6
Figur 6: Sammenkædning af SeqAPASS-resultater med empiriske data. (A) Koncentrationer af middeleffekt på tværs af taksonomiske grupper med data tilgængelige i ECOTOXicology-videnbasen for udvalgte kemikalier, der vides at binde til det humane TTR-protein. B) Overlapning af antallet af arter, der indgår i hver SeqAPASS-analyse, med de arter, for hvilke der forelå ECOTOX-data. I panel A angiver parenteser langs x-aksen antallet af forespørgselshits, for hvilke data blev aggregeret. Stjerner angiver par med signifikant forskellige effektkoncentrationer mellem artsgrupper inden for rammerne af et enkelt kemikalie (Dunns test, p < 0,05), hvor et højere antal stjerner indikerer stærkere signifikansniveauer (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Midterlinjerne i hver boks repræsenterer medianen, med bokskanter, der viser interkvartilområdet. Whiskers strækker sig op til 1,5 gange interkvartilområdet. Outliers, der falder uden for dette interval, vises som individuelle punkter. Forkortelser: TTR = transthyretin; SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter; ECOTOX = ECOTOXicology vidensbase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Samlet set tyder disse data på, at bioaktivitet for de vurderede kemikalier forekommer hos hvirveldyrarter, men ikke forekommer hos hvirvelløse dyr. Mens manglen på biologisk mål- og vejinformation i ECOTOX gør det umuligt at forbinde disse empiriske data direkte med TTR, understøtter disse resultater SeqAPASS-forudsigelserne om, at hvirvelløse arter ikke deler modtagelighed. Alle hvirveldyrarter med tilgængelige data viste modtagelighed for både PFOS og TBBPA, selv om middeleffektkoncentrationerne var signifikant højere hos fisk og fugle end padder. Disse data tyder på potentielle forskelle i følsomhed mellem taksonomiske grupper, der kan tilskrives biologiske vejforskelle (herunder TTR). Det er bemærkelsesværdigt, at andre variabler som metabolisme og udskillelse også kan spille en rolle i forskelle i følsomhed. For PFHxA og PFOS viste det sig, at fisk var signifikant mere følsomme end både hvirvelløse dyr og fugle, og for DES havde padder signifikant højere middeleffektkoncentrationer end hvirvelløse dyr. Igen understøtter disse data vores SeqAPASS-forudsigelse om, at hvirvelløse dyr ikke deler modtagelighed med hvirveldyrarter. Af alle arter, der blev vurderet ved hjælp af dette værktøj, og for hvilke der forelå TTR-sekvensdata, havde kun et lille antal tilsvarende ECOTOX-data for de fire relevante kemikalier (figur 6B, supplerende tabel S1 og supplerende tabel S2). For de arter, der mangler apikale data, tilføjer SeqAPASS-forudsigelser af modtagelighed yderligere beviser for, at beslægtede arter kan opføre sig på samme måde som dem med apikale data. Data for alle SeqAPASS- og ECOTOX-analyser er tilgængelige i supplerende fil 1.

Ifølge Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bidrog opioider i 2017 til omkring 47.600 dødsfald ved overdosering i USA, et tal, der fortsætter med at stige27. Spildevandsanlæg i USA reguleres nationalt af US Environmental Protection Agency's National Pollutant Discharge Elimination System, som ikke kræver test for opioider eller andre lægemidler i deres udledning28. I de senere år er der gjort en indsats for at bruge spildevandsbaseret epidemiologi som et redskab til at kortlægge samfundets opioidbrug. Opioidovervågningsindsatsen har påvist koncentrationer så høje som 1,27 μg/L i spildevand og 0,7 μg/l i overfladevand29,30. Nylige toksicitetsundersøgelser, der vurderer virkningen af opioideksponering på fisk, har rapporteret udviklingen af vanedannende adfærd og negative immunologiske virkninger (f.eks. højere infektionsrater, nedregulering af immungener)31,32,33. Samlet set tyder disse undersøgelser på, at der er potentiale for negative miljømæssige opioideksponeringer og fremhæver vigtigheden af at forstå den risiko, disse kemikalier udgør for akvatiske arter. I betragtning af omfanget af arter, der kan støde på disse forbindelser i miljøet, kan identifikation af potentielt modtagelige arter ved hjælp af SeqAPASS være vigtig for prioriteringen af test- eller overvågningsindsatsen.

MOR udgør det vigtigste opioidmål for behandling af smerte og er ansvarlig for de kraftige smertestillende og vanedannende egenskaber af opiatalkaloider hos mennesker34,35. På grund af denne receptors betydning for menneskers sundhed er MOR-ligander velkendte, og røntgenkrystallografiundersøgelser af høj kvalitet er tilgængelige, hvilket gør dette mål ideelt til SeqAPASS-analyse 8,9,13. Ved hjælp af NCBI-tiltrædelsen for human μ opioidreceptor, ACM90349.1, blev der udført en niveau 1-analyse ved hjælp af standardindstillinger. Følsomhedsafskæringen blev etableret ved 55% for niveau 1, med procentvise ligheder for pattedyr (Mammalia), fugle (Aves), krybdyr (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibier (Amfibier) og de fleste fiskearter (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes), der falder over denne afskæring; derfor resulterede arter fra disse taksonomiske grupper i en følsomhedsforudsigelse af "Y" (dvs. ja), hvilket indikerer, at de sandsynligvis ville være modtagelige for kemikalier, der vides at interagere med human MOR (figur 7 og supplerende fil 1). Ved hjælp af NCBI Conserved Domain Database blev 7tmA_Mu_opioid_R identificeret (tiltrædelse cd15090) som et funktionelt domæne bestående af alle syv helices af MOR-proteinet fra 133 til 411, herunder et formodet ligandbindingssted. Sammenlignet med niveau 1 identificerede niveau 2-resultaterne en højere modtagelighedsafskæring på 88% lighed med pattedyr, fugle, krybdyr, padder og de fleste fiskearter, der findes over denne afskæring og resulterer i en følsomhedsforudsigelse af "Y" for ja (figur 8). Samlet set tyder resultater fra niveau 1- og niveau 2-analyser på, at de fleste hvirveldyrarter deler bevarelse af MOR og sandsynligvis vil være modtagelige for kemikalier, der vides at interagere med human MOR.

Figure 7
Figur 7: SeqAPASS niveau 1 analyse af μ opioidreceptorbevarelse på tværs af taksonomiske grupper med tilgængelig sekvensinformation i forhold til det humane protein. Procent lighed mellem proteinaminosyresekvensen vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åbne cirkler (○) angiver forespørgselssekvensen, og lukkede cirkler (●) angiver arten inden for den taksonomiske gruppe med den højeste procentvise lighed. Inden for plottet repræsenterer toppen og bunden af hver boks de 75. og 25. percentiler, whiskers strækker sig til 1, 5 gange interkvartilområdet, og middel- og medianværdierne er repræsenteret af vandrette sorte linjer på kassen. Den stiplede linje angiver afskæringen for følsomhedsforudsigelser. Forkortelser: MOR = mu-opioid receptor; SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: SeqAPASS niveau 2 analyse af den μ opioidreceptorligandbindende domænebevarelse i forhold til domænet i det humane protein. Procent lighed mellem det ligandbindende domæneaminosyresekvens vises på Y-aksen; taksonomisk gruppe vises på X-aksen. Åbne cirkler (○) angiver forespørgselssekvensen, og lukkede cirkler (●) angiver arten inden for den taksonomiske gruppe med den højeste procentvise lighed. Inden for plottet repræsenterer toppen og bunden af hver boks de 75. og 25. percentiler, whiskers strækker sig til 1, 5 gange interkvartilområdet, og middel- og medianværdierne er repræsenteret af vandrette sorte linjer på kassen. Den stiplede linje angiver afskæringen for følsomhedsforudsigelser. Forkortelser: MOR = mu-opioid receptor; SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Gennem analyse af molekylær modellering og proteinkrystallografiundersøgelser blev aminosyrer identificeret i bindingsområdet af MOR, der forudsiges at interagere med kendte ligander. Selvom det forskellige sæt ligander, der binder godt til opioidreceptorer, resulterer i kompleks farmakologi, observeres nogle konsistente ligand-proteininteraktioner36,37. Baseret på molekylær docking til forskellige MOR-krystalstrukturer, både morfin og fentanyl, mor-agonister med høj affinitet, interagerer med D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 og Y32636,38. Rester D147, Y148, M151 og H297 er også impliceret i krystalstrukturer af MOR bundet til morfinagonisten BU72, mens D147, M151, H297 og Y326 også er kritiske for bindingen til den irreversible morfinantagonist β-funaltrexamine37. I betragtning af disse bevislinjer blev ni restkoncentrationer udvalgt (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) til niveau 3-evaluering ved hjælp af human MOR som skabelonsekvens og eksklusive delvise, forudsagte, hypotetiske og lavkvalitetssekvenser. Det er vigtigt, at aminosyrepositioner, der er rapporteret i litteraturen, udelukker et 64-aminosyresegment i forhold til NCBI-proteintiltrædelsen, og af denne grund blev positioner i niveau 3 valgt til at repræsentere dem, der var på linje med skabelonsekvensen for korrekte justeringssekvenser.

I niveau 3-analysen af den menneskelige MOR blev 284 arter vurderet på tværs af hvirveldyrarter (pattedyr, fugle, padder, krybdyr og fisk). På tværs af alle evaluerede arter var de ni aminosyrer enten et totalt match eller et delvist match baseret på sidekædeklassificering og molekylvægt; derfor resulterede alle vurderede arter i en følsomhedsforudsigelse af "Y" for ja (tabel 3 og supplerende fil 1). Da disse aminosyrer er vigtige i bindingen af både stærke MOR-agonister og stærke antagonister, tyder disse data på, at opioidforbindelser rettet mod humane μ opioidreceptorer kan interagere på samme måde med receptorer på tværs af hvirveldyrarter. Selv om der til dato kun er få empiriske data tilgængelige inden for ECOTOX-videnbasen for opioidforbindelser, tyder flere undersøgelser på, at fisk sandsynligvis er modtagelige31,32,33. Samlet set peger resultater fra SeqAPASS på potentialet for bredere miljøpåvirkninger af MOR-modulerende kemikalier på tværs af arter, hvilket indikerer, at mere forskning og måske overvågning kan være værdifuld. Data for alle analyser findes i supplerende fil 1.

Tabel 3: SeqAPASS niveau 3 analyse af bevarelsen af aminosyrerester, der er vigtige for kemisk binding til den μ opioidreceptor. Oversigtstabel, der viser antallet af arter med tilgængelige sekvensdata på tværs af alle taksonomiske grupper, antallet af arter, der forventes at være tilsvarende modtagelige (Y), og antallet af arter, der forventes ikke at være tilsvarende modtagelige, samt fulde, delvise og ikke-matchende aminosyrer. Forkortelse: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S1: Arter med tilgængelige ECOTOX-data for de fire kemikalier af interesse, der vides at binde til det humane transthyretinprotein. Data, der er tilgængelige for hvert kemikalie, er tilpasset SeqAPASS-forudsigelser af lignende modtagelighed på tværs af niveau 1, 2 og 3. Alle SeqAPASS-forudsigelser i forhold til den humane transthyretinsekvens. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter; DES = diethylstilbestrol; PFHxA = perfluorhexansyre; PFOS = perfluoroctansulfonsyre; TBBPA = tetrabromobisphenol A. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel S2: Samlet antal arter med tilgængelige data på tværs af SeqAPASS- og ECOTOX-evalueringer for udvalgte kemikalier, der vides at binde til det humane transthyretinprotein. SeqAPASS giver mulighed for at forudsige artsmodtagelighed på tværs af mange arter, for hvilke empiriske toksicitetsdata ikke er tilgængelige. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: SeqAPASS- og ECOTOX-data for alle repræsentative resultater. Filen indeholder ToC efterfulgt af følgende datablade: Tab 1-hTTR SeqAPASS-resultatniveau 1, fane 2-hTTR SeqAPASS-resultater niveau 2, fane 3-hTTR SeqAPASS-resultater niveau 3, fane 4-EcoTox-data for DES, tab 5-EcoTox-data for PFOS, tab 6-EcoTox-data for PFHxA, tab 7-EcoTox-data for TBBPA, tab 8-EcoTox-gruppegennemsnitsberegninger, Tab 9-SeqAPASS EcoTox Datasammenligninger, Tab 10-hMOR SeqAPASS Resultater Niveau 1, Tab 11-hMOR SeqAPASS Resultater Niveau 2 og Tab 12-μ-hMOR SeqAPASS Resultater Niveau 3. Forkortelser: SeqAPASS = sekvensjustering for at forudsige følsomhed på tværs af arter; ToC = indholdsfortegnelse; hTTR = humant transthyretin; ECOTOX = Økotoksikologisk videnbase; DES = diethylstilbestrol; PFOS = perfluoroctansulfonsyre; PFHxA = perfluorhexansyre; TBBPA = tetrabromobisphenol A; hMOR = human mu-opioid receptor. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er udbredt erkendelse af, at det ikke er muligt empirisk at teste nok arter til at fange den genomiske, fænotypiske, fysiologiske og adfærdsmæssige mangfoldighed af levende organismer, der kan blive udsat for kemikalier af toksikologisk interesse. Målet med SeqAPASS er at maksimere brugen af eksisterende og kontinuerligt voksende proteinsekvens- og strukturdata for at hjælpe og informere ekstrapoleringen af kemiske toksicitetsdata / viden fra testede organismer til hundreder eller tusinder af andre arter gennem sammenligninger på molekylært niveau. SeqAPASS-værktøjet blev designet til at reducere kompleksiteten af proteinsekvenssammenligninger for forskere, risikovurderinger og regulatorer gennem en strømlinet og hurtig analyse, der inkluderer gennemsigtigt genererede og downloadbare oversigtstabeller, interaktive datavisualiseringer og nem identifikation af truede og truede arter samt almindelige modelorganismer. Protokoller er beskrevet her for at køre SeqAPASS niveau 1, 2 og 3 til evaluering af primær aminosyresekvenslighed, funktionel domænebevarelse og kritiske aminosyrer involveret i interaktioner mellem kemisk protein og protein-protein. Bevislinjer indsamlet fra hvert niveau af SeqAPASS-analyse forudsiger kemisk modtagelighed på tværs af arter, hvilket giver konsistente og let fortolkelige data. Til dato er dette værktøj blevet brugt på tværs af en bred vifte af applikationer, herunder identifikation af kemikalier, der binder til visse receptorer og vurdering af læsepotentiale for hvirveldyrs økologiske receptorer med pattedyrsystemer. Derudover er to casestudier med fokus på skjoldbruskkirtelhormonfordelingsproteinet, TTR og MOR beskrevet her for at demonstrere de nye funktioner og funktionalitet i SeqAPASS v2 til v6.

Som med enhver beregningsmæssig tilgang er evnen til at generere forudsigelser af artsmodtagelighed inden for SeqAPASS-værktøjet meget afhængig af input af passende parametre 8,9,13. Det er derfor afgørende, at der forud for gennemførelsen af en analyse udføres et problemformuleringstrin for at undersøge eksisterende data og litteratur for det tilsigtede mål. Start af en analyse med viden om proteinmålet giver brugeren mulighed for at identificere passende proteintiltrædelsesnumre og sekvenser af høj kvalitet. På samme måde sikrer viden om en følsom eller målrettet art eller om modelorganismer, der anvendes i assays eller AOP-udvikling, udvælgelsen af en passende forespørgselsart, som alle andre arter sammenlignes med. Valg af funktionelle domæner for niveau 2 og kritiske aminosyrerester til niveau 3 er også kritiske trin, der kræver, at brugeren identificerer passende inputparametre for at generere forudsigelser. På grund af dette behov for allerede eksisterende viden om en interaktion mellem kemikalier og protein integrerer de seneste versioner af SeqAPASS-værktøjet brugervenlige ressourcer, der er designet til at hjælpe brugerne med at guide brugerne til relevante oplysninger til indledning af en forespørgsel (f.eks. links til andre værktøjer) (tabel 2 og figur 2). Derudover er pop op-informationsmeddelelser og advarsler blevet integreret i værktøjet for at guide brugeren gennem analysen og hjælpe med at informere brugeren om eventuelle fejl, der skal løses.

Kompleksiteten af kemisk-biologiske interaktioner udgør en begrænsning af SeqAPASS-værktøjet. Ved ekstrapolering af toksicitetsdata på tværs af arter er bevarelsen af det molekylære mål en af mange faktorer, der skal overvejes. Adsorption, distribution, metabolisme og udskillelse (ADME) af et kemikalie er afgørende, når man overvejer kemisk toksicitet, da kemikalier enten kan aktiveres eller afgiftes ved disse processer39,40. Andre faktorer, såsom vejen for kemisk eksponering, organismens livsstadium og livshistorie og kost, kan også spille vigtige roller i bestemmelsen af kemisk følsomhed på tværs af arter samt41,42. For at imødegå denne begrænsning er det vigtigt at forstå det hovedspørgsmål, SeqAPASS stiller, når man forudsiger kemisk modtagelighed: er det sandsynligt, at et kemikalies proteinmål er til stede i en anden art, som kemikaliet kan handle på? Dette spørgsmål behandles ved at identificere ortologkandidater og overveje bevarelsen af dette mål på tværs af arter i forhold til en kendt følsom eller målrettet art. Disse oplysninger kan bruges som en evidenslinje for ekstrapolering på tværs af arter og integreres i andre evidensstrømme (f.eks. potentialet for eksponering) for bedre at forstå arternes modtagelighed for kemiske stressfaktorer. Opdateringer til SeqAPASS har indarbejdet integrerede links til eksterne værktøjer, herunder den amerikanske EPA ECOTOX-vidensbase43 og US Fish & Wildlife Service Environmental Conservation Online System (ECOS)44. Forbindelse til disse databaser giver SeqAPASS-brugere let adgang til empiriske kemiske toksicitetsdata til sammenligning med sekvensbaserede forudsigelser og et middel til at identificere arter, der kan have beskyttet status.

SeqAPASS-værktøjet giver en videnskabeligt baseret platform til beregningsmæssige forudsigelser af iboende modtagelighed, der understøttes af begreber i evolutionær biologi og caseeksempler, der sammenligner forudsigelser med tilgængelige empiriske resultater. Derudover er SeqAPASS gratis og offentligt tilgængelig på en velunderstøttet webbaseret platform, der er bredt tilgængelig (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Da dette værktøj udnytter sekvensdata og proteininformation fra eksisterende databaser, forbedres dets evne til at forudsige kemisk modtagelighed i en bredere mangfoldighed af arter konstant, efterhånden som sekventeringsteknologien skrider frem, og genomerne fra nye arter sekventeres og kommenteres. Selv om dette giver klare fordele med hensyn til datatilgængelighed, udgør det også en begrænsning, idet offentligt tilgængelige sekvensoplysninger kan være underlagt inkonsekvent kvalitet, dårlig annotation og ufuldstændighed af proteinsekvenser for nogle arter. Det er imidlertid lovende, at omics-teknologier og -metoder inden for bioinformatik udvikler sig hurtigt, og derfor vil sekvenskuratering og kvalitet sandsynligvis fortsætte med at forbedre sig over tid.

Et vigtigt mål med SeqAPASS-værktøjet er gennemsigtighed, der giver adgang i form af links til alle datakilder og værktøjer, der er integreret i backend. En sådan gennemsigtighed giver brugeren hurtig adgang til de oprindelige kilder til sekvensen eller taksonomiske oplysninger fra NCBI. Anvendelsesområdet for dette værktøj er defineret af de oplysninger, der er nødvendige for at foretage en meningsfuld analyse. Da viden om en interaktion mellem kemisk protein eller proteinprotein i en kendt følsom eller målrettet art er nøgleelementer for at starte en forespørgsel, må det erkendes, at forespørgsler, der udføres uden disse oplysninger, ikke er meningsfulde. Derudover udgør kemikalier, der har flere udefinerede biologiske mål eller interagerer med forskellige mål med forskellige grader af styrke, også en udfordring og begrænsning af værktøjet i dets nuværende form. Det forventes, at med forbedret bioinformatik, beregningsmodellering og cellebaseret, high-throughput screening og transkriptomics, vil større viden på tværs af mangfoldigheden af kemiske rum vedrørende interaktioner med specifikke proteiner fortsat blive belyst. Det forventes, at evnen til at anvende SeqAPASS på bredere udfordringer ved artsekstrapolering i forhold til at forstå potentialet for negative kemiske virkninger på tværs af arternes mangfoldighed fortsat vil blive forbedret.

Afslutningsvis er SeqAPASS-værktøjet en tilgængelig platform, der let anvender molekylær information til at tackle den betydelige udfordring med ekstrapolering på tværs af arter i kemikaliesikkerhedsevalueringer. Selvom de eksempler, der er fremhævet her, er fokuseret på at generere forudsigelser af kemisk modtagelighed, kan resultaterne også hjælpe med at forstå den samlede bevarelse af biologiske veje. Dette værktøj samler forskellige bevislinjer og letter adgangen til flere platforme og databaser og hjælper med at opbygge gennemsigtige sager til prioritering af kemisk testning og tildeling af ressourcer. Med den fortsatte udvikling af videnskabelige og bioinformatiske kapaciteter vil værktøjets magt og anvendelighed fortsætte med at vokse og forbedres for at imødekomme behovene hos forsknings- og reguleringssamfund, samtidig med at de ressourcer, der kræves til vurderinger på tværs af arter, reduceres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Daniel L. Villeneuve (U.S. EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) og Dr. Jon A. Doering (Department of Environmental Sciences, Louisiana State University) for at have givet kommentarer til et tidligere udkast til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af U.S. Environmental Protection Agency. De synspunkter, der udtrykkes i dette papir, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis synspunkterne eller politikkerne fra US Environmental Protection Agency, og omtalen af handelsnavne eller kommercielle produkter indikerer heller ikke godkendelse fra den føderale regering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor's highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. Richardson, S. J., Cody, V. , Springer. Berlin Heidelberg, Germany. 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths - United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. EPA. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018).
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. EPA. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021).
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service. , Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021).

Tags

Genetik udgave 192 ekstrapolering på tværs af arter økotoksikologi prædiktiv toksikologi ny tilgangsmetode opioidreceptor transthyretin
Demonstration af sekvensjusteringen for at forudsige følsomhedsværktøj på tværs af arter til hurtig vurdering af proteinbevarelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz,… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter