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Genetics

Demonstração do alinhamento da sequência para prever a ferramenta de suscetibilidade entre espécies para avaliação rápida da conservação de proteínas

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para utilizar a versão mais recente da ferramenta Alinhamento de Sequência da Agência de Proteção Ambiental dos EUA para Prever a Suscetibilidade entre Espécies (SeqAPASS). Este protocolo demonstra a aplicação da ferramenta on-line para analisar rapidamente a conservação de proteínas e fornecer previsões personalizáveis e facilmente interpretáveis de suscetibilidade química entre espécies.

Abstract

A ferramenta Alinhamento de Sequência da Agência de Proteção Ambiental dos EUA para Prever a Suscetibilidade entre Espécies (SeqAPASS) é um aplicativo de triagem on-line rápido, disponível gratuitamente e que permite que pesquisadores e reguladores extrapolem informações de toxicidade entre espécies. Para alvos biológicos em sistemas modelo, como células humanas, camundongos, ratos e peixes-zebra, os dados de toxicidade estão disponíveis para uma variedade de produtos químicos. Através da avaliação da conservação do alvo de proteínas, esta ferramenta pode ser usada para extrapolar dados gerados a partir de tais sistemas modelo para milhares de outras espécies sem dados de toxicidade, produzindo previsões de suscetibilidade química intrínseca relativa. As versões mais recentes da ferramenta (versões 2.0-6.1) incorporaram novos recursos que permitem a rápida síntese, interpretação e uso dos dados para publicação, além de gráficos de qualidade de apresentação.

Entre esses recursos estão visualizações de dados personalizáveis e um relatório de resumo abrangente projetado para resumir os dados do SeqAPASS para facilitar a interpretação. Este artigo descreve o protocolo para orientar os usuários através do envio de trabalhos, navegando pelos vários níveis de comparações de sequências de proteínas e interpretando e exibindo os dados resultantes. Novos recursos do SeqAPASS v2.0-6.0 são destacados. Além disso, são descritos dois casos de uso focados na conservação da transtirretina e da proteína do receptor opioide usando essa ferramenta. Finalmente, os pontos fortes e limitações do SeqAPASS são discutidos para definir o domínio de aplicabilidade da ferramenta e destacar diferentes aplicações para extrapolação entre espécies.

Introduction

Tradicionalmente, o campo da toxicologia tem se baseado fortemente no uso de testes em animais inteiros para fornecer os dados necessários para as avaliações de segurança química. Tais métodos são tipicamente caros e consomem muitos recursos. No entanto, devido ao grande número de produtos químicos atualmente utilizados e ao ritmo acelerado em que novos produtos químicos estão sendo desenvolvidos, globalmente há uma necessidade reconhecida de métodos mais eficientes de triagem química 1,2. Essa necessidade e a mudança de paradigma resultante dos testes em animais levaram ao desenvolvimento de muitos novos métodos de abordagem, incluindo ensaios de triagem de alto rendimento, transcriptômica de alto rendimento, sequenciamento de próxima geração e modelagem computacional, que são estratégias alternativas de teste promissoras 3,4.

Avaliar a segurança química em toda a diversidade de espécies potencialmente impactadas por exposições químicas tem sido um desafio duradouro, não apenas com os testes tradicionais de toxicidade, mas também com novos métodos de abordagem. Os avanços na toxicologia comparativa e preditiva forneceram estruturas para a compreensão da sensibilidade relativa de diferentes espécies, e os avanços tecnológicos nos métodos computacionais continuam a aumentar a aplicabilidade desses métodos. Várias estratégias têm sido discutidas ao longo da última década que alavancam os bancos de dados de sequências de genes e proteínas existentes, juntamente com o conhecimento de alvos moleculares químicos específicos, para apoiar abordagens preditivas para extrapolação entre espécies e melhorar as avaliações de segurança química além dos organismos modelo típicos 5,6,7,8.

Para avançar a ciência em ação, com base nesses estudos fundamentais em toxicologia preditiva, priorizar os esforços de testes químicos e apoiar a tomada de decisões, foi criada a ferramenta Alinhamento de Sequência da Agência de Proteção Ambiental dos EUA para Prever a Suscetibilidade entre Espécies (SeqAPASS). Esta ferramenta é um aplicativo público e disponível gratuitamente baseado na web que usa repositórios públicos de informações de sequência de proteínas em constante expansão para prever a suscetibilidade química em toda a diversidade de espécies9. Com base no princípio de que a suscetibilidade intrínseca relativa de uma espécie a um determinado produto químico pode ser determinada avaliando a conservação dos alvos proteicos conhecidos desse produto químico, esta ferramenta compara rapidamente sequências de aminoácidos proteicos de uma espécie com sensibilidade conhecida a todas as espécies com dados de sequência de proteínas existentes. Esta avaliação é completada através de três níveis de análise, incluindo (1) sequência de aminoácidos primários, (2) domínio funcional e (3) comparações críticas de resíduos de aminoácidos, cada um exigindo um conhecimento mais aprofundado da interação químico-proteína e proporcionando maior resolução taxonômica na predição de susceptibilidade. Uma grande força do SeqAPASS é que os usuários podem personalizar e refinar sua avaliação, adicionando linhas adicionais de evidência para a conservação do alvo com base na quantidade de informações disponíveis sobre a interação química-proteína ou proteína-proteína de interesse.

A primeira versão foi lançada em 2016, que permitiu aos usuários avaliar sequências de aminoácidos primários e domínios funcionais de maneira simplificada para prever a suscetibilidade química e continha recursos mínimos de visualização de dados (Tabela 1). Diferenças individuais de aminoácidos têm se mostrado determinantes importantes de diferenças entre espécies nas interações químico-proteína, o que pode afetar a suscetibilidade química das espécies10,11,12. Portanto, versões subsequentes foram desenvolvidas para considerar os aminoácidos críticos que são importantes para a interação química direta13. Respondendo ao feedback das partes interessadas e dos usuários, essa ferramenta passou por lançamentos de versões anuais com novos recursos adicionais projetados para atender às necessidades de pesquisadores e comunidades regulatórias para enfrentar os desafios na extrapolação entre espécies (Tabela 1). O lançamento do SeqAPASS versão 5.0 em 2020 trouxe recursos centrados no usuário que incorporam opções de visualização e síntese de dados, links externos, opções de tabela de resumo e relatório e recursos gráficos. No geral, os novos atributos e capacidades desta versão melhoraram a síntese de dados, a interoperabilidade entre bancos de dados externos e a facilidade de interpretação de dados para previsões de suscetibilidade entre espécies.

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Protocol

1. Primeiros passos

NOTA: O protocolo apresentado aqui é focado no utilitário da ferramenta e nos principais recursos. Descrições detalhadas de métodos, recursos e componentes podem ser encontradas no site em um Guia do Usuário abrangente (Tabela 1).

Tabela 1: Evolução da ferramenta SeqAPASS. Uma lista de recursos e atualizações adicionados à ferramenta SeqAPASS desde sua implantação inicial. abreviaturas: seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies; ECOTOX = Base de conhecimento ECOTOXicology. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

  1. Acesse https://seqapass.epa.gov/seqapass usando o Chrome. Selecione Login para usar uma conta existente ou siga as instruções para criar uma conta SeqAPASS, que permitirá que os usuários executem, armazenem, acessem e personalizem seus trabalhos concluídos.
  2. Antes de realizar uma análise, primeiro identifique uma proteína de interesse e uma espécie-alvo ou sensível, revisando a literatura existente ou dados pré-existentes (Figura 1). Como o SeqAPASS contém links para recursos externos para ajudar a identificar a proteína de consulta, clique nos botões suspensos em Identificar um alvo de proteína para acessar recursos relevantes.

Figure 1
Figura 1: Formulação do problema SeqAPASS: diagrama esquemático das informações preliminares necessárias para uma análise bem-sucedida. abreviaturas: seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies; LBD = domínio de ligação de ligantes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Interoperabilidade do SeqAPASS entre bancos de dados. Diagrama esquemático de ferramentas, bancos de dados e recursos externos integrados ao SeqAPASS. abreviaturas: seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies; POA = via de desfecho adverso; NCBI = Centro Nacional de Informação em Biotecnologia; ECOTOX = Base de conhecimento ECOTOXicology. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 2: Links, recursos e ferramentas integrados à ferramenta SeqAPASS. Uma lista das várias fontes de dados, links e recursos aproveitados na ferramenta SeqAPASS. Abreviação: SeqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

2. Desenvolvendo e executando uma consulta SeqAPASS: Nível 1

NOTA: Em uma análise de Nível 1, toda a sequência de aminoácidos primários de uma proteína de consulta é comparada com as sequências de aminoácidos primários de todas as espécies com informações de sequência disponíveis. Essa ferramenta usa algoritmos para minerar, coletar e compilar dados disponíveis publicamente para alinhar e comparar rapidamente sequências de aminoácidos entre espécies. O back-end armazena informações dos bancos de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e usa estrategicamente as versões autônomas da Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)54 e da Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)55.

  1. Em Comparar Sequências de Aminoácidos Primários, clique em Por Espécie ou Por Acesso. Use a seleção Por espécie para digitar ou selecionar em uma lista de espécies para escolher o alvo de proteína de interesse.
  2. Envie acessos de proteína (ou seja, ID de proteína NCBI) diretamente inserindo a(s) adesão(ões) na caixa de texto Por Adesão .
  3. Selecione Executar solicitação para enviar a consulta. Uma vez enviado, aguarde até que uma notificação apareça no canto superior direito da janela do navegador, indicando um envio bem-sucedido.
  4. Selecione a guia Status da Execução do SeqAPASS na parte superior da página para exibir uma lista de todas as execuções do SeqAPASS realizadas nessa conta de usuário e verificar a porcentagem de conclusão.
    1. Clique em Atualizar Dados enquanto o botão de opção apropriado está selecionado para verificar o status das execuções de Nível 2 e Nível 3.
  5. Selecione a guia Exibir Relatórios do SeqAPASS na parte superior da página para acessar uma lista de todos os relatórios concluídos nessa conta.
  6. Na guia Exibir Relatórios do SeqAPASS , selecione a proteína de consulta de interesse. Clique em Solicitar Relatório Selecionado para abrir a página Informações de Proteína de Consulta de Nível 1 e exibir resultados, opções de personalização de dados, visualizações e relatórios de resumo.
  7. Por padrão, selecione Exibir Relatório para exibir dados no navegador da Web. Como alternativa, selecione Salvar relatório para baixar dados brutos como um arquivo .zip.
    NOTA: O tempo necessário para uma análise de Nível 1 variará (média de 23 minutos para a versão 5.1) dependendo da demanda global do usuário naquele momento, do número de trabalhos enviados para a fila e da quantidade de informações de proteína que existem para um trabalho enviado. Se um alvo de proteína tiver sido previamente concluído, os dados estarão disponíveis em segundos após a submissão.

3. Desenvolvendo e executando uma consulta SeqAPASS: Nível 2

NOTA: Como toda a sequência de proteínas não está diretamente envolvida em uma interação química, uma análise de Nível 2 compara apenas a sequência de aminoácidos do domínio funcional para fazer previsões de suscetibilidade em classificações taxonômicas mais baixas (por exemplo, classe, ordem, família).

  1. Na página Informações de Proteína de Consulta de Nível 1, clique no sinal de adição + ao lado do cabeçalho Nível 2 para preencher o menu Consulta de Nível 2 .
  2. Identifique o(s) domínio(s) apropriado(s) na proteína de interesse (proteína de consulta).
    1. Se um domínio não tiver sido identificado, clique no link integrado para o NCBI Conserved Domains Database (CDD) (Tabela 1), que pode ajudar na identificação da seleção de domínio apropriada.
      Observação : normalmente, apenas domínios de hit específicos são selecionados como consultas no nível 2.
  3. Clique na caixa Selecionar Domínio para preencher automaticamente uma lista de domínios funcionais para a proteína de consulta.
  4. Selecione a( s) acessão(ões) de domínio na lista suspensa e inicie a consulta de Nível 2 clicando no botão Solicitar Execução de Domínio . Uma vez enviado, aguarde até que uma notificação apareça indicando um envio bem-sucedido.
  5. Clique em Atualizar execuções de Nível 2 e 3 para preencher os dados de Nível 2 , que estarão disponíveis em segundos após o envio.
  6. Em Exibir Dados de Nível 2, selecione a(s) adesão(ões) de domínio concluída(s) na lista suspensa e clique no botão Exibir Dados de Nível 2 para abrir os resultados em uma nova página.

4. Acesso e compreensão dos dados: SeqAPASS Nível 1 e Nível 2

  1. Role até a parte inferior da página Informações sobre a Proteína de Consulta para exibir um relatório dos resultados - um Relatório Primário é fornecido com análises de Nível 1 e 2 por padrão. Selecione o botão de opção Relatório completo para exibir um relatório mais detalhado que forneça todos os hits de sequência e métricas de alinhamento. Clique na acessão/ID/nome apropriado em ambos os relatórios para acessar as informações transparentes de alinhamento e taxonomia de proteínas no banco de dados NCBI.
  2. Role até o lado direito da tabela de resultados para exibir a coluna ECOTOX . Clique em links para a base de conhecimento ECOTOXicology (ECOTOX) para coletar rapidamente dados de toxicidade correspondentes para espécies com previsões de suscetibilidade.
    NOTA: O ECOTOX é uma base de conhecimentos abrangente e publicamente disponível que fornece dados únicos de toxicidade química para plantas aquáticas e terrestres e animais selvagens. O SeqAPASS v6.0 inclui um widget ECOTOX para se conectar com dados ECOTOX relevantes mais rapidamente por produtos químicos e espécies de interesse.
  3. Clique em Baixar Tabela para salvar a tabela como um arquivo de planilha. Clique no botão Exibir Relatório de Resumo para exibir e baixar uma tabela de relatório de resumo que apresenta dados classificados por grupo taxonômico.
    NOTA: As tabelas de resumo de dados estão disponíveis para Relatórios Principais e Completos e fornecem uma visão geral das previsões para um determinado destino.

5. Manipulando configurações de dados: SeqAPASS Nível 1 e Nível 2

NOTA: Em ambas as análises de Nível 1 e Nível 2, assume-se que quanto maior a similaridade da proteína, maior a probabilidade de um produto químico interagir com a proteína de maneira semelhante à espécie/proteína de consulta, tornando-os suscetíveis a potenciais impactos de produtos químicos com esse alvo molecular. Devido à semelhança desses dados, as etapas para a compreensão dos dados de Nível 1 e 2 são descritas juntas em um único protocolo.

  1. Consulte os submenus na parte superior de Consultar informações de proteína para acessar e manipular as configurações de relatório e usar as configurações padrão para todas as opções de relatório para a maioria das análises. Se houver justificativa científica para alterar a configuração padrão, siga estas etapas opcionais:
    1. (OPCIONAL) Clique no sinal de adição + ao lado de Corte de suscetibilidade para exibir e ajustar as configurações de corte de suscetibilidade em uma nova guia. Selecione um novo valor de corte em uma lista suspensa ou insira um valor de corte definido pelo usuário.
    2. (OPCIONAL) Altere o número no campo E-Value (o número de alinhamentos diferentes esperados por acaso) se algo diferente do padrão for desejado.
      NOTA: Qualquer proteína com um valor E maior que o número na caixa será eliminada do relatório principal.
    3. (OPCIONAL) Use a opção Classificar por Grupo Taxonômico para escolher o Nível de hierarquia taxonômica a ser exibida na coluna Grupo Taxonômico Filtrado na tabela de resultados.
      NOTA: Alterar a hierarquia taxonômica também alterará a previsão de suscetibilidade com base nas espécies de cada grupo filtrado que são encontradas acima do ponto de corte.
    4. (OPCIONAL) Altere o campo Domínio Comum (quantos domínios comuns uma proteína deve compartilhar com a proteína de consulta a ser incluída nos resultados) se algo diferente do padrão for desejado.
      Observação : como a configuração padrão é 1, qualquer sequência que não compartilha pelo menos um domínio comum com a proteína de consulta será excluída.
    5. (OPCIONAL) Selecione Não em Espécies lidas para recuperar as previsões de suscetibilidade de Y somente se a Similaridade Percentual for maior ou igual ao ponto de corte ou se o acerto for identificado como um candidato a ortolog.
      NOTA: Esta configuração padrão é Sim, o que significa que uma previsão de suscetibilidade de Y será relatada para todos os candidatos a ortolog, todas as espécies listadas acima do ponto de corte de suscetibilidade e todas as espécies abaixo do ponto de corte do mesmo grupo taxonômico com uma ou mais espécies acima do ponto de corte.
  2. Clique no botão Baixar configurações atuais do relatório para baixar um arquivo que capture as configurações atuais aplicadas.
    NOTA: O nível de avaliação específico (1, 2 ou 3) selecionado ditará as configurações apresentadas no relatório.

6. Visualizando os dados: SeqAPASS Nível 1 e Nível 2

  1. Clique no sinal de adição + ao lado de Visualização e clique no botão Visualizar Dados para abrir uma guia separada exibindo as informações definidas pelo usuário e a opção para selecionar um gráfico interativo de resultados.
  2. Clique em Boxplot para abrir os controles de plotagem e boxplot interativos e permitir que a visualização de boxplot seja atualizada ativamente para refletir as alterações na tabela de dados e fornecer gráficos de qualidade de publicação e apresentação.
    Observação : O boxplot padrão exibe grupos de espécies no eixo x e semelhança percentual no eixo y. Os boxplots exibem o ponto de corte de suscetibilidade (linha tracejada), a semelhança percentual entre as espécies em comparação com as espécies de consulta e os valores médios e medianos para cada grupo taxonômico, juntamente com os percentis 25 e 75 e a faixa interquartil. Dependendo do objetivo da análise e das necessidades do usuário, muitos recursos do boxplot podem ser modificados por meio das seguintes etapas opcionais.
    1. (OPCIONAL) Para personalizar os grupos taxonômicos exibidos, consulte a caixa Grupos Taxonômicos na seção Controles . Remova grupos rolando sobre os nomes e selecionando x ou usando o menu suspenso Grupos taxonômicos .
    2. (OPCIONAL) Para adicionar uma legenda que identifique uma espécie de interesse ou grupos predefinidos específicos (por exemplo, espécies ameaçadas ou ameaçadas), passe o mouse sobre um nome de grupo taxonômico no eixo x para ativar uma caixa pop-up listando as três principais espécies ordenadas por maior similaridade percentual. Passe o mouse sobre as espécies na legenda para gerar uma caixa pop-up com as informações de espécies correspondentes. Clique na caixa de um grupo taxonômico específico para gerar uma tabela de resumo para download listando espécies e previsões.
  3. Clique em Download Boxplot para escolher um tipo de arquivo, personalizar a resolução de largura/altura e salvar a visualização.

7. Desenvolvendo e executando uma análise SeqAPASS: Nível 3

NOTA: Uma análise de Nível 3 avalia os resíduos de aminoácidos identificados pelo usuário dentro da proteína de consulta e compara rapidamente a conservação desses resíduos entre as espécies. Presume-se que as espécies em que esses resíduos são conservados são mais propensas a interagir com um produto químico de maneira semelhante à espécie/proteína modelo. Como o Nível 3 se concentra em aminoácidos individuais, uma análise só pode ser realizada quando o conhecimento detalhado dos resíduos de aminoácidos críticos para a interação química-proteína ou proteína-proteína estiver disponível.

  1. Clique no sinal de adição + ao lado do cabeçalho Nível 3 na página Informações de Proteína de Consulta de Nível 1 para preencher o menu Consulta de Nível 3.
  2. Clique no sinal de mais + ao lado do Reference Explorer para abrir a ferramenta de explorador de referência, que gera uma cadeia de caracteres booleana predefinida para consultar a literatura disponível e auxilia os usuários na identificação de literatura apropriada para apoiar a identificação de aminoácidos críticos a serem usados na avaliação de Nível 3 (Tabela 2 e Figura 2).
    1. (OPCIONAL) Depois que a proteína de consulta for preenchida automaticamente, use a função Adicionar nome da proteína para adicionar proteínas adicionais.
  3. Clique em Gerar link do Google Acadêmico para abrir um pop-up contendo uma cadeia de caracteres de pesquisa gerada automaticamente que inclui termos de pesquisa relevantes.
  4. Clique em Pesquisar no Google Acadêmico para consultar o banco de dados de literatura usando a cadeia de caracteres de pesquisa.
    1. Como alternativa, clique em Copiar para a Área de Transferência e personalize a cadeia de caracteres de pesquisa adicionando ou removendo termos usando as funções no Gerenciador de Referências.

8. Identificar resíduos críticos de aminoácidos usando a literatura identificada

  1. Selecione a sequência de modelos à qual as espécies selecionadas pelo usuário serão alinhadas no menu Consulta de Nível 3.
    NOTA: Esta sequência de modelos é comumente escolhida com base na literatura para a qual os aminoácidos críticos foram identificados e podem ser da mesma espécie ou de uma espécie diferente das consultadas nos níveis 1 e 2.
    1. (OPCIONAL) Use a caixa Comparações Adicionais para comparar quaisquer acessos/sequências que não apareçam nas tabelas Relatório Principal/Completo .
  2. Insira um nome definido pelo usuário para a execução de Nível 3 na caixa de texto Inserir Nome de Execução de Nível 3 para identificar a execução de Nível 3 concluída. Escolha um nome exclusivo para cada avaliação.
  3. Selecione o grupo taxonômico de interesse no campo Escolher grupo(s) taxonômico(s ). Selecione um grupo taxonômico para filtrar automaticamente a tabela por esse grupo taxonômico.
  4. Na tabela de resultados, clique manualmente na caixa de seleção ao lado de qualquer espécie a ser alinhada à sequência do modelo.
    NOTA: Para garantir o alinhamento apropriado, um grupo taxonômico de cada vez deve ser comparado ao modelo. Selecione apenas proteínas anotadas de forma semelhante para as espécies de interesse. Ao selecionar sequências para comparação, é importante prestar atenção a certas sequências (por exemplo, hipotéticas, de BAIXA QUALIDADE ou parciais). A menos que haja uma justificativa transparente para a inclusão, é melhor excluir essas sequências, pois elas podem distorcer as previsões devido a informações de sequência incompletas ou inadequadas.
  5. Repita as etapas para alinhar todos os grupos taxonômicos de interesse.
  6. Clique em Atualizar execuções de Nível 2 e 3 depois que todas as espécies tiverem sido alinhadas para preencher o menu Selecionar Nome de Execução de Nível 3 com os trabalhos de Nível 3 concluídos e obter os dados de um alinhamento de Nível 3 imediatamente.
  7. Clique em Combinar Dados de Nível 3 para combinar alinhamentos de vários grupos taxonômicos.
    1. Como alternativa, para exibir um único relatório, selecione o nome definido pelo usuário em Escolher Consulta a Exibir e clique em Exibir Dados de Nível 3.
  8. Selecione o modelo de Nível 3 a ser usado como base para a comparação de resíduos de aminoácidos no menu Combinar Relatórios de Nível 3 e clique em Avançar.
  9. Em Trabalhos de Nível 3, selecione trabalhos concluídos para comparação e clique em Avançar. Use a função Trabalhos de Nível 3 de Ordem para reordenar os grupos taxonômicos, se desejado. Clique em Exibir Dados de Nível 3 para produzir uma página de relatório de Nível 3 com os grupos taxonômicos combinados alinhados.
  10. Selecione as posições de aminoácidos previamente identificadas para as espécies-modelo digitando a(s) posição(ões) de aminoácidos, separada por vírgulas, na caixa Inserir Posições de Resíduos de Aminoácidos e, em seguida, selecionando Copiar para Lista de Resíduos . Selecione diretamente os resíduos na sequência do modelo na caixa de transporte.
  11. Clique em Atualizar Relatório para atualizar a página e exibir as previsões de suscetibilidade de Nível 3.
    NOTA: O nível 3 usa um conjunto simples de regras derivadas de descritores básicos de propriedades funcionais de cadeia lateral (por exemplo, alifáticas, aromáticas) e dimensões moleculares (diferenças de peso molecular >30 g/mol) para determinar se as diferenças em posições-chave provavelmente afetarão as interações proteicas13.

9. Visualizando dados SeqAPASS de nível 3

NOTA: Como nos níveis anteriores, os relatórios principal e completo estão disponíveis. Além de dados idênticos aos dados dos Níveis 1 e 2, o Relatório Primário exibe posições de aminoácidos, abreviações e uma suscetibilidade sim/não (S/N) semelhante à previsão do modelo. Da mesma forma, o Relatório Completo contém informações sobre a classificação da cadeia lateral dos aminoácidos e o peso molecular.

  1. Na página Relatório de Nível 3, role até a parte inferior para exibir um relatório dos resultados. Clique em Baixar Tabela na parte inferior do relatório para salvá-la.
  2. Clique em Exibir Relatório de Resumo de Nível 3 para exibir e baixar uma tabela de relatório de resumo que apresenta dados classificados por grupo taxonômico. Clique no sinal de adição + ao lado de Visualização na página Relatório de Nível 3 para abrir uma guia separada do navegador exibindo as informações definidas pelo usuário e a opção de exibir os resultados na forma de um mapa de calor interativo.
  3. Clique em Mapa de calor na página Informações de visualização para abrir o gráfico interativo e os controles e permitir que a visualização do mapa de calor seja atualizada ativamente para refletir as alterações na tabela de dados. Execute as seguintes etapas opcionais para personalizar o mapa de calor.
    1. (OPCIONAL) Selecione Opções de Relatório para alternar entre um Relatório Simples, que exibe a posição do aminoácido, a abreviação de uma letra e a semelhança de aminoácidos, ou um Relatório Completo, que exibe informações detalhadas sobre cada aminoácido selecionado.
    2. (OPCIONAL) Selecione Opções de Relatório para alterar a forma como as espécies são exibidas, seja por Nome Comum ou Nome Científico.
      NOTA: No Relatório Simples, os aminoácidos são categorizados como Correspondência Total (azul escuro), Correspondência Parcial (azul claro, substituições que atendem a apenas um critério) ou Não é uma Correspondência (amarelo, substituições que não atendem a nenhum critério) para o aminoácido modelo. O Relatório Completo exibe comparações como uma Correspondência Total (azul escuro) ou Não é uma Correspondência (amarelo).
    3. (OPCIONAL) Selecione Seleções Opcionais para destacar informações úteis, como Candidatos a Ortolog, Espécies Ameaçadas, Espécies Ameaçadas ou Organismos Modelo Comuns.
    4. (OPCIONAL) Selecione Configurações do Mapa de Calor para selecionar opções de personalização adicionais, incluindo adicionar ou remover colunas, legendas e texto.
  4. Clique em Download Boxplot para escolher um tipo de arquivo e salvar a visualização.

10. Interpretação dos Resultados do SeqAPASS: Linhas de evidência para a conservação de proteínas

NOTA: Para facilitar a interpretação, esta ferramenta inclui um Relatório de Resumo de Decisão (Relatório DS) concebido para integrar dados entre Níveis. O Relatório DS contém os resultados (ou seja, tabelas de dados e/ou visualizações) que o usuário selecionou e permite a rápida avaliação de previsões de suscetibilidade em vários níveis para várias espécies simultaneamente.

  1. Clique em Enviar número de nível para o relatório DS nas páginas de resultados ou visualização de dados e aguarde até que os dados sejam "enviados" e a guia Relatório DS se torne ativa.
    Observação : se os resultados ou quaisquer alterações não tiverem sido enviadas por push para o relatório DS, o nível de envio # para o relatório DS permanecerá ativo até que seja selecionado. Se uma configuração tiver sido alterada, o texto Clique para enviar novas alterações por push será exibido até que as alterações sejam enviadas por push para o relatório. As visualizações podem ser enviadas por push para o Relatório DS a qualquer momento durante a avaliação.
  2. Selecione a guia Relatório DS a qualquer momento para acessar a página DS.
    NOTA: Para todas as espécies alinhadas no Nível 1, a tabela Relatório de Resumo da Decisão Final contém os dados importantes e as previsões de suscetibilidade para cada análise. Se uma espécie na tabela DS não foi incluída no relatório de Nível 3, mas foi encontrada em trabalhos de Nível 1 e/ou Nível 2, a célula na tabela receberá uma designação não aplicável (NA) para a previsão de suscetibilidade de Nível 3.

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Representative Results

Para demonstrar a aplicação da ferramenta SeqAPASS e destacar novos recursos, dois estudos de caso são descritos representando casos em que a conservação de proteínas prevê que há diferenças na suscetibilidade química entre as espécies (transtirretina humana) e que não há diferenças (μ receptor opioide [MOR]). O primeiro desses exemplos aborda comparações estruturais / sequência de proteínas para prever o domínio da aplicabilidade para vias de desfechos adversos (POAs, ver Tabela 2 para definição), enquanto o segundo está focado no desenvolvimento de hipóteses de pesquisa relevantes para a suscetibilidade entre espécies a opioides presentes em águas residuais. As abordagens básicas descritas nesses estudos de caso podem ser aplicadas a qualquer produto químico e demonstram a ampla utilidade dessa ferramenta para a tomada de decisões e pesquisas.

Os hormônios tireoidianos são essenciais para o crescimento e desenvolvimento normais. São sintetizados na glândula tireoide e secretados na corrente sanguínea, onde se ligam às proteínas de distribuição e circulam por todo o corpo 14,15,16,17,18. Estudos recentes têm demonstrado que contaminantes ambientais, como bifenilos policlorados (PCBs), éteres difenílicos polibromados (PBDEs) e substâncias per- e polifluoroalquil (PFAS), podem se ligar competitivamente à proteína de distribuição transtirretina (TTR) e interromper os processos tireoidianos normais 19,20,21,22,23,24,25 . Uma POA foi desenvolvida descrevendo a ligação competitiva à TTR levando à toxicidade do neurodesenvolvimento humano (https://aopwiki.org/aops/152). Embora existam evidências de que este POA também é aplicável a roedores, a aplicabilidade a outros grupos taxonômicos ainda não foi definida. Como os produtos químicos de ligação a TTR estão presentes no ambiente, é importante entender a relevância taxonômica dessa POA, um desafio que pode ser abordado em parte por meio da análise SeqAPASS. Usando a estratégia de formulação de problemas da ferramenta, o objetivo da análise pode ser declarado da seguinte forma: Com o conhecimento de que os compostos de ligação ao TTR levam a resultados adversos em humanos, quais grupos taxonômicos seriam previstos para compartilhar suscetibilidade semelhante?

A proteína transtirretina humana está bem caracterizada, e existem vários ligantes bem estudados conhecidos por se ligarem no local de ligação do TTR humano (hTTR), tornando-se um alvo ideal para a análise do SeqAPASS 8,9,13. Usando a adesão NCBI para transtirretina humana, P02766.1, uma análise de Nível 1 foi conduzida com configurações padrão. Os resultados da análise de Nível 1 estabeleceram o ponto de corte de similaridade percentual em 49%, com mamíferos (Mammalia), aves (Aves), répteis (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), anfíbios (Amphibia) e a maioria das espécies de peixes (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) caindo acima desse ponto de corte (Figura 3). Assim, todas as espécies desses grupos taxonômicos resultaram em uma predição de suscetibilidade de "Y" (ou seja, sim) e provavelmente são suscetíveis a produtos químicos conhecidos por interagir com hTTR (Figura 3 e Arquivo Suplementar 1).

Para a avaliação de Nível 2 do(s) domínio(s) funcional(is), o NCBI Conserved Domain Database foi utilizado para identificar TR_THY (accession smart00095) como um domínio conservado que compreende a cadeia madura da proteína da subunidade TTR dos resíduos 27 a 147. Como a sequência de proteínas de TTR relatada no NCBI inclui um pré-segmento de 20 aminoácidos não relevante para a análise atual, focar a comparação na cadeia madura fornece uma linha de evidência adicional, mais específica, para a conservação dessa proteína entre as espécies. A partir da avaliação de Nível 2, foi relatado um ponto de corte percentual de similaridade de 58%, com mamíferos, aves, répteis, anfíbios e a maioria das espécies de peixes novamente caindo acima desse ponto de corte (Figura 4). Consequentemente, o SeqAPASS concluiu uma predição de suscetibilidade de "Y" (ou seja, sim) para espécies desses grupos taxonômicos, indicando que elas provavelmente são suscetíveis a produtos químicos que interagem com a proteína hTTR (Figura 4 e Arquivo Suplementar 1). No geral, os resultados das análises de Nível 1 e Nível 2 sugerem que a maioria das espécies de vertebrados compartilha a conservação do hTTR e provavelmente é suscetível a substâncias químicas conhecidas por interagir com essa proteína.

Figure 3
Figura 3: Análise SeqAPASS Nível 1 da conservação da transtirretina em grupos taxonômicos com informações de sequência disponíveis em relação à proteína humana. A semelhança percentual da sequência de aminoácidos proteicos é exibida no eixo Y; o grupo taxonômico é exibido no eixo X. Círculos abertos (○) indicam a sequência de consulta, e círculos fechados (●) indicam as espécies dentro do grupo taxonômico com a maior similaridade percentual. Dentro do gráfico, a parte superior e inferior de cada caixa representamos percentis 75 e 25, os bigodes se estendem até 1,5 vezes a faixa interquartil e os valores médiose medianos são representados por linhas pretas horizontais na caixa. A linha tracejada indica o ponto de corte para previsões de suscetibilidade. Abreviaturas: TTR = transtirretina; seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise SeqAPASS Nível 2 da conservação do domínio de ligação ao ligante do receptor transtirretina em todos os grupos taxonômicos com informações de sequência disponíveis em relação à proteína humana LBD. A semelhança percentual da sequência de aminoácidos do domínio de ligação do ligante é exibida no eixo Y; o grupo taxonômico é exibido no eixo X. Círculos abertos (○) indicam a sequência de consulta, e círculos fechados (●) indicam as espécies dentro do grupo taxonômico com a maior similaridade percentual. Dentro do gráfico, a parte superior e inferior de cada caixa representamos percentis 75 e 25, os bigodes se estendem até 1,5 vezes a faixa interquartil e os valores médiose medianos são representados por linhas pretas horizontais na caixa. A linha tracejada indica o ponto de corte para previsões de suscetibilidade. Abreviaturas: TTR = transtirretina; seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Através da análise de modelagem molecular e estudos de cristalografia de proteínas, foram identificados aminoácidos na região de ligação do TTR que se prevê que interajam com o ligante endógeno 3,3′,5,5′-tetraiodo-L-tireonina (T4, PDB 2ROX), bem como três produtos químicos ambientais: perfluorooctano sulfonato (PFOS, PDB 5JIM), tetrabromobisfenol A (TBBPA, PDB 5HJG) e dietilestilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Os resíduos de aminoácidos Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 e Thr139 foram identificados como desempenhando um papel fundamental nas interações proteína-ligante, seja por meio de interações diretas de ligação de hidrogênio ou interações de van der Waals. Esses seis resíduos de aminoácidos foram avaliados em uma análise de Nível 3 entre espécies usando hTTR como sequência de molde e excluindo sequências não homólogas, hipotéticas, parciais e de baixa qualidade (Arquivo Suplementar 1). Como foi previamente determinado que a TTR é conservada apenas entre espécies de vertebrados, as espécies de invertebrados foram excluídas desta análise (Figura 3 e Figura 4). Além disso, é importante ressaltar que as posições de aminoácidos relatadas na literatura excluem um pré-segmento de 20 aminoácidos que está ausente na proteína hTTR madura e, por esse motivo, as posições apresentadas no Nível 3 foram ajustadas daquelas relatadas na literatura para garantir o alinhamento preciso à proteína modelo selecionada15 (Arquivo Suplementar 1).

Na análise de Nível 3 do TTR, 294 espécies de vertebrados foram selecionadas para alinhamento (mamíferos, aves, anfíbios, répteis e peixes). Das espécies avaliadas, 18 apresentaram diferenças nos principais aminoácidos, resultando em uma predição de suscetibilidade de "N" (ou seja, não). Curiosamente, cinco espécies de mamíferos marinhos apresentaram uma substituição de aminoácidos na posição 2 (128A), enquanto quatro espécies de peixes demonstraram substituições na posição 2 (128A) ou na posição 6 (139T) (Figura 5). Como esses aminoácidos desempenham papéis importantes nas interações proteína-ligante no canal de ligação do TTR, esses dados sugerem que os ligantes TTR podem interagir de forma diferente nessas espécies e resultariam em suscetibilidade química diferente em relação aos seres humanos.

Figure 5
Figura 5: Análise de nível 3 do SeqAPASS da conservação de resíduos de aminoácidos importantes para a ligação TTR-química. (A) Tabela de resumo de nível 3 exibindo o número de espécies com dados de sequência disponíveis em todos os grupos taxonômicos, o número de espécies previstas para serem similarmente suscetíveis (Y) e o número de espécies previstas para não serem similarmente suscetíveis (N). (B) Mapa de calor de nível 3 exibindo espécies selecionadas que se prevê não serem igualmente suscetíveis em relação à proteína TTR transtirretina humana, demonstrando aminoácidos completos, parciais e não compatíveis. Abreviaturas: TTR = transtirretina; seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em resposta ao feedback das partes interessadas e dos usuários, novos recursos foram projetados e incorporados à ferramenta SeqAPASS, incluindo a capacidade de se conectar a dados empíricos para diferentes aplicativos. A interoperabilidade desta ferramenta com a base de conhecimento do ECOTOX (Tabela 1) foi alcançada tanto pela incorporação de links externos nas tabelas de dados de Nível 1 e Nível 2 para acessos presentes no ECOTOX quanto pela criação de um widget ECOTOX dentro da ferramenta para filtrar diretamente os dados de toxicidade mais relevantes no ECOTOX. Através dos links e do widget, os usuários podem consultar rapidamente o ECOTOX e coletar dados de toxicidade correspondentes para espécies com previsões de suscetibilidade ao SeqAPASS. Atualmente, as previsões do SeqAPASS estão conectadas ao ECOTOX através de um estressor químico e espécie; no entanto, os dados de toxicidade ainda não estão ligados a genes/proteínas específicos, o que permitiria ligações diretas aos parâmetros de avaliação/alvos moleculares específicos de interesse no SeqAPASS. Embora vincular previsões a dados de toxicidade com base em um estressor químico não seja o ideal, pois os dados podem não ser específicos de uma determinada via, estabelecer uma conexão para reunir resultados é o primeiro passo. Como a primeira iteração de uma integração SeqAPASS-ECOTOX, a abordagem atual fornece aos usuários todos os dados de toxicidade disponíveis para o(s) estressor(es) químico(s) e espécies, em um nível amplo. Esses dados, quando combinados com as previsões do SeqAPASS, podem fornecer contexto em níveis amplos (vertebrados versus invertebrados) e podem ser considerados dentro do contexto da estrutura da POA.

O TTR apresenta um bom exemplo de caso para examinar essa conexão, pois o AOP existente (AOP 152) fornece contexto para a interpretação de dados de toxicidade ECOTOX potencialmente relevantes. Começando com os ligantes examinados no SeqAPASS Nível 3, foram coletados dados de toxicidade ambiental entre espécies para quatro produtos químicos conhecidos por interagir com o domínio de ligação do ligante TTR (dietilestilbestrol [DES], ácido perfluorohexanóico [PFHxA], perfluorooctano sulfonato [PFOS] e tetrabromobisfenol A [TBBPA])19,21,23,24 . Para cada produto químico, o ECOTOX foi consultado quanto a dados aquáticos e terrestres pelo número do Chemical Abstracts Service (CAS) usando parâmetros de busca personalizados (Arquivo Suplementar 1). Os dados foram filtrados para grupos de espécies de interesse (anfíbios, aves, peixes, invertebrados, mamíferos, répteis). Dentro dos resultados da consulta filtrada, uma média das concentrações mínimas e máximas de efeito do estudo foi calculada e implementada como uma aproximação para a média de quaisquer acertos que não relatassem um valor médio de concentração de efeito (Figura 6A e Arquivo Suplementar 1). Dentro do contexto de um único produto químico, os testes de Kruskal-Wallis foram conduzidos para comparar as concentrações médias de efeito de diferentes grupos taxonômicos, uma vez que os dados não atendiam aos pressupostos do teste ANOVA. Testes de comparação post-hoc pareados foram então conduzidos usando o Teste de Dunn para todos os produtos químicos, uma vez que os grupos taxonômicos consistiram em tamanhos de amostra desiguais. Os resultados aquáticos e terrestres foram analisados separadamente, uma vez que os dados entre os dois tipos de exposições não são diretamente comparáveis. No ECOTOX, os dados de toxicidade aquática para os produtos químicos selecionados estavam disponíveis para anfíbios, aves, invertebrados e espécies de peixes (Figura 6A). Os dados de toxicidade terrestre para os produtos químicos seleccionados só estavam disponíveis para mamíferos e SF (Supplemental File 1).

Figure 6
Figura 6: Ligando os resultados do SeqAPASS com dados empíricos . (A) Concentrações médias de efeito entre grupos taxonômicos com dados disponíveis na base de conhecimento ECOTOXicology para produtos químicos selecionados conhecidos por se ligarem à proteína TTR humana. (B) Sobreposição do número de espécies incluídas em cada análise SeqAPASS com as espécies para as quais estavam disponíveis dados ECOTOX. No painel A, parênteses ao longo do eixo x indicam o número de acertos de consulta para os quais os dados foram agregados. Os asteriscos indicam pares de concentrações de efeito significativamente diferentes entre grupos de espécies dentro do contexto de um único produto químico (teste de Dunn, p < 0,05), onde maiores números de asteriscos indicam níveis mais fortes de significância (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). As linhas centrais dentro de cada caixa representam a mediana, com bordas de caixa demonstrando o intervalo interquartil. Os bigodes se estendem até 1,5 vezes a faixa interquartil. Os valores atípicos que estão fora desse intervalo são mostrados como pontos individuais. Abreviaturas: TTR = transtirretina; seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies; ECOTOX = Base de conhecimento ECOTOXicology. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No geral, esses dados sugerem que a bioatividade para os produtos químicos avaliados ocorre em espécies de vertebrados, mas não ocorre em invertebrados. Embora a falta de informações biológicas sobre o alvo e a via no ECOTOX impossibilitem a ligação direta desses dados empíricos ao TTR, esses resultados apoiam as previsões do SeqAPASS de que as espécies de invertebrados não compartilham suscetibilidade. Todas as espécies de vertebrados com dados disponíveis demonstraram suscetibilidade tanto ao PFOS quanto ao TBBPA, embora as concentrações médias de efeito tenham sido significativamente maiores em peixes e aves do que em anfíbios. Esses dados sugerem diferenças potenciais na sensibilidade entre grupos taxonômicos que podem ser atribuídas a diferenças de vias biológicas (incluindo TTR). Vale ressaltar que outras variáveis como metabolismo e excreção também podem desempenhar um papel nas diferenças de sensibilidade. Para PFHxA e PFOS, os peixes foram significativamente mais sensíveis do que os invertebrados e as aves e, para o DES, os anfíbios apresentaram concentrações médias de efeito significativamente mais elevadas do que os invertebrados. Novamente, esses dados apoiam nossa previsão do SeqAPASS de que os invertebrados não compartilham suscetibilidade com espécies de vertebrados. De todas as espécies avaliadas por meio dessa ferramenta para as quais havia dados disponíveis da sequência TTR, apenas um pequeno número tinha dados ECOTOX correspondentes para os quatro produtos químicos de interesse (Figura 6B, Tabela Suplementar S1 e Tabela Suplementar S2). Para as espécies que carecem de dados apicais, as previsões de suscetibilidade do SeqAPASS adicionam linhas adicionais de evidência de que espécies relacionadas podem se comportar de forma semelhante àquelas com dados apicais. Os dados para todas as análises SeqAPASS e ECOTOX estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1.

De acordo com os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), em 2017, os opioides contribuíram para cerca de 47.600 mortes por overdose nos Estados Unidos, um número que continua a aumentar27. As usinas de águas residuais nos EUA são regulamentadas nacionalmente pelo Sistema Nacional de Eliminação de Descargas de Poluentes da Agência Nacional de Proteção Ambiental dos EUA, que não requer testes para opioides ou outros produtos farmacêuticos em sua descarga28. Nos últimos anos, um esforço tem sido feito para usar a epidemiologia baseada em águas residuais como uma ferramenta para mapear o uso comunitário de opiáceos. Os esforços de monitorização de opiáceos detectaram concentrações tão elevadas como 1,27 μg/L em efluentes de águas residuais e 0,7 μg/L em águas superficiais29,30. Estudos recentes de toxicidade que avaliaram o efeito da exposição a opioides em peixes relataram o desenvolvimento de comportamentos aditivos e efeitos imunológicos adversos (por exemplo, maiores taxas de infecção, regulação negativa de genes imunológicos)31,32,33. No geral, esses estudos sugerem que há potencial para exposições ambientais adversas a opioides e destacam a importância de entender o risco que esses produtos químicos representam para as espécies aquáticas. Dada a variedade de espécies que podem encontrar esses compostos no ambiente, a identificação de espécies potencialmente suscetíveis usando o SeqAPASS pode ser importante para a priorização dos esforços de teste ou monitoramento.

O MOR constitui o principal alvo opioide para o manejo da dor e é responsável pelas poderosas propriedades analgésicas e viciantes dos alcaloides opiáceos em humanos34,35. Devido à importância desse receptor para a saúde humana, os ligantes MOR são bem conhecidos, e estudos de cristalografia de raios-X de alta qualidade estão disponíveis, tornando esse alvo ideal para a análise do SeqAPASS 8,9,13. Usando a adesão NCBI para o receptor opioide μ humano, ACM90349.1, uma análise de Nível 1 foi conduzida usando configurações padrão. O ponto de corte de suscetibilidade foi estabelecido em 55% para o Nível 1, com semelhanças percentuais para mamíferos (Mammalia), aves (Aves), répteis (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), anfíbios (Amphibia) e a maioria das espécies de peixes (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) acima desse ponto de corte; portanto, as espécies desses grupos taxonômicos resultaram em uma predição de suscetibilidade de "Y" (ou seja, sim), indicando que provavelmente seriam suscetíveis a produtos químicos conhecidos por interagir com MOR humano (Figura 7 e Arquivo Suplementar 1). Usando o NCBI Conserved Domain Database, 7tmA_Mu_opioid_R foi identificado (cd15090 de acesso) como um domínio funcional que compreende todas as sete hélices da proteína MOR de 133 a 411, incluindo um suposto sítio de ligação de ligantes. Em comparação com o Nível 1, os resultados do Nível 2 identificaram um maior ponto de corte de suscetibilidade de 88% de similaridade, com mamíferos, aves, répteis, anfíbios e a maioria das espécies de peixes encontrados acima desse ponto de corte e resultando em uma predição de suscetibilidade de "Y" para sim (Figura 8). No geral, os resultados das análises de Nível 1 e Nível 2 sugerem que a maioria das espécies de vertebrados compartilha a conservação do MOR e provavelmente é suscetível a produtos químicos conhecidos por interagir com o MOR humano.

Figure 7
Figura 7: Análise SeqAPASS Nível 1 da conservação do receptor opioide μ em todos os grupos taxonômicos com informações de sequência disponíveis em relação à proteína humana. A semelhança percentual da sequência de aminoácidos proteicos é exibida no eixo Y; o grupo taxonômico é exibido no eixo X. Círculos abertos (○) indicam a sequência de consulta, e círculos fechados (●) indicam as espécies dentro do grupo taxonômico com a maior similaridade percentual. Dentro do gráfico, a parte superior e inferior de cada caixa representam os percentis 75 e 25, os bigodes se estendem até 1,5 vezes a faixa interquartil e os valores médios e medianos são representados por linhas pretas horizontais na caixa. A linha tracejada indica o ponto de corte para previsões de suscetibilidade. Abreviaturas: MOR = receptor mu-opióide; seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Análise SeqAPASS Nível 2 da conservação do domínio de ligação ao ligante do receptor opioide μ em relação ao domínio na proteína humana. A semelhança percentual da sequência de aminoácidos do domínio ligante é exibida no eixo Y; o grupo taxonômico é exibido no eixo X. Círculos abertos (○) indicam a sequência de consulta, e círculos fechados (●) indicam as espécies dentro do grupo taxonômico com a maior similaridade percentual. Dentro do gráfico, a parte superior e inferior de cada caixa representam os percentis 75 e 25, os bigodes se estendem até 1,5 vezes a faixa interquartil e os valores médios e medianos são representados por linhas pretas horizontais na caixa. A linha tracejada indica o ponto de corte para previsões de suscetibilidade. Abreviaturas: MOR = receptor mu-opióide; seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Através da análise de modelagem molecular e estudos de cristalografia de proteínas, aminoácidos foram identificados na região de ligação do MOR que são previstos para interagir com ligantes conhecidos. Embora o conjunto diversificado de ligantes que se ligam bem aos receptores opioides resulte em farmacologia complexa, algumas interações consistentes ligante-proteína são observadas36,37. Com base na acoplagem molecular a várias estruturas cristalinas MOR, tanto morfina quanto fentanil, agonistas MOR de alta afinidade, interagem com D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 e Y32636,38. Os resíduos D147, Y148, M151 e H297 também estão implicados em estruturas cristalinas de MOR ligadas ao agonista da morfina BU72, enquanto D147, M151, H297 e Y326 também são críticos na ligação ao antagonista irreversível da morfina β-funaltrexamine37. Considerando essas linhas de evidência, nove resíduos foram selecionados (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) para avaliação de Nível 3 utilizando MOR humano como sequência de molde e excluindo sequências parciais, previstas, hipotéticas e de baixa qualidade. É importante ressaltar que as posições de aminoácidos relatadas na literatura excluem um segmento de 64 aminoácidos em relação à adesão à proteína NCBI e, por esse motivo, as posições no Nível 3 foram selecionadas para representar aquelas que se alinharam com a sequência de modelos para sequências de alinhamento corretas.

Na análise de Nível 3 do MOR humano, 284 espécies foram avaliadas entre espécies de vertebrados (mamíferos, aves, anfíbios, répteis e peixes). Em todas as espécies avaliadas, os nove aminoácidos foram uma correspondência total ou parcial com base na classificação da cadeia lateral e no peso molecular; consequentemente, todas as espécies avaliadas resultaram em uma predição de suscetibilidade de "Y" para sim (Tabela 3 e Arquivo Suplementar 1). Como esses aminoácidos são importantes na ligação de agonistas fortes de MOR e antagonistas fortes, esses dados sugerem que os compostos opioides direcionados a receptores opioides humanos μ podem interagir de forma semelhante com receptores entre espécies de vertebrados. Embora existam poucos dados empíricos disponíveis até o momento dentro da base de conhecimento do ECOTOX para compostos opioides, vários estudos sugerem que os peixes são provavelmente suscetíveis31,32,33. No geral, os resultados do SeqAPASS apontam para o potencial de impactos ambientais mais amplos de produtos químicos moduladores de MOR em todas as espécies, indicando que mais pesquisas e talvez monitoramento possam ser valiosos. Os dados para todas as análises estão disponíveis no Arquivo Suplementar 1.

Tabela 3: Análise SeqAPASS Nível 3 da conservação de resíduos de aminoácidos importantes para a ligação química ao receptor opioide μ. Tabela de resumo exibindo o número de espécies com dados de sequência disponíveis em todos os grupos taxonômicos, o número de espécies previstas para serem similarmente suscetíveis (Y) e o número de espécies previstas para não serem igualmente suscetíveis, bem como aminoácidos completos, parciais e não correspondentes. Abreviação: SeqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela Suplementar S1: Espécies com dados ECOTOX disponíveis para os quatro produtos químicos de interesse conhecidos por se ligarem à proteína transtirretina humana. Os dados disponíveis para cada produto químico estão alinhados com as previsões do SeqAPASS de suscetibilidade semelhante nos níveis 1, 2 e 3. Todas as previsões do SeqAPASS relativas à sequência da transtirretina humana. abreviaturas: seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies; DES = dietilestilbestrol; PFHxA = ácido perfluorohexanóico; PFOS = ácido perfluorooctanosulfônico; TBBPA = tetrabromobisfenol A. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela Suplementar S2: Número total de espécies com dados disponíveis nas avaliações SeqAPASS e ECOTOX para produtos químicos selecionados conhecidos por se ligarem à proteína transtirretina humana. O SeqAPASS fornece meios para prever a suscetibilidade de espécies em muitas espécies para as quais os dados empíricos de toxicidade não estão disponíveis. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Dados SeqAPASS e ECOTOX para todos os resultados representativos. O arquivo contém ToC seguido pelas seguintes folhas de dados: Tab 1-hTTR SeqAPASS Results Level 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Results Level 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Results Level 3, Tab 4-EcoTox data for DES, Tab 5-EcoTox data for PFOS, Tab 6-EcoTox data for PFHxA, Tab 7-EcoTox data for TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Mean Calculations, Tab 9-SeqAPASS EcoTox Data Comparisons, Tab 10-hMOR SeqAPASS Results Level 1, Tab 11-hMOR SeqAPASS Results Level 2 e Tab 12-μ-hMOR SeqAPASS Results Level 3. abreviaturas: seqAPASS = alinhamento de sequência para prever a suscetibilidade entre espécies; TdC = Índice; hTTR = transtirretina humana; ECOTOX = Base de conhecimentos de Ecotoxicologia; DES = dietilestilbestrol; PFOS = ácido perfluorooctanosulfônico; PFHxA = ácido perfluorohexanóico; TBBPA = tetrabromobisfenol A; hMOR = receptor mu-opióide humano. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Há um reconhecimento generalizado de que não é viável testar empiricamente espécies suficientes para capturar a diversidade genômica, fenotípica, fisiológica e comportamental de organismos vivos que podem ser expostos a produtos químicos de interesse toxicológico. O objetivo do SeqAPASS é maximizar o uso de dados estruturais e de sequência de proteínas existentes e em contínua expansão para auxiliar e informar a extrapolação de dados/conhecimentos de toxicidade química de organismos testados para centenas ou milhares de outras espécies através de comparações em nível molecular. A ferramenta SeqAPASS foi projetada para reduzir a complexidade das comparações de sequências de proteínas para cientistas, avaliadores de risco e reguladores por meio de uma análise simplificada e rápida que inclui tabelas de resumo geradas de forma transparente e para download, visualizações interativas de dados e a fácil identificação de espécies ameaçadas e ameaçadas, bem como organismos modelo comuns. Os protocolos são descritos aqui para executar os níveis 1, 2 e 3 do SeqAPASS para a avaliação da similaridade da sequência de aminoácidos primários, conservação do domínio funcional e aminoácidos críticos envolvidos nas interações químico-proteína e proteína-proteína. Linhas de evidência coletadas de cada nível de análise SeqAPASS predizem a suscetibilidade química entre as espécies, fornecendo dados consistentes e prontamente interpretáveis. Até à data, esta ferramenta tem sido utilizada numa vasta gama de aplicações, incluindo a identificação de substâncias químicas que se ligam a determinados recetores e a avaliação do potencial de comparação de leitura para recetores ecológicos de vertebrados com sistemas de mamíferos. Além disso, dois estudos de caso focados na proteína de distribuição do hormônio tireoidiano, TTR e MOR são descritos aqui para demonstrar os novos recursos e funcionalidades do SeqAPASS v2 a v6.

Como em qualquer abordagem computacional, a capacidade de gerar previsões de suscetibilidade de espécies dentro da ferramenta SeqAPASS é altamente dependente da entrada de parâmetros apropriados 8,9,13. É, portanto, fundamental que, antes de realizar uma análise, uma etapa de formulação do problema seja conduzida para pesquisar os dados e a literatura existentes para o alvo pretendido. Iniciar uma análise com conhecimento do alvo proteico permite ao usuário identificar números apropriados de adesão à proteína e sequências de alta qualidade. Do mesmo modo, o conhecimento de uma espécie sensível ou visada, ou de organismos modelo utilizados em ensaios ou no desenvolvimento de POA, assegura a selecção de uma espécie de consulta adequada com a qual todas as outras espécies são comparadas. A seleção de domínios funcionais para o Nível 2 e os resíduos de aminoácidos críticos para o Nível 3 também são etapas críticas que exigem que o usuário identifique parâmetros de entrada apropriados para gerar previsões. Devido a essa necessidade de conhecimento pré-existente de uma interação químico-proteína, as versões recentes da ferramenta SeqAPASS integram recursos fáceis de usar projetados para ajudar a orientar os usuários para informações relevantes para o início de uma consulta (por exemplo, links para outras ferramentas) (Tabela 2 e Figura 2). Além disso, mensagens de informações pop-up e alertas foram integrados à ferramenta para orientar o usuário através da análise e ajudar a informar o usuário de quaisquer erros que precisem ser resolvidos.

A complexidade das interações químico-biológicas apresenta uma limitação da ferramenta SeqAPASS. Ao extrapolar dados de toxicidade entre espécies, a conservação do alvo molecular é um dos muitos fatores a serem considerados. A adsorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) de um produto químico é crucial quando se considera a toxicidade química, pois os produtos químicos podem ser ativados ou desintoxicados por esses processos39,40. Outros fatores, como a via de exposição química, o estágio e a história de vida do organismo e a dieta, também podem desempenhar papéis importantes na determinação da sensibilidade química entre asespécies41,42. Para abordar essa limitação, é importante entender a principal questão que o SeqAPASS faz ao prever a suscetibilidade química: é provável que o alvo proteico de um produto químico esteja presente em outra espécie para o produto químico agir? Esta questão é abordada através da identificação de candidatos a ortólogos e da consideração da conservação desse alvo entre espécies em relação a uma espécie sensível ou alvo conhecida. Essas informações podem ser usadas como uma linha de evidência para extrapolação entre espécies e integradas em outros fluxos de evidência (por exemplo, o potencial de exposição) para entender melhor a suscetibilidade das espécies a estressores químicos. As atualizações do SeqAPASS incorporaram links integrados para ferramentas externas, incluindo a base de conhecimento43 da EPA dos EUA e o Sistema Online de Conservação Ambiental (ECOS) do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA44. A conexão com esses bancos de dados fornece aos usuários do SeqAPASS fácil acesso a dados empíricos de toxicidade química para comparação com previsões baseadas em sequências e um meio de identificar espécies que podem ter status protegido.

A ferramenta SeqAPASS fornece uma plataforma cientificamente baseada para previsões computacionais de suscetibilidade intrínseca que são apoiadas por conceitos em biologia evolutiva e exemplos de casos que comparam previsões com resultados empíricos disponíveis. Além disso, o SeqAPASS é gratuito e publicamente disponível em uma plataforma baseada na Web bem suportada que é amplamente acessível (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). À medida que essa ferramenta aproveita dados de sequência e informações de proteínas de bancos de dados existentes, sua capacidade de prever a suscetibilidade química em uma diversidade mais ampla de espécies está melhorando constantemente à medida que a tecnologia de sequenciamento avança e os genomas de novas espécies são sequenciados e anotados. Embora isso ofereça vantagens distintas em relação à disponibilidade de dados, também apresenta uma limitação na medida em que as informações de sequência publicamente disponíveis podem estar sujeitas a qualidade inconsistente, má anotação e incompletude das sequências de proteínas para algumas espécies. No entanto, é promissor que as tecnologias e métodos ômicos em bioinformática estejam avançando rapidamente e, portanto, a curadoria e a qualidade da sequência provavelmente continuarão a melhorar ao longo do tempo.

Um dos principais objetivos da ferramenta SeqAPASS é a transparência, fornecendo acesso na forma de links para todas as fontes de dados e ferramentas integradas no back-end. Essa transparência permite ao usuário acesso rápido às fontes originais da sequência ou da informação taxonômica do NCBI. O domínio de aplicabilidade para esta ferramenta é definido pelas informações necessárias para realizar uma análise significativa. Uma vez que o conhecimento de uma interação químico-proteína ou proteína-proteína em uma espécie sensível ou alvo conhecida são elementos-chave para iniciar uma consulta, deve-se reconhecer que as consultas realizadas sem essas informações não são significativas. Além disso, os produtos químicos que têm múltiplos alvos biológicos indefinidos ou interagem com diferentes alvos com diferentes graus de potência também apresentam um desafio e uma limitação da ferramenta em sua forma atual. Prevê-se que, com a melhoria da bioinformática, modelagem computacional e triagem e transcriptômica baseadas em células e alto rendimento, um maior conhecimento em toda a diversidade do espaço químico sobre interações com proteínas específicas continuará a ser elucidado. Espera-se que a capacidade de aplicar o SeqAPASS a desafios mais amplos de extrapolação de espécies, em relação à compreensão do potencial de efeitos químicos adversos em toda a diversidade de espécies, continue a melhorar.

Em conclusão, a ferramenta SeqAPASS é uma plataforma acessível que aplica prontamente informações moleculares para enfrentar o desafio considerável da extrapolação entre espécies nas avaliações de segurança química. Embora os exemplos destacados aqui estejam focados em gerar previsões de suscetibilidade química, os resultados também podem ajudar na compreensão da conservação geral das vias biológicas. Reunindo diferentes linhas de evidência e facilitando o acesso a múltiplas plataformas e bancos de dados, essa ferramenta ajuda a construir casos transparentes para a priorização de testes químicos e alocação de recursos. Com o desenvolvimento contínuo de capacidades científicas e bioinformáticas, o poder e a utilidade da ferramenta continuarão a crescer e melhorar para atender às necessidades das comunidades de pesquisa e regulamentação, reduzindo os recursos necessários para avaliações entre espécies.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem ao Dr. Daniel L. Villeneuve (EPA dos EUA, Centro de Toxicologia Computacional e Exposição) e ao Dr. Jon A. Doering (Departamento de Ciências Ambientais, Louisiana State University) por fornecerem comentários sobre um rascunho anterior do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA. As opiniões expressas neste artigo são as dos autores e não refletem necessariamente as opiniões ou políticas da Agência de Proteção Ambiental dos EUA, nem a menção de nomes comerciais ou produtos comerciais indica endosso pelo governo federal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

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Genética Edição 192 Extrapolação entre espécies ecotoxicologia toxicologia preditiva metodologia de nova abordagem receptor opioide transtirretina
Demonstração do alinhamento da sequência para prever a ferramenta de suscetibilidade entre espécies para avaliação rápida da conservação de proteínas
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