Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Demonstration av sekvensjusteringen för att förutsäga över arters känslighetsverktyg för snabb bedömning av proteinbevarande

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att använda den senaste versionen av verktyget US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS). Detta protokoll visar tillämpningen av onlineverktyget för att snabbt analysera proteinbevarande och ge anpassningsbara och lättolkade förutsägelser om kemisk mottaglighet mellan arter.

Abstract

Verktyget Us Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) är en snabb, fritt tillgänglig online-screeningapplikation som gör det möjligt för forskare och tillsynsmyndigheter att extrapolera toxicitetsinformation mellan arter. För biologiska mål i modellsystem som mänskliga celler, möss, råttor och zebrafiskar finns toxicitetsdata tillgängliga för en mängd olika kemikalier. Genom utvärdering av proteinmålbevarande kan detta verktyg användas för att extrapolera data som genereras från sådana modellsystem till tusentals andra arter som saknar toxicitetsdata, vilket ger förutsägelser om relativ inneboende kemisk mottaglighet. De senaste versionerna av verktyget (versionerna 2.0-6.1) har införlivat nya funktioner som möjliggör snabb syntes, tolkning och användning av data för publicering plus grafik av presentationskvalitet.

Bland dessa funktioner finns anpassningsbara datavisualiseringar och en omfattande sammanfattande rapport som är utformad för att sammanfatta SeqAPASS-data för enkel tolkning. Detta dokument beskriver protokollet för att vägleda användare genom att skicka jobb, navigera i de olika nivåerna av proteinsekvensjämförelser och tolka och visa resulterande data. Nya funktioner i SeqAPASS v2.0-6.0 markeras. Dessutom beskrivs två användningsfall fokuserade på transtyretin och opioidreceptorproteinbevarande med hjälp av detta verktyg. Slutligen diskuteras SeqAPASS styrkor och begränsningar för att definiera tillämplighetsdomänen för verktyget och lyfta fram olika applikationer för extrapolering mellan arter.

Introduction

Traditionellt har toxikologiområdet i hög grad förlitat sig på användningen av tester för hela djur för att tillhandahålla de uppgifter som krävs för kemikaliesäkerhetsbedömningar. Sådana metoder är vanligtvis kostsamma och resurskrävande. På grund av det stora antalet kemikalier som för närvarande används och den snabba takt med vilken nya kemikalier utvecklas finns det globalt ett erkänt behov av effektivare metoder för kemisk screening 1,2. Detta behov och det resulterande paradigmskiftet bort från djurförsök har lett till utvecklingen av många nya metodmetoder, inklusive screeninganalyser med hög genomströmning, transkriptomik med hög genomströmning, nästa generations sekvensering och beräkningsmodellering, som lovar alternativa teststrategier 3,4.

Att utvärdera kemikaliesäkerheten för de olika arter som kan påverkas av kemisk exponering har varit en bestående utmaning, inte bara med traditionella toxicitetstester utan också med nya metoder. Framsteg inom jämförande och prediktiv toxikologi har gett ramar för att förstå den relativa känsligheten hos olika arter, och tekniska framsteg inom beräkningsmetoder fortsätter att öka tillämpligheten av dessa metoder. Flera strategier har diskuterats under det senaste decenniet som utnyttjar befintliga gen- och proteinsekvensdatabaser, tillsammans med kunskap om specifika kemiska molekylära mål, för att stödja prediktiva metoder för extrapolering mellan arter och förbättra kemikaliesäkerhetsutvärderingar utöver de typiska modellorganismerna 5,6,7,8.

För att främja vetenskapen till handling, bygga vidare på dessa grundläggande studier inom prediktiv toxikologi, prioritera kemiska testinsatser och stödja beslutsfattande, skapades verktyget US Environmental Protection Agency Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS). Detta verktyg är en offentlig och fritt tillgänglig webbaserad applikation som använder offentliga förvar av ständigt växande proteinsekvensinformation för att förutsäga kemisk mottaglighet över mångfalden av arter9. Baserat på principen att en arts relativa inneboende mottaglighet för en viss kemikalie kan bestämmas genom att utvärderabevarandet av de kända proteinmålen för den kemikalien, jämför detta verktyg snabbt proteinaminosyrasekvenser från en art med känd känslighet för alla arter med befintliga proteinsekvensdata. Denna utvärdering slutförs genom tre analysnivåer, inklusive (1) primär aminosyrasekvens, (2) funktionell domän och (3) kritiska jämförelser av aminosyrarester, var och en kräver mer djupgående kunskap om interaktionen mellan kemikalier och protein och ger större taxonomisk upplösning i känslighetsförutsägelsen. En stor styrka med SeqAPASS är att användare kan anpassa och förfina sin utvärdering genom att lägga till ytterligare bevislinjer mot målbevarande baserat på hur mycket information som finns tillgänglig om interaktionen mellan kemiskt protein eller protein-protein och intressant.

Den första versionen släpptes 2016, vilket gjorde det möjligt för användare att utvärdera primära aminosyrasekvenser och funktionella domäner på ett strömlinjeformat sätt för att förutsäga kemisk mottaglighet och innehöll minimala datavisualiseringsfunktioner (tabell 1). Individuella aminosyraskillnader har visat sig vara viktiga determinanter för skillnader mellan arter i interaktioner mellan kemikalier och protein, vilket kan påverka arternas kemiska känslighet10,11,12. Därför utvecklades efterföljande versioner för att överväga de kritiska aminosyrorna som är viktiga för direkt kemisk interaktion13. Som svar på feedback från intressenter och användare har detta verktyg genomgått årliga versioner med ytterligare nya funktioner som är utformade för att möta behoven hos både forskare och regleringssamhällen för att hantera utmaningar vid extrapolering mellan arter (tabell 1). Lanseringen av SeqAPASS version 5.0 2020 tog fram användarcentrerade funktioner som innehåller alternativ för datavisualisering och datasyntes, externa länkar, sammanfattningstabell och rapportalternativ och grafiska funktioner. Sammantaget förbättrade de nya attributen och funktionerna i denna version datasyntesen, interoperabiliteten mellan externa databaser och den enkla datatolkningen för förutsägelser om mottaglighet mellan arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Komma igång

OBS: Protokollet som presenteras här är fokuserat på verktygsverktyg och nyckelfunktioner. Detaljerade beskrivningar av metoder, funktioner och komponenter finns på webbplatsen i en omfattande användarhandbok (tabell 1).

Tabell 1: Utveckling av SeqAPASS-verktyget. En lista över funktioner och uppdateringar som lagts till i SeqAPASS-verktyget från den första distributionen. Förkortningar: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet; ECOTOX = ECOTOXicology kunskapsbas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

  1. Gå till https://seqapass.epa.gov/seqapass med Chrome. Välj antingen Logga in för att använda ett befintligt konto eller följ instruktionerna för att skapa ett SeqAPASS-konto, vilket gör det möjligt för användare att köra, lagra, komma åt och anpassa sina slutförda jobb.
  2. Innan du utför en analys, identifiera först ett protein av intresse och en riktad eller känslig art genom att granska befintlig litteratur eller befintliga data (figur 1). Eftersom SeqAPASS innehåller länkar till externa resurser för att identifiera frågeproteinet klickar du på rullgardinsknapparna under Identifiera ett proteinmål för att komma åt relevanta resurser.

Figure 1
Figur 1: SeqAPASS problemformulering: schematiskt diagram över den preliminära information som krävs för en framgångsrik analys. Förkortningar: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet; LBD = ligandbindande domän. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: SeqAPASS-samverkan mellan databaser. Schematiskt diagram över externa verktyg, databaser och resurser integrerade i SeqAPASS. Förkortningar: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet; AOP = negativ utfallsväg; NCBI = Nationellt centrum för bioteknikinformation; ECOTOX = ECOTOXicology kunskapsbas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 2: Länkar, resurser och verktyg som är integrerade i SeqAPASS-verktyget. En lista över de olika datakällor, länkar och resurser som används i SeqAPASS-verktyget. Förkortning: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

2. Utveckla och köra en SeqAPASS-fråga: Nivå 1

OBS: I en nivå 1-analys jämförs hela den primära aminosyrasekvensen för ett frågeprotein med de primära aminosyrasekvenserna för alla arter med tillgänglig sekvensinformation. Detta verktyg använder algoritmer för att bryta, samla in och sammanställa offentligt tillgängliga data för att snabbt anpassa och jämföra aminosyrasekvenser mellan arter. Backend lagrar information från National Center for Biotechnology Information (NCBI) databaser och använder strategiskt de fristående versionerna av Protein Basic Local Alignment Search Tool (BLASTp)54 och Constraint-based Multiple Alignment Tool (COBALT)55.

  1. Under Jämför primära aminosyrasekvenser klickar du antingen på Efter art eller Efter anslutning. Använd urvalet Efter art för att skriva eller välja från en lista över arter för att välja det proteinmål som är av intresse.
  2. Skicka in proteinanslutningar (dvs. NCBI-protein-ID) direkt genom att ange anslutningen eller anslutningarna i textrutan Efter anslutning .
  3. Välj Begär körning för att skicka frågan. När du har skickat in väntar du på att ett meddelande visas i det övre högra hörnet av webbläsarfönstret som indikerar en lyckad inlämning.
  4. Välj fliken SeqAPASS Run Status högst upp på sidan för att visa en lista över alla SeqAPASS-körningar som utförts under det användarkontot och kontrollera den procentuella slutförandet.
    1. Klicka på Uppdatera data medan lämplig alternativknapp är markerad för att kontrollera statusen för nivå 2- och nivå 3-körningar.
  5. Välj fliken Visa SeqAPASS-rapporter högst upp på sidan för att komma åt en lista över alla rapporter som slutförts under det kontot.
  6. På fliken Visa SeqAPASS-rapporter väljer du det frågeprotein som är av intresse. Klicka på Begär vald rapport för att öppna sidan Nivå 1-frågeproteininformation och visa resultat, alternativ för dataanpassning, visualiseringar och sammanfattningsrapporter.
  7. Som standard väljer du Visa rapport för att visa data i webbläsaren. Du kan också välja Spara rapport för att ladda ned rådata som en .zip fil.
    Den tid som krävs för en nivå 1-analys varierar (i genomsnitt 23 minuter för version 5.1) beroende på den globala användarefterfrågan vid den tidpunkten, antalet jobb som skickas till kön och mängden proteininformation som finns för ett skickat jobb. Om ett proteinmål tidigare har slutförts kommer data att finnas tillgängliga på några sekunder efter inlämning.

3. Utveckla och köra en SeqAPASS-fråga: Nivå 2

OBS: Eftersom hela proteinsekvensen inte är direkt involverad i en kemisk interaktion, jämför en nivå 2-analys endast aminosyrasekvensen i den funktionella domänen för att göra känslighetsförutsägelser vid lägre taxonomiska led (t.ex. klass, ordning, familj).

  1. På sidan Nivå 1-frågeproteininformation klickar du på plustecknet + bredvid rubriken Nivå 2 för att fylla i frågemenyn Nivå 2 .
  2. Identifiera lämpliga domäner i proteinet av intresse (frågeprotein).
    1. Om en domän inte har identifierats klickar du på den integrerade länken till NCBI Conserved Domains Database (CDD) (tabell 1), vilket kan hjälpa till att identifiera lämpligt domänval.
      Vanligtvis väljs endast specifika träffdomäner som frågor på nivå 2.
  3. Klicka på rutan Välj domän för att automatiskt fylla i en lista över funktionella domäner för frågeproteinet.
  4. Välj domänanslutning(ar) i listrutan och initiera nivå 2-frågan genom att klicka på knappen Begär domänkörning . När du har skickat in väntar du på att ett meddelande visas som anger en lyckad inlämning.
  5. Klicka på Uppdatera nivå 2 och 3 körs för att fylla i nivå 2-data, som kommer att vara tillgängliga inom några sekunder efter att de har skickats in.
  6. Under Visa nivå 2-data väljer du de slutförda domänanslutningarna i listrutan och klickar på knappen Visa nivå 2-data för att öppna resultaten på en ny sida.

4. Åtkomst till och förståelse av data: SeqAPASS nivå 1 och nivå 2

  1. Bläddra till botten av sidan Frågeproteininformation för att visa en rapport om resultaten - en primär rapport tillhandahålls med nivå 1- och 2-analyser som standard. Välj alternativknappen Fullständig rapport om du vill visa en mer detaljerad rapport som innehåller alla sekvensträffar och justeringsmått. Klicka på lämplig anslutning/ID/namn i båda rapporterna för att komma åt den transparenta proteinjusterings- och taxonomiinformationen i NCBI-databasen.
  2. Bläddra till höger om resultattabellen för att visa ECOTOX-kolumnen . Klicka på länkarna till ECOTOXicologys kunskapsbas (ECOTOX) för att snabbt samla in motsvarande toxicitetsdata för arter med känslighetsförutsägelser.
    OBS: ECOTOX är en omfattande, allmänt tillgänglig kunskapsbas som tillhandahåller enskilda kemiska toxicitetsdata för vattenlevande och landlevande växter och vilda djur. SeqAPASS v6.0 innehåller en ECOTOX-widget för att snabbare ansluta till relevanta ECOTOX-data efter kemikalie och art av intresse.
  3. Klicka på Ladda ned tabell för att spara tabellen som en kalkylarksfil. Klicka på knappen Visa sammanfattningsrapport om du vill visa och ladda ned en sammanfattningsrapporttabell med data sorterade efter taxonomisk grupp.
    Datasammanfattningstabeller är tillgängliga för både primära och fullständiga rapporter och ger en översikt över förutsägelser för ett visst mål.

5. Manipulera datainställningar: SeqAPASS nivå 1 och nivå 2

OBS: I både nivå 1- och nivå 2-analyser antas det att ju större proteinlikhet, desto större är sannolikheten för att en kemikalie kommer att interagera med proteinet på ett liknande sätt som frågearten/proteinet, vilket gör dem mottagliga för potentiella effekter av kemikalier med detta molekylära mål. På grund av likheten mellan dessa data beskrivs steg för att förstå nivå 1- och 2-data tillsammans i ett enda protokoll.

  1. Se undermenyerna högst upp i Query Protein Information för att komma åt och ändra rapportinställningarna och använda standardinställningarna för alla rapportalternativ för de flesta analyser. Om det finns vetenskapliga skäl för att ändra standardinställningen följer du dessa valfria steg:
    1. (VALFRITT) Klicka på plustecknet + bredvid Känslighetsavgränsning för att visa och justera inställningarna för känslighetsavgränsning i en ny flik. Välj antingen ett nytt gränsvärde i en listruta eller ange ett användardefinierat gränsvärde.
    2. (VALFRITT) Ändra fältet för antal i E-värde (antalet olika justeringar som förväntas inträffa av en slump) om något annat än standard önskas.
      OBS: Allt protein med ett E-värde som är större än numret i rutan kommer att elimineras från den primära rapporten.
    3. (VALFRITT) Använd alternativet Sortera efter taxonomisk grupp för att välja den taxonomiska hierarkins nivå som ska visas i kolumnen Filtrerad taxonomisk grupp i resultattabellen.
      OBS: Att ändra den taxonomiska hierarkin kommer också att ändra förutsägelsen av mottaglighet baserat på arterna från varje filtrerad grupp som finns ovanför cutoff.
    4. (VALFRITT) Ändra fältet Common Domain (hur många gemensamma domäner ett protein måste dela med frågeproteinet för att inkluderas i resultaten) om något annat än standard önskas.
      OBS: Eftersom standardinställningen är 1 kommer alla sekvenser som inte delar minst en gemensam domän med frågeproteinet att uteslutas.
    5. (VALFRITT) Välj Nej under Artläsning för att få tillbaka känslighetsförutsägelserna för Y endast om Procentlikhet är större än eller lika med cutoffen eller om träffen identifieras som en ortologkandidat.
      OBS: Den här inställningen är som standard Ja, vilket innebär att en känslighetsförutsägelse av Y kommer att rapporteras för alla ortologkandidater, alla arter som listas ovanför känslighetsgränsen och alla arter under gränsen från samma taxonomiska grupp med en eller flera arter ovanför cutoff.
  2. Klicka på knappen Ladda ned aktuella rapportinställningar för att ladda ned en fil som samlar in de aktuella inställningarna.
    Den specifika utvärderingsnivån (1, 2 eller 3) som valts kommer att diktera inställningarna som presenteras i rapporten.

6. Visualisera data: SeqAPASS nivå 1 och nivå 2

  1. Klicka på plustecknet + bredvid Visualisering och klicka på knappen Visualisera data för att öppna en separat flik som visar den användardefinierade informationen och alternativet att välja ett interaktivt diagram med resultat.
  2. Klicka på Boxplot för att öppna de interaktiva boxplot- och diagramkontrollerna och låt boxplot-visualiseringen aktivt uppdateras för att återspegla ändringar i datatabellen och tillhandahålla grafik av publikations- och presentationskvalitet.
    OBS: Standardboxplot visar artgrupper på x-axeln och procentlikhet på y-axeln. Boxplots visar känslighetsgränsen (streckad linje), procentuell likhet mellan arter jämfört med frågearten och medel- och medianvärden för varje taxonomisk grupp tillsammans med 25: e och 75: e percentilen och interkvartilintervallet. Beroende på målet med analysen och användarens behov kan många boxplot-funktioner ändras genom följande valfria steg.
    1. (VALFRITT) Information om hur du anpassar de taxonomiska grupper som visas finns i rutan Taxonomiska grupper under avsnittet Kontroller . Ta bort grupper genom att bläddra över namnen och välja x eller genom att använda rullgardinsmenyn Taxonomiska grupper .
    2. (VALFRITT) Om du vill lägga till en förklaring som identifierar en art av intresse eller specifika fördefinierade grupper (t.ex. hotade eller hotade arter) håller du muspekaren över ett taxonomiskt gruppnamn på x-axeln för att aktivera en popup-ruta som listar de tre främsta arterna ordnade efter högsta procentlikhet. Håll muspekaren över arter i legenden för att skapa en popup-ruta med motsvarande artinformation. Klicka på rutan för en specifik taxonomisk grupp för att generera en nedladdningsbar sammanfattningstabell med arter och förutsägelser.
  3. Klicka på Ladda ned Boxplot för att välja en filtyp, anpassa bredd-/höjdupplösningen och spara visualiseringen.

7. Utveckla och driva en SeqAPASS-analys: Nivå 3

OBS: En nivå 3-analys bedömer användaridentifierade aminosyrarester i frågeproteinet och jämför snabbt bevarandet av dessa rester mellan arter. Arter där dessa rester bevaras antas vara mer benägna att interagera med en kemikalie på ett liknande sätt som mallarten/proteinet. Eftersom nivå 3 fokuserar på enskilda aminosyror kan en analys endast utföras när detaljerad kunskap om aminosyraresterna som är kritiska för interaktionen mellan kemiskt protein eller protein-protein finns tillgänglig.

  1. Klicka på plustecknet + bredvid rubriken Nivå 3 på sidan Nivå 1-frågeproteininformation för att fylla i frågemenyn Nivå 3.
  2. Klicka på plustecknet + bredvid Referensutforskaren för att öppna verktyget för referensutforskaren , som genererar en fördefinierad boolesk sträng för att fråga den tillgängliga litteraturen och hjälper användarna att identifiera lämplig litteratur för att stödja identifieringen av kritiska aminosyror som ska användas i nivå 3-utvärderingen (tabell 2 och figur 2).
    1. (VALFRITT) När frågeproteinet fylls i automatiskt använder du funktionen Lägg till proteinnamn för att lägga till ytterligare proteiner.
  3. Klicka på länken Generera Google Scholar för att öppna ett popup-fönster som innehåller en automatiskt genererad söksträng som innehåller relevanta söktermer.
  4. Klicka på Sök i Google Scholar för att söka i litteraturdatabasen med hjälp av söksträngen.
    1. Du kan också klicka på Kopiera till Urklipp och anpassa söksträngen genom att lägga till eller ta bort termer med hjälp av funktionerna i Referensutforskaren.

8. Identifiera kritiska aminosyrarester med hjälp av identifierad litteratur

  1. Välj den mallsekvens som användarvalda arter ska justeras till på frågemenyn Nivå 3.
    OBS: Denna mallsekvens väljs vanligtvis baserat på litteraturen för vilken de kritiska aminosyrorna identifierades och kan vara samma eller en annan art än de som efterfrågas i nivå 1 och nivå 2.
    1. (VALFRITT) Använd rutan Ytterligare jämförelser för att jämföra eventuella anslutningar/sekvenser som inte visas i tabellerna Primär/ Fullständig rapport .
  2. Ange ett användardefinierat namn för körningen på Nivå 3 i textrutan Ange körningsnamn på nivå 3 för att identifiera den slutförda nivå 3-körningen . Välj ett unikt namn för varje utvärdering.
  3. Välj den taxonomiska grupp som är av intresse i fältet Välj taxonomiska grupper . Välj en taxonomisk grupp för att automatiskt filtrera tabellen efter den taxonomiska gruppen.
  4. Klicka manuellt på kryssrutan bredvid de arter som ska justeras mot mallsekvensen i resultattabellen.
    OBS: För att säkerställa lämplig justering bör en taxonomisk grupp i taget jämföras med mallen. Välj endast liknande kommenterade proteiner för de arter som är av intresse. När du väljer sekvenser för jämförelse är det viktigt att vara uppmärksam på vissa sekvenser (t.ex. hypotetiska, LÅG KVALITET eller delvis). Om det inte finns en transparent motivering för inkludering är det bäst att utesluta dessa sekvenser eftersom de kan snedvrida förutsägelser på grund av ofullständig eller olämplig sekvensinformation.
  5. Upprepa stegen för att justera alla taxonomiska grupper av intresse.
  6. Klicka på Uppdatera nivå 2- och 3-körningar när alla arter har justerats för att fylla i menyn Välj nivå 3-körningsnamn med de slutförda nivå 3-jobben och hämta data från en nivå 3-justering omedelbart.
  7. Klicka på Kombinera nivå 3-data om du vill kombinera justeringar från flera taxonomiska grupper.
    1. Om du vill visa en enskild rapport kan du också välja det användardefinierade namnet under Välj fråga att visa och klicka på Visa data på nivå 3.
  8. Välj den nivå 3-mall som ska användas som grund för jämförelse av aminosyrarester i menyn Kombinera nivå 3-rapporter och klicka på Nästa.
  9. I Nivå 3-jobb väljer du slutförda jobb för jämförelse och klickar på Nästa. Använd funktionen Ordernivå 3-jobb för att ordna om de taxonomiska grupperna om du vill. Klicka på Visa nivå 3-data om du vill skapa en rapportsida på nivå 3 med de kombinerade taxonomiska grupperna justerade.
  10. Välj tidigare identifierade aminosyrapositioner för mallarterna genom att skriva in aminosyrapositionen, avgränsade med kommatecken, i rutan Ange aminosyrarestpositioner och sedan välja Kopiera till restlista. Välj direkt rester i mallsekvensen från skyttelrutan.
  11. Klicka på Uppdatera rapport för att uppdatera sidan och visa förutsägelser om känslighet på nivå 3.
    OBS: Nivå 3 använder en enkel uppsättning regler härledda från grundläggande deskriptorer av sidokedjefunktionella egenskaper (t.ex. alifatiska, aromatiska) och molekylära dimensioner (molekylviktsskillnader >30 g / mol) för att avgöra om skillnader vid nyckelpositioner sannolikt kommer att påverka proteininteraktioner13.

9. Visualisering av SeqAPASS-data på nivå 3

OBS: Som i tidigare nivåer finns primära och fullständiga rapporter tillgängliga. Förutom data som är identiska med data i nivå 1 och 2 visar primärrapporten aminosyrapositioner, förkortningar och en ja/nej (J/N) liknande känslighet som mallförutsägelsen. På samma sätt innehåller den fullständiga rapporten information om aminosyrans sidokedjeklassificering och molekylvikt.

  1. På rapportsidan på nivå 3 bläddrar du längst ned för att visa en rapport om resultaten. Klicka på Ladda ned tabell längst ned i rapporten för att spara tabellen.
  2. Klicka på Visa sammanfattningsrapport på nivå 3 om du vill visa och hämta en sammanfattningsrapporttabell med data sorterade efter taxonomisk grupp. Klicka på plustecknet + bredvid Visualisering på rapportsidan Nivå 3 för att öppna en separat webbläsarflik som visar den användardefinierade informationen och alternativet att visa resultat i form av en interaktiv värmekarta.
  3. Klicka på Värmekarta på sidan Visualiseringsinformation för att öppna den interaktiva grafiken och kontrollerna och låta visualiseringen av värmekartan aktivt uppdateras för att återspegla ändringar i datatabellen. Utför följande valfria steg för att anpassa värmekartan.
    1. (VALFRITT) Välj Rapportalternativ om du vill växla mellan en enkel rapport, som visar aminosyrapositionen, en bokstavsförkortning och aminosyralikhet, eller en fullständig rapport, som visar detaljerad information om varje vald aminosyra.
    2. (VALFRITT) Välj Rapportalternativ om du vill ändra hur arter visas, antingen efter eget namn eller vetenskapligt namn.
      OBS: I den enkla rapporten kategoriseras aminosyror som en Total Match (mörkblå), Partiell Match (ljusblå, substitutioner som endast uppfyller ett kriterium) eller Not a Match (gul, substitutioner som uppfyller inget av kriterierna) till mallen aminosyra. Den fullständiga rapporten visar jämförelser som antingen en Total Match (mörkblå) eller Inte en matchning (gul).
    3. (VALFRITT) Välj Valfria val för att markera användbar information som ortologkandidater, hotade arter, hotade arter eller vanliga modellorganismer.
    4. (VALFRITT) Välj Inställningar för värmekarta för att välja ytterligare anpassningsalternativ, inklusive att lägga till eller ta bort kolumner, förklaringar och text.
  4. Klicka på Ladda ned Boxplot för att välja en filtyp och spara visualiseringen.

10. Tolkning av SeqAPASS-resultat: Bevislinjer för proteinbevarande

OBS: För att underlätta tolkningen innehåller detta verktyg en beslutssammanfattningsrapport (DS-rapport) som är utformad för att integrera data över nivåer. DS-rapporten innehåller de resultat (dvs. datatabeller och/eller visualiseringar) som användaren har valt och möjliggör snabb utvärdering av känslighetsförutsägelser över flera nivåer för flera arter samtidigt.

  1. Klicka på Push-nivå # till DS-rapport från resultat- eller datavisualiseringssidorna och vänta tills data "pushas" och fliken DS-rapport blir aktiv.
    Om resultat eller ändringar inte har skickats till DS-rapporten förblir push-nivå # till DS-rapport aktiv tills den väljs. Om en inställning har ändrats visas texten Klicka för att skicka nya ändringar tills ändringarna skickas till rapporten. Visualiseringar kan skickas till DS-rapporten när som helst under utvärderingen.
  2. Välj fliken DS-rapport när som helst för att komma åt DS-sidan.
    OBS: För alla arter som är anpassade till nivå 1 innehåller tabellen Slutlig beslutssammanfattningsrapport viktiga data och känslighetsförutsägelser för varje analys. Om en art i DS-tabellen inte inkluderades i nivå 3-rapporten men hittades i nivå 1- och/eller nivå 2-jobb, får cellen i tabellen en icke tillämplig (NA) beteckning för nivå 3-känslighetsförutsägelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att demonstrera tillämpningen av SeqAPASS-verktyget och lyfta fram nya funktioner beskrivs två fallstudier som representerar fall där proteinbevarande förutsäger att det finns skillnader i kemisk mottaglighet mellan arter (human transtyretin) och att det inte finns några skillnader (μ opioidreceptor [MOR]). Det första av dessa exempel behandlar proteinsekvens/strukturella jämförelser för att förutsäga tillämplighetsområdet för negativa utfallsvägar (AOP, se tabell 2 för definition), medan det andra är inriktat på att utveckla forskningshypoteser som är relevanta för mottaglighet mellan arter för opioider som finns i avloppsvatten. De grundläggande tillvägagångssätten som beskrivs i dessa fallstudier kan tillämpas på alla kemikalier och visa den breda nyttan av detta verktyg för beslutsfattande och forskning.

Sköldkörtelhormoner är viktiga för normal tillväxt och utveckling. De syntetiseras i sköldkörteln och utsöndras i blodomloppet där de binder till distributionsproteiner och cirkuleras i hela kroppen 14,15,16,17,18. Nyligen genomförda studier har visat att miljöföroreningar, såsom polyklorerade bifenyler (PCB), polybromerade difenyletrar (PBDE) och per- och polyfluoralkylsubstanser (PFAS), kan binda konkurrenskraftigt till distributionsproteinet transtyretin (TTR) och störa normala sköldkörtelprocesser 19,20,21,22,23,24,25 . En AOP har utvecklats som beskriver konkurrenskraftig bindning till TTR som leder till human neurodevelopmental toxicitet (https://aopwiki.org/aops/152). Även om det finns bevis för att denna AOP också är tillämplig på gnagare, har tillämpligheten på andra taxonomiska grupper ännu inte definierats. Eftersom TTR-bindande kemikalier finns i miljön är det viktigt att förstå den taxonomiska relevansen av denna AOP, en utmaning som delvis kan hanteras genom SeqAPASS-analys. Med hjälp av verktygets problemformuleringsstrategi kan syftet med analysen anges enligt följande: Med vetskapen om att TTR-bindande föreningar leder till negativa resultat hos människor, vilka taxonomiska grupper skulle förutspås dela liknande mottaglighet?

Det humana transtyretinproteinet är väl karakteriserat, och det finns flera välstuderade ligander som är kända för att binda vid det humana TTR-bindningsstället (hTTR), vilket gör det till ett optimalt mål för SeqAPASS-analys 8,9,13. Med hjälp av NCBI-anslutningen för human transtyretin, P02766.1, genomfördes en nivå 1-analys med standardinställningar. Resultaten av nivå 1-analysen satte den procentuella likhetsgränsen till 49%, med däggdjur (Mammalia), fåglar (Aves), reptiler (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibier (Amphibia) och de flesta fiskarter (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) som faller ovanför denna cutoff (Figur 3). Således resulterade alla arter från dessa taxonomiska grupper i en känslighetsförutsägelse av "Y" (dvs. ja) och är sannolikt mottagliga för kemikalier som är kända för att interagera med hTTR (figur 3 och kompletterande fil 1).

För nivå 2-bedömningen av funktionella domäner användes NCBI Conserved Domain Database för att identifiera TR_THY (accession smart00095) som en bevarad domän som omfattar den mogna kedjan av TTR-subenhetsproteinet från rester 27 till 147. Eftersom proteinsekvensen av TTR som rapporterats i NCBI innehåller ett 20 aminosyraförsegment som inte är relevant för den aktuella analysen, ger fokusering på den mogna kedjan en ytterligare, mer specifik, bevislinje mot bevarandet av detta protein över arter. Från nivå 2-utvärderingen rapporterades en procentuell likhetsgräns på 58%, med däggdjur, fåglar, reptiler, amfibier och de flesta fiskarter som återigen faller över denna cutoff (figur 4). Följaktligen avslutade SeqAPASS en känslighetsförutsägelse av "Y" (dvs. ja) för arter från dessa taxonomiska grupper, vilket indikerar att de sannolikt är mottagliga för kemikalier som interagerar med hTTR-proteinet (figur 4 och kompletterande fil 1). Sammantaget tyder resultaten från nivå 1- och nivå 2-analyser på att de flesta ryggradsdjur delar bevarandet av hTTR och sannolikt är mottagliga för kemikalier som är kända för att interagera med detta protein.

Figure 3
Figur 3: SeqAPASS nivå 1-analys av transtyretinbevarande över taxonomiska grupper med tillgänglig sekvensinformation i förhållande till det humana proteinet. Procentlikhet av proteinaminosyrasekvensen visas på Y-axeln; taxonomisk grupp visas på X-axeln. Öppna cirklar (○) anger frågesekvensen och slutna cirklar (●) anger arten inom den taxonomiska gruppen med den högsta procentlikheten. Inom diagrammet representerar toppen och botten av varje ruta den 75: e och 25:e percentilen, morrhåren sträcker sig till 1,5 gånger interkvartilområdet och medelvärdena och medianvärdena representeras av horisontella svarta linjer på rutan. Den streckade linjen anger gränsen för känslighetsförutsägelser. Förkortningar: TTR = transtyretin; SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: SeqAPASS nivå 2-analys av transtyretinreceptorns ligandbindande domänbevarande över taxonomiska grupper med tillgänglig sekvensinformation i förhållande till det humana proteinet LBD. Procentlikhet av ligandbindningsdomänens aminosyrasekvens visas på Y-axeln; taxonomisk grupp visas på X-axeln. Öppna cirklar (○) anger frågesekvensen och slutna cirklar (●) anger arten inom den taxonomiska gruppen med den högsta procentlikheten. Inom diagrammet representerar toppen och botten av varje ruta den 75: e och 25:e percentilen, morrhåren sträcker sig till 1,5 gånger interkvartilområdet och medelvärdena och medianvärdena representeras av horisontella svarta linjer på rutan. Den streckade linjen anger gränsen för känslighetsförutsägelser. Förkortningar: TTR = transtyretin; SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Genom analys av molekylär modellering och proteinkristallografistudier identifierades aminosyror i bindningsområdet för TTR som förutspås interagera med den endogena liganden 3,3′,5,5′-tetrajod-L-tyronin (T4, PDB 2ROX), samt tre miljökemikalier: perfluoroktansulfonat (PFOS, PDB 5JIM), tetrabromobisfenol A (TBBPA, PDB 5HJG) och dietylstilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Aminosyraresterna Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 och Thr139 identifierades alla som en nyckelroll i protein-ligandinteraktioner, antingen genom direkta vätebindningsinteraktioner eller van der Waals-interaktioner. Dessa sex aminosyrarester utvärderades i en nivå 3-analys över arter med hTTR som mallsekvens och exklusive icke-homologa, hypotetiska, partiella och lågkvalitativa sekvenser (Supplemental File 1). Eftersom det tidigare fastställts att TTR endast bevaras över ryggradsdjur, uteslöts ryggradslösa djurarter från denna analys (figur 3 och figur 4). Dessutom är det viktigt att notera att aminosyrapositioner som rapporterats i litteraturen utesluter ett 20 aminosyraförsegment som saknas i det mogna hTTR-proteinet och av denna anledning justerades positioner som lämnats in i nivå 3 från de som rapporterats i litteraturen för att säkerställa korrekt anpassning till det valda mallproteinet15 (Supplemental File 1).

I nivå 3-analysen av TTR valdes 294 ryggradsdjurarter ut för anpassning (däggdjur, fåglar, amfibier, reptiler och fiskar). Av de utvärderade arterna visade 18 skillnader i viktiga aminosyror vilket resulterade i en känslighetsförutsägelse av "N" (dvs. nej). Intressant nog presenterade fem arter av marina däggdjur en aminosyrasubstitution vid position 2 (128A), medan fyra fiskarter visade substitutioner vid antingen position 2 (128A) eller position 6 (139T) (Figur 5). Eftersom dessa aminosyror spelar viktiga roller i protein-ligandinteraktioner i bindningskanalen för TTR, tyder dessa data på att TTR-ligander kan interagera annorlunda i dessa arter och skulle resultera i olika kemiska mottaglighet i förhållande till människor.

Figure 5
Figur 5: SeqAPASS nivå 3-analys av bevarandet av aminosyrarester som är viktiga för TTR-kemisk bindning. (A) Sammanfattande tabell på nivå 3 som visar antalet arter med tillgängliga sekvensdata för alla taxonomiska grupper, antalet arter som förutspås vara lika mottagliga (Y) och antalet arter som förutspås inte vara lika mottagliga (N). (B) Värmekarta på nivå 3 som visar utvalda arter som inte förväntas vara lika mottagliga i förhållande till det humana transtyretin-TTR-proteinet, som visar fullständiga, partiella och icke-matchande aminosyror. Förkortningar: TTR = transtyretin; SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Som svar på feedback från intressenter och användare har nya funktioner utformats och införlivats i SeqAPASS-verktyget, inklusive möjligheten att ansluta till empiriska data för olika applikationer. Verktygets interoperabilitet med ECOTOX-kunskapsbasen (tabell 1) uppnåddes både genom att integrera externa länkar i datatabellerna på nivå 1 och nivå 2 för anslutningar som finns i ECOTOX och genom att skapa en ECOTOX-widget i verktyget för att direkt filtrera till de mest relevanta toxicitetsdata i ECOTOX. Genom länkarna och widgeten kan användare snabbt fråga ECOTOX och samla in motsvarande toxicitetsdata för arter med SeqAPASS-känslighetsförutsägelser. För närvarande är SeqAPASS-förutsägelser kopplade till ECOTOX genom en kemisk stressor och art; Toxicitetsdata är dock ännu inte kopplade till specifika gener/proteiner, vilket skulle möjliggöra direkta kopplingar till de specifika endpoints/molekylära mål som är av intresse för SeqAPASS. Även om det inte är idealiskt att koppla förutsägelser till toxicitetsdata baserade på en kemisk stressor, eftersom data kanske inte är specifika för en viss väg, är det första steget att upprätta en koppling för att sammanföra resultat. Som den första iterationen av en SeqAPASS-ECOTOX-integration ger den nuvarande metoden användarna alla tillgängliga toxicitetsdata för de kemiska stressfaktorerna och arterna på bred nivå. Dessa data, i kombination med SeqAPASS-förutsägelser, kan ge sammanhang på breda nivåer (ryggradsdjur kontra ryggradslösa djur) och kan övervägas inom ramen för AOP-ramverket.

TTR är ett bra exempel för att undersöka detta samband eftersom den befintliga AOP (AOP 152) ger sammanhang för tolkning av potentiellt relevanta ECOTOX-toxicitetsdata. Från och med de ligander som undersöktes i SeqAPASS nivå 3 samlades miljötoxicitetsdata in för fyra kemikalier som är kända för att interagera med TTR-ligandbindningsdomänen (dietylstilbestrol [DES], perfluorhexansyra [PFHxA], perfluoroktansulfonat [PFOS] och tetrabromobisfenol A [TBBPA])19,21,23,24 . För varje kemikalie efterfrågades ECOTOX efter akvatiska och terrestra data av CAS-nummer (Chemical Abstracts Service) med hjälp av anpassade sökparametrar (Supplemental File 1). Data filtrerades till artgrupper av intresse (amfibier, fåglar, fiskar, ryggradslösa djur, däggdjur, reptiler). Inom de filtrerade frågeresultaten beräknades och implementerades ett genomsnitt av studiens lägsta och högsta effektkoncentrationer som en approximation för medelvärdet för alla träffar som inte rapporterade ett medelvärde för effektkoncentration (figur 6A och kompletterande fil 1). Inom ramen för en enda kemikalie genomfördes Kruskal-Wallis-tester för att jämföra de genomsnittliga effektkoncentrationerna för olika taxonomiska grupper eftersom data inte uppfyllde ANOVA-testantaganden. Post-hoc parvisa jämförelsetester utfördes sedan med Dunns test för alla kemikalier, eftersom de taxonomiska grupperna bestod av ojämna provstorlekar. Akvatiska och terrestra resultat analyserades separat, eftersom data mellan de två typerna av exponeringar inte är direkt jämförbara. Inom ECOTOX fanns toxicitetsdata för vattenmiljö för de utvalda kemikalierna tillgängliga för groddjur, fåglar, ryggradslösa djur och fiskarter (figur 6A). Uppgifter om toxicitet på land för de utvalda kemikalierna var endast tillgängliga för däggdjur och DES (tilläggsfil 1).

Figure 6
Figur 6: Länka SeqAPASS-resultat med empiriska data. (A) Genomsnittliga effektkoncentrationer över taxonomiska grupper med data tillgängliga i ECOTOXicologys kunskapsbas för utvalda kemikalier som är kända för att binda till det humana TTR-proteinet. B) Överlappning av antalet arter som ingår i varje SeqAPASS-analys med de arter för vilka ECOTOX-data fanns tillgängliga. I panel A anger parenteser längs x-axeln antalet frågeträffar för vilka data har aggregerats. Asterisker indikerar par med signifikant olika effektkoncentrationer mellan artgrupper inom ramen för en enda kemikalie (Dunns test, p < 0,05), där högre antal asterisker indikerar starkare signifikansnivåer (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Mittlinjerna inom varje ruta representerar medianen, med rutkanter som visar interkvartilområdet. Morrhåren sträcker sig upp till 1,5 gånger interkvartilområdet. Avvikande värden som faller utanför det intervallet visas som enskilda punkter. Förkortningar: TTR = transtyretin; SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga över arters mottaglighet; ECOTOX = ECOTOXicology kunskapsbas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sammantaget tyder dessa data på att bioaktivitet för de utvärderade kemikalierna förekommer hos ryggradsdjur men inte hos ryggradslösa djur. Även om bristen på biologisk mål- och väginformation i ECOTOX gör det omöjligt att direkt koppla dessa empiriska data till TTR, stöder dessa resultat SeqAPASS-förutsägelserna om att ryggradslösa djurarter inte delar mottaglighet. Alla ryggradsdjur med tillgängliga data visade mottaglighet för både PFOS och TBBPA, även om de genomsnittliga effektkoncentrationerna var signifikant högre hos fisk och fåglar än amfibier. Dessa data tyder på potentiella skillnader i känslighet mellan taxonomiska grupper som kan hänföras till biologiska vägskillnader (inklusive TTR). Det är anmärkningsvärt att andra variabler som metabolism och utsöndring också kan spela en roll i skillnader i känslighet. För PFHxA och PFOS visade sig fisk vara betydligt känsligare än både ryggradslösa djur och fåglar, och för DES uppvisade groddjur signifikant högre genomsnittliga effektkoncentrationer än ryggradslösa djur. Återigen stöder dessa data vår SeqAPASS-förutsägelse att ryggradslösa djur inte delar mottaglighet med ryggradsdjur. Av alla arter som bedömdes med hjälp av detta verktyg för vilka det fanns tillgängliga TTR-sekvensdata hade endast ett litet antal motsvarande ECOTOX-data för de fyra kemikalier som är av intresse (figur 6B, kompletterande tabell S1 och kompletterande tabell S2). För de arter som saknar apikala data lägger SeqAPASS-förutsägelser om mottaglighet till ytterligare rader av bevis för att besläktade arter kan bete sig på samma sätt som de med apikala data. Data för alla SeqAPASS- och ECOTOX-analyser finns tillgängliga i tilläggsfil 1.

Enligt Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bidrog opioider 2017 till cirka 47 600 dödsfall genom överdosering i USA, ett antal som fortsätter att ökamed 27. Avloppsreningsverk i USA regleras nationellt av US Environmental Protection Agency's National Pollutant Discharge Elimination System, som inte kräver testning för opioider eller andra läkemedel i deras utsläpp28. Under de senaste åren har man försökt använda avloppsbaserad epidemiologi som ett verktyg för att kartlägga samhällets opioidanvändning. Opioidövervakningsinsatser har upptäckt koncentrationer så höga som 1,27 μg/L i avloppsvatten och 0,7 μg/L i ytvatten29,30. Nyligen genomförda toxicitetsstudier som bedömer effekten av opioidexponering på fisk har rapporterat utvecklingen av beroendeframkallande beteenden och negativa immunologiska effekter (t.ex. högre infektionshastigheter, nedreglering av immungener)31,32,33. Sammantaget tyder dessa studier på att det finns potential för negativ miljöexponering för opioider och belyser vikten av att förstå den risk som dessa kemikalier utgör för vattenlevande arter. Med tanke på det antal arter som kan stöta på dessa föreningar i miljön kan det vara viktigt att identifiera potentiellt mottagliga arter med hjälp av SeqAPASS för prioriteringen av test- eller övervakningsinsatser.

MOR utgör det huvudsakliga opioidmålet för hantering av smärta och ansvarar för de kraftfulla smärtstillande och beroendeframkallande egenskaperna hos opiatalkaloider hos människor34,35. På grund av denna receptors betydelse för människors hälsa är MOR-ligander välkända och högkvalitativa röntgenkristallografistudier finns tillgängliga, vilket gör detta mål idealiskt för SeqAPASS-analys 8,9,13. Med hjälp av NCBI-anslutningen för humant μ opioidreceptor, ACM90349.1, genomfördes en nivå 1-analys med standardinställningar. Känslighetsgränsen fastställdes till 55% för nivå 1, med procentuella likheter för däggdjur (Mammalia), fåglar (Aves), reptiler (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), amfibier (Amphibia) och de flesta fiskarter (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) som faller ovanför denna cutoff; Därför resulterade arter från dessa taxonomiska grupper i en känslighetsförutsägelse av "Y" (dvs. ja), vilket indikerar att de sannolikt skulle vara mottagliga för kemikalier som är kända för att interagera med mänsklig MOR (figur 7 och kompletterande fil 1). Med hjälp av NCBI Conserved Domain Database identifierades 7tmA_Mu_opioid_R (anslutning cd15090) som en funktionell domän som omfattar alla sju helices av MOR-proteinet från 133 till 411, inklusive ett förmodat ligandbindningsställe. Jämfört med nivå 1 identifierade nivå 2-resultaten en högre känslighetsgräns på 88% likhet, med däggdjur, fåglar, reptiler, amfibier och de flesta fiskarter som finns ovanför denna cutoff och resulterade i en känslighetsförutsägelse av "Y" för ja (Figur 8). Sammantaget tyder resultaten från nivå 1- och nivå 2-analyser på att de flesta ryggradsdjur delar bevarandet av MOR och sannolikt är mottagliga för kemikalier som är kända för att interagera med mänsklig MOR.

Figure 7
Figur 7: SeqAPASS nivå 1-analys av μ opioidreceptorbevarande över taxonomiska grupper med tillgänglig sekvensinformation i förhållande till det humana proteinet. Procentlikhet av proteinaminosyrasekvensen visas på Y-axeln; taxonomisk grupp visas på X-axeln. Öppna cirklar (○) anger frågesekvensen och slutna cirklar (●) anger arten inom den taxonomiska gruppen med den högsta procentlikheten. Inom diagrammet representerar toppen och botten av varje ruta den 75: e och 25: e percentilen, morrhåren sträcker sig till 1,5 gånger interkvartilområdet och medelvärdena och medianvärdena representeras av horisontella svarta linjer på rutan. Den streckade linjen anger gränsen för känslighetsförutsägelser. Förkortningar: MOR = mu-opioidreceptor; SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: SeqAPASS nivå 2-analys av den μ opioidreceptorns ligandbindande domänbevarande i förhållande till domänen i det humana proteinet. Procentlikhet av den ligandbindande domänens aminosyrasekvens visas på Y-axeln; taxonomisk grupp visas på X-axeln. Öppna cirklar (○) anger frågesekvensen och slutna cirklar (●) anger arten inom den taxonomiska gruppen med den högsta procentlikheten. Inom diagrammet representerar toppen och botten av varje ruta den 75: e och 25: e percentilen, morrhåren sträcker sig till 1,5 gånger interkvartilområdet och medelvärdena och medianvärdena representeras av horisontella svarta linjer på rutan. Den streckade linjen anger gränsen för känslighetsförutsägelser. Förkortningar: MOR = mu-opioidreceptor; SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Genom analys av molekylär modellering och proteinkristallografistudier identifierades aminosyror i bindningsområdet för MOR som förutspås interagera med kända ligander. Även om den olika uppsättningen ligander som binder väl till opioidreceptorer resulterar i komplex farmakologi, observeras vissa konsekventa ligand-proteininteraktioner36,37. Baserat på molekylär dockning till olika MOR-kristallstrukturer, både morfin och fentanyl, interagerar MOR-agonister med hög affinitet med D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 och Y32636,38. Rester D147, Y148, M151 och H297 är också inblandade i kristallstrukturer av MOR bundna till morfinagonisten BU72, medan D147, M151, H297 och Y326 också är kritiska för att binda till den irreversibla morfinantagonisten β-funaltrexamine37. Med tanke på dessa bevislinjer valdes nio rester (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) för nivå 3-utvärdering med human MOR som mallsekvens och exklusive partiella, förutsagda, hypotetiska och lågkvalitativa sekvenser. Viktigt är att aminosyrapositioner som rapporterats i litteraturen utesluter ett 64-aminosyrasegment i förhållande till NCBI-proteinanslutningen och av denna anledning valdes positioner i nivå 3 för att representera de som anpassades till mallsekvensen för korrekta justeringssekvenser.

I nivå 3-analysen av människans mor-minne bedömdes 284 arter över ryggradsdjur (däggdjur, fåglar, amfibier, reptiler och fiskar). För alla utvärderade arter var de nio aminosyrorna antingen en total matchning eller en partiell matchning baserat på sidokedjeklassificering och molekylvikt; Följaktligen resulterade alla bedömda arter i en känslighetsförutsägelse av "Y" för ja (tabell 3 och kompletterande fil 1). Eftersom dessa aminosyror är viktiga vid bindning av både starka MOR-agonister och starka antagonister, tyder dessa data på att opioidföreningar som riktar sig mot humana μ opioidreceptorer kan interagera på samma sätt med receptorer över ryggradsdjur. Även om det hittills finns få empiriska data tillgängliga inom ECOTOX-kunskapsbasen för opioidföreningar, tyder flera studier på att fisk sannolikt är mottagliga31,32,33. Sammantaget pekar resultaten från SeqAPASS på potentialen för bredare miljöpåverkan av MOR-modulerande kemikalier mellan arter, vilket indikerar att mer forskning och kanske övervakning kan vara värdefull. Data för alla analyser finns i tilläggsfil 1.

Tabell 3: SeqAPASS nivå 3-analys av bevarandet av aminosyrarester som är viktiga för kemisk bindning till den μ opioidreceptorn. Sammanfattande tabell som visar antalet arter med tillgängliga sekvensdata för alla taxonomiska grupper, antalet arter som förutspås vara lika mottagliga (Y) och antalet arter som förutspås inte vara lika mottagliga, samt fullständiga, partiella och icke-matchande aminosyror. Förkortning: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell S1: Arter med tillgängliga ECOTOX-data för de fyra kemikalier av intresse som är kända för att binda till humant transtyretinprotein. Data som finns tillgängliga för varje kemikalie är anpassade till SeqAPASS förutsägelser om liknande mottaglighet över nivå 1, 2 och 3. Alla SeqAPASS-förutsägelser i förhållande till den mänskliga transtyretinsekvensen. Förkortningar: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet; DES = dietylstilbestrol; PFHxA = perfluorhexansyra; PFOS = perfluoroktansulfonsyra; TBBPA = tetrabromobisfenol A. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Kompletterande tabell S2: Totalt antal arter med tillgängliga data för SeqAPASS- och ECOTOX-utvärderingar för utvalda kemikalier som är kända för att binda till humant transtyretinprotein. SeqAPASS tillhandahåller medel för att förutsäga arters mottaglighet för många arter för vilka empiriska toxicitetsdata inte är tillgängliga. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggsfil 1: SeqAPASS- och ECOTOX-data för alla representativa resultat. Filen innehåller ToC följt av följande datablad: Tab 1-hTTR SeqAPASS Results Level 1, Tab 2-hTTR SeqAPASS Results Level 2, Tab 3-hTTR SeqAPASS Results Level 3, Tab 4-EcoTox data for DES, Tab 5-EcoTox data for PFOS, Tab 6-EcoTox data for PFHxA, Tab 7-EcoTox data for TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Mean Calculations, Flik 9-SeqAPASS EcoTox datajämförelser, Flik 10-hMOR SeqAPASS Resultatnivå 1, Flik 11-hMOR SeqAPASS Resultatnivå 2 och Flik 12-μ-hMOR SeqAPASS Resultatnivå 3. Förkortningar: SeqAPASS = sekvensjustering för att förutsäga artkänslighet; ToC = Innehållsförteckning; hTTR = human transtyretin; ECOTOX = Ekotoxikologi kunskapsbas; DES = dietylstilbestrol; PFOS = perfluoroktansulfonsyra; PFHxA = perfluorhexansyra; TBBPA = tetrabromobisfenol A; hMOR = human mu-opioidreceptor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns ett brett erkännande av att det inte är möjligt att empiriskt testa tillräckligt med arter för att fånga den genomiska, fenotypiska, fysiologiska och beteendemässiga mångfalden hos levande organismer som kan utsättas för kemikalier av toxikologiskt intresse. Målet med SeqAPASS är att maximera användningen av befintliga och kontinuerligt expanderande proteinsekvens- och strukturdata för att underlätta och informera extrapoleringen av kemiska toxicitetsdata / kunskap från testade organismer till hundratals eller tusentals andra arter genom jämförelser på molekylär nivå. SeqAPASS-verktyget utformades för att minska komplexiteten i proteinsekvensjämförelser för forskare, riskbedömare och tillsynsmyndigheter genom en strömlinjeformad och snabb analys som inkluderar transparent genererade och nedladdningsbara sammanfattningstabeller, interaktiva datavisualiseringar och enkel identifiering av hotade och hotade arter samt vanliga modellorganismer. Protokoll beskrivs här för att köra SeqAPASS nivåer 1, 2 och 3 för utvärdering av primär aminosyrasekvenslikhet, funktionell domänbevarande och kritiska aminosyror som är involverade i kemiska-protein- och protein-proteininteraktioner. Rader av bevis som samlats in från varje nivå av SeqAPASS-analys förutsäger kemisk mottaglighet mellan arter, vilket ger konsekventa och lätttolkbara data. Hittills har detta verktyg använts i ett brett spektrum av applikationer, inklusive identifiering av kemikalier som binder till vissa receptorer och bedömning av läspotentialen för ryggradsdjurs ekologiska receptorer med däggdjurssystem. Dessutom beskrivs två fallstudier fokuserade på sköldkörtelhormondistributionsproteinet, TTR och MOR här för att demonstrera de nya funktionerna och funktionaliteten hos SeqAPASS v2 till v6.

Som med alla beräkningsmetoder är förmågan att generera förutsägelser om arters mottaglighet i SeqAPASS-verktyget mycket beroende av inmatningen av lämpliga parametrar 8,9,13. Det är därför viktigt att innan en analys genomförs ett problemformuleringssteg för att kartlägga befintliga data och litteratur för det avsedda målet. Genom att starta en analys med kunskap om proteinmålet kan användaren identifiera lämpliga proteinanslutningsnummer och högkvalitativa sekvenser. På samma sätt säkerställer kunskap om en känslig eller målinriktad art eller om modellorganismer som används i analyser eller AOP-utveckling valet av en lämplig frågeart som alla andra arter jämförs med. Att välja funktionella domäner för nivå 2 och kritiska aminosyrarester för nivå 3 är också kritiska steg som kräver att användaren identifierar lämpliga indataparametrar för att generera förutsägelser. På grund av detta behov av befintlig kunskap om en kemisk-proteininteraktion integrerar de senaste versionerna av SeqAPASS-verktyget användarvänliga resurser som är utformade för att hjälpa användare till relevant information för att initiera en fråga (t.ex. länkar till andra verktyg) (tabell 2 och figur 2). Dessutom har popup-informationsmeddelanden och varningar integrerats i verktyget för att vägleda användaren genom analysen och hjälpa till att informera användaren om eventuella fel som behöver lösas.

Komplexiteten i kemisk-biologiska interaktioner utgör en begränsning av SeqAPASS-verktyget. Vid extrapolering av toxicitetsdata mellan arter är bevarandet av det molekylära målet en av många faktorer att tänka på. Adsorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) av en kemikalie är avgörande när man överväger kemisk toxicitet, eftersom kemikalier antingen kan aktiveras eller avgiftas av dessa processer39,40. Andra faktorer, såsom vägen för kemisk exponering, organismens livsstadium och livshistoria och kost, kan också spela viktiga roller för att bestämma kemisk känslighet mellan arter också41,42. För att ta itu med denna begränsning är det viktigt att förstå huvudfrågan som SeqAPASS ställer när han förutsäger kemisk mottaglighet: är det troligt att en kemikalies proteinmål finns i en annan art för kemikalien att agera på? Denna fråga hanteras genom att identifiera ortologkandidater och överväga bevarandet av detta mål för alla arter i förhållande till en känd känslig eller målart. Denna information kan användas som en rad bevis för extrapolering mellan arter och integreras i andra bevisströmmar (t.ex. risken för exponering) för att bättre förstå arters mottaglighet för kemiska stressfaktorer. Uppdateringar av SeqAPASS har införlivat integrerade länkar till externa verktyg, inklusive US EPA Ecotox kunskapsbas43 och US Fish & Wildlife Service Environmental Conservation Online System (ECOS)44. Anslutning till dessa databaser ger SeqAPASS-användare enkel tillgång till empiriska kemiska toxicitetsdata för jämförelse med sekvensbaserade förutsägelser och ett sätt att identifiera arter som kan ha skyddad status.

SeqAPASS-verktyget tillhandahåller en vetenskapligt baserad plattform för beräkningsförutsägelser av inneboende mottaglighet som stöds av begrepp inom evolutionsbiologi och fallexempel som jämför förutsägelser med tillgängliga empiriska resultat. Dessutom är SeqAPASS gratis och offentligt tillgängligt på en välstödd webbaserad plattform som är allmänt tillgänglig (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). Eftersom detta verktyg utnyttjar sekvensdata och proteininformation från befintliga databaser, förbättras dess förmåga att förutsäga kemisk mottaglighet i en bredare mångfald av arter ständigt när sekvenseringstekniken utvecklas och genomen hos nya arter sekvenseras och kommenteras. Även om detta ger tydliga fördelar när det gäller datatillgänglighet, utgör det också en begränsning genom att offentligt tillgänglig sekvensinformation kan vara föremål för inkonsekvent kvalitet, dålig annotering och ofullständighet av proteinsekvenser för vissa arter. Det är dock lovande att omics-teknologier och metoder inom bioinformatik utvecklas snabbt och därför kommer sekvenskurering och kvalitet sannolikt att fortsätta att förbättras över tiden.

Ett viktigt mål med SeqAPASS-verktyget är transparens, som ger åtkomst i form av länkar till alla datakällor och verktyg som är integrerade i backend. Sådan transparens ger användaren snabb tillgång till de ursprungliga källorna till sekvensen eller taxonomisk information från NCBI. Tillämplighetsområdet för detta verktyg definieras av den information som behövs för att göra en meningsfull analys. Eftersom kunskap om en kemisk-protein- eller protein-proteininteraktion hos en känd känslig eller riktad art är nyckelelement för att inleda en fråga, måste det erkännas att frågor som utförs utan denna information inte är meningsfulla. Dessutom utgör kemikalier som har flera odefinierade biologiska mål eller interagerar med olika mål med olika grader av styrka också en utmaning och begränsning av verktyget i sin nuvarande form. Det förväntas att, med förbättrad bioinformatik, beräkningsmodellering och cellbaserad, högkapacitetsscreening och transkriptomik, kommer större kunskap över mångfalden av kemiskt utrymme angående interaktioner med specifika proteiner att fortsätta att belysas. Det förväntas att förmågan att tillämpa SeqAPASS på bredare utmaningar med artextrapolering, i förhållande till att förstå potentialen för negativa kemiska effekter på mångfalden av arter, kommer att fortsätta att förbättras.

Sammanfattningsvis är SeqAPASS-verktyget en tillgänglig plattform som enkelt tillämpar molekylär information för att hantera den stora utmaningen med extrapolering mellan arter i kemikaliesäkerhetsutvärderingar. Även om exemplen som lyfts fram här är inriktade på att generera förutsägelser om kemisk mottaglighet, kan resultaten också hjälpa till att förstå det övergripande bevarandet av biologiska vägar. Genom att sammanföra olika bevislinjer och underlätta åtkomst till flera plattformar och databaser hjälper detta verktyg till att bygga transparenta fall för prioritering av kemisk testning och fördelning av resurser. Med den fortsatta utvecklingen av vetenskaplig och bioinformatisk kapacitet kommer verktygets kraft och användbarhet att fortsätta växa och förbättras för att möta behoven hos forsknings- och regleringssamhällen samtidigt som de resurser som krävs för bedömningar mellan arter minskar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr. Daniel L. Villeneuve (U.S. EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) och Dr. Jon A. Doering (Department of Environmental Sciences, Louisiana State University) för att ha kommenterat ett tidigare utkast till manuskriptet. Detta arbete stöddes av U.S. Environmental Protection Agency. De åsikter som uttrycks i detta dokument är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis åsikterna eller policyerna från US Environmental Protection Agency, och inte heller omnämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter indikerar godkännande av den federala regeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krewski, D., et al. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 13 (2-4), 51-138 (2010).
  2. Wang, Z., Walker, G. W., Muir, D. C. G., Nagatani-Yoshida, K. Toward a global understanding of chemical pollution: A first comprehensive analysis of national and regional chemical inventories. Environmental Science & Technology. 54 (5), 2575-2584 (2020).
  3. Brooks, B. W., et al. Toxicology advances for 21st century chemical pollution. One Earth. 2 (4), 312-316 (2020).
  4. Kostal, J., Voutchkova-Kostal, A. Going all in: A strategic investment in in silico toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (4), 880-888 (2020).
  5. Cheng, W., Doering, J. A., LaLone, C., Ng, C. Integrative computational approaches to inform relative bioaccumulation potential of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) across species. Toxicology Sciences. 180 (2), 212-223 (2021).
  6. Kostich, M. S., Lazorchak, J. M. Risks to aquatic organisms posed by human pharmaceutical use. Science of the Total Environment. 389 (2-3), 329-339 (2008).
  7. Gunnarsson, L., Jauhiainen, A., Kristiansson, E., Nerman, O., Larsson, D. G. Evolutionary conservation of human drug targets in organisms used for environmental risk assessments. Environmental Science & Technology. 42 (15), 5807-5813 (2008).
  8. LaLone, C. A., et al. Evidence for cross species extrapolation of mammalian-based high-throughput screening assay results. Environmental Science & Technology. 52 (23), 13960-13971 (2018).
  9. LaLone, C. A., et al. Editor's highlight: Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS): A web-based tool for addressing the challenges of cross-species extrapolation of chemical toxicity. Toxicology Sciences. 153 (2), 228-245 (2016).
  10. Head, J. A., Hahn, M. E., Kennedy, S. W. Key amino acids in the aryl hydrocarbon receptor predict dioxin sensitivity in avian species. Environmental Science & Technology. 42 (19), 7535-7541 (2008).
  11. Bass, C., et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae. BMC Neuroscience. 12, 51-51 (2011).
  12. Erdmanis, L., et al. Association of neonicotinoid insensitivity with a conserved residue in the loop d binding region of the tick nicotinic acetylcholine receptor. Biochemistry. 51 (23), 4627-4629 (2012).
  13. Doering, J. A., et al. et al. In silico site-directed mutagenesis informs species-specific predictions of chemical susceptibility derived from the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) tool. Toxicology Sciences. 166 (1), 131-145 (2018).
  14. Noyes, P. D., et al. Evaluating chemicals for thyroid disruption: Opportunities and challenges with in vitro testing and adverse outcome pathway approaches. Environmental Health Perspectives. 127 (9), 95001 (2019).
  15. Park, G. Y., Jamerlan, A., Shim, K. H., An, S. S. A. Diagnostic and treatment approaches involving transthyretin in amyloidogenic diseases. Int J Mol Sci. 20 (12), 2982 (2019).
  16. Rabah, S. A., Gowan, I. L., Pagnin, M., Osman, N., Richardson, S. J. Thyroid hormone distributor proteins during development in vertebrates. Front Endocrinol (Lausane). 10, 506 (2019).
  17. Richardson, S. J. Cell and molecular biology of transthyretin and thyroid hormones. International Review of Cytology. 258, 137-193 (2007).
  18. Yamauchi, K., Ishihara, A. Transthyretin and Endocrine Disruptors. Recent Advances in Transthyretin Evolution, Structure and Biological Functions. Richardson, S. J., Cody, V. , Springer. Berlin Heidelberg, Germany. 159-171 (2009).
  19. Iakovleva, I., et al. Tetrabromobisphenol A is an efficient stabilizer of the transthyretin tetramer. PLoS One. 11 (4), 0153529 (2016).
  20. Ishihara, A., Sawatsubashi, S., Yamauchi, K. Endocrine disrupting chemicals: Interference of thyroid hormone binding to transthyretins and to thyroid hormone receptors. Molecular and Cellular Endocrinology. 199 (1), 105-117 (2003).
  21. Kar, S., Sepúlveda, M. S., Roy, K., Leszczynski, J. Endocrine-disrupting activity of per- and polyfluoroalkyl substances: Exploring combined approaches of ligand and structure based modeling. Chemosphere. 184, 514-523 (2017).
  22. Morais-de-Sa, E., Pereira, P. J., Saraiva, M. J., Damas, A. M. The crystal structure of transthyretin in complex with diethylstilbestrol: A promising template for the design of amyloid inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 279 (51), 53483-53490 (2004).
  23. Morgado, I., Campinho, M. A., Costa, R., Jacinto, R., Power, D. M. Disruption of the thyroid system by diethylstilbestrol and ioxynil in the sea bream (Sparus aurata). Aquatic Toxicology. 92 (4), 271-280 (2009).
  24. Yamauchi, K., Prapunpoj, P., Richardson, S. J. Effect of diethylstilbestrol on thyroid hormone binding to amphibian transthyretins. General and Comparative Endocrinology. 119 (3), 329-339 (2000).
  25. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  26. Ren, X. M., et al. Binding interactions of perfluoroalkyl substances with thyroid hormone transport proteins and potential toxicological implications. Toxicology. 366-367, 32-42 (2016).
  27. Wilson, N., Mbabazi, K., Seth, P., Smith, H., Davis, N. L. Drug and opioid-involved overdose deaths - United States, 2017-2018. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (11), 290-297 (2020).
  28. EPA. National Pollutant Discharge Elimination System (NPDES). United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://www.epa.gov/npdes/npdes-resources (2018).
  29. Duvallet, C., Hayes, B. D., Erickson, T. B., Chai, P. R., Matus, M. Mapping community opioid exposure through wastewater-based epidemiology as a means to engage pharmacies in harm reduction efforts. Preventing Chronic Disease. 17, 200053 (2020).
  30. Gushgari, A. J., Venkatesan, A. K., Chen, J., Steele, J. C., Halden, R. U. Long-term tracking of opioid consumption in two United States cities using wastewater-based epidemiology approach. Water Research. 161, 171-180 (2019).
  31. Lau, B., Bretaud, S., Huang, Y., Lin, E., Guo, S. Dissociation of food and opiate preference by a genetic mutation in zebrafish. Genes Brain Behave. 5 (7), 497-505 (2006).
  32. Bossé, G. D., Peterson, R. T. Development of an opioid self-administration assay to study drug seeking in zebrafish. Behavioural Brain Research. 335, 158-166 (2017).
  33. Mottaz, H., et al. Dose-dependent effects of morphine on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation, and involvement of multixenobiotic resistance (MXR) transporters in LPS efflux in teleost fish. Environmental Pollution. 221, 105-115 (2017).
  34. Manglik, A., et al. Crystal structure of the µ-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485 (7398), 321-326 (2012).
  35. Comer, S. D., Cahill, C. M. Fentanyl: Receptor pharmacology, abuse potential, and implications for treatment. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 106, 49-57 (2019).
  36. Podlewska, S., Bugno, R., Kudla, L., Bojarski, A. J., Przewlocki, R. Molecular modeling of µ opioid receptor ligands with various functional properties: PZM21, SR-17018, morphine, and fentanyl-simulated interaction patterns confronted with experimental data. Molecules. 25 (20), 4636 (2020).
  37. Huang, W., et al. Structural insights into µ-opioid receptor activation. Nature. 524 (7565), 315-321 (2015).
  38. Lipiński, P. F. J., et al. Fentanyl family at the mu-opioid receptor: Uniform assessment of binding and computational analysis. Molecules. 24 (4), 740 (2019).
  39. Boland, L. A., Angles, J. M. Feline permethrin toxicity: Retrospective study of 42 cases. Journal of Feline Medicine and Surgery. 12 (2), 61-71 (2010).
  40. Stevenson, B. J., Pignatelli, P., Nikou, D., Paine, M. J. Pinpointing P450s associated with pyrethroid metabolism in the dengue vector, Aedes aegypti: developing new tools to combat insecticide resistance. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1595 (2012).
  41. Ankley, G. T., Gray, L. E. Cross-species conservation of endocrine pathways: A critical analysis of tier 1 fish and rat screening assays with 12 model chemicals. Environmental Toxicology and Chemistry. 32 (5), 1084-1087 (2013).
  42. Meteyer, C. U., Rideout, B. A., Gilbert, M., Shivaprasad, H. L., Oaks, J. L. Pathology and proposed pathophysiology of diclofenac poisoning in free-living and experimentally exposed oriental white-backed vultures (Gyps bengalensis). Journal of Wildlife Diseases. 41 (4), 707-716 (2005).
  43. EPA. ECOTOX User Guide: ECOTOXicology Knowledgebase System. EPA, United States Environmental Protection Agency. , Available from: https://cfpub.epa.gov/ecotox/index.cfm (2021).
  44. ECOS Environmental Conservation Online System. U.S. Fish & Wildlife Service. , Available from: https://ecos.fws.gov/ecp/ (2021).

Tags

Genetik utgåva 192 Extrapolering mellan arter ekotoxikologi prediktiv toxikologi ny metod opioidreceptor transtyretin
Demonstration av sekvensjusteringen för att förutsäga över arters känslighetsverktyg för snabb bedömning av proteinbevarande
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz,… More

Vliet, S. M. F., Hazemi, M., Blatz, D., Jensen, M., Mayasich, S., Transue, T. R., Simmons, C., Wilkinson, A., LaLone, C. A. Demonstration of the Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility Tool for Rapid Assessment of Protein Conservation. J. Vis. Exp. (192), e63970, doi:10.3791/63970 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter