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Genetics

Demostración de la alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies herramienta para una evaluación rápida de la conservación de proteínas

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/63970
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 4, 5, 5, 5, 6
1Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Scientific Computing and Data Curation Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Oak Ridge Institute for Science and Education, 3Swenson College of Science and Engineering, Department of Biology, University of Minnesota Duluth, 4University of Wisconsin-Madison Aquatic Sciences Center, 5General Dynamics Information Technology, Research Triangle Park, 6Office of Research and Development, Center for Computational Toxicology and Exposure, Great Lakes Toxicology and Ecology Division, U.S. Environmental Protection Agency

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar la última versión de la herramienta de alineación de secuencias de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos para predecir la susceptibilidad a través de especies (SeqAPASS). Este protocolo demuestra la aplicación de la herramienta en línea para analizar rápidamente la conservación de proteínas y proporcionar predicciones personalizables y fácilmente interpretables de susceptibilidad química en todas las especies.

Abstract

La herramienta Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos es una aplicación de detección en línea rápida y disponible gratuitamente que permite a los investigadores y reguladores extrapolar información de toxicidad entre especies. Para objetivos biológicos en sistemas modelo como células humanas, ratones, ratas y peces cebra, los datos de toxicidad están disponibles para una variedad de productos químicos. A través de la evaluación de la conservación de objetivos proteicos, esta herramienta se puede utilizar para extrapolar los datos generados a partir de dichos sistemas modelo a miles de otras especies que carecen de datos de toxicidad, lo que produce predicciones de susceptibilidad química intrínseca relativa. Las últimas versiones de la herramienta (versiones 2.0-6.1) han incorporado nuevas características que permiten la rápida síntesis, interpretación y uso de los datos para la publicación más gráficos de calidad de presentación.

Entre estas características se encuentran visualizaciones de datos personalizables y un informe de resumen completo diseñado para resumir los datos de SeqAPASS para facilitar la interpretación. Este documento describe el protocolo para guiar a los usuarios a través del envío de trabajos, la navegación por los diversos niveles de comparaciones de secuencias de proteínas y la interpretación y visualización de los datos resultantes. Se destacan las nuevas características de SeqAPASS v2.0-6.0. Además, se describen dos casos de uso centrados en la conservación de proteínas transtiretinas y receptoras opioides utilizando esta herramienta. Finalmente, se discuten las fortalezas y limitaciones de SeqAPASS para definir el dominio de aplicabilidad de la herramienta y resaltar diferentes aplicaciones para la extrapolación entre especies.

Introduction

Tradicionalmente, el campo de la toxicología se ha basado en gran medida en el uso de pruebas con animales enteros para proporcionar los datos necesarios para las evaluaciones de seguridad química. Tales métodos suelen ser costosos y requieren muchos recursos. Sin embargo, debido al gran número de productos químicos utilizados actualmente y al rápido ritmo al que se están desarrollando nuevos productos químicos, a nivel mundial existe una necesidad reconocida de métodos más eficientes de detección química 1,2. Esta necesidad y el cambio de paradigma resultante de las pruebas con animales ha llevado al desarrollo de muchos métodos de enfoque nuevos, incluidos los ensayos de detección de alto rendimiento, la transcriptómica de alto rendimiento, la secuenciación de próxima generación y el modelado computacional, que son estrategias de prueba alternativas prometedoras 3,4.

La evaluación de la seguridad química en toda la diversidad de especies potencialmente afectadas por las exposiciones químicas ha sido un desafío permanente, no solo con las pruebas de toxicidad tradicionales, sino también con los nuevos métodos de enfoque. Los avances en toxicología comparativa y predictiva han proporcionado marcos para comprender la sensibilidad relativa de diferentes especies, y los avances tecnológicos en métodos computacionales continúan aumentando la aplicabilidad de estos métodos. En la última década se han discutido varias estrategias que aprovechan las bases de datos existentes de secuencias de genes y proteínas, junto con el conocimiento de objetivos moleculares químicos específicos, para apoyar los enfoques predictivos para la extrapolación entre especies y mejorar las evaluaciones de seguridad química más allá de los organismos modelo típicos 5,6,7,8.

Para avanzar en la ciencia hacia la acción, construir sobre estos estudios fundamentales en toxicología predictiva, priorizar los esfuerzos de pruebas químicas y apoyar la toma de decisiones, se creó la herramienta de alineación de secuencias de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos para predecir la susceptibilidad entre especies (SeqAPASS). Esta herramienta es una aplicación basada en la web pública y de libre acceso que utiliza repositorios públicos de información de secuencias de proteínas en constante expansión para predecir la susceptibilidad química en la diversidad de especies9. Basándose en el principio de que la susceptibilidad intrínseca relativa de una especie a una sustancia química en particular puede determinarse evaluando la conservación de las dianas proteicas conocidas de esa sustancia química, esta herramienta compara rápidamente las secuencias de aminoácidos proteicos de una especie con sensibilidad conocida a todas las especies con los datos de secuencias de proteínas existentes. Esta evaluación se completa a través de tres niveles de análisis, que incluyen (1) secuencia primaria de aminoácidos, (2) dominio funcional y (3) comparaciones de residuos críticos de aminoácidos, cada uno de los cuales requiere un conocimiento más profundo de la interacción químico-proteína y proporciona una mayor resolución taxonómica en la predicción de susceptibilidad. Una fortaleza importante de SeqAPASS es que los usuarios pueden personalizar y refinar su evaluación agregando líneas adicionales de evidencia hacia la conservación del objetivo en función de la cantidad de información disponible sobre la interacción químico-proteína o proteína-proteína de interés.

La primera versión se lanzó en 2016, que permitió a los usuarios evaluar secuencias de aminoácidos primarios y dominios funcionales de manera simplificada para predecir la susceptibilidad química y contenía capacidades mínimas de visualización de datos (Tabla 1). Se ha demostrado que las diferencias individuales de aminoácidos son determinantes importantes de las diferencias entre especies en las interacciones químico-proteicas, que pueden afectar la susceptibilidad química de las especies10,11,12. Por lo tanto, las versiones posteriores fueron desarrolladas para considerar los aminoácidos críticos que son importantes para la interacción química directa13. En respuesta a los comentarios de las partes interesadas y los usuarios, esta herramienta ha sido lanzada anualmente con nuevas características adicionales diseñadas para satisfacer las necesidades tanto de los investigadores como de las comunidades reguladoras para abordar los desafíos en la extrapolación entre especies (Tabla 1). El lanzamiento de SeqAPASS versión 5.0 en 2020 trajo características centradas en el usuario que incorporan opciones de visualización y síntesis de datos, enlaces externos, opciones de tabla de resumen e informe y características gráficas. En general, los nuevos atributos y capacidades de esta versión mejoraron la síntesis de datos, la interoperabilidad entre bases de datos externas y la facilidad de interpretación de datos para las predicciones de susceptibilidad entre especies.

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Protocol

1. Primeros pasos

NOTA: El protocolo presentado aquí se centra en la utilidad de la herramienta y las características clave. Las descripciones detalladas de los métodos, características y componentes se pueden encontrar en el sitio web en una Guía del usuario completa (Tabla 1).

Tabla 1: Evolución de la herramienta SeqAPASS. Una lista de características y actualizaciones agregadas a la herramienta SeqAPASS desde su implementación inicial. Abreviaturas: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies; ECOTOX = Base de conocimiento de ECOTOXicology. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

  1. Ve a https://seqapass.epa.gov/seqapass usando Chrome. Seleccione Iniciar sesión para usar una cuenta existente o siga las instrucciones para crear una cuenta SeqAPASS, que permitirá a los usuarios ejecutar, almacenar, acceder y personalizar sus trabajos completados.
  2. Antes de realizar un análisis, primero identifique una proteína de interés y una especie objetivo o sensible revisando la literatura existente o los datos preexistentes (Figura 1). Como SeqAPASS contiene enlaces a recursos externos para ayudar a identificar la proteína de consulta, haga clic en los botones desplegables en Identificar un objetivo de proteína para acceder a los recursos relevantes.

Figure 1
Figura 1: Formulación del problema SeqAPASS: diagrama esquemático de la información preliminar necesaria para un análisis exitoso. Abreviaturas: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies; LBD = dominio de unión al ligando. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Interoperabilidad de SeqAPASS entre bases de datos. Diagrama esquemático de herramientas externas, bases de datos y recursos integrados en SeqAPASS. Abreviaturas: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies; AOP = vía de resultado adverso; NCBI = Centro Nacional de Información Biotecnológica; ECOTOX = Base de conocimiento de ECOTOXicology. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 2: Enlaces, recursos y herramientas integradas en la herramienta SeqAPASS. Una lista de las diversas fuentes de datos, enlaces y recursos aprovechados en la herramienta SeqAPASS. Abreviatura: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

2. Desarrollo y ejecución de una consulta SeqAPASS: Level 1

NOTA: En un análisis de Nivel 1, toda la secuencia de aminoácidos primarios de una proteína de consulta se compara con las secuencias de aminoácidos primarios de todas las especies con información de secuencia disponible. Esta herramienta utiliza algoritmos para extraer, recopilar y compilar datos disponibles públicamente para alinear y comparar rápidamente las secuencias de aminoácidos entre especies. El backend almacena información de las bases de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y utiliza estratégicamente las versiones independientes de la Herramienta de búsqueda de alineación local básica de proteínas (BLASTp)54 y la Herramienta de alineación múltiple basada en restricciones (COBALT)55.

  1. En Comparar secuencias de aminoácidos primarios, haga clic en Por especie o Por adhesión. Utilice la selección Por especie para escribir o seleccionar de una lista de especies para elegir el objetivo de proteína de interés.
  2. Envíe las accesiones de proteínas (es decir, identificación de proteína NCBI) directamente ingresando la(s) accesibilidad(es) en el cuadro de texto Por accesión .
  3. Seleccione Solicitar ejecución para enviar la consulta. Una vez enviado, espere a que aparezca una notificación en la esquina superior derecha de la ventana del navegador que indique un envío exitoso.
  4. Seleccione la pestaña Estado de ejecución de SeqAPASS en la parte superior de la página para mostrar una lista de todas las ejecuciones de SeqAPASS realizadas en esa cuenta de usuario y verificar el porcentaje de finalización.
    1. Haga clic en Actualizar datos mientras se selecciona el botón de opción apropiado para comprobar el estado de las ejecuciones de nivel 2 y nivel 3.
  5. Seleccione la pestaña Ver informes de SeqAPASS en la parte superior de la página para acceder a una lista de todos los informes completados con esa cuenta.
  6. En la pestaña Ver informes de SeqPASS , seleccione la proteína de consulta que le interese. Haga clic en Solicitar informe seleccionado para abrir la página Información de proteína de consulta de nivel 1 y ver resultados, opciones de personalización de datos, visualizaciones e informes de resumen.
  7. De forma predeterminada, seleccione Ver informe para ver los datos en el explorador web. Como alternativa, seleccione Guardar informe para descargar datos sin procesar como un archivo .zip.
    NOTA: El tiempo requerido para un análisis de Nivel 1 variará (promedio de 23 minutos para la versión 5.1) dependiendo de la demanda global del usuario en ese momento, el número de trabajos enviados a la cola y la cantidad de información de proteínas que existe para un trabajo enviado. Si un objetivo de proteína se ha completado previamente, los datos estarán disponibles en segundos después de la presentación.

3. Desarrollo y ejecución de una consulta SeqAPASS: Level 2

NOTA: Como toda la secuencia de proteínas no está directamente involucrada en una interacción química, un análisis de Nivel 2 compara solo la secuencia de aminoácidos del dominio funcional para hacer predicciones de susceptibilidad en rangos taxonómicos más bajos (por ejemplo, clase, orden, familia).

  1. En la página Información de proteína de consulta de nivel 1, haga clic en el signo más + situado junto al encabezado de nivel 2 para rellenar el menú Consulta de nivel 2.
  2. Identificar el(los) dominio(s) apropiado(s) en la proteína de interés (proteína de consulta).
    1. Si no se ha identificado un dominio, haga clic en el enlace integrado a la Base de datos de dominios conservados (CDD) del NCBI (Tabla 1), que puede ayudar en la identificación de la selección de dominio adecuada.
      NOTA: Normalmente, solo se seleccionan dominios de visitas específicos como consultas en el nivel 2.
  3. Haga clic en el cuadro Seleccionar dominio para rellenar automáticamente una lista de dominios funcionales para la proteína de consulta.
  4. Seleccione las adhesiones al dominio de la lista desplegable e inicie la consulta de nivel 2 haciendo clic en el botón Solicitar ejecución de dominio . Una vez enviado, espere a que aparezca una notificación que indique un envío exitoso.
  5. Haga clic en Actualizar ejecuciones de nivel 2 y 3 para rellenar los datos de nivel 2 , que estarán disponibles en cuestión de segundos después del envío.
  6. En Ver datos de nivel 2, seleccione las accesiones de dominio completadas de la lista desplegable y haga clic en el botón Ver datos de nivel 2 para abrir los resultados en una página nueva.

4. Acceso y comprensión de los datos: SeqAPASS Nivel 1 y Nivel 2

  1. Desplácese hasta la parte inferior de la página Consultar información de proteínas para ver un informe de los resultados: se proporciona un informe primario con análisis de nivel 1 y 2 de forma predeterminada. Seleccione el botón de opción Informe completo para ver un informe más detallado que proporciona todos los aciertos de secuencia y métricas de alineación. Haga clic en la accesición/ID/nombre apropiado en ambos informes para acceder a la alineación transparente de proteínas y la información de taxonomía en la base de datos NCBI.
  2. Desplácese hasta el lado derecho de la tabla de resultados para ver la columna ECOTOX . Haga clic en los enlaces a la base de conocimiento de ECOTOXicology (ECOTOX) para recopilar rápidamente los datos de toxicidad correspondientes para especies con predicciones de susceptibilidad.
    NOTA: ECOTOX es una base de conocimientos completa y disponible públicamente que proporciona datos únicos de toxicidad química para plantas acuáticas y terrestres y vida silvestre. SeqAPASS v6.0 incluye un widget ECOTOX para conectarse con datos relevantes de ECOTOX más rápidamente por producto químico y especies de interés.
  3. Haga clic en Descargar tabla para guardar la tabla como un archivo de hoja de cálculo. Haga clic en el botón Ver informe de resumen para ver y descargar una tabla de informe de resumen que presenta datos ordenados por grupo taxonómico.
    NOTA: Las tablas de resumen de datos están disponibles para los informes primarios y completos y proporcionan una descripción general de las predicciones para un objetivo determinado.

5. Manipulación de la configuración de datos: SeqAPASS Nivel 1 y Nivel 2

NOTA: En los análisis de Nivel 1 y Nivel 2, se supone que cuanto mayor sea la similitud de la proteína, mayor será la probabilidad de que una sustancia química interactúe con la proteína de manera similar a la especie/proteína consulta, haciéndola susceptible a los posibles impactos de las sustancias químicas con este objetivo molecular. Debido a la similitud de estos datos, los pasos para comprender los datos de Nivel 1 y 2 se describen juntos en un solo protocolo.

  1. Consulte los submenús en la parte superior de Consultar información de proteínas para acceder y manipular la configuración del informe y usar la configuración predeterminada para todas las opciones de informe para la mayoría de los análisis. Si hay una justificación científica para cambiar la configuración predeterminada, siga estos pasos opcionales:
    1. (OPCIONAL) Haga clic en el signo más + junto a Corte de susceptibilidad para ver y ajustar la configuración de corte de susceptibilidad en una pestaña nueva. Seleccione un nuevo valor de corte de una lista desplegable o introduzca un valor de corte definido por el usuario.
    2. (OPCIONAL) Cambie el número en el campo E-Value (el número de alineaciones diferentes que se espera que ocurran por casualidad) si se desea algo distinto al predeterminado.
      NOTA: Cualquier proteína con un valor E mayor que el número en el cuadro se eliminará del informe primario.
    3. (OPCIONAL) Utilice la opción Ordenar por grupo taxonómico para elegir el nivel de jerarquía taxonómica que desea mostrar en la columna Grupo taxonómico filtrado de la tabla de resultados.
      NOTA: Cambiar la jerarquía taxonómica también alterará la predicción de susceptibilidad basada en las especies de cada grupo filtrado que se encuentran por encima del límite.
    4. (OPCIONAL) Cambie el campo Dominio común (cuántos dominios comunes debe compartir una proteína con la proteína de consulta para incluirla en los resultados) si se desea algo distinto del predeterminado.
      NOTA: Como el valor predeterminado es 1, se excluirá cualquier secuencia que no comparta al menos un dominio común con la proteína de consulta.
    5. (OPCIONAL) Seleccione No en Lectura de especies para recuperar las predicciones de susceptibilidad de Y solo si la similitud porcentual es mayor o igual que el límite o si el resultado se identifica como un candidato ortológico.
      NOTA: Esta configuración predeterminada es Sí, lo que significa que se informará una predicción de susceptibilidad de Y para todos los candidatos ortológicos, todas las especies enumeradas por encima del límite de susceptibilidad y todas las especies por debajo del límite del mismo grupo taxonómico con una o más especies por encima del límite.
  2. Haga clic en el botón Descargar configuración de informe actual para descargar un archivo que capture la configuración actual aplicada.
    NOTA: El nivel de evaluación específico (1, 2 o 3) seleccionado dictará la configuración que se presenta en el informe.

6. Visualización de los datos: SeqAPASS Nivel 1 y Nivel 2

  1. Haga clic en el signo más + junto a Visualización y haga clic en el botón Visualizar datos para abrir una pestaña separada que muestra la información definida por el usuario y la opción de seleccionar un gráfico interactivo de resultados.
  2. Haga clic en Diagrama de cuadro para abrir el diagrama de cuadro interactivo y los controles de trazado y permitir que la visualización del diagrama de cuadro se actualice activamente para reflejar los cambios en la tabla de datos y proporcionar gráficos con calidad de publicación y presentación.
    NOTA: El diagrama de caja predeterminado muestra los grupos de especies en el eje x y la similitud porcentual en el eje y. Los diagramas de caja muestran el límite de susceptibilidad (línea discontinua), el porcentaje de similitud entre especies en comparación con la especie de consulta, y los valores medios y medianos para cada grupo taxonómico junto con los percentiles 25 y 75 y el rango intercuartílico. Dependiendo del objetivo del análisis y las necesidades del usuario, muchas características de diagrama de caja se pueden modificar a través de los siguientes pasos opcionales.
    1. (OPCIONAL) Para personalizar los grupos taxonómicos mostrados, consulte el cuadro Grupos taxonómicos en la sección Controles . Elimine grupos desplazándose sobre los nombres y seleccionando x o usando el menú desplegable Grupos taxonómicos .
    2. (OPCIONAL) Para agregar una leyenda que señale una especie de interés o grupos específicos predefinidos (por ejemplo, especies en peligro de extinción o amenazadas), coloque el cursor sobre el nombre de un grupo taxonómico en el eje x para activar un cuadro emergente que enumera las tres especies principales ordenadas por mayor similitud porcentual. Desplácese sobre las especies de la leyenda para generar un cuadro emergente con la información de especies correspondiente. Haga clic en el cuadro de un grupo taxonómico específico para generar una tabla de resumen descargable que enumere especies y predicciones.
  3. Haga clic en Descargar diagrama de caja para elegir un tipo de archivo, personalizar la resolución de ancho / alto y guardar la visualización.

7. Desarrollo y ejecución de un análisis SeqAPASS: Level 3

NOTA: Un análisis de Nivel 3 evalúa los residuos de aminoácidos identificados por el usuario dentro de la proteína de consulta y compara rápidamente la conservación de estos residuos en todas las especies. Se supone que las especies en las que se conservan estos residuos tienen más probabilidades de interactuar con una sustancia química de manera similar a la especie/proteína modelo. Como el Nivel 3 se centra en aminoácidos individuales, solo se puede realizar un análisis cuando se dispone de un conocimiento detallado de los residuos de aminoácidos críticos para la interacción químico-proteína o proteína-proteína.

  1. Haga clic en el signo más + situado junto al encabezado de nivel 3 en la página Información de proteína de consulta de nivel 1 para rellenar el menú Consulta de nivel 3.
  2. Haga clic en el signo más + junto al Explorador de referencias para abrir la herramienta del explorador de referencias, que genera una cadena booleana predefinida para consultar la literatura disponible y ayuda a los usuarios a identificar la literatura apropiada para apoyar la identificación de aminoácidos críticos que se utilizarán en la evaluación de Nivel 3 (Tabla 2 y Figura 2).
    1. (OPCIONAL) Una vez que la proteína de consulta se rellena automáticamente, use la función Agregar nombre de proteína para agregar proteínas adicionales.
  3. Haga clic en Generar enlace de Google Académico para abrir una ventana emergente que contenga una cadena de búsqueda generada automáticamente que incluya términos de búsqueda relevantes.
  4. Haga clic en Buscar en Google Académico para consultar la base de datos de literatura utilizando la cadena de búsqueda.
    1. Como alternativa, haga clic en Copiar al Portapapeles y personalice la cadena de búsqueda agregando o quitando términos mediante las funciones del Explorador de referencias.

8. Identificar residuos críticos de aminoácidos utilizando literatura identificada

  1. Seleccione la secuencia de plantilla con la que se alinearán las especies seleccionadas por el usuario en el menú Consulta de nivel 3.
    NOTA: Esta secuencia de plantilla se elige comúnmente en base a la literatura para la cual se identificaron los aminoácidos críticos y puede ser la misma especie o una especie diferente a las consultadas en el Nivel 1 y Nivel 2.
    1. (OPCIONAL) Utilice el cuadro Comparaciones adicionales para comparar las accesiones o secuencias que no aparecen en las tablas Principal/Informe completo .
  2. Introduzca un nombre definido por el usuario para la ejecución de nivel 3 en el cuadro de texto Introducir nombre de ejecución de nivel 3 para identificar la ejecución de nivel 3 completada. Elija un nombre único para cada evaluación.
  3. Seleccione el grupo taxonómico de interés en el campo Elegir grupo(s) taxonómico(s). Seleccione un grupo taxonómico para filtrar automáticamente la tabla por ese grupo taxonómico.
  4. En la tabla de resultados, haga clic manualmente en la casilla de verificación situada junto a cualquier especie que desee alinearse con la secuencia de plantilla.
    NOTA: Para garantizar una alineación adecuada, se debe comparar un grupo taxonómico a la vez con la plantilla. Solo seleccione proteínas con anotaciones similares para la especie de interés. Al seleccionar secuencias para la comparación, es importante prestar atención a ciertas secuencias (por ejemplo , hipotéticas, de BAJA CALIDAD o parciales). A menos que haya una justificación transparente para la inclusión, es mejor excluir estas secuencias, ya que pueden distorsionar las predicciones debido a información de secuencia incompleta o inadecuada.
  5. Repita los pasos para alinear todos los grupos taxonómicos de interés.
  6. Haga clic en Actualizar ejecuciones de nivel 2 y 3 una vez que todas las especies se hayan alineado para rellenar el menú Seleccionar nombre de ejecución de nivel 3 con los trabajos de nivel 3 completados y obtener los datos de una alineación de nivel 3 inmediatamente.
  7. Haga clic en Combinar datos de nivel 3 para combinar alineaciones de varios grupos taxonómicos.
    1. Como alternativa, para ver un solo informe, seleccione el nombre definido por el usuario en Elegir consulta para ver y haga clic en Ver datos de nivel 3.
  8. Seleccione la plantilla de nivel 3 que se utilizará como base para la comparación de residuos de aminoácidos en el menú Combinar informes de nivel 3 y haga clic en Siguiente.
  9. En Trabajos de nivel 3, seleccione trabajos completados para compararlos y haga clic en Siguiente. Utilice la función Trabajos de nivel de orden 3 para reordenar los grupos taxonómicos si lo desea. Haga clic en Ver datos de nivel 3 para generar una página de informe de nivel 3 con los grupos taxonómicos combinados alineados.
  10. Seleccione las posiciones de aminoácidos previamente identificadas para las especies de plantilla escribiendo las posiciones de aminoácidos, separadas por comas, en el cuadro Introducir posiciones de residuos de aminoácidos y, a continuación, seleccionando Copiar a la lista de residuos. Seleccione directamente los residuos en la secuencia de plantillas de la caja lanzadera.
  11. Haga clic en Actualizar informe para actualizar la página y mostrar las predicciones de susceptibilidad de nivel 3.
    NOTA: El nivel 3 utiliza un conjunto simple de reglas derivadas de descriptores básicos de propiedades funcionales de cadena lateral (por ejemplo, alifáticas, aromáticas) y dimensiones moleculares (diferencias de peso molecular >30 g/mol) para determinar si es probable que las diferencias en posiciones clave afecten las interacciones de proteínas13.

9. Visualización de datos SeqAPASS de nivel 3

NOTA: Al igual que en los niveles anteriores, los informes primario y completo están disponibles. Además de los datos idénticos a los datos de los Niveles 1 y 2, el Informe primario muestra posiciones de aminoácidos, abreviaturas y una susceptibilidad sí/no (Y/N) similar a la predicción de la plantilla. Del mismo modo, el informe completo contiene información sobre la clasificación de la cadena lateral de aminoácidos y el peso molecular.

  1. En la página Informe de nivel 3, desplácese hasta la parte inferior para ver un informe de los resultados. Haga clic en Descargar tabla en la parte inferior del informe para guardar la tabla .
  2. Haga clic en Ver informe de resumen de nivel 3 para ver y descargar una tabla de informe de resumen que presenta datos ordenados por grupo taxonómico. Haga clic en el signo más + junto a Visualización en la página Informe de nivel 3 para abrir una pestaña separada del navegador que muestra la información definida por el usuario y la opción de ver los resultados en forma de un mapa de calor interactivo.
  3. Haga clic en Mapa de calor en la página Información de visualización para abrir el gráfico interactivo y los controles y permitir que la visualización del mapa de calor se actualice activamente para reflejar los cambios en la tabla de datos. Realice los siguientes pasos opcionales para personalizar el mapa de calor.
    1. (OPCIONAL) Seleccione Opciones de informe para cambiar entre un informe simple, que muestra la posición del aminoácido, la abreviatura de una letra y la similitud de aminoácidos, o un informe completo, que muestra información detallada sobre cada aminoácido seleccionado.
    2. (OPCIONAL) Seleccione Opciones de informe para cambiar la forma en que se muestran las especies, ya sea por Nombre común o Nombre científico.
      NOTA: Dentro del Informe simple, los aminoácidos se clasifican como una coincidencia total (azul oscuro), coincidencia parcial (azul claro, sustituciones que cumplen solo un criterio) o no una coincidencia (amarillo, sustituciones que no cumplen ninguno de los criterios) al aminoácido plantilla. El informe completo muestra las comparaciones como una coincidencia total (azul oscuro) o no una coincidencia (amarillo).
    3. (OPCIONAL) Seleccione Selecciones opcionales para resaltar información útil como candidatos ortológicos, especies amenazadas, especies en peligro de extinción u organismos modelo comunes.
    4. (OPCIONAL) Seleccione Configuración del mapa de calor para seleccionar opciones de personalización adicionales, incluida la adición o eliminación de columnas, leyendas y texto.
  4. Haga clic en Descargar diagrama de caja para elegir un tipo de archivo y guardar la visualización.

10. Interpretación de los resultados de SeqAPASS: Líneas de evidencia para la conservación de proteínas

NOTA: Para facilitar la interpretación, esta herramienta incluye un Informe de resumen de decisiones (Informe DS) diseñado para integrar datos entre niveles. El Informe DS contiene los resultados (es decir, tablas de datos y/o visualizaciones) que el usuario ha seleccionado y permite la evaluación rápida de las predicciones de susceptibilidad en múltiples niveles para múltiples especies simultáneamente.

  1. Haga clic en Push Level # to DS Report en las páginas de visualización de resultados o datos y espere a que los datos se "inserten" y la pestaña DS Report se active.
    NOTA: Si los resultados o cualquier cambio no se han insertado en el Informe de DS, el nivel de inserción # al Informe de DS permanecerá activo hasta que se seleccione. Si se ha cambiado una configuración, aparecerá el texto Haga clic para insertar nuevos cambios hasta que los cambios se inserten en el informe. Las visualizaciones se pueden enviar al Informe de DS en cualquier momento durante la evaluación.
  2. Seleccione la ficha Informe de DS en cualquier momento para acceder a la página de DS .
    NOTA: Para todas las especies alineadas en el Nivel 1, la tabla del Informe Resumido de Decisión Final contiene los datos importantes y las predicciones de susceptibilidad para cada análisis. Si una especie en la tabla DS no se incluyó en el informe de Nivel 3 pero se encontró en trabajos de Nivel 1 y / o Nivel 2, la celda de la tabla recibirá una designación no aplicable (NA) para la predicción de susceptibilidad de Nivel 3.

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Representative Results

Para demostrar la aplicación de la herramienta SeqAPASS y resaltar nuevas características, se describen dos estudios de caso que representan casos en los que la conservación de proteínas predice que existen diferencias en la susceptibilidad química entre especies (transtiretina humana) y que no hay diferencias (μ receptor opioide [MOR]). El primero de estos ejemplos aborda las comparaciones estructurales / secuencia de proteínas para predecir el dominio de aplicabilidad para las vías de resultados adversos (AOP, consulte la Tabla 2 para la definición), mientras que el segundo se centra en el desarrollo de hipótesis de investigación relevantes para la susceptibilidad entre especies a los opioides presentes en las aguas residuales. Los enfoques básicos descritos en estos estudios de caso se pueden aplicar a cualquier producto químico y demuestran la amplia utilidad de esta herramienta para la toma de decisiones y la investigación.

Las hormonas tiroideas son esenciales para el crecimiento y desarrollo normal. Se sintetizan en la glándula tiroides y se secretan en el torrente sanguíneo donde se unen a las proteínas de distribución y circulan por todo el cuerpo 14,15,16,17,18. Estudios recientes han demostrado que los contaminantes ambientales, como los bifenilos policlorados (PCB), los éteres de difenilo polibromados (PBDE) y las sustancias perfluoroalquiladas y polifluoroalquiladas (PFAS), pueden unirse competitivamente a la proteína de distribución transtiretina (TTR) e interrumpir los procesos normales de tiroides 19,20,21,22,23,24,25 . Se ha desarrollado un AOP que describe la unión competitiva a TTR que conduce a la toxicidad del desarrollo neurológico humano (https://aopwiki.org/aops/152). Si bien hay evidencia de que este AOP también es aplicable a roedores, la aplicabilidad a otros grupos taxonómicos aún no se ha definido. Como los productos químicos de unión a TTR están presentes en el medio ambiente, es importante comprender la relevancia taxonómica de este AOP, un desafío que puede abordarse en parte a través del análisis SeqPASA. Utilizando la estrategia de formulación de problemas de la herramienta, el objetivo del análisis se puede establecer de la siguiente manera: Con el conocimiento de que los compuestos de unión a TTR conducen a resultados adversos en humanos, ¿qué grupos taxonómicos se predeciría que compartirían una susceptibilidad similar?

La proteína transtiretina humana está bien caracterizada, y hay varios ligandos bien estudiados que se sabe que se unen en el sitio de unión al TTR humano (hTTR), lo que la convierte en un objetivo óptimo para el análisis SeqAPASS 8,9,13. Utilizando la accesión NCBI para transtiretina humana, P02766.1, se realizó un análisis de Nivel 1 con la configuración predeterminada. Los resultados del análisis de Nivel 1 establecieron el límite de similitud porcentual en 49%, con mamíferos (Mammalia), aves (Aves), reptiles (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), anfibios (Amphibia) y la mayoría de las especies de peces (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) que caen por encima de este límite (Figura 3). Por lo tanto, todas las especies de estos grupos taxonómicos dieron como resultado una predicción de susceptibilidad de "Y" (es decir, sí) y son probablemente susceptibles a sustancias químicas que se sabe que interactúan con hTTR (Figura 3 y Archivo Suplementario 1).

Para la evaluación de nivel 2 de dominio(s) funcional(es), se utilizó la base de datos de dominios conservados del NCBI para identificar TR_THY (acceso smart00095) como un dominio conservado que comprende la cadena madura de la proteína de la subunidad TTR de los residuos 27 a 147. Como la secuencia de proteínas de TTR reportada en NCBI incluye un presegmento de 20 aminoácidos no relevante para el análisis actual, enfocar la comparación en la cadena madura proporciona una línea de evidencia adicional, más específica, hacia la conservación de esta proteína en todas las especies. A partir de la evaluación de Nivel 2, se informó un límite de similitud porcentual del 58%, con mamíferos, aves, reptiles, anfibios y la mayoría de las especies de peces nuevamente cayendo por encima de este límite (Figura 4). En consecuencia, SeqAPASS concluyó una predicción de susceptibilidad de "Y" (es decir, sí) para especies de estos grupos taxonómicos, lo que indica que probablemente son susceptibles a sustancias químicas que interactúan con la proteína hTTR (Figura 4 y Archivo Suplementario 1). En general, los resultados de los análisis de Nivel 1 y Nivel 2 sugieren que la mayoría de las especies de vertebrados comparten la conservación del hTTR y es probable que sean susceptibles a los productos químicos que se sabe que interactúan con esta proteína.

Figure 3
Figura 3: Análisis SeqAPASS Nivel 1 de la conservación de transtiretina en grupos taxonómicos con información de secuencia disponible relativa a la proteína humana. El porcentaje de similitud de la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestra en el eje Y; El grupo taxonómico se muestra en el eje X. Los círculos abiertos (○) indican la secuencia de consulta, y los círculos cerrados (●) indican la especie dentro del grupo taxonómico con el mayor porcentaje de similitud. Dentro de la gráfica, la parte superior e inferior de cada caja representan los percentiles 75 y 25, los bigotes se extienden a 1,5 veces el rango intercuartílico, y los valoresmedios y medianos están representados por líneas negras horizontales en la caja. La línea discontinua indica el límite para las predicciones de susceptibilidad. Abreviaturas: TTR = transtiretina; SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Análisis SeqAPASS Nivel 2 de la conservación del dominio de unión al ligando del receptor de transtiretina en grupos taxonómicos con información de secuencia disponible relativa a la proteína humana LBD. El porcentaje de similitud de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión al ligando se muestra en el eje Y; El grupo taxonómico se muestra en el eje X. Los círculos abiertos (○) indican la secuencia de consulta, y los círculos cerrados (●) indican la especie dentro del grupo taxonómico con el mayor porcentaje de similitud. Dentro de la gráfica, la parte superior e inferior de cada caja representan los percentiles 75 y 25, los bigotes se extienden a 1,5 veces el rango intercuartílico, y los valoresmedios y medianos están representados por líneas negras horizontales en la caja. La línea discontinua indica el límite para las predicciones de susceptibilidad. Abreviaturas: TTR = transtiretina; SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A través del análisis de modelos moleculares y estudios de cristalografía de proteínas, se identificaron aminoácidos en la región de unión de TTR que se predice que interactúan con el ligando endógeno 3,3′,5,5′-tetrayodo-L-tironina (T4, PDB 2ROX), así como tres productos químicos ambientales: sulfonato de perfluorooctano (PFOS, PDB 5JIM), tetrabromobisfenol A (TBBPA, PDB 5HJG) y dietilestilbestrol (DES, PDB 1TZ8)19, 21,22,26. Los residuos de aminoácidos Lys35, Ser137, Leu130, Ala128, Ala129 y Thr139 fueron identificados como desempeñando un papel clave en las interacciones proteína-ligando, ya sea a través de interacciones directas de enlace de hidrógeno o interacciones de van der Waals. Estos seis residuos de aminoácidos se evaluaron en un análisis de Nivel 3 en todas las especies utilizando hTTR como secuencia de plantilla y excluyendo secuencias no homólogas, hipotéticas, parciales y de baja calidad (Archivo Suplementario 1). Como se determinó previamente que el TTR se conserva solo entre especies de vertebrados, las especies de invertebrados se excluyeron de este análisis (Figura 3 y Figura 4). Además, es importante señalar que las posiciones de aminoácidos reportadas en la literatura excluyen un presegmento de 20 aminoácidos que está ausente en la proteína hTTR madura y, por esta razón, las posiciones presentadas en el Nivel 3 se ajustaron de las reportadas en la literatura para asegurar una alineación precisa con la proteína plantilla seleccionada15 (Archivo Suplementario 1).

En el análisis de Nivel 3 de TTR, se seleccionaron 294 especies de vertebrados para la alineación (mamíferos, aves, anfibios, reptiles y peces). De las especies evaluadas, 18 mostraron diferencias en aminoácidos clave que resultaron en una predicción de susceptibilidad de "N" (es decir, no). Curiosamente, cinco especies de mamíferos marinos presentaron una sustitución de aminoácidos en la posición 2 (128A), mientras que cuatro especies de peces demostraron sustituciones en la posición 2 (128A) o en la posición 6 (139T) (Figura 5). Como estos aminoácidos juegan un papel importante en las interacciones proteína-ligando en el canal de unión de TTR, estos datos sugieren que los ligandos TTR pueden interactuar de manera diferente en estas especies y darían lugar a una susceptibilidad química diferente en relación con los humanos.

Figure 5
Figura 5: Análisis SeqAPASS Nivel 3 de la conservación de residuos de aminoácidos importantes para la unión TTR-química. (A) Tabla sinóptico de nivel 3 que muestra el número de especies con datos de secuencia disponibles en todos los grupos taxonómicos, el número de especies que se prevé que sean susceptibles de manera similar (Y) y el número de especies que se prevé que no sean susceptibles de manera similar (N). (B) Mapa de calor de nivel 3 que muestra especies seleccionadas que se prevé que no sean igualmente susceptibles en relación con la proteína TTR de transtiretina humana, que demuestra aminoácidos completos, parciales y no coincidentes. Abreviaturas: TTR = transtiretina; SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En respuesta a los comentarios de las partes interesadas y los usuarios, se han diseñado e incorporado nuevas características en la herramienta SeqAPASS, incluida la capacidad de conectarse a datos empíricos para diferentes aplicaciones. La interoperabilidad de esta herramienta con la base de conocimiento ECOTOX (Tabla 1) se logró incorporando enlaces externos en las tablas de datos de Nivel 1 y Nivel 2 para las accesiones presentes en ECOTOX y creando un widget ECOTOX dentro de la herramienta para filtrar directamente los datos de toxicidad más relevantes en ECOTOX. A través de los enlaces y el widget, los usuarios pueden consultar rápidamente ECOTOX y recopilar los datos de toxicidad correspondientes para especies con predicciones de susceptibilidad SeqAPASS. Actualmente, las predicciones de SeqAPASS están conectadas a ECOTOX a través de un estresor químico y especies; sin embargo, los datos de toxicidad aún no están vinculados a genes / proteínas específicos, lo que permitiría conexiones directas a los puntos finales / objetivos moleculares específicos de interés en SeqAPASS. Si bien vincular las predicciones a los datos de toxicidad basados en un factor de estrés químico no es ideal, ya que los datos pueden no ser específicos de una vía determinada, establecer una conexión para reunir los resultados es el primer paso. Como la primera iteración de una integración SeqAPASS-ECOTOX, el enfoque actual proporciona a los usuarios todos los datos de toxicidad disponibles para el (los) estresor químico (s) y las especies a un nivel amplio. Estos datos, cuando se combinan con las predicciones de SeqAPASS, pueden proporcionar contexto a niveles amplios (vertebrados vs. invertebrados) y pueden considerarse dentro del contexto del marco AOP.

TTR presenta un buen ejemplo de caso para examinar esta conexión, ya que el AOP existente (AOP 152) proporciona un contexto para interpretar los datos de toxicidad de ECOTOX potencialmente relevantes. Comenzando con los ligandos examinados en SeqAPASS Nivel 3, se recopilaron datos de toxicidad ambiental entre especies para cuatro sustancias químicas que se sabe que interactúan con el dominio de unión al ligando TTR (dietilestilbestrol [DES], ácido perfluorohexanoico [PFHxA], sulfonato de perfluorooctano [PFOS] y tetrabromobisfenol A [TBBPA])19,21,23,24 . Para cada producto químico, ECOTOX fue consultado para obtener datos acuáticos y terrestres por el número del Chemical Abstracts Service (CAS) utilizando parámetros de búsqueda personalizados (Archivo Suplementario 1). Los datos se filtraron por grupos de especies de interés (anfibios, aves, peces, invertebrados, mamíferos, reptiles). Dentro de los resultados de la consulta filtrada, se calculó un promedio de las concentraciones mínimas y máximas del efecto del estudio y se implementó como una aproximación para la media de cualquier resultado que no informara un valor de concentración del efecto medio (Figura 6A y Archivo Suplementario 1). En el contexto de un solo producto químico, se realizaron pruebas de Kruskal-Wallis para comparar las concentraciones de efecto medio de diferentes grupos taxonómicos, ya que los datos no cumplían con los supuestos de la prueba ANOVA. Luego se realizaron pruebas de comparación por pares post-hoc utilizando la prueba de Dunn para todos los productos químicos, ya que los grupos taxonómicos consistían en tamaños de muestra desiguales. Los resultados acuáticos y terrestres se analizaron por separado, ya que los datos entre los dos tipos de exposiciones no son directamente comparables. Dentro de ECOTOX, se disponía de datos de toxicidad acuática para los productos químicos seleccionados para anfibios, aves, invertebrados y especies de peces (Figura 6A). Los datos de toxicidad terrestre para los productos químicos seleccionados sólo estaban disponibles para mamíferos y DES (Archivo Suplementario 1).

Figure 6
Figura 6: Vinculación de los resultados de SeqAPASS con datos empíricos . (A) Concentraciones de efecto medio a través de grupos taxonómicos con datos disponibles en la base de conocimiento de ECOTOXicology para productos químicos seleccionados que se sabe que se unen a la proteína TTR humana. (B) Superposición en el número de especies incluidas en cada análisis SeqAPASS con las especies para las cuales se disponía de datos ECOTOX. En el panel A, los paréntesis a lo largo del eje x indican el número de aciertos de consulta para los que se agregaron datos. Los asteriscos indican pares de concentraciones de efecto significativamente diferentes entre grupos de especies en el contexto de una sola sustancia química (prueba de Dunn, p < 0,05), donde un mayor número de asteriscos indica niveles más fuertes de significación (*: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001; ****: p < 0,0001). Las líneas centrales dentro de cada caja representan la mediana, con bordes de caja que demuestran el rango intercuartílico. Los bigotes se extienden hasta 1,5 veces el rango intercuartílico. Los valores atípicos que quedan fuera de ese rango se muestran como puntos individuales. Abreviaturas: TTR = transtiretina; SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies; ECOTOX = Base de conocimiento de ECOTOXicology. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En general, estos datos sugieren que la bioactividad de los productos químicos evaluados ocurre en especies de vertebrados, pero no ocurre en invertebrados. Si bien la falta de información sobre objetivos biológicos y vías en ECOTOX hace imposible vincular directamente estos datos empíricos con TTR, estos resultados respaldan las predicciones de SeqAPASS de que las especies de invertebrados no comparten susceptibilidad. Todas las especies de vertebrados con datos disponibles demostraron susceptibilidad tanto al PFOS como al TBBPA, aunque las concentraciones medias del efecto fueron significativamente más altas en peces y aves que en anfibios. Estos datos sugieren diferencias potenciales en la sensibilidad entre los grupos taxonómicos que pueden atribuirse a las diferencias de la vía biológica (incluido TTR). Cabe destacar que otras variables como el metabolismo y la excreción también pueden desempeñar un papel en las diferencias en la sensibilidad. Para PFHxA y PFOS, se encontró que los peces eran significativamente más sensibles que los invertebrados y las aves, y, para DES, los anfibios presentaron concentraciones de efecto medio significativamente más altas que los invertebrados. Una vez más, estos datos apoyan nuestra predicción de SeqAPASS de que los invertebrados no comparten susceptibilidad con las especies de vertebrados. De todas las especies evaluadas utilizando esta herramienta para las cuales había datos disponibles de la secuencia TTR, solo un pequeño número tenía datos ECOTOX correspondientes para los cuatro productos químicos de interés (Figura 6B, Tabla Suplementaria S1 y Tabla Suplementaria S2). Para aquellas especies que carecen de datos apicales, las predicciones de susceptibilidad de SeqAPASS agregan líneas adicionales de evidencia de que las especies relacionadas pueden comportarse de manera similar a aquellas con datos apicales. Los datos de todos los análisis de SeqAPASS y ECOTOX están disponibles en el Archivo Suplementario 1.

Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC), en 2017, los opioides contribuyeron a aproximadamente 47,600 muertes por sobredosis en los Estados Unidos, un número que sigue aumentando27. Las plantas de aguas residuales en los Estados Unidos están reguladas a nivel nacional por el Sistema Nacional de Eliminación de Descargas de Contaminantes de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, que no requiere pruebas de opioides u otros productos farmacéuticos en su descarga28. En los últimos años, se ha hecho un esfuerzo para utilizar la epidemiología basada en las aguas residuales como una herramienta para mapear el uso comunitario de opioides. Los esfuerzos de monitoreo de opioides han detectado concentraciones tan altas como 1.27 μg / L en efluentes de aguas residuales y 0.7 μg / L en aguas superficiales29,30. Estudios recientes de toxicidad que evalúan el efecto de la exposición a opioides en los peces han reportado el desarrollo de comportamientos adictivos y efectos inmunológicos adversos (por ejemplo, mayores tasas de infección, regulación negativa de los genes inmunes)31,32,33. En general, estos estudios sugieren que existe la posibilidad de exposiciones ambientales adversas a los opioides y destacan la importancia de comprender el riesgo que estos productos químicos representan para las especies acuáticas. Dado el rango de especies que pueden encontrar estos compuestos en el medio ambiente, la identificación de especies potencialmente susceptibles utilizando SeqAPASS puede ser importante para la priorización de los esfuerzos de prueba o monitoreo.

El MOR constituye la principal diana opioide para el tratamiento del dolor y es responsable de las poderosas propiedades analgésicas y adictivas de los alcaloides opiáceos en humanos34,35. Debido a la importancia de este receptor para la salud humana, los ligandos MOR son bien conocidos, y se dispone de estudios de cristalografía de rayos X de alta calidad, lo que hace que este objetivo sea ideal para el análisis SeqAPASS 8,9,13. Utilizando la accesión NCBI para el receptor opioide de μ humano, ACM90349.1, se realizó un análisis de Nivel 1 utilizando la configuración predeterminada. El límite de susceptibilidad se estableció en 55% para el Nivel 1, con similitudes porcentuales para mamíferos (Mammalia), aves (Aves), reptiles (Testudines, Lepidosauria, Crocodylia), anfibios (Amphibia) y la mayoría de las especies de peces (Actinopteri, Coelacanthimorpha, Cladista, Chondrichthyes) por encima de este límite; por lo tanto, las especies de estos grupos taxonómicos dieron como resultado una predicción de susceptibilidad de "Y" (es decir, sí), lo que indica que probablemente serían susceptibles a sustancias químicas que se sabe que interactúan con el MOR humano (Figura 7 y Archivo Suplementario 1). Utilizando la base de datos de dominios conservados NCBI, 7tmA_Mu_opioid_R se identificó (acceso cd15090) como un dominio funcional que comprende las siete hélices de la proteína MOR de 133 a 411, incluido un sitio de unión al ligando putativo. En comparación con el Nivel 1, los resultados del Nivel 2 identificaron un límite de susceptibilidad más alto del 88% de similitud, con mamíferos, aves, reptiles, anfibios y la mayoría de las especies de peces que se encuentran por encima de este límite y que resultan en una predicción de susceptibilidad de "Y" para sí (Figura 8). En general, los resultados de los análisis de Nivel 1 y Nivel 2 sugieren que la mayoría de las especies de vertebrados comparten la conservación del MOR y es probable que sean susceptibles a los productos químicos que se sabe que interactúan con el MOR humano.

Figure 7
Figura 7: Análisis SeqAPASS Nivel 1 de μ conservación de receptores opioides en grupos taxonómicos con información de secuencia disponible relativa a la proteína humana. El porcentaje de similitud de la secuencia de aminoácidos de la proteína se muestra en el eje Y; El grupo taxonómico se muestra en el eje X. Los círculos abiertos (○) indican la secuencia de consulta, y los círculos cerrados (●) indican la especie dentro del grupo taxonómico con el mayor porcentaje de similitud. Dentro de la gráfica, la parte superior e inferior de cada cuadro representan los percentiles 75 y 25, los bigotes se extienden a 1,5 veces el rango intercuartílico, y los valores medios y medianos están representados por líneas negras horizontales en el cuadro. La línea discontinua indica el límite para las predicciones de susceptibilidad. Abreviaturas: MOR = receptor opioide mu; SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Análisis SeqAPASS Nivel 2 de la conservación del dominio de unión al ligando del receptor opioide μ en relación con el dominio en la proteína humana. El porcentaje de similitud de la secuencia de aminoácidos del dominio de unión al ligando se muestra en el eje Y; El grupo taxonómico se muestra en el eje X. Los círculos abiertos (○) indican la secuencia de consulta, y los círculos cerrados (●) indican la especie dentro del grupo taxonómico con el mayor porcentaje de similitud. Dentro de la gráfica, la parte superior e inferior de cada cuadro representan los percentiles 75 y 25, los bigotes se extienden a 1,5 veces el rango intercuartílico, y los valores medios y medianos están representados por líneas negras horizontales en el cuadro. La línea discontinua indica el límite para las predicciones de susceptibilidad. Abreviaturas: MOR = receptor opioide mu; SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A través del análisis de modelos moleculares y estudios de cristalografía de proteínas, se identificaron aminoácidos en la región de unión de MOR que se predice que interactúan con ligandos conocidos. Aunque el conjunto diverso de ligandos que se unen bien a los receptores opioides da como resultado una farmacología compleja, se observan algunas interacciones ligando-proteína consistentes36,37. Basado en el acoplamiento molecular a varias estructuras cristalinas MOR, tanto morfina como fentanilo, los agonistas MOR de alta afinidad, interactúan con D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322 e Y32636,38. Los residuos D147, Y148, M151 y H297 también están implicados en estructuras cristalinas de MOR unidas al agonista de morfina BU72, mientras que D147, M151, H297 e Y326 también son críticos para unirse al antagonista irreversible de la morfina β-funaltrexamine37. Teniendo en cuenta estas líneas de evidencia, se seleccionaron nueve residuos (D147, Y148, M151, W293, I296, H297, V300, I322, Y326) para la evaluación de Nivel 3 utilizando MOR humano como secuencia de plantilla y excluyendo secuencias parciales, previstas, hipotéticas y de baja calidad. Es importante destacar que las posiciones de aminoácidos informadas en la literatura excluyen un segmento de 64 aminoácidos en relación con la accesión de proteínas NCBI y, por esta razón, se seleccionaron posiciones en el Nivel 3 para representar aquellas que se alinearon con la secuencia de plantilla para secuencias de alineación correctas.

En el análisis de Nivel 3 del MOR humano, se evaluaron 284 especies de especies de vertebrados (mamíferos, aves, anfibios, reptiles y peces). En todas las especies evaluadas, los nueve aminoácidos fueron una coincidencia total o parcial basada en la clasificación de la cadena lateral y el peso molecular; en consecuencia, todas las especies evaluadas resultaron en una predicción de susceptibilidad de "Y" para sí (Tabla 3 y Archivo Suplementario 1). Como estos aminoácidos son importantes en la unión tanto de agonistas MOR fuertes como de antagonistas fuertes, estos datos sugieren que los compuestos opioides dirigidos a los receptores opioides de μ humanos pueden interactuar de manera similar con los receptores en todas las especies de vertebrados. Aunque hay pocos datos empíricos disponibles hasta la fecha dentro de la base de conocimientos ECOTOX para compuestos opioides, varios estudios sugieren que los peces son probablemente susceptibles31,32,33. En general, los resultados de SeqAPASS apuntan al potencial de impactos ambientales más amplios de los productos químicos moduladores de MOR en todas las especies, lo que indica que más investigación y quizás monitoreo pueden ser valiosos. Los datos de todos los análisis están disponibles en el Archivo Suplementario 1.

Tabla 3: Análisis SeqAPASS Nivel 3 de la conservación de residuos de aminoácidos importantes para la unión química al receptor opioide μ. Tabla resumen que muestra el número de especies con datos de secuencia disponibles en todos los grupos taxonómicos, el número de especies que se prevé que sean susceptibles de manera similar (Y) y el número de especies que se prevé que no sean susceptibles de manera similar, así como aminoácidos completos, parciales y no coincidentes. Abreviatura: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla Suplementaria S1: Especies con datos ECOTOX disponibles para los cuatro productos químicos de interés que se sabe que se unen a la proteína transtiretina humana. Los datos disponibles para cada producto químico están alineados con las predicciones de SeqAPASS de susceptibilidad similar en los niveles 1, 2 y 3. Todas las predicciones de SeqAPASS relativas a la secuencia de transtiretina humana. Abreviaturas: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies; DES = dietilestilbestrol; PFHxA = ácido perfluorohexanoico; PFOS = ácido perfluorooctano sulfónico; TBBPA = tetrabromobisfenol A. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla suplementaria S2: Número total de especies con datos disponibles en las evaluaciones SeqAPASS y ECOTOX para productos químicos seleccionados que se sabe que se unen a la proteína transtiretina humana. SeqAPASS proporciona medios para predecir la susceptibilidad de las especies en muchas especies para las que no se dispone de datos empíricos de toxicidad. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Datos de SeqAPASS y ECOTOX para todos los resultados representativos. El archivo contiene TdC seguido de las siguientes hojas de datos: Pestaña 1-hTTR Resultados SeqAPASS Nivel 1, Pestaña 2-hTTR Resultados SeqAPASS Nivel 2, Pestaña 3-hTTR Resultados SeqAPASS Nivel 3, Pestaña 4-EcoTox datos para DES, Pestaña 5-EcoTox datos para PFOS, Pestaña 6-EcoTox datos para PFHxA, Tab 7-EcoTox datos para TBBPA, Tab 8-EcoTox Group Cálculos medios, Tab 9-SeqAPASS EcoTox Data Comparisons, Tab 10-hMOR SeqAPASS Results Level 1, Tab 11-hMOR SeqAPASS Results Level 2 y Tab 12-μ-hMOR SeqAPASS Results Level 3. Abreviaturas: SeqAPASS = alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies; TdC = Tabla de contenido; hTTR = transtiretina humana; ECOTOX = Base de conocimientos de ecotoxicología; DES = dietilestilbestrol; PFOS = ácido perfluorooctano sulfónico; PFHxA = ácido perfluorohexanoico; TBBPA = tetrabromobisfenol A; hMOR = receptor opioide mu humano. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Existe un reconocimiento generalizado de que no es factible probar empíricamente suficientes especies para capturar la diversidad genómica, fenotípica, fisiológica y de comportamiento de los organismos vivos que pueden estar expuestos a productos químicos de interés toxicológico. El objetivo de SeqAPASS es maximizar el uso de la secuencia de proteínas existente y en continua expansión y los datos estructurales para ayudar e informar la extrapolación de datos / conocimientos de toxicidad química de organismos probados a cientos o miles de otras especies a través de comparaciones a nivel molecular. La herramienta SeqAPASS fue diseñada para reducir la complejidad de las comparaciones de secuencias de proteínas para científicos, evaluadores de riesgos y reguladores a través de un análisis simplificado y rápido que incluye tablas de resumen generadas y descargables de forma transparente, visualizaciones interactivas de datos y la fácil identificación de especies amenazadas y en peligro de extinción, así como organismos modelo comunes. Aquí se describen protocolos para ejecutar los niveles 1, 2 y 3 de SeqAPASS para la evaluación de la similitud de la secuencia de aminoácidos primarios, la conservación del dominio funcional y los aminoácidos críticos involucrados en las interacciones químico-proteína y proteína-proteína. Las líneas de evidencia recopiladas de cada análisis de nivel de SeqAPASS predicen la susceptibilidad química entre especies, proporcionando datos consistentes y fácilmente interpretables. Hasta la fecha, esta herramienta se ha utilizado en una amplia gama de aplicaciones, incluida la identificación de sustancias químicas que se unen a ciertos receptores y la evaluación del potencial de lectura cruzada de receptores ecológicos de vertebrados con sistemas de mamíferos. Además, dos estudios de caso centrados en la proteína de distribución de la hormona tiroidea, TTR, y el MOR se describen aquí para demostrar las nuevas características y funcionalidades de SeqAPASS v2 a v6.

Al igual que con cualquier enfoque computacional, la capacidad de generar predicciones de susceptibilidad de especies dentro de la herramienta SeqAPASS depende en gran medida de la entrada de parámetros apropiados 8,9,13. Por lo tanto, es fundamental que, antes de realizar un análisis, se lleve a cabo un paso de formulación del problema para examinar los datos y la literatura existentes para el objetivo previsto. Iniciar un análisis con el conocimiento del objetivo de la proteína permite al usuario identificar los números de acceso de proteínas apropiados y las secuencias de alta calidad. Del mismo modo, el conocimiento de una especie sensible o objetivo o de los organismos modelo utilizados en los ensayos o en el desarrollo de AOP garantiza la selección de una especie de consulta apropiada con la que se comparan todas las demás especies. La selección de dominios funcionales para el Nivel 2 y los residuos críticos de aminoácidos para el Nivel 3 también son pasos críticos que requieren que el usuario identifique los parámetros de entrada apropiados para generar predicciones. Debido a esta necesidad de conocimiento preexistente de una interacción químico-proteína, las versiones recientes de la herramienta SeqAPASS integran recursos fáciles de usar diseñados para ayudar a guiar a los usuarios a información relevante para el inicio de una consulta (por ejemplo, enlaces a otras herramientas) (Tabla 2 y Figura 2). Además, se han integrado mensajes de información emergentes y alertas en la herramienta para guiar al usuario a través del análisis y ayudar a informar al usuario de cualquier error que deba resolverse.

La complejidad de las interacciones químico-biológicas presenta una limitación de la herramienta SeqAPASS. Al extrapolar los datos de toxicidad entre especies, la conservación del objetivo molecular es uno de los muchos factores a considerar. La adsorción, distribución, metabolismo y excreción (ADME) de un producto químico es crucial cuando se considera la toxicidad química, ya que los productos químicos pueden ser activados o desintoxicados por estos procesos39,40. Otros factores, como la ruta de exposición química, la etapa de vida y la historia de vida del organismo, y la dieta, también pueden desempeñar un papel importante en la determinación de la sensibilidad química en todas las especies41,42. Para abordar esta limitación, es importante comprender la pregunta principal que SeqAPASS hace al predecir la susceptibilidad química: ¿es probable que el objetivo proteico de un químico esté presente en otra especie para que el químico actúe sobre él? Esta pregunta se aborda identificando candidatos ortológicos y considerando la conservación de ese objetivo en todas las especies en relación con una especie sensible o objetivo conocida. Esta información puede usarse como una línea de evidencia para la extrapolación entre especies e integrarse en otros flujos de evidencia (por ejemplo, el potencial de exposición) para comprender mejor la susceptibilidad de las especies a los factores químicos estresantes. Las actualizaciones de SeqAPASS han incorporado enlaces integrados a herramientas externas, incluida la base de conocimiento Ecotox43 de la EPA de los Estados Unidos y el Sistema en línea de conservación ambiental (ECOS) del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos44. La conexión a estas bases de datos proporciona a los usuarios de SeqAPASS un fácil acceso a los datos empíricos de toxicidad química para compararlos con las predicciones basadas en secuencias y un medio para identificar especies que pueden tener un estado protegido.

La herramienta SeqAPASS proporciona una plataforma con base científica para predicciones computacionales de susceptibilidad intrínseca que están respaldadas por conceptos de biología evolutiva y ejemplos de casos que comparan predicciones con resultados empíricos disponibles. Además, SeqAPASS es gratuito y está disponible públicamente en una plataforma basada en la web bien soportada que es ampliamente accesible (https://seqapass.epa.gov/seqapass/). A medida que esta herramienta aprovecha los datos de secuencia y la información de proteínas de las bases de datos existentes, su capacidad para predecir la susceptibilidad química en una diversidad más amplia de especies mejora constantemente a medida que avanza la tecnología de secuenciación y se secuencian y anotan los genomas de nuevas especies. Aunque esto ofrece claras ventajas con respecto a la disponibilidad de datos, también presenta una limitación en el sentido de que la información de secuencia disponible públicamente puede estar sujeta a una calidad inconsistente, anotaciones deficientes y secuencias de proteínas incompletas para algunas especies. Sin embargo, es prometedor que las tecnologías y métodos ómicos en bioinformática estén avanzando rápidamente y, por lo tanto, es probable que la curación y la calidad de la secuencia continúen mejorando con el tiempo.

Uno de los principales objetivos de la herramienta SeqAPASS es la transparencia, proporcionando acceso en forma de enlaces a todas las fuentes de datos y herramientas que están integradas en el backend. Dicha transparencia permite al usuario un acceso rápido a las fuentes originales de la secuencia o a la información taxonómica del NCBI. El dominio de aplicabilidad de esta herramienta se define por la información necesaria para realizar un análisis significativo. Dado que el conocimiento de una interacción químico-proteína o proteína-proteína en una especie sensible o objetivo conocida son elementos clave para comenzar una consulta, debe reconocerse que las consultas realizadas sin esta información no son significativas. Además, los productos químicos que tienen múltiples objetivos biológicos indefinidos o interactúan con diferentes objetivos con diferentes grados de potencia también presentan un desafío y una limitación de la herramienta en su forma actual. Se anticipa que, con la mejora de la bioinformática, el modelado computacional y la cribado y transcriptómica de alto rendimiento basados en células, se continuará dilucidando un mayor conocimiento en la diversidad del espacio químico con respecto a las interacciones con proteínas específicas. Se espera que la capacidad de aplicar SeqAPASS a desafíos más amplios de extrapolación de especies, en relación con la comprensión del potencial de efectos químicos adversos en la diversidad de especies, continúe mejorando.

En conclusión, la herramienta SeqAPASS es una plataforma accesible que aplica fácilmente la información molecular para abordar el considerable desafío de la extrapolación entre especies en las evaluaciones de seguridad química. Aunque los ejemplos destacados aquí se centran en generar predicciones de susceptibilidad química, los resultados también pueden ayudar a comprender la conservación general de las vías biológicas. Al reunir diferentes líneas de evidencia y facilitar el acceso a múltiples plataformas y bases de datos, esta herramienta ayuda a construir casos transparentes para la priorización de las pruebas químicas y la asignación de recursos. Con el desarrollo continuo de capacidades científicas y bioinformáticas, el poder y la utilidad de la herramienta continuarán creciendo y mejorando para satisfacer las necesidades de las comunidades de investigación y reguladoras, al tiempo que reducen los recursos necesarios para las evaluaciones entre especies.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Dr. Daniel L. Villeneuve (U.S. EPA, Center for Computational Toxicology and Exposure) y al Dr. Jon A. Doering (Departamento de Ciencias Ambientales, Louisiana State University) por proporcionar comentarios sobre un borrador anterior del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos. Las opiniones expresadas en este documento son las de los autores y no reflejan necesariamente las opiniones o políticas de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, ni la mención de nombres comerciales o productos comerciales indica respaldo por parte del gobierno federal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spreadsheet program N/A N/A Any program that can be used to view and work with csv files (e.g. Microsoft Excel, OpenOffice Calc, Google Docs) can be used to access data export files.
Basic computing setup and internet access N/A N/A SeqAPASS is a free, online tool that can be easily used via an internet connection. No software downloads are required.

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References

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Genética Número 192 Extrapolación entre especies ecotoxicología toxicología predictiva metodología de nuevo enfoque receptor opioide transtiretina
Demostración de la alineación de secuencias para predecir la susceptibilidad entre especies herramienta para una evaluación rápida de la conservación de proteínas
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