Summary
Visualisering av myelinisering er et viktig mål for mange forskere som studerer nervesystemet. CARS er en teknikk som er kompatibel med immunfluorescens som naturlig kan avbilde lipider i vev som hjernen som belyser spesialiserte strukturer som myelin.
Abstract
Koherent anti-Stokes Raman-spektroskopi (CARS) er en teknikk som klassisk brukes av kjemikere og fysikere for å produsere et sammenhengende signal om signaturvibrasjoner av molekyler. Imidlertid er disse vibrasjonssignaturene også karakteristiske for molekyler i anatomisk vev som hjernen, noe som gjør den stadig mer nyttig og anvendelig for nevrovitenskapsapplikasjoner. For eksempel kan CARS måle lipider ved spesielt spennende kjemiske bindinger i disse molekylene, noe som muliggjør kvantifisering av forskjellige aspekter av vev, for eksempel myelin involvert i nevrotransmisjon. I tillegg, sammenlignet med andre teknikker som vanligvis brukes til å kvantifisere myelin, kan CARS også settes opp for å være kompatible med immunfluorescerende teknikker, noe som muliggjør sammerking med andre markører som natriumkanaler eller andre komponenter i synaptisk overføring. Myeliniseringsendringer er en iboende viktig mekanisme i demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose eller andre nevrologiske tilstander som Fragilt X-syndrom eller autismespekterforstyrrelser er et fremvoksende forskningsområde. Avslutningsvis kan CARS brukes på innovative måter for å svare på presserende spørsmål i nevrovitenskap og gi bevis for underliggende mekanismer relatert til mange forskjellige nevrologiske forhold.
Introduction
Handlingspotensialer er den grunnleggende informasjonsenheten i hjernen, og handlingspotensialutbredelse gjennom aksoner danner en søyle i informasjonsbehandling 1,2,3. Nevroner mottar vanligvis afferente innganger fra flere andre nevroner og integrerer disse inngangene innenfor et gitt smalt tidsvindu 4,5. Derfor har virkningsmekanismene potensiell forplantning i aksoner fått betydelig oppmerksomhet fra etterforskere.
Ved forplantning gjennom et akson regenereres et handlingspotensial gjentatte ganger langs aksonet for å sikre pålitelig forplantning6. I de fleste nevroner av kjeve vertebrater (gnathostomer) er axoner omgitt av en skjede av myelin, som er en lipidrik substans produsert av nærliggende oligodendrocytter eller Schwann-celler, som er typer glialceller (gjennomgått i 7,8). Denne myelinskjeden isolerer aksonet elektrisk, reduserer kapasitansen og tillater handlingspotensialutbredelse effektivt, raskt og med lavere energiforbruk. Myelin dekker ikke aksonet jevnt, men det kapper aksonet i segmenter som har korte hull mellom dem, kalt nodene til Ranvier (gjennomgått i 9,10). Både myeliniseringstykkelsen, som styrer nivået av elektrisk isolasjon av et akson, og avstanden mellom nodene til Ranvier, som styrer frekvensen som handlingspotensialer regenereres langs et akson, påvirker hastigheten på handlingspotensialutbredelsen (gjennomgått i11).
Det er en stor mengde litteratur som tyder på at myeliniseringstykkelsen påvirker hastigheten på virkningspotensialutbredelsen i aksoner12,13,14. Videre kan endringer i aksonmyelinisering resultere i en rekke CNS-underskudd 15,16,17,18,19,20,21. Det er derfor ikke overraskende at fokus for mange forskningsinnsatser innebærer måling og karakterisering av aksonmyelinisering. Målinger av myelintykkelse har oftest blitt gjort med elektronmikroskopi, en teknikk som krever en betydelig mengde vevspreparering og er utfordrende å bruke i kombinasjon med immunhistokjemi. Imidlertid er det også en raskere og enklere teknikk for å måle aksonmyelinisering som er basert på Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS). En CARS-laser kan stilles inn på forskjellige frekvenser, og når den er innstilt på frekvenser som er egnet til å opphisse lipider, kan myelin avbildes uten behov for ytterligere etiketter22. Lipidavbildningen kan kombineres med standard immunhistokjemi slik at lipider kan avbildes sammen med flere fluorescerende kanaler23. Imaging myelinisering med CARS er betydelig raskere enn elektronmikroskopi og har en oppløsning som er, om enn lavere enn EM, tilstrekkelig til å oppdage selv små forskjeller i myelinisering i samme type axoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter overholdt alle gjeldende lover, National Institutes of Health retningslinjer, og ble godkjent av University of Colorado Anschutz Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dyr
- Bruk C57BL/6J (lager #000664) mus (Mus musculus ) hentet fra The Jackson Laboratory eller mongolske gerbils (Meriones unguiculatus) opprinnelig hentet fra Charles.
2. Forberedelse av vev
- For transkardial perfusjon, overdose gnager arter av interesse med pentobarbital (120 mg / kg kroppsvekt) og transkardialt perfuse dem med fosfatbufret saltvann (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,76 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4) etterfulgt av4% paraformaldehyd (PFA) 24.
- Spesielt åpne magen og ribbe buret med saks og hold ribbe buret på plass med Kelly hemostatiske tang for å eksponere hjertet.
- Sett en 23 GA nål koblet til en perfusjonspumpe inn i venstre ventrikel og klipp raskt høyre atrium med fin saks.
- Administrer PBS gjennom perfusjonspumpen og nålen i hjertet i 10 minutter for å tømme hjernen og kroppen for blod.
- Bytt perfusjonspumpe til 4 % PFA i 10 minutter og kontroller stivhet i lemmer og hale for å bekrefte vellykket perfusjon.
- Etter perfusjon, halshugg dyrene og fjern hjernen fra skallen. Hold hjernen over natten i 4% PFA før du overfører til PBS. Legg inn hjernestammer i 4% agarose (i PBS) og skjær koronalt ved hjelp av en vibratom med 200 μm tykkelse.
3. Farging
- Flekkfrie flytende seksjoner for Nissl, for å visualisere cellelegemer (1:100), i antistoffmedier (AB-medier: 0,1 M fosfatbuffer (PB: 50 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% bovint serumalbumin (BSA)) i 30 minutter ved romtemperatur på en standard laboratorieshaker25.
- Beskytt delene mot lys med aluminiumsfolie og/eller et deksel. Bølgelengder på 550 nm eller lavere er kompatible med CARS-bildebehandling (figur 1).
MERK: Selv om vi ikke forventer at Triton-X eller andre reagenser har innvirkning på CARS-avbildning av lipider, kan ytterligere kontroller med spesifikke antistoffmedier være berettiget.
- Beskytt delene mot lys med aluminiumsfolie og/eller et deksel. Bølgelengder på 550 nm eller lavere er kompatible med CARS-bildebehandling (figur 1).
- PAUSEPUNKT: Oppbevar frittflytende seksjoner (mens de er beskyttet mot lys) i PBS til bildebehandling. Når seksjonert, bilde hjernen seksjoner innen 2 uker.
Figur 1: CARS-avbildning kan kombineres med immunfluorescerende bildebehandling. Grafene viser at CARS-avbildning skjer ved 660/640 nm rødt signalspektrum26. Denne bølgelengden er tilstrekkelig fjernt fra det grønne, blå eller UV-området, noe som muliggjør kombinasjon av CARS-signalet med immunfluorescens i disse områdene. Spesielt indikerer grafen også eksitasjon og utslipp for Nissl merket med blå fluorofor, som ble kombinert med CARS under innsamlingen av representative resultater for denne publikasjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Bildebehandling
MERK: CARS-laseroppsettet inneholder en fiberlaser som gir 80 MHz-klokken, og en OPO (Optical Parametric Oscillator) laser med et justerbart område på 770-990 nm med Stokes-strålen festet til 1031 nm, som er nødvendig for å samle CARS-signalet. Det er en blenderåpning for begge bjelkene.
- Før du bringer prøver til mikroskopet, slå på og varm opp CARS-laseren i minst 1 time, juster CARS-laseren, og Koehler kondensatoroptikken og membranen til mikroskopet for fremover CARS-bildebehandling.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for riktig funksjon av CARS mikroskopi.- For romlig justering av de to laserstrålene (pumpe og stokes), få tilgang til de to interne PSD-ene (posisjonsfølsomme detektorer) via CARS-laser-GUI.
- Oppnå tidsmessig justering ved å bruke forsinkelsesfunksjonen i CARS-laser-GUI, som kan bidra til å overlappe pulsene til de to laserne (pumpe og stokes) som har forskjellige dispersjoner på grunn av deres forskjellige bølgelengder. Derfor gjøres både tidsmessig og romlig overlapping av pumpen og stokebjelkene med brukerinngangen gjennom GUI.
- Juster det eksterne periskopet (de to siste speilene i oppsettet) for å sentrere de romlig overlappede to laserne på mikroskopets skannehodespeil.
- For best fremover CARS ikke-deskannet deteksjon, sørg for at kondensatoren er Koehler-ed (som betyr at kondensatoren er sentrert og fokusert på membranen for å oppnå jevn belysning)
- For immunfluorescens konfokal avbildning og CARS-avbildning, tilpass CARS-laseren, med både fremover- og epi CARS-ikke-deskannet detektorer (NDD), ved å inkorporere et konfokalt mikroskop utstyrt med synlige lasere for fluorescensavbildning (figur 2).
- Plasser seksjoner i en kulturskål med coverslip (for invertert mikroskopi), PBS for å unngå at vevet tørker ut, og en glassvekt for å holde vevet nær coverslip.
- Ta z-stacks eller enkeltbilder med et 60X, 1,2 NA infrarødt korrigert vannmål, som tjener til innsamling av CARS-signalet i epi-retningen og gjennom en 0,55 NA-kondensator i fremoverretningen for å avbilde hjerneområder som mediale kjernen i trapesformet legeme (MNTB).
- Ta CARS-bildene på ca. 600 mW pumpe/sonde og 300 mW Stokes, ved å bruke CARS-laser-GUI. Disse lasereffektverdiene måles internt av systemet. Begge lasernes krefter på prøvestedet er mindre enn 25 mW og trygge for vevsprøven.
- Overlapp pumpen og Stokes bjelker romlig og tidsmessig. Still OPO til 797,2 nm. Dette gir en CARS-bølgelengde på 650 nm. På grunn av det høyere energinivået er den resulterende returen til grunntilstanden anti-Stokes (blå forskjøvet) til eksitasjonen.
- Fang opp CARS-signalet i epi eller fremover ikke-deskannet detektorer ved hjelp av båndpassfiltre (640-680 nm) etterfulgt av sekvensiell deteksjon av immunfluorescensetiketten (i dette tilfellet fluorescerende merket Nissl).
MERK: Nissl neuronal soma-markøren er ikke fanget i CARS 640-680 nm bandpass-filteret, noe som tillater kombinasjonen av fluorescens og CARS-avbildning i bildene som presenteres nedenfor. - CARS og fluorescens deler ikke PMT. Bruk disse innstillingene for optimalt lipidsignal for å selektivt avbilde myelinisering i hjerneområdet.
FORSIKTIG: Skjerm brukeren mot laserstrålen
- Lagre bildene som OIB-filer, som kan importeres til et bildeanalyseprogram for videre kvantifisering (figur 3).
Figur 2: CARS-instrumentdiagram som viser CARS-lasere (røde piler) og ikke-deskannet (NDD) epi- og fremoverdeteksjon innlemmet på en laserskanningskonfokal. I forward NDD anskaffer vi CARS for C-H-bindinger (mørkerøde piler) og SHG (andre harmoniske generatioin) ved 515 nm (oransje pil). I epi NDD anskaffer vi CARS for C-H-bindinger (mørkerøde piler) og 2PE (to-fotonutslipp) autofluorescens (lyseblå pil). Sekvensielt kan fluorescens konfokale bilder anskaffes (grønne piler for synlig laser, blå piler for konfokal deteksjon). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: CARS kan belyse myelin (magenta) i hjernevev (hjernestamme) og samtidig avbilde Nissl (cyan) eller fluorescerende markører. De to panelene viser representative resultater fra en mongolsk gerbil (enkeltbilde M. unguiculatus, figur 3A, C, E) og mus (z-stack maks projeksjon M. musculus, figur 2B, D, F) hjerne, noe som indikerer at denne teknikken kan brukes på tvers av arter. Figur 3A, B som viser Nissl i cyan, C, D viser CARS-signalet i magenta, E, F kombinerer Nissl- og CARS-signalene med hvert panel for henholdsvis gerbil eller mus. Begge settene med bilder viser en del av den mediale kjernen i trapesformet legeme (MNTB) i hjernestammen. Nevroner i MNTB mottar innganger fra tungt myeliniserte axoner, som avsluttes i kalyxen av holdt, en type gigantisk synapse27. Skala bar er 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En av de største fordelene med CARS-mikroskopi i forhold til andre teknikker er kompatibiliteten med fluorescerende bildebehandling23. Figur 1 viser CARS-spektrene sammenlignet med Nissl merket med immunfluorescerende markør som viser liten/ingen overlapping i spektra. Figur 2 illustrerer laseroppsettet for CARS i kombinasjon med konfokalmikroskopi. Figur 3 viser to representative bilder, ett som en enkelt stabel og en z-stack maks projeksjon fra ørkenrotte og mus som kan oppnås ved hjelp av CARS-avbildning som viser både cellelegemer (cyan) og myelinsignal (magenta).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En voksende litteratur understreker myelins rolle i hjernefunksjonen 13,16,21,28. Videre vet vi at myeliniseringstykkelse og myeliniseringsmønster kan endres i flere nevrologiske tilstander som multippel sklerose (gjennomgått i29), aldring (gjennomgått i 30), autisme20,31 og mange andre. Det er derfor ikke overraskende at flere og flere etterforskere må vurdere myelinisering på tvers av hjernevev og dyremodeller, under flere medisinske tilstander og i et økende antall eksperimentelle situasjoner. Tradisjonelle metoder for å avbilde myelinisering i hjernevev inkluderer antistoffmerking etterfulgt av lysmikroskopi og elektronmikroskopi (EM). Begge teknikkene er tidkrevende og krever flertrinns vevsprepareringsprotokoller, som er forbundet med mulige feil og endringer i vevssammensetningen. Vi demonstrerte en alternativ metode som kan gi lignende resultater mye raskere på grunn av muligheten til å avbilde myelin mye raskere, og som kan kombineres med ekstra fluorescenslysmikroskopi. Det er viktig at denne teknikken kan brukes til å avbilde lipider i hjernevev uten behov for ekstra markører eller etiketter. Denne teknikken tillater ikke bare avbildning av myelin langs intakte aksoner, men det muliggjør avbildning av myelinnedbrytningsprodukter som plakk eller væskedråper32, som har vist seg å forekomme, for eksempel i multippel sklerose33.
Frekvensen som CARS-laseren ble innstilt på, var egnet til å forskyve bildet tungt til fordel for lipider, noe som resulterte i generelle høykvalitetsbilder av myelinisering, siden myelin er langt det vanligste lipidrike stoffet i hjernen. Prinsippet med denne teknikken er at en CARS-laser, som kan stilles inn på forskjellige frekvenser, er innstilt til 792,2 nm, som er en frekvens som er egnet til å opphisseCH2-bindinger . Disse er rikelig i lipider, som inneholder lange kjeder avCH2-grupper forbundet med karbon-karbonbindinger med en terminal karboksylsyregruppe på slutten. Spennende lipider med denne frekvensen resulterte i et signal som deretter kunne avbildes med standard konfokal mikroskopdeteksjonsteknologi. Kvaliteten på de resulterende bildene støtter kvantitative analyser som enten kan gjøres av en menneskelig observatør eller automatiserte algoritmer34. Imidlertid merker denne metoden ikke utelukkende myelin sidenCH2-bindinger ikke er eksklusive for myelin, og derfor er CARS mindre spesifikk enn et antistoff ville være. Som et resultat viser bildene noen etikett, som ikke er forbundet med myelin. Det er viktig at denne bakgrunnsmerkingen ikke kompromitterer kvaliteten på målingene eller muligheten for kvantitative analyser.
Oppløsningen av CARS-avbildning er diffraksjonsbegrenset og ligner på to fotonmikroskopi (~ 250 nm) og dermed lavere enn EM. Derfor må etterforskere som tar sikte på å vurdere svært små forskjeller i myeliniseringstykkelse når den oppstår, for eksempel i visse medisinske tilstander, være oppmerksomme på denne begrensningen. Ytterligere EM-kontroller i et lite utvalg kan bekrefte at oppløsningen er tilstrekkelig for deres forskningsmål.
En stor fordel med CARS for avbildning av myelin, i tillegg til hastighet og letthet, er muligheten til å kombinere etikettfri lipidavbildning med fluorescens konfokal mikroskopi. Avhengig av mikroskopet som brukes til CARS, kan to eller til og med tre ekstra kanaler avbildes slik at myelinavbildning kan kombineres med antistoffmerking, Nissl-flekk, transgene muselinjer som uttrykker fluorescerende proteiner eller lignende. Potensielle begrensninger ved bruk av lengre bølgelengde fluorofor er for det meste fordi CARS-signalet observeres gjennom 640-680 nm båndpassfiltre som kan fange utslipp av grønne og / eller røde fluoroforer. Imidlertid har picosekundlaseren som brukes til CARS-eksitasjon en topppulsenergi på ~ 10 ganger mindre enn standard femtosekundlaser som brukes til tofotoneksitasjon, oversatt til ~ 100 mindre fluorescens. Videre er 797, 2 nm puls picosekundlaseren som brukes til CARS-eksitasjon, spektralt langt fra toppen av to-fotontverrsnittabsorpsjonen av de synlige fluoroforene. Derfor er CARS picosekundlaser svært ineffektiv for to-foton eksitering av synlige fluoroforer, noe som gjør det fluorescerende signalet ubetydelig for kryssing i CARS-deteksjonen. Dette bør imidlertid testes ved å avbilde en negativ kontrollprøve som ikke har noen fluorescerende etiketter sammenlignet med en prøve med fluorescerende markører.
Avslutningsvis er CARS-avbildning en egnet teknikk for å avbilde myelin i hjernevev. Mens oppløsningen er sammenlignbar med standard lysmikroskopi og dermed er lavere enn EM, gjør hastigheten og brukervennligheten denne teknikken til et attraktivt alternativ til eksisterende metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Støttes av NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) og NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 og FRAXA (McCullagh). CARS-avbildningen ble utført i Advanced Light Microscopy Core-delen av NeuroTechnology Center ved University of Colorado Anschutz Medical Campus, delvis støttet av NIH P30 NS048154 og NIH P30 DK116073.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors - 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma - Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A.
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B.
- Boullerne, A. I.
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), London, England. 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al.
- Fluorescence SpectraViewer. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022).
- Held, H.
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O'Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
