Summary
Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att sätta upp en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus. Denna modell med hög genomströmning simulerar bättre infektioner in vivo jämfört med konventionella mikrobiologiska tekniker och ger forskare en fysiologiskt relevant plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel.
Abstract
Utvecklingen av antimikrobiella medel är en dyr process med allt lägre framgångsgrad, vilket gör ytterligare investeringar i forskning om upptäckt av antimikrobiella medel mindre attraktiva. Antimikrobiell läkemedelsupptäckt och efterföljande kommersialisering kan göras mer lukrativ om en misslyckad-snabb-och-misslyckas-billig strategi kan implementeras inom de ledande optimeringsstadierna där forskare har större kontroll över läkemedelsdesign och formulering. I den här artikeln beskrivs installationen av en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus, som är enkel, kostnadseffektiv, hög genomströmning och reproducerbar. Bakteriefysiologin i modellen efterliknar att vid infektion som bakterieproliferation är beroende av patogenens förmåga att skada vävnaden. Upprättandet av sårinfektion verifieras genom en ökning av livskraftiga bakterieantal jämfört med inokulumet. Denna modell kan användas som en plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel i blyoptimeringsstadiet. Det kan hävdas att tillgången till denna modell kommer att ge forskare som utvecklar antimikrobiella medel en misslyckas-snabbt-och-misslyckas-billigt modell, vilket kommer att bidra till att öka framgångsgraden i efterföljande djurförsök. Modellen kommer också att underlätta minskning och förfining av djuranvändning för forskning och i slutändan möjliggöra snabbare och mer kostnadseffektiv översättning av nya antimikrobiella medel för hud- och mjukdelsinfektioner till kliniken.
Introduction
Hudinfektioner är en viktig global fråga, med stora ekonomiska kostnader för vårdgivare runt om i världen. Utvecklingen av multidrogresistens och biofilmbildning av patogener spelar en nyckelroll i förekomsten av icke-helande sår 1,2,3,4. Som ett resultat av detta är hud- och mjukvävnadsinfektioner en av de vanligaste orsakerna till förlängd sjukhusvistelse och efterföljande återinläggning5. Förseningar i sårläkning är kostsamma för både patienten och vårdgivare, med vissa uppskattningar som tyder på att cirka 6,5 miljoner patienter drabbas årligen i USA. I Storbritannien leder hudinfektioner och tillhörande komplikationer till cirka 75 000 dödsfall årligen 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) är en formidabel sårpatogen som ofta isoleras från patientsår 2,7. Graden av uppkomst av multiresistans ökade drastiskt under 2000-talet. Under denna tid var cirka 60% av akuta bakteriella hud- och hudstrukturinfektioner kulturpositiva för meticillinresistenta S. aureus1. Det ökande antalet multiresistenta stammar bland stafylokocker, och faktiskt andra patogener, under de senaste 2 decennierna indikerar ett brådskande behov av snabb utveckling av antibiotika med nya verkningssätt som kan övervinna resistens.
Men sedan början av 2000-talet har antibiotikaupptäcktsprogram dominerats av längre utvecklingstider och låga framgångsgrader, med endast 17% av nya antibiotika som går in i kliniska prövningar i USA som uppnår marknadsgodkännande8. Detta tyder på en skillnad mellan resultat från in vitro-testning av nya antibiotika och deras kliniska resultat. Det kan hävdas att denna skillnad till stor del beror på skillnader i bakteriell fysiologi vid infektioner in vivo och under konventionella mikrobiologiska metoder vid testning av antibiotikas effektivitet i de prekliniska in vitro-stadierna. Därför behövs nya laboratoriemetoder som är mer representativa för bakteriell fysiologi under infektion för att förbättra framgångsgraden i antibiotikaupptäcktsprogram.
Nuvarande metoder för att studera hudinfektioner inkluderar studier på levande djur (t.ex. möss), ex vivo-hudmodeller (t.ex. svin) och 3D-vävnadskonstruerade hudmodeller (t.ex. människa)9,10,11,12. Studier på levande djur är strikt reglerade och har relativt låg genomströmning. I djurmodeller orsakar sår och infektion betydande lidande för djuren och väcker etiska problem. Mänskliga hudmodeller, ex vivo eller vävnadskonstruerade, kräver etiskt godkännande, efterlevnad av lokal och global lagstiftning (lagen om mänsklig vävnad, Helsingforsdeklarationen), och det finns svårigheter att skaffa vävnader, med vissa förfrågningar som tar år att uppfylla13,14. Båda modelltyperna är arbetsintensiva och kräver betydande expertis för att säkerställa experimentell framgång. Vissa nuvarande ex vivo-hudinfektionsmodeller kräver förinokulerade skivor och tillsatser för sårbädden för att möjliggöra infektion; Även om dessa modeller är otroligt användbara finns det begränsningar i infektionsprocessen eftersom tillsatser begränsar användningen av sårbädden som näringskälla10,15,16,17. Modellen som beskrivs i denna studie använder inga tillsatser till sårbädden, vilket säkerställer att infektionspatologin och livskraftiga cellantal är ett resultat av direkt utnyttjande av sårbädden som den enda näringskällan.
Med tanke på behovet av nya laboratoriemetoder har en ny ex vivo-modell med hög genomströmning av hudinfektioner utvecklats för att utvärdera effekten av nya antibiotika. Hudinfektionsstudier står inför många utmaningar-höga kostnader, etiska problem och modeller som inte visar en fullständig bild20,21. Ex vivo-modeller och 3D-explantmodeller möjliggör bättre visualisering av sjukdomsprocessen och den inverkan behandlingar kan ha från en mer kliniskt relevant modell. Här beskrivs installationen av en ny fårhudsmodell, som är enkel, reproducerbar och kliniskt relevant och har hög genomströmning. Fårskinn valdes eftersom får är ett av de stora däggdjur som vanligtvis används för att modellera svar på infektioner in vivo. Dessutom är de lätt tillgängliga från slakterier, vilket säkerställer en stadig tillgång på hud för forskning, och deras slaktkroppar skållas inte, vilket garanterar god vävnadskvalitet. Denna studie använde S. aureus som exempelpatogen; Modellen fungerar dock bra med andra mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Lammhuvuden från R.B Elliott och Son Abattoir användes som källa till hudprover i detta projekt. Alla lamm slaktades för konsumtion som mat. Istället för att kasta huvudena återanvändes dessa för forskning. Etiskt godkännande krävdes inte eftersom vävnaden kom från avfall som kasserats från slakterier.
1. Sterilisering
- Desinficera tången före uppsamling av huvudena genom att ta rena tångar och utföra sterilisering av torr värme i en ugn vid 200 °C i 1 h. Autoklavera alla glasvaror vid 121 °C i 15 minuter före användning.
- Utför allt beskrivet arbete inom ett mikrobiologi klass 2 skåp. Förbered alla reagenser enligt tillverkarens instruktioner.
2. Insamling av prover
- I slakteriet slaktades Swaledale-lamm genom bedövning med hjälp av elektricitet eller en pistol med fångenskap och exsanguinerades. Samla lammhuvuden högst 4 h efter slakt.
3. Förberedelse av huvudena
- Desinficera lammets pannparti genom att hälla cirka 100 ml 200 ppm klordioxidlösning på provområdet. Raka pannans sektion av huvudet med elektriska klippare och tvätta området med 200 ml 200 ppm klordioxidlösning.
- Torka av området med etanol och blå rulle och täck provområdet med hårborttagningskräm i 35 minuter. Skrapa försiktigt bort hårborttagningskrämen med ett skrapverktyg och bedöm provområdet. Om en betydande mängd hår kvarstår, upprepa hårborttagningsprocessen.
- Använd ytterligare 200 ml klordioxidlösning för att skölja området och skölj sedan med etanol och torka av med en blå rulle.
- Skär ut 8 mm hudprover från det beredda området med en steril 8 mm biopsistans. Ta bort proverna med sterila tångar och en skalpell med 15 blad, så att allt kutant fett avlägsnas.
- Placera proverna i en steril 0,5 L burk fylld med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och överför dem sedan till sterila 50 ml rör med 50 ml 200 ppm klordioxidlösning, invertera två gånger och låt sterilisera i 30 minuter.
- Ta bort proverna från klordioxidlösningen och tvätta dem genom att placera dem i ett 50 ml rör fyllt med 40 ml steril PBS. När du har tvättat, placera varje enskilt hudprov i en separat brunn på en 24-brunnsplatta.
- Tillsätt 350 μl förvärmt medium samtidigt som provet bibehålls vid luft-vätskegränssnittet. Mediets sammansättning är följande: MK-media (Medium 199 med Hanks salter, L-glutamat och 1,75 mg / ml natriumbikarbonat) och Hams F12 i förhållandet 1: 1, med tillsatt FBS (10% v / v), EGF (10 ng / ml), insulin (5 μg / ml), penicillin-streptomycin (100 U / ml) och amfotericin B (2,5 μg / ml).
- Försegla 24-brunnsplattorna med en gasgenomsläpplig platttätning och inkubera vid 37 °C i en fuktad 5% CO 2-vävnadsinkubator i upp till 24 timmar.
4. Underhåll av hudprover
- Efter inkubation, ta bort odlingsmediet och skölj proverna i 500 μl steril PBS. Tillsätt antibiotikafria medier till varje prov och inkubera vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-vävnadsinkubator i 24 timmar för att avlägsna kvarvarande antibiotika i provet.
- Om grumlighet eller svampinfektion utvecklas i det antibiotikafria mediet efter 24 timmar, kassera sedan provet.
5. Beredning av inokulatet
- Förbered ett 50 ml rör med 10 ml steril tryptisk sojabuljong. Ta en färsk agarplatta av S. aureus och använd en vattpinne för att överföra flera kolonier till buljongen. Inkubera i 18 timmar vid 37 °C vid 150 rpm.
- Centrifugera vid 4 000 x g i 3 minuter. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml steril PBS. Upprepa två gånger för att säkerställa tillräcklig tvättning av cellerna.
- Justera inokulatet till 0,6 OD600 i steril PBS. Bekräfta inokulumbelastningen genom att genomföra ett manuellt antal livskraftiga plattor.
6. Infektion av hudprover
- Förbered en ny 24-brunnsplatta med 400 μl förvärmda antibiotikafria medier och lägg i 24-brunnsinsatserna med sterila pincett.
- Ta bort mediet från hudproverna, tvätta med 500 μL steril PBS och ta bort tvätten. Använd sterila pincett för att försiktigt hålla provet i botten av brunnen.
- Använd en 4 mm stansbiopsi för att göra en central sårflik, genomträngande till ett grovt djup på 1-2 mm. Använd sedan en 15-bladig skalpell och sterila tandade allis-vävnadstångar för att ta bort det övre lagret av sårfliken. Variabilitet i sårdimensionerna kan påverka resultatet av infektionen och de slutpunktskolonibildande enheterna (CFU).
- När alla prover har sårats, överför dem till 24-brunnsinsatserna med sterila pincett. Pipettera 15 μL av bakterieinokulumet i sårbädden. Inkubera sedan i 24 timmar vid 37 °C i en fuktad 5% CO 2-vävnadsinkubator.
- Om längre inkubationsperioder är nödvändiga, ta bort mediet och ersätt det med färska medier var 24: e timme och inkubera under samma förhållanden.
7. Bestämning av bakteriebelastningen
- Ta bort media från botten av brunnarna. Med sterila pincett överför du varje prov till ett separat 50 ml rör fyllt med 1 ml sterilt PBS.
- Använd en finspetsad homogenisator för att homogenisera provets yta. Var noga med att se till att sårbädden är i direkt kontakt med homogenisatorns spets.
- Homogenisera varje prov i 35 s på medium/hög. Homogenisatorn lossar bakterierna från sårbäddens yta för att möjliggöra uppräkning av bakteriebelastningen.
- När alla prover har bearbetats, virvla varje prov, i tur och ordning, före pipettering. Detta för att säkerställa att bakteriehomogenatet blandas.
- Pipettera 20 μl virvlat homogenat till motsvarande brunn i en 96-brunnsplatta innehållande 180 μl steril PBS.
- Späd varje provhomogenat serie till 1 x 10−7 och pipettera 10 μl av det utspädda homogenatet på en tryptisk sojaagarplatta i tre exemplar.
- Inkubera agarplattan i 18 timmar vid 37 °C. Räkna sedan antalet kolonier för att bestämma CFU för varje prov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifieringen av en väg för att sterilisera huden innan man satte upp sårinfektionsmodellen var utmanande. Utmaningen låg i att sterilisera huden utan att skada de olika hudlagren, vilket sedan kan få oavsiktliga konsekvenser i resultatet av infektionen. För att identifiera en lämplig steriliseringsregim prövades olika behandlingar under olika lång tid, som beskrivs i tabell 1. Kontaminering registrerades som utveckling av grumlighet efter 48 timmar i MK-mediet som användes för att underhålla hudproverna. Vävnadsintegritet övervakades med histologi följt av färgning med hematoxylin och eosin (H&E) omedelbart efter behandling (figur 1). En 30 minuters behandling med klordioxid visade sig vara den mest effektiva för att reproducerbart sterilisera hudvävnaden samtidigt som vävnadens integritet bevarades.
I experimentuppställningen placeras den sårade sterila vävnaden i den apikala kammaren i en 24-brunnsinsats vid luft-vätskegränssnittet (figur 2A). Två olika sårtekniker försöktes - en klaffborttagningsteknik, där vävnaden såras av ett stansbiopsiverktyg och det övre lagret av den sårade vävnaden avlägsnas med en kombination av en 15-bladig skalpell och steril tandad allisvävnadstång, och en repteknik, där vävnaden skadas av ett stansbiopsiverktyg ensam. Även om repmodellen hade ett högre genomsnittligt antal CFUs efter 24 timmar, var resultaten varierande. Klaffborttagningstekniken gav mer konsekventa resultat (figur 2C). Efter 48 timmar återfanns cirka 100 gånger fler bakteriella CFUs från den sårade vävnaden jämfört med inokulum (figur 2D). Detta ansågs tyda på en lyckad infektion. En vit film i sårbädden syntes på vävnaden 48 timmar efter infektion (figur 2B). Gramfärgade histologisektioner av infekterad vävnad indikerade närvaron av S. aureus-celler i sårbädden (figur 2E,F). Gramfärgade histologisektioner av oinfekterad vävnad tillhandahålls som en komparator (figur 2G,H).
Från ett lammhuvud kan en 100 cm2 sektion (10 cm x 10 cm) nås realistiskt. Med tanke på att varje hudfläck stansas ut ur pannan med en cirkulär slagbiopsi med en diameter på 8 mm kan cirka 100 hudfläckar erhållas från ett lamms panna per vecka. Att skaffa ytterligare lammhuvuden ökar proportionellt antalet hudprover som kan erhållas per vecka. Därför hävdas det att förfarandet är relativt hög genomströmning. För denna studie erhölls 24 hudprover rutinmässigt per vecka. Hud från olika lammhuvuden bearbetades som biologiska replikat för att ta hänsyn till den potentiella givarens till givarens variation. Under beredningen av hudplåstren (steg 3.1-3.8) är den största tidsåtgången 30 minuters inkubation av hudproverna i klordioxidlösningen och 2 x 35 min väntan på hårborttagningskrämbehandlingen. Användningen av stansbiopsi för att generera de 24 hudplåstren tar cirka 15 minuter. Det är den här gången som skulle skala linjärt om antalet hudfläckar ökades.
| Desinfektionsmedel | 10 minuter | 30 minuter | 60 minuter |
| 1% desinfektionsmedel på hög nivå av medicinsk yta | F | P | P |
| 1% desinfektionsmedel för flera ändamål | F | F | P |
| 3% povidon | F | F | F |
| 5% povidon | F | P | P |
| 10% povidon | F | P | P |
| 70% etanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% hypoklorit | F | P | P |
| 200 ppm klordioxid | F | P | P |
Tabell 1: Sterilisering av färskt lammskinn. Varje hudprov lämnades i desinfektionsmedlet under den angivna tiden. F betecknar misslyckande med att sterilisera vävnaden, med bakteriell kontaminering närvarande i media. P betecknar passerande, utan bakteriell kontaminering närvarande i media.
Figur 1: Histologi av oinfekterad ex vivo fårhud behandlad med desinfektionsmedel (H&E-fläck) vid 100x förstoring. (A) Kontrollera hudprov med 30 minuters behandling i PBS. Viss epidermal shedding kan ses, men epidermis störs inte. (B) Fårhud behandlad med 1% högnivå medicinsk ytdesinfektionsmedel i 30 minuter. Epidermal shedding (svart pil) tillsammans med viss störning av stratum granulosum (blå pil). (C) Fårskinn behandlat med 5% povidon i 30 minuter. Måttlig skada på vävnaden kan ses här, med epidermal shedding av stratum corneum (svart pil). Det finns minimal störning i de underliggande epidermala skikten. (D) Fårskinn behandlat med 10% povidon i 30 minuter. De översta skikten av epidermis har skadats, med bevis på shedding (svart pil) och gallring (grön pil). (E) Fårskinn behandlat med 2% multifunktionellt desinfektionsmedel i 30 minuter. Allvarlig skada på provet kan observeras, med signifikant epidermal shedding (svart pil) och fullständig utrotning av stratum corneum (röd pil). (F) Fårskinn som behandlats i klordioxid på 200 ppm i 30 minuter. Viss epidermal shedding kan ses, men epidermis är intakt. (G) Fårskinn som behandlats med 0,6 % hypoklorit i 30 minuter. Allvarlig skada på epidermis är närvarande, med en hög nivå av epidermal shedding (svart pil) och utrotning av epidermis på platser (röd pil). (H) Fårskinn behandlat med 70 % etanol i 30 minuter. Skador på epidermis kan ses, med signifikant epidermal shedding (svart pil). Skalstrecket är 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Ex vivo fårhud infekterad med S. aureus. (A) Schematisk för experimentuppställningen. (B) Bilder av ex vivo fårhud före infektion (vänster bild) och efter 48 timmars infektion (höger bild). Observera den vita filmen som finns efter 48 timmars inkubation i infekterad vävnad, som saknas i oinfekterad vävnad. (C) Testa effekten av olika sårningsmetoder på den slutliga kolonibildande enheten (CFU) efter homogenisering. Klaffavlägsnande (n = 6) och repa (n = 9) infekterad med S. aureus i 24 timmar. Felstaplar indikerar standardavvikelse. anger ett p-värde < 0,0001. (D) Testa effekten av inkubationstider på CFU-antal efter homogenisering. 24 h inkubation (n = 6) och 48 h inkubation (n = 12). Felstaplar indikerar standardavvikelse. anger ett p-värde < 0,0001. (E,F) Representativa bilder av histopatologisk analys av infekterad fårhud efter 48 timmars infektion med en modifierad gramfläck (E) vid 100x förstoring (skalstreck på 200 μm). Rutan anger det förstorade området i (F) vid 1 000x förstoring (skalstreck på 50 μm). Svarta pilar indikerar bakterier. (G,H) Representativa bilder av histopatologisk analys av oinfekterad fårhud efter en 48-timmarsperiod (kontroll) med en modifierad gGram-fläck (G) vid 100x förstoring (skalstreck på 200 μm). Rutan anger det förstorade området i (H) vid 1 000x förstoring (skalstreck på 50 μm). Statistisk analys utfördes som en enkelriktad ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvecklingen av antimikrobiella medel är en viktig men dyr satsning som beräknas kosta cirka 1 miljard dollar och ta cirka 15 år att slutföra. Över 90% av antimikrobiella läkemedelsupptäckter och prekliniska studier av antimikrobiell läkemedelseffekt utförs av akademiska forskare och små till medelstora företag med vanligtvis mindre än 50 anställda22. Dessa team är mycket ekonomiskt begränsade, vilket gör misslyckandet med blymolekyler i senare skeden av translationell forskning katastrofalt. Ökningen av antimikrobiell resistens går snabbare än utvecklingen av nya antimikrobiella medel, vilket ytterligare ökar behovet av att förvalta de redan begränsade investeringarna i antimikrobiell forskning på ett ansvarsfullt sätt23.
Skillnaden i bakteriell fysiologi mellan infektioner in vivo och in vitro-laboratoriekulturer tenderar att orsaka en överskattning av träffarnas antimikrobiella effekt under blyidentifieringsstadiet. En sådan överskattning bidrar till de höga utmattningsfrekvenser som ses under de efterföljande stadierna av översättningen. Tillgången till in vitro-plattformar för testning av antimikrobiell effekt som innehåller bakterier med en fysiologi som bättre efterliknar den som hittades vid infektioner in vivo kommer att möjliggöra en mer exakt uppskattning av antimikrobiell effekt och ge forskare större kontroll över blyoptimering utan att förlita sig på dyra och hårt reglerade djurförsök. Sådana modeller kommer också att minska utmattningsgraden under de efterföljande stadierna av översättning och kan göra upptäckt av antimikrobiella läkemedel mer attraktivt för investeringar.
Denna modell för infektion med fårhud som beskrivs här är ett användbart verktyg som kommer att ge forskare en fysiologiskt relevant in vitro-modell av ett infekterat sår för att testa effekten av nya topikala antimikrobiella formuleringar i prekliniska stadier. I motsats till majoriteten av ex vivo-infektionsmodellerna som beskrivs i den vetenskapliga litteraturen 10,15,24,25,26,27,28, i denna modell, kompletteras inte patogenerna som exponeras för ex vivo-vävnaden med odlingsmedier under infektion. Patogenproliferation och efterföljande infektion är beroende av organismens förmåga att skada vävnaden. Därför är patogenfysiologin i denna modell närmare besläktad med den under in vivo-infektioner jämfört med konventionella mikrobiologiska kulturer. En mycket reproducerbar infektion erhålls från denna modell, vilket bedöms av antalet CFU: er som hämtas från vävnaden efter inkubation.
Med överflödet av mänskliga hudekvivalenter och ex vivo-sårmodeller för människor och svin kan användningen av fårvävnad i denna modell ytligt hävdas vara en begränsning. Får hör dock till den grupp stora djur som används som modeller av infektioner in vivo 29,30,31. Dessutom har får använts som surrogater för människor i immunologiforskning och vaccinutveckling, vilket indikerar att deras immunsvar liknar människors32. Vävnadsreparationsprocessen under sårläkning är liknande hos stora däggdjur, inklusive får och människor33,34, och interventioner för att förbättra sårläkning som framgångsrikt har visats hos får har föreslagits för översättning till människor35,36,37. Därför är användningen av ex vivo fårhud i denna sårmodell inte en begränsning. Dessutom kan denna fårmodell bedömas vara ett tillförlitligt alternativ till modeller som innehåller mänsklig eller svinhud av följande skäl. Tillgången på mänsklig hud är begränsad och av varierande kvalitet när den är tillgänglig38. Vävnadskonstruerad human epidermis och levande hudekvivalenter kräver förbättringar i sina odlingsförhållanden för att säkerställa reproducerbarhet i vävnadsfysiologi39. Även om svinhud är mer tillgänglig än mänsklig hud, skållas den allmänt tillgängliga svinhuden som en del av slaktkroppsbearbetningen i slakteriet, vilket tar bort epidermis10. Av erfarenhet är oskalad svinhud mindre lättillgänglig från slakterier.
Under hela protokollet som beskrivs här finns det kritiska steg som säkerställer modellens framgång. Det mest kritiska steget innebär sterilisering av vävnaden efter skörd. Klordioxidlösning måste blandas med vävnadsproverna och en kontakttid på 30 minuter måste tillåtas för att desinficera vävnaden tillräckligt och avlägsna föroreningar. När du ställer in detta experiment kan grumlighet eller svampförorening uppstå på grund av felaktig hantering eller ineffektiv behandling med desinfektionsmedel och antibiotika. I ett sådant fall måste prover som utvecklar grumlighet kasseras. För att minska utvecklingen av grumlighet och förorening bör laboratoriemiljön hållas ren, med frekvent sterilisering av inkubatorn, användning av filterspetsar och säkerställande av fullständig sterilisering av verktygen och behållarna som används med proverna. Ett annat kritiskt steg i protokollet är när 4 mm biopsistansen används för att såra vävnaden. Användningen av detta verktyg möjliggör sårbäddar av samma storlek för att säkerställa protokollets repeterbarhet och reproducerbarhet. Variabilitet i sårbäddens storlek påverkar slutpunkten CFU. När det finns adekvat avlägsnande av vävnadsfliken är resultaten mycket mer konsekventa. Ett ytterligare kritiskt steg associerat med integriteten hos slutpunktens CFU-antal är användningen av den finspetsade homogenisatorn för att frigöra bakterieceller. Homogenisatorspetsens position sågs ha en inverkan på CFU-antalet från prov till prov; När spetsen var korrekt placerad direkt på sårbädden sågs det mycket mindre variation från prov till prov.
Ändå är den modell som föreslås här inte utan begränsningar. Denna modell har begränsningar som är inneboende för alla ex vivo-studier (dvs. bristen på aktivt vaskulärt flöde, frånvaron av kommensal mikrobiota, som kan modulera infektionsförloppet och frånvaron av immunceller). Det kan hävdas att eftersom ex vivo-sårmodellen inte innehåller aktiva immunceller, kan infektionsprogressionen in vivo i närvaro av dessa celler skilja sig från den som observerats i ex vivo-modeller. Oavsett ger ex vivo-modeller en vävnadsyta för fastsättning och en näringskälla för bakterier och presenterar en 3D-diffusionsbarriär mot formuleringar, vilket möjliggör en mer exakt bedömning av antimikrobiell effekt än konventionella mikrobiologiska odlingstekniker.
En viktig fördel med modellen är att vävnaden kommer från lamm som odlas som livsmedel. Mer specifikt återanvänder modellen hud från lammhuvuden, som vanligtvis kasseras. Dessutom har modellen hög genomströmning och möjliggör kostnadseffektiva, snabba och reproducerbara jämförande studier. Det kan hävdas att tillgången till denna modell kommer att minska och förfina behovet av djur som är avsedda för translationell forskning i linje med principerna i de tre R: erna, som underlättar mer humana forskningsmetoder. Även om modellen som beskrivs här innehåller S. aureus som exempelpatogen, kan modellen användas med andra mikroorganismer inklusive andra bakterier, svampar och virus, vilket breddar omfattningen av läkemedelsutveckling som modellen möjliggör. Man kan tänka sig att användningen av denna modell kommer att möjliggöra snabb översättning av välbehövliga antibiotika för hudinfektioner genom att ge forskare större kontroll över läkemedelsdesign och formulering i de prekliniska stadierna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Författarna vill tacka EPSRC (EP/R513313/1) för finansieringen. Författarna vill också tacka R.B Elliot och Son Abattoir i Calow, Chesterfield, för att ha tillhandahållit lammhuvuden och för att vara så tillmötesgående i de tidiga stadierna av projektet, Kasia Emery för hennes stöd under hela utvecklingen av detta protokoll och Fiona Wright från institutionen för infektion, immunitet och hjärt-kärlsjukdom vid University of Sheffield för att ha bearbetat histologiproverna och varit så otroligt hjälpsamma under hela detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al.
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, Supplement 4 (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , Springer. New York, NY. 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
