Summary
El protocolo describe un método paso a paso para establecer un modelo de piel herida ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus. Este modelo de alto rendimiento simula mejor las infecciones in vivo en comparación con las técnicas microbiológicas convencionales y presenta a los investigadores una plataforma fisiológicamente relevante para probar la eficacia de los antimicrobianos emergentes.
Abstract
El desarrollo de antimicrobianos es un proceso costoso con tasas de éxito cada vez más bajas, lo que hace que una mayor inversión en la investigación de descubrimiento de antimicrobianos sea menos atractiva. El descubrimiento de fármacos antimicrobianos y su posterior comercialización pueden ser más lucrativos si se puede implementar un enfoque de fallar rápido y fallar barato dentro de las etapas de optimización de plomo donde los investigadores tienen un mayor control sobre el diseño y la formulación de medicamentos. En este artículo, se describe la configuración de un modelo de piel herida ovina ex vivo infectado con Staphylococcus aureus, que es simple, rentable, de alto rendimiento y reproducible. La fisiología bacteriana en el modelo imita que durante la infección la proliferación bacteriana depende de la capacidad del patógeno para dañar el tejido. El establecimiento de la infección de la herida se verifica mediante un aumento en los recuentos bacterianos viables en comparación con el inóculo. Este modelo se puede utilizar como plataforma para probar la eficacia de los antimicrobianos emergentes en la etapa de optimización de plomo. Se puede afirmar que la disponibilidad de este modelo proporcionará a los investigadores que desarrollan antimicrobianos un modelo de falla rápida y barata de falla, lo que ayudará a aumentar las tasas de éxito en ensayos posteriores con animales. El modelo también facilitará la reducción y el refinamiento del uso de animales para la investigación y, en última instancia, permitirá una traducción más rápida y rentable de nuevos antimicrobianos para infecciones de piel y tejidos blandos a la clínica.
Introduction
Las infecciones de la piel son un problema global importante, con grandes costos económicos para los proveedores de atención médica de todo el mundo. El desarrollo de resistencia a múltiples fármacos y la formación de biopelículas por patógenos juega un papel clave en la prevalencia de heridas que no cicatrizan 1,2,3,4. Como resultado de esto, las infecciones de la piel y los tejidos blandos son una de las razones más comunes para la hospitalización prolongada y el posterior reingreso5. Los retrasos en la cicatrización de heridas son costosos tanto para el paciente como para los proveedores de atención médica, y algunas estimaciones sugieren que alrededor de 6.5 millones de pacientes se ven afectados anualmente en los Estados Unidos. En el Reino Unido, las infecciones de la piel y las complicaciones asociadas resultan en aproximadamente 75,000 muertes anuales 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un formidable patógeno de heridas frecuentemente aislado de heridas de pacientes 2,7. La tasa de aparición de resistencia a múltiples fármacos aumentó drásticamente en la década de 2000. Durante este tiempo, alrededor del 60% de las infecciones bacterianas agudas de la piel y la estructura de la piel fueron positivas para S. aureus resistente a la meticilina 1. El creciente número de cepas resistentes a múltiples fármacos entre Staphylococci, y de hecho otros patógenos, en las últimas 2 décadas indica una necesidad urgente para el rápido desarrollo de antibióticos con nuevos modos de acción que puedan superar la resistencia.
Sin embargo, desde principios de la década de 2000, los programas de descubrimiento de antibióticos han estado dominados por tiempos de desarrollo más largos y bajas tasas de éxito, con solo el 17% de los nuevos antibióticos ingresando a ensayos clínicos en los Estados Unidos logrando la aprobación del mercado8. Esto sugiere una disparidad entre los resultados de las pruebas in vitro de antibióticos emergentes y sus resultados clínicos. Se puede afirmar que esta disparidad se debe en gran medida a las diferencias en la fisiología bacteriana durante las infecciones in vivo y durante los métodos microbiológicos convencionales al probar la eficacia de los antibióticos en las etapas preclínicas in vitro . Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos de laboratorio que sean más representativos de la fisiología bacteriana durante la infección para mejorar las tasas de éxito en los programas de descubrimiento de antibióticos.
Los métodos actuales para estudiar infecciones de la piel incluyen estudios en animales vivos (por ejemplo, ratones), modelos de piel ex vivo (por ejemplo, porcinos) y modelos de piel de ingeniería tisular 3D (por ejemplo, humanos)9,10,11,12. Los estudios en animales vivos están estrictamente regulados y tienen un rendimiento relativamente bajo. En modelos animales, las heridas y la infección causan angustia significativa a los animales y plantean preocupaciones éticas. Los modelos de piel humana, ex vivo o diseñados con tejidos, requieren aprobación ética, cumplimiento de la legislación local y mundial (la Ley de Tejidos Humanos, la Declaración de Helsinki), y hay dificultades para adquirir tejidos, con algunas solicitudes que tardan años en cumplirse13,14. Ambos tipos de modelos requieren mucha mano de obra y una experiencia significativa para garantizar el éxito experimental. Algunos modelos actuales de infección cutánea ex vivo requieren discos preinoculados y aditivos para el lecho de la herida para permitir la infección; Aunque estos modelos son increíblemente útiles, existen limitaciones en el proceso de infección ya que los aditivos limitan la utilización del lecho de la herida como fuente de nutrientes10,15,16,17. El modelo descrito en este estudio no utiliza aditivos para el lecho de la herida, lo que garantiza que la patología de la infección y los recuentos celulares viables sean el resultado de la utilización directa del lecho de la herida como única fuente de nutrientes.
Dada la necesidad de nuevos métodos de laboratorio, se ha desarrollado un nuevo modelo ovino ex vivo de alto rendimiento de infecciones de la piel para su uso en la evaluación de la eficacia de los antibióticos emergentes. Los estudios de infección de la piel enfrentan muchos desafíos: altos costos, preocupaciones éticas y modelos que no muestran una imagen completa20,21. Los modelos ex vivo y los modelos de explante 3D permiten una mejor visualización del proceso de la enfermedad y el impacto que los tratamientos pueden tener a partir de un modelo clínicamente más relevante. Aquí, se describe la configuración de un nuevo modelo de piel ovina, que es simple, reproducible y clínicamente relevante y tiene un alto rendimiento. La piel ovina fue elegida ya que las ovejas son uno de los grandes mamíferos comúnmente utilizados para modelar las respuestas a las infecciones in vivo. Además, están fácilmente disponibles en los mataderos, lo que garantiza un suministro constante de piel para la investigación, y sus canales no se escaldan, lo que garantiza una buena calidad del tejido. Este estudio utilizó S. aureus como patógeno ejemplar; Sin embargo, el modelo funciona bien con otros microorganismos.
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Protocol
Las cabezas de cordero del matadero R.B Elliott and Son se utilizaron como fuente de muestras de piel en este proyecto. Todos los corderos fueron sacrificados para su consumo como alimento. En lugar de descartar las cabezas, estas fueron reutilizadas para la investigación. No se requirió aprobación ética ya que el tejido se obtuvo de desechos desechados de mataderos.
1. Esterilización
- Desinfectar las pinzas antes de recoger los cabezales tomando pinzas limpias y realizando la esterilización por calor seco en un horno a 200 °C durante 1 h. Autoclave toda la cristalería a 121 °C durante 15 min antes de su uso.
- Llevar a cabo todo el trabajo descrito dentro de un gabinete de microbiología clase 2. Prepare todos los reactivos según las instrucciones del fabricante.
2. Recogida de muestras
- En el matadero, los corderos Swaledale eran sacrificados aturdiendo, usando electricidad o una pistola de cerrojo cautivo, y se desangraban. Recoger las cabezas de cordero no más de 4 h después del sacrificio.
3. Preparación de los cabezales
- Desinfecte la sección de la frente del cordero vertiendo aproximadamente 100 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm en el área de la muestra. Afeite la sección de la frente del cabezal con cortapelos eléctricos y lave el área con 200 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm.
- Limpie el área con etanol y rollo azul y cubra el área de muestra con crema depilatoria durante 35 minutos. Raspa suavemente la crema depilatoria con una herramienta de raspado y evalúa el área de la muestra. Si queda una cantidad significativa de vello, repita el proceso de depilación.
- Use otros 200 ml de solución de dióxido de cloro para enjuagar el área, y luego enjuague con etanol y limpie con un rollo azul.
- Con un punzón de biopsia estéril de 8 mm, extraiga muestras de piel de 8 mm del área preparada. Retire las muestras con fórceps estériles y un bisturí de 15 hojas, asegurándose de que se elimine toda la grasa cutánea.
- Coloque las muestras en un frasco estéril de 0,5 L lleno de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y luego transfiéralas a tubos estériles de 50 ml con 50 ml de solución de dióxido de cloro de 200 ppm, invierta dos veces y deje esterilizar durante 30 minutos.
- Retire las muestras de la solución de dióxido de cloro y lávelas colocándolas en un tubo de 50 ml lleno de 40 ml de PBS estéril. Una vez lavada, coloque cada muestra de piel individual en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos.
- Añadir 350 μL de medio precalentado manteniendo la muestra en la interfaz aire-líquido. La composición de los medios es la siguiente: medios MK (Medio 199 con sales de Hanks, L-glutamato y 1,75 mg/ml de bicarbonato de sodio) y F12 de Ham en una proporción de 1:1, con FBS añadido (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicilina-estreptomicina (100 U/mL) y anfotericina B (2,5 μg/mL).
- Selle las placas de 24 pocillos con un sello de placa permeable al gas e incube a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada al 5% deCO2 durante un máximo de 24 h.
4. Mantenimiento de muestras de piel
- Después de la incubación, retirar el medio de cultivo y enjuagar las muestras en 500 μL de PBS estéril. Añadir medios libres de antibióticos a cada muestra e incubar a 37 °C en una incubadora de tejido humidificada al 5% deCO2 durante 24 h para eliminar los antibióticos residuales de la muestra.
- Si se desarrolla turbidez o infección fúngica en los medios libres de antibióticos después de 24 h, deseche la muestra.
5. Preparación del inóculo
- Prepare un tubo de 50 ml con 10 ml de caldo de soja tríptico estéril. Tome una placa de agar fresco de S. aureus y use un hisopo para transferir varias colonias al caldo. Incubar durante 18 h a 37 °C a 150 rpm.
- Centrifugadora a 4.000 x g durante 3 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de PBS estéril. Repita dos veces para asegurar un lavado adecuado de las celdas.
- Ajustar el inóculo a 0,6 OD600 en PBS estéril. Confirme la carga de inóculo realizando un recuento manual viable de placas.
6. Infección de muestras de piel
- Prepare una placa fresca de 24 pocillos con 400 μL de medios libres de antibióticos precalentados y agregue los insertos de 24 pocillos utilizando pinzas estériles.
- Retire el medio de las muestras de piel, lave con 500 μL de PBS estéril y retire el lavado. Use fórceps estériles para sostener suavemente la muestra en el fondo del pozo.
- Use una biopsia por punción de 4 mm para hacer un colgajo central de la herida, perforando hasta una profundidad aproximada de 1-2 mm. Luego, use un bisturí de 15 hojas y pinzas de tejido allis dentadas estériles para eliminar la capa superior del colgajo de la herida. La variabilidad en las dimensiones de la herida puede afectar el resultado de la infección y las unidades formadoras de colonias de punto final (UFC).
- Una vez que todas las muestras hayan sido heridas, transfiéralas a los insertos de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Pipetear 15 μL del inóculo bacteriano en el lecho de la herida. A continuación, incubar durante 24 h a 37 °C en una incubadora de tejidos humidificada al 5% deCO2 .
- Si son necesarios períodos de incubación más largos, retire el medio y reemplácelo con medios nuevos cada 24 h e incube en las mismas condiciones.
7. Determinación de la carga bacteriana
- Retire los medios del fondo de los pozos. Con pinzas estériles, transfiera cada muestra a un tubo separado de 50 ml lleno de 1 ml de PBS estéril.
- Utilice un homogeneizador de punta fina para homogeneizar la superficie de la muestra. Tenga cuidado de asegurarse de que el lecho de la herida esté en contacto directo con la punta del homogeneizador.
- Homogeneizar cada muestra durante 35 s a medio/alto. El homogeneizador separa las bacterias de la superficie del lecho de la herida para permitir la enumeración de la carga bacteriana.
- Una vez procesadas todas las muestras, vortex cada muestra, a su vez, antes del pipeteo. Esto es para asegurar que el homogeneizado bacteriano se mezcle.
- Pipetear 20 μL de homogeneizado de vórtice en el pocillo correspondiente de una placa de 96 pocillos que contenga 180 μL de PBS estéril.
- Diluir en serie cada homogeneizado de muestra a 1 x 10−7 y pipetear 10 μL del homogeneizado diluido en una placa tríptica de agar de soja por triplicado.
- Incubar la placa de agar durante 18 h a 37 °C. Luego, cuente el número de colonias para determinar la UFC para cada muestra.
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Representative Results
La identificación de una ruta para esterilizar la piel antes de establecer el modelo de infección de la herida fue un desafío. El desafío consistía en esterilizar la piel sin dañar las diferentes capas de la piel, lo que puede tener consecuencias no deseadas en el resultado de la infección. Para identificar un régimen de esterilización apropiado, se probaron diferentes tratamientos durante diferentes períodos de tiempo, como se describe en la Tabla 1. La contaminación se registró como el desarrollo de turbidez después de 48 h en el medio MK utilizado para mantener las muestras de piel. La integridad del tejido se monitorizó mediante histología seguida de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) inmediatamente después del tratamiento (Figura 1). Un tratamiento de 30 minutos con dióxido de cloro demostró ser el más eficaz para esterilizar de forma reproducible el tejido de la piel preservando la integridad del tejido.
En la configuración experimental, el tejido estéril herido se coloca en la cámara apical de un inserto de 24 pocillos en la interfaz aire-líquido (Figura 2A). Se intentaron dos técnicas diferentes de heridas: una técnica de extracción de colgajo, en la que el tejido se lesiona con una herramienta de biopsia por punción y la capa superior del tejido herido se extrae utilizando una combinación de un bisturí de 15 hojas y pinzas de tejido allis dentado estéril, y una técnica de rasguño, en la que el tejido se lesiona solo con una herramienta de biopsia por punción. Aunque el modelo scratch albergaba un mayor número promedio de UFC después de 24 h, los resultados fueron variables. La técnica de extracción del colgajo produjo resultados más consistentes (Figura 2C). Después de 48 h, se recuperaron aproximadamente 100 veces más UFC bacterianas del tejido herido en comparación con el inóculo (Figura 2D). Se consideró que esto indicaba una infección exitosa. Una película blanca en el lecho de la herida fue evidente en el tejido 48 h después de la infección (Figura 2B). Las secciones histológicas teñidas de Gram del tejido infectado indicaron la presencia de células de S. aureus en el lecho de la herida (Figura 2E, F). Las secciones histológicas teñidas de Gram de tejido no infectado se proporcionan como comparador (Figura 2G, H).
Desde la cabeza de un cordero, se puede acceder de manera realista a una sección de 100 cm2 (10 cm x 10 cm). Dado que cada parche de piel se perfora de la frente mediante una biopsia circular de 8 mm de diámetro, se pueden obtener aproximadamente 100 parches cutáneos de la frente de un cordero por semana. La obtención de más cabezas de cordero aumenta proporcionalmente el número de muestras de piel que se pueden obtener por semana. Por lo tanto, se afirma que el procedimiento tiene un rendimiento relativamente alto. Para este estudio, se obtuvieron 24 muestras de piel de forma rutinaria por semana. La piel de varias cabezas de cordero se procesó como réplicas biológicas para tener en cuenta la posible variabilidad de donante a donante. Durante la preparación de los parches cutáneos (pasos 3.1-3.8), el mayor consumo de tiempo es la incubación de 30 minutos de las muestras de piel en la solución de dióxido de cloro y la espera de 2 x 35 minutos para el tratamiento con crema depilatoria. El uso de la biopsia por punción para generar los 24 parches cutáneos tarda unos 15 minutos. Es este tiempo el que escalaría linealmente si se aumentara el número de parches cutáneos.
| Desinfectante | 10 minutos | 30 minutos | 60 minutos |
| 1% desinfectante de superficies médicas de alto nivel | F | P | P |
| 1% desinfectante multiusos | F | F | P |
| 3% povidona | F | F | F |
| 5% povidona | F | P | P |
| 10% povidona | F | P | P |
| 70% etanol | F | P | P |
| UV | F | F | F |
| 0,55% de hipoclorito | F | P | P |
| 200 ppm de dióxido de cloro | F | P | P |
Tabla 1: Esterilización de piel fresca de cordero. Cada muestra de piel se dejó en el desinfectante durante el tiempo especificado. F denota falta de esterilización del tejido, con contaminación bacteriana presente en los medios. P denota paso, sin contaminación bacteriana presente en los medios.
Figura 1: Histología de la piel ovina no infectada ex vivo tratada con desinfectantes (tinción H&E) a un aumento de 100x. (A) Muestra de piel de control con tratamiento de 30 min en PBS. Se puede ver algo de desprendimiento epidérmico, pero la epidermis no se interrumpe. (B) Piel ovina tratada con desinfectante médico de superficies de alto nivel al 1% durante 30 min. Desprendimiento epidérmico (flecha negra) junto con alguna interrupción del estrato granuloso (flecha azul). (C) Piel ovina tratada con povidona al 5% durante 30 min. Aquí se puede ver un daño moderado al tejido, con desprendimiento epidérmico del estrato córneo (flecha negra). Hay una interrupción mínima de las capas epidérmicas subyacentes. (D) Piel ovina tratada con povidona al 10% durante 30 min. Las capas superiores de la epidermis han sido dañadas, con evidencia de desprendimiento (flecha negra) y adelgazamiento (flecha verde). (E) Piel ovina tratada con desinfectante multiusos al 2% durante 30 min. Se puede observar un daño severo en la muestra, con un desprendimiento epidérmico significativo (flecha negra) y la erradicación completa del estrato córneo (flecha roja). (F) Piel ovina tratada en 200 ppm de dióxido de cloro durante 30 min. Se puede ver algo de desprendimiento epidérmico, pero la epidermis está intacta. (G) Piel ovina tratada con hipoclorito al 0,6% durante 30 min. El daño severo a la epidermis está presente, con un alto nivel de desprendimiento epidérmico (flecha negra) y erradicación de la epidermis en algunos lugares (flecha roja). (H) Piel ovina tratada con etanol al 70% durante 30 min. Se puede observar daño a la epidermis, con desprendimiento epidérmico significativo (flecha negra). La barra de escala es de 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Piel ovina ex vivo infectada por S. aureus. (A) Esquema de la configuración experimental. (B) Imágenes de piel ovina ex vivo antes de la infección (imagen izquierda) y después de la infección de 48 h (imagen derecha). Tenga en cuenta la película blanca presente después de 48 h de incubación en el tejido infectado, que está ausente en el tejido no infectado. (C) Probar el efecto de diferentes métodos de herida en el recuento final de unidades formadoras de colonias (UFC) después de la homogeneización. Extracción del colgajo (n = 6) y rasguño (n = 9) infectado con S. aureus durante 24 h. Las barras de error indican la desviación estándar. indica un valor p < 0,0001. (D) Probar el efecto de los tiempos de incubación en los recuentos de UFC después de la homogeneización. Incubación de 24 h (n = 6) e incubación de 48 h (n = 12). Las barras de error indican la desviación estándar. indica un valor p < 0,0001. (E,F) Imágenes representativas del análisis histopatológico de la piel ovina infectada después de la infección de 48 h con una tinción de Gram modificada (E) con un aumento de 100x (barra de escala de 200 μm). El recuadro indica el área ampliada en (F) con un aumento de 1.000x (barra de escala de 50 μm). Las flechas negras indican bacterias. (G,H) Imágenes representativas del análisis histopatológico de piel ovina no infectada después de un período de 48 h (control) con una tinción de gGram modificada (G) con un aumento de 100x (barra de escala de 200 μm). El recuadro indica el área ampliada en (H) con un aumento de 1.000x (barra de escala de 50 μm). El análisis estadístico se llevó a cabo como un ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El desarrollo de antimicrobianos es una empresa importante pero costosa que se estima que costará alrededor de $ 1 mil millones y tardará alrededor de 15 años en completarse. Más del 90% del descubrimiento de fármacos antimicrobianos y los estudios preclínicos de eficacia de fármacos antimicrobianos son llevados a cabo por investigadores académicos y pequeñas y medianas empresas con menos de 50 empleados22. Estos equipos están muy limitados financieramente, lo que hace que el fracaso de las moléculas de plomo en etapas posteriores de la investigación traslacional sea calamitoso. El aumento de la resistencia a los antimicrobianos está superando el desarrollo de nuevos antimicrobianos, lo que intensifica aún más la necesidad de administrar de manera responsable la ya limitada inversión en investigación antimicrobiana23.
La disparidad en la fisiología bacteriana entre las infecciones en cultivos de laboratorio in vivo e in vitro tiende a causar una sobreestimación de la eficacia antimicrobiana de los golpes durante la etapa de identificación del plomo. Esta sobreestimación contribuye a las altas tasas de deserción observadas durante las etapas posteriores de la traducción. La disponibilidad de plataformas de pruebas de eficacia antimicrobiana in vitro que incorporan bacterias con una fisiología que imita mejor la encontrada durante las infecciones in vivo permitirá una estimación más precisa de la eficacia antimicrobiana y proporcionará a los investigadores un mayor control de la optimización del plomo sin depender de ensayos en animales costosos y estrictamente regulados. Estos modelos también disminuirán las tasas de deserción durante las etapas posteriores de la traducción y pueden hacer que el descubrimiento de fármacos antimicrobianos sea más atractivo para la inversión.
Este modelo de infección de la piel ovina descrito aquí es una herramienta útil que proporcionará a los investigadores un modelo in vitro fisiológicamente relevante de una herida infectada para probar la eficacia de las formulaciones antimicrobianas tópicas emergentes en las etapas preclínicas. En contraste con la mayoría de los modelos de infección ex vivo descritos en la literatura científica 10,15,24,25,26,27,28, en este modelo, los patógenos expuestos al tejido ex vivo no se complementan con medios de cultivo durante la infección. La proliferación de patógenos y la infección posterior dependen de la capacidad del organismo para dañar el tejido. Por lo tanto, la fisiología del patógeno en este modelo está más estrechamente relacionada con la de las infecciones in vivo en comparación con los cultivos microbiológicos convencionales. A partir de este modelo se obtiene una infección altamente reproducible, a juzgar por el número de UFC recuperadas del tejido después de la incubación.
Con la plétora de equivalentes de piel humana y modelos de heridas ex vivo humanas y porcinas, el uso de tejido ovino en este modelo podría argumentarse superficialmente como una limitación. Sin embargo, las ovejas se encuentran entre el grupo de animales grandes utilizados como modelos de infecciones in vivo 29,30,31. Además, las ovejas han sido utilizadas como sustitutos de los seres humanos en la investigación de inmunología y el desarrollo de vacunas, lo que indica que sus respuestas inmunes son similares a las de los seres humanos32. El proceso de reparación de tejidos durante la cicatrización de heridas es similar en mamíferos grandes, incluyendo ovejas y humanos33,34, y las intervenciones para mejorar la cicatrización de heridas que se han demostrado con éxito en ovejas se han sugerido para su traducción a humanos35,36,37. Por lo tanto, el uso de piel ovina ex vivo en este modelo de herida no es una limitación. Además, este modelo ovino puede considerarse una alternativa fiable a los modelos que incorporan piel humana o porcina por las siguientes razones. La disponibilidad de piel humana es limitada y de calidad variable cuando se dispone deella 38. La epidermis humana diseñada con tejidos y los equivalentes de piel viva requieren refinamientos en sus condiciones de cultivo para garantizar la reproducibilidad en la fisiología tisular39. Aunque la piel porcina es más accesible que la piel humana, la piel porcina ampliamente disponible se escalda como parte del procesamiento de la canal en el matadero, que elimina la epidermis10. Por experiencia, la piel porcina sin escaldar está menos disponible en los mataderos.
A lo largo del protocolo descrito aquí, hay pasos críticos que aseguran el éxito del modelo. El paso más crítico implica la esterilización del tejido después de la recolección. La solución de dióxido de cloro debe mezclarse con las muestras de tejido, y se debe permitir un tiempo de contacto de 30 minutos para desinfectar suficientemente el tejido y eliminar los contaminantes. Además, al configurar este experimento, puede producirse turbidez o contaminación por hongos debido a un manejo inadecuado o un tratamiento ineficaz con desinfectantes y medios antibióticos. En tal caso, las muestras que desarrollan turbidez deben descartarse. Para reducir el desarrollo de turbidez y contaminación, el entorno del laboratorio debe mantenerse limpio, con esterilización frecuente de la incubadora, el uso de puntas de filtro y asegurando la esterilización completa de las herramientas y recipientes utilizados con las muestras. Otro paso crítico en el protocolo es cuando se utiliza el punzón de biopsia de 4 mm para herir el tejido. El uso de esta herramienta permite lechos de heridas de tamaño similar para garantizar la repetibilidad y reproducibilidad del protocolo. La variabilidad en el tamaño del lecho de la herida afecta la UFC del punto final. Cuando hay una extracción adecuada del colgajo de tejido, los resultados son mucho más consistentes. Otro paso crítico asociado con la integridad del recuento de UFC de punto final es el uso del homogeneizador de punta fina para liberar células bacterianas. Se observó que la posición de la punta del homogeneizador tenía un impacto en el recuento de UFC de muestra a muestra; Cuando la punta se colocó correctamente directamente sobre el lecho de la herida, se observó mucha menos variabilidad de una muestra a otra.
Sin embargo, el modelo propuesto aquí no está exento de limitaciones. Este modelo tiene limitaciones inherentes a todos los estudios ex vivo (es decir, la falta de flujo vascular activo, la ausencia de microbiota comensal, que puede modular el progreso de la infección, y la ausencia de células inmunes). Se puede argumentar que, dado que el modelo de herida ex vivo no incorpora células inmunes activas, la progresión de la infección in vivo en presencia de estas células podría ser diferente de la observada en modelos ex vivo. En cualquier caso, los modelos ex vivo proporcionan una superficie de tejido para la fijación y una fuente de nutrientes para las bacterias y presentan una barrera de difusión 3D para las formulaciones, lo que permite una evaluación más precisa de la eficacia antimicrobiana que las técnicas convencionales de cultivo microbiológico.
Una ventaja clave del modelo es que el tejido proviene de corderos que se cultivan para el consumo humano. Más particularmente, el modelo reutiliza la piel de las cabezas de cordero, que generalmente se descartan. Además, el modelo tiene un alto rendimiento y permite estudios comparativos rentables, rápidos y reproducibles. Se puede afirmar que la disponibilidad de este modelo reducirá y refinará la necesidad de animales criados específicamente para la investigación traslacional en línea con los principios de las tres R, que facilitan prácticas de investigación más humanas. Aunque el modelo descrito aquí incorpora S. aureus como el patógeno ejemplar, el modelo se puede utilizar con otros microorganismos, incluidas otras bacterias, hongos y virus, ampliando así el alcance del desarrollo de fármacos que el modelo permite. Se puede prever que el uso de este modelo permitirá la traducción rápida de antibióticos muy necesarios para las infecciones de la piel al proporcionar a los investigadores un mayor control sobre el diseño y la formulación de medicamentos en las etapas preclínicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a EPSRC (EP/R513313/1) por su financiación. Los autores también desean agradecer a R.B Elliot and Son Abattoir en Calow, Chesterfield, por proporcionar cabezas de cordero y por ser tan complacientes en las primeras etapas del proyecto, Kasia Emery por su apoyo durante el desarrollo de este protocolo, y Fiona Wright del Departamento de Infección, Inmunidad y Enfermedades Cardiovasculares de la Universidad de Sheffield por procesar las muestras histológicas y ser tan increíblemente útil durante este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
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