Summary
Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Herstellung von Nukleosomalkomplexen unter Verwendung von zwei Methoden der Probenvorbereitung zum Einfrieren von TEM-Gittern.
Abstract
Die DNA-Reparatur im Zusammenhang mit Chromatin ist kaum verstanden. Biochemische Studien mit Nukleosomenkernpartikeln, der grundlegenden Wiederholungseinheit des Chromatins, zeigen, dass die meisten DNA-Reparaturenzyme DNA-Schäden im Vergleich zu freier DNA mit reduzierten Raten entfernen. Die molekularen Details darüber, wie Basen-Exzisionsreparatur-Enzyme (BER) DNA-Schäden in Nukleosomen erkennen und entfernen, wurden nicht aufgeklärt. Biochemische BER-Daten von nukleosomalen Substraten deuten jedoch darauf hin, dass das Nukleosom je nach Ort der DNA-Läsion und des Enzyms unterschiedliche strukturelle Barrieren aufweist. Dies deutet darauf hin, dass die Mechanismen, die von diesen Enzymen verwendet werden, um DNA-Schäden in freier DNA zu entfernen, sich von denen unterscheiden können, die in Nukleosomen verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass der Großteil der genomischen DNA zu Nukleosomen zusammengesetzt ist, werden strukturelle Informationen dieser Komplexe benötigt. Bis heute fehlen der wissenschaftlichen Gemeinschaft detaillierte Protokolle, um technisch machbare Strukturstudien dieser Komplexe durchzuführen. Hier stellen wir zwei Methoden zur Verfügung, um einen Komplex aus zwei genetisch fusionierten BER-Enzymen (Polymerase β und AP Endonuclease1) herzustellen, die an eine Einzelnukleotidlücke in der Nähe des Eintritts-Austritts des Nukleosoms gebunden sind, um die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu ermöglichen. Beide Methoden der Probenvorbereitung sind für die Verglasung von Qualitätsgittern durch Tauchgefrieren geeignet. Dieses Protokoll kann als Ausgangspunkt für die Herstellung anderer nukleosomaler Komplexe mit verschiedenen BER-Faktoren, Pionier-Transkriptionsfaktoren und Chromatin-modifizierenden Enzymen verwendet werden.
Introduction
Eukaryotische DNA wird durch Histonproteine organisiert und verdichtet, wobei Chromatin gebildet wird. Das Nukleosomenkernpartikel (NCP) stellt die grundlegende Wiederholungseinheit des Chromatins dar, die den Zugang zu DNA-bindenden Proteinen für die DNA-Reparatur, -Transkription und -Replikation reguliert1. Obwohl die erste Röntgenkristallstruktur des NCP erstmals vor mehr als zwei Jahrzehnten aufgeklärt wurde2 und viele weitere Strukturen des NCP seit 3,4,5,6 veröffentlicht wurden, sind DNA-Reparaturmechanismen in nukleosomalen Substraten noch nicht beschrieben. Die Aufdeckung der molekularen Details, die der DNA-Reparatur im Chromatin zugrunde liegen, erfordert eine strukturelle Charakterisierung der beteiligten Komponenten, um zu verstehen, wie lokale strukturelle Merkmale des NCP die DNA-Reparaturaktivitäten regulieren. Dies ist besonders wichtig im Zusammenhang mit der Basenexzisionsreparatur (BER), da biochemische Studien mit BER-Enzymen auf einzigartige DNA-Reparaturmechanismen in Nukleosomen hindeuten, die von enzymspezifischen strukturellen Anforderungen für die Katalyse und der strukturellen Position der DNA-Läsion innerhalb des Nukleosomsabhängen 7,8,9,10,11,12,13 . Da es sich bei der BER um einen lebenswichtigen DNA-Reparaturprozess handelt, besteht ein erhebliches Interesse, diese Lücken zu schließen und gleichzeitig einen Ausgangspunkt zu schaffen, von dem aus andere technisch realisierbare Strukturstudien mit relevanten nukleosomalen Komplexen durchgeführt werden können.
Die Kryo-EM entwickelt sich schnell zur Methode der Wahl, um die dreidimensionale (3D) Struktur von Komplexen zu lösen, deren großflächige Vorbereitung einer homogenen Probe eine Herausforderung darstellt. Obwohl das Design und die Aufreinigung von NCPs, die mit einem DNA-Reparaturfaktor (NCP-DRF) komplexiert sind, wahrscheinlich eine maßgeschneiderte Optimierung erfordern wird, liefert das hier vorgestellte Verfahren zur Erzeugung und zum Einfrieren eines stabilen NCP-DRF-Komplexes Details zur Optimierung der Proben- und Kryo-EM-Gittervorbereitung. Zwei (sich nicht gegenseitig ausschließende) Workflows, die in Abbildung 1 dargestellt sind, und die spezifischen Details im Protokoll identifizieren kritische Schritte und bieten Strategien zur Optimierung dieser Schritte. Diese Arbeit wird das Chromatin- und DNA-Reparaturfeld in eine Richtung treiben, in der die Ergänzung biochemischer mit strukturellen Studien technisch möglich wird, um die molekularen Mechanismen der nukleosomalen DNA-Reparatur besser zu verstehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zusammenbau von Nukleosomenkernpartikeln mittels Salz-Garstoff-Dialyse
ANMERKUNG: Die Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln unter Verwendung rekombinanter Histonproteine für Strukturstudien wurde von anderen ausführlich beschrieben14,15,16. Befolgen Sie die Reinigung der rekombinanten X. laevis-Histone und der Histon-Oktamer-Assemblierung, die von anderen14,15 beschrieben wurden, und bauen Sie das nukleosomale Substrat wie unten beschrieben zusammen.
- Kaufen Sie drei Oligonukleotide (aufgeführt in Tabelle 1) in der angegebenen Skala: UND-197mer, 161mer, 35mer.
- PAGE reinigt Ultramere (197mer und 161mer) wie beschrieben17.
- Anneale äquimolare Mengen an Oligonukleotiden in 1x Annealing-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Mischen Sie beispielsweise 40 μl 161-mer [166,7 μM]; 8 μl 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μl 197-merer Comp-Strang [408,2 μM]; 10 μl 10x Glühpuffer und 10,9 μldH2O.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Glühreaktion mit einem Temperaturgradienten zu steuern. In Tabelle 2 finden Sie Details zum Temperaturgradienten.
- Anneale äquimolare Mengen an Oligonukleotiden in 1x Annealing-Puffer (10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 50 mM NaCl). Mischen Sie beispielsweise 40 μl 161-mer [166,7 μM]; 8 μl 35-mer [292,4 μM]; 16,8 μl 197-merer Comp-Strang [408,2 μM]; 10 μl 10x Glühpuffer und 10,9 μldH2O.
- PAGE reinigt Ultramere (197mer und 161mer) wie beschrieben17.
- Durchführung von Rekonstitutionen im kleinen Maßstab (Skalierung um den Faktor 1/57 des unten gezeigten Beispiels für ein Endvolumen von 50 μl), um das Verhältnis von DNA zu Histon-Oktamer zu bestimmen (typische Ausgangsverhältnisse von DNA:Oktamer sind wie folgt: 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2; dargestellt in Abbildung 2A); Es ist wichtig, dieses Verhältnis empirisch mit kleinräumigen Rekonstitutionen zu bestimmen.
- Nachdem dieses Verhältnis bestimmt wurde, bereiten Sie eine groß angelegte Rekonstitution vor. Mischen Sie beispielsweise 32,9 μl DNA-197 bp [99,4 μM]; 1647,1 μl TE (1x); 1120 μl 5 M NaCl und 62,3 μl WT-Histon-Oktamer [2,56 μM].
- Stellen Sie Dialysepuffer her: RBniedrig und RBhoch , wie in Tabelle 3 bzw. Tabelle 4 beschrieben; Richten Sie die Rekonstitutionen wie zuvor beschrieben ein14.
- Das Dialyseröhrchen wird in das Becherglas mitRB high gegeben und die Dialyse unter leichtem Rühren 16 h lang fortgesetzt oder bis 2 L RBlow in das Becherglas überführt wurden.
- Das Dialyseröhrchen wird in ein 1-Liter-Becherglas mit RB50 mM Puffer (Tabelle 5) überführt und die Probe mindestens 3 h oder über Nacht dialysieren lassen.
- Bewerten Sie die Rekonstitutionseffizienz auf einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel, um sicherzustellen, dass weniger als 10% freie DNA und eine einzelne NCP-Bande vorhanden sind. NCPs bei 4 °C lagern. Siehe Abbildung 2A (Spur 5) und Abbildung 2B für repräsentative optimale Rekonstitutionsergebnisse.
2. Bereiten Sie den NCP-DNA-Reparaturfaktor-Komplex (NCP-DRF) vor
- Aufreinigung durch präparative Gelelektrophorese
HINWEIS: Diese Methode ist die arbeitsintensivste (der beiden beschriebenen) und obwohl sie bei der Entfernung von Spezies mit hohem Molekulargewicht (HMW) (Abbildung 6A) aufgrund des hohen Verdünnungsfaktors kann es zu einer gewissen Demontage kommen, wie in Abbildung 7A (NCP-Vorbereitungszelle aus der Spur), Freisetzung von DNA. Bis zu 25% freie DNA ist jedoch immer noch mit Kryo-EM-Studien kompatibel. Verwenden Sie diese Methode aufgrund der hohen Verdünnung, um nur den NCP und nicht den gesamten Komplex zu reinigen.- Bereiten Sie 70 ml 6%ige nicht denaturierende Polyacrylamid-Gellösung in 0,2x TBE unter Verwendung von Polyacrylamid-Gellösung 37,5:1, Acrylamid:Bisacrylamid vor. Gießen Sie ein zylindrisches Gel mit einem Außenradius von 28 mm und polymerisieren Sie über Nacht.
- Montieren Sie die präparative Gellaufvorrichtung unter Verwendung einer Dialysemembran mit einem Cutoff von 6-8 kDa MW. Verwenden Sie 0,25x TBE als Laufpuffer und 1x Elutionspuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5). Lassen Sie das zylindrische Gel 1 Stunde lang bei konstanten 12 W vorlaufen und sammeln Sie Fraktionen, die die Peristaltikpumpe mit einer Durchflussrate von ca. 1 ml/min betreiben.
HINWEIS: Wenn kein UV-Detektor zur Identifizierung von DNA-haltigen Fraktionen zur Verfügung steht, kann ein Screening-Experiment mit 32P-NCP durchgeführt werden, um die interessierenden Fraktionen zu identifizieren. Unter Beibehaltung aller Bedingungen können unmarkierte NCPs dann ohne UV-Detektor gereinigt werden. - Die 2,8 ml NCP werden mit einem Zentrifugalfilter (MW-Cutoff 30 kDa) auf 250 μl konzentriert und insgesamt 6 h lang auf das präparative Gel und die Elektrophorese geladen. Nach 2 Stunden, wenn das Xylolcyanol aus dem Gel ausgelaufen ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von 1,5-ml-Fraktionen.
HINWEIS: Nach 2,5 h sind die Fraktionen frei von Xylolcyanol; Die DNA (197mer) eluiert nach etwa 3-3,5 h, und es wird erwartet, dass das NCP nach 4,5-5 h eluiert. - Analysieren Sie die interessierenden Fraktionen auf einem 6% nicht denaturierenden Polyacrylamidgel. Pool-Fraktionen, die das NCP enthalten, und sofort mit einem Zentrifugalfilter (MW-Cutoff 30 kDa) auf 1 mg/ml konzentrieren. Bewerten Sie am nächsten Tag die Qualität des NCP auf einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel, bevor Sie mit dem gewünschten DNA-Reparaturfaktor (DRF) komplexieren.
- Inkubieren Sie den NCP und den DRF von Interesse 15 Minuten lang auf Eis mit einem optimalen Puffer für den spezifischen Komplex. Mischen Sie beispielsweise 1.000 μl NCP [1,2 μM]; 260 μl 5x Bindungspuffer (250 mM HEPES, pH 8, 500 mM KCl, 25 mM MgCl2), 22 μl 3 M KCl und 18 μl MBP-Pol β-APE1 [338 μM].
HINWEIS: Die Temperatur und die Ionenstärke, bei der der Komplex hergestellt wird, müssen möglicherweise für verschiedene Komplexe optimiert werden. - Fügen Sie Glutaraldehyd hinzu (frisch geöffnet; EM-Gehalt) bis zu einer Endkonzentration von 0,005 %. Fügen Sie daher zu dieser Reaktion 26,8 μl 0,25% Glutaraldehyd mit 13,2 μl dH2O hinzu. Gut mischen und 13 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Abschrecken mit 1 M Tris-Cl, pH 7,5, bis zu einer Endkonzentration von 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Konzentrat auf ~50 μL und Austausch des Puffers mit 1x Gefrierpuffer: 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7,5 unter Verwendung einer Entsalzungssäule.
ACHTUNG: Glutaraldehyd kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen; Es ist schädlich, wenn es verschluckt wird, und es ist giftig, wenn es eingeatmet wird. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille, Handschuhe und behandeln Sie Glutaraldehyd in einem Abzug und tragen Sie eine Maske.
HINWEIS: Es ist wichtig, die Vernetzungsreaktion in einem großen Volumen mit dem NCP in dieser niedrigeren Konzentration durchzuführen. Frühere Versuche der Vernetzung, selbst bei dieser Konzentration von Glutaraldehyd, aber bei einem 10-fach höher konzentrierten NCP, führten zu einer Aggregation der Probe und einer Übervernetzung, wie durch SDS PAGE und Größenausschlusschromatographie angezeigt. Diese Gitter hatten keine erkennbaren Partikel mit nur Klumpen (Abbildung 5D, E). - Bestimmen Sie die Absorptionen bei OD 280 und OD 260 und konzentrieren Sie sich bei Bedarf weiter, um 1,3-3 mg/ml zu erreichen, basierend auf OD 280 (typisches Verhältnis von OD260 / OD 280 = 1,7-2 ergibt gute Partikel). Für dieses kleine Volumen von 50 μl besteht die beste Methode zur Reduzierung des Probenverlusts darin, einen Dialyseknopf mit einem Deckel aus einem 1,7-ml-Röhrchen herzustellen, das von einer Dialysemembran bedeckt ist (6-8 kDa MW Cutoff), den Boden des Röhrchens zu schneiden und den Rand des Röhrchens zu verwenden, um die Membran oben auf dem Deckel abzudichten.
- Legen Sie den Dialyseknopf mit der Probe mit der Membran nach unten auf ein Polyethylenglykolbett (überprüfen Sie den Fortschritt alle 2 Minuten). Diese Methode wird bevorzugt, wenn die erforderliche Konzentration kleiner oder gleich dem 2,5-fachen ist, um eine Verdünnung oder einen Verlust der Probe im Konzentrator zu vermeiden. Es ist wichtig, sofort nach diesem Schritt Kryo-EM-Gitter des Komplexes vorzubereiten.
- Aufreinigung durch Größenausschlusschromatographie
- Am Tag vor dem Einfrieren eine Größenausschlusssäule mit 60 ml dH2O, gefolgt von 80 ml Gefrierpuffer (50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 8) über Nacht mit einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/min waschen und äquilibrieren. Bereiten Sie den gleichen Komplex mit NCPs direkt nach der Rekonstitution mit 2,5-mal größeren Mengen wie folgt vor: Mischen Sie 2.500 μl NCP [1,2 μM]; 650 μl 5-facher Bindungspuffer; 45 μl MBP-Pol β-APE1 [338 μM] und 55 μl 3M KCl.
- Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang auf Eis ohne Vernetzer. Fügen Sie dann Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,005% hinzu, wie in der präparativen Gelmethode beschrieben. In diesem Fall wird der Komplex jedoch in einem voräquilibrierten (mit Gefrierpuffer) Zentrifugalfilter auf ca. 120 μL eingeengt.
- Analysieren Sie sofort die Peakfraktionen und konzentrieren Sie die Fraktionen, die die Histone und MBP-Pol β-APE1 enthalten, wie zuvor angegeben. Siehe Abbildung 5A, B, C für erfolgreiche Ergebnisse mit der Größenausschlussmethode und Abbildung 7 mit beiden Methoden.
3. Nukleosomalkomplex einfrieren
- Nach dem Einschalten des Gefrierschranks und dem Befüllen des Luftbefeuchters mit 50 ml dH2O stellen Sie die Kammertemperatur auf 22 °C und HR (Luftfeuchtigkeit) auf 98% ein. Stellen Sie den Ethanbecher und den Flüssigstickstoffbecher (mit einer beschrifteten Gitterbox) in die entsprechenden Platzhalter.
- Decken Sie den Ethanbecher mit dem Ethandeckelspender ab und gießen Sie vorsichtig flüssigen Stickstoff (LN2) darüber, während Sie den LN 2-Becher gleichzeitig mit LN2 füllen. Wenn sich der LN2-Füllstand stabilisiert hat und 100 % und eine Temperatur von -180 °C erreicht hat, öffnen Sie vorsichtig das Ethanventil und füllen Sie den Ethanbecher, bis er eine Blase auf dem durchsichtigen Deckel bildet. Entfernen Sie den Ethanspender.
- Legen Sie zwei Filterpapiere auf das Löschgerät und sichern Sie sie mit einem Metallring. Gehen Sie zum Setup und verwenden Sie die folgenden Parameter für das Blotting: 0 Pre-Blot, 3 s Blot, 0 Post-Blot; Wählen Sie A-Plunge und klicken Sie auf OK.
- Klicken Sie auf dem Hauptbildschirm auf Pinzette laden und laden Sie sie mit einem Gitter mit der Carbon-/Anwendungsseite nach links (wie zuvor vorbereitet). Kalibrieren Sie die Pinzette und stellen Sie die Z-Achse ein, um einen festen Fleck zu gewährleisten. Klicken Sie auf Untere Kammer und tragen Sie 3 μl des Komplexes (1,3-3 mg/ml; OD280). Klicken Sie auf Blot/A-plunge. Dadurch wird das Gitter so gedreht, dass es von vorne abdeckt, und es wird eingefroren.
- Übertragen und lagern Sie das Gitter in der Gitterbox in der LN2-Kammer . Wenn alle vier Gitter eingefroren und in die Gitterbox gelegt wurden, drehen Sie den Deckel in die neutrale Position, in der alle Gitter vom Deckel bedeckt sind, und ziehen Sie die Schraube fest. Gitter können in LN2 gespeichert werden, bis die Siebung eingeleitet wird.
4. Bildschirmraster
- Bevor Sie die Proben in das Mikroskop einlegen, legen Sie die verglasten Gitter auf einen Ring und befestigen Sie sie mit einem C-Clip. Führen Sie diesen Clipping-Vorgang unter LN2 in einem feuchtigkeitskontrollierten Raum durch, um eine Eiskontamination zu vermeiden.
- Legen Sie beim Einlegen des Mikroskops die Gitter in eine Kassette mit 12 Steckplätzen ein. Legen Sie die Kassette in eine Nanocab-Kapsel und laden Sie sie in den Autoloader. Der Autoloader-Robotermechanismus leitet den Prozess ein.
- Übertragen Sie das Gitter von der Kassette auf den Mikroskoptisch. Stellen Sie den Tisch auf euzentrische Höhe ein, indem Sie den Tisch um 10° wackeln und gleichzeitig die Z-Höhe verschieben, bis eine minimale planare Verschiebung in den Bildern beobachtet wird.
- Sobald die euzentrische Höhe erreicht ist, beginnen Sie mit der Bildgebung. Erhalten Sie zunächst den Atlas, indem Sie ein 3 x 3-Montagebild des Rasters aufnehmen, in dem jede Montage mit 62-facher Vergrößerung aufgenommen wird. Wählen Sie drei Quadrate unterschiedlicher Größe; Nehmen Sie die euzentrische Höhe und nehmen Sie dann das Bild mit 210-facher Vergrößerung auf.
- Sobald ein Quadrat abgebildet ist, wählen Sie jeweils ein Loch von der Kante, in der Mitte und dazwischen innerhalb der Quadrate. Stellen Sie jedes Loch mit 2600-facher Vergrößerung dar.
- Vor der Aufnahme dieses Bildes mit hoher Vergrößerung erfolgt der Autofokus in einem Versatz des Abbildungsbereichs. Nehmen Sie das Bild mit hoher Vergrößerung aus der Mitte des Lochs mit 36.000-facher Vergrößerung und einer Belichtungszeit von 7,1 s, 60 Bildern, einer Größe von 1,18 Pixel und einer Unschärfe von 3 μm auf. Repräsentative Bilder des Screenings finden Sie in Abbildung 5, Abbildung 6 und Abbildung 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Richtig zusammengesetzte NCPs (Abbildung 2) wurden verwendet, um einen Komplex mit einem rekombinanten Fusionsprotein aus MBP-Polβ-APE1 herzustellen (Abbildung 3). Um das Verhältnis von NCP zu MBP-Polβ-APE1 zur Bildung eines stabilen Komplexes zu bestimmen, führten wir elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) durch (Abbildung 4), die eine einfach verschobene Bande des NCP mit einem 5-fachen molaren Überschuss an MBP-Polβ-APE1 zeigten. Bei der Optimierung der Herstellung dieses Komplexes war die Vernetzung mit Glutaraldehyd entscheidend, um ein Auseinanderfallen des NCP zu verhindern. Anfänglich wurde die Assemblierung des Komplexes von NCP-Polβ-APE1 in einem kleineren Volumen bei etwa 10 μM NCP unter Verwendung einer endgültigen Glutaraldehydkonzentration von 0,005% durchgeführt. Unter diesen Bedingungen war die Probe übermäßig vernetzt (Abbildung 5D-E) und führte zu Aggregaten ohne erkennbare Einzelkomplexe. Die Vernetzung bei etwa 10-fach verdünnten NCPs (1,2 μM NCP) führte zu einer signifikant reduzierten Aggregation und einer verbesserten Partikelstabilität (Abbildung 5A-C). Abbildung 6 veranschaulicht, dass beide in Abbildung 1 gezeigten Methoden mit dem präparativen Gel kombiniert werden können, was die Qualität der NCPs verbessert, wenn das NCP eine signifikante Menge an hochmolekularen (HMW)-Aggregaten enthält (Abbildung 6A), gefolgt von der Reinigung des Komplexes durch Größenausschluss. Obwohl dies große Erfolge bei der Vorbereitung der Probe (Abbildung 5B-C) und der Gitter zeigte, die stabile Partikel ergaben (Abbildung 6D), ergab die suboptimale Bildung des Komplexes (Abbildung 6A) allein eine 3D-Karte des NCP (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass beide Methoden (Größenausschluss und präparatives Gel) unabhängig voneinander verwendet werden können, um stabile Komplexe zu erzeugen (Abbildung 7A-C). Tatsächlich wurden Daten aus beiden Gittern gesammelt und zeigen nahezu identische 2D-Klassen (Abbildung 7D) und 3D-Karten (Abbildung 7E) mit einer Auflösung von etwa 3,2 Å.
Abbildung 1: Arbeitsablauf der beiden in diesem Protokoll vorgestellten Methoden zur Herstellung und zum Einfrieren eines NCP-Polβ-APE1-Komplexes über 1) präparatives Gel und 2) Größenausschluss. Obwohl hier nicht gezeigt, können diese Verfahren kombiniert werden (Abbildung 6), beginnend mit (1) und Reinigung des konzentrierten Komplexes von (1) unter Verwendung einer Größenspalte. Dies erfordert eine Verdoppelung des Ausgangsmaterials der NKS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative NCP-Rekonstitutionen. (A) Die DNA wurde mit zunehmenden Mengen an Histon-Oktamer in Verhältnissen von 1:0,9, 1:1,1, 1:1,2, 1:2, DNA:Oktamer titriert. (B) Duplizieren von großflächig zusammengesetzten NCPs (1:2, DNA:Oktamer). Die Rekonstitutionen wurden in einem 6%igen nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel elektrophoresiert, gefolgt von einer Sybr-Green-I-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Schematische Darstellung des genetisch fusionierten Polβ-APE1 mit MBP an seinem N-Terminal. Das MBP-Polβ-APE1-Fusionsprotein wurde für beide Aktivitäten enzymatisch charakterisiert (Daten nicht gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: MBP-Polβ-APE1-Bindung an NCPs. Nukleosomales Substrat (100 nM) wurde mit zunehmenden Mengen an MBP-Polβ-APE1 für 15 min auf Eis inkubiert. Gebundenes und ungebundenes NCP wurden in einem nicht denaturierenden 6%igen Polyacrylamid-Gel getrennt, gefolgt von einer Sybr-Green-I-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Analyse erfolgreicher und erfolgloser Vernetzungsergebnisse. Das Elutionsprofil des Komplexes ist in (A) dargestellt, wobei der Peak of Interest beschriftet ist. Fraktionen, die mit "F" bezeichnet werden und aus dieser Elution entnommen wurden, wurden in einem 16%igen Tricin-Polyacrylamid-Gel analysiert und in (B) gezeigt. (C) Die Probe von (B) wurde unter Verwendung von löchrigen Kohlenstoffträgergittern eingefroren und mit dem 200-kV-Feldemissions-Kryo-Transmissionselektronenmikroskop abgebildet. Entsprechende erfolglose Experimente sind in (D), (E) und (F) dargestellt. Beachten Sie, dass diese erfolglosen Experimente das Fusionsprotein ohne MBP enthalten. HOc und HOD bezeichnen Histon-Oktamer konzentriert bzw. verdünnt; RT bezeichnet Raumtemperatur; "X" entspricht der Vernetzung mit Glutaraldehyd. Maßstabsbalken = 100 nm (C, F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Herstellung des NCP-Polβ-APE1-Komplexes unter Verwendung der beiden Methoden im Tandem. (A) Ungebunden und gebunden (1:1, NCP-Polβ-APE1) wurden in 6% Polyacrylamid nicht denaturierendem Gel analysiert (beachten Sie, dass bei diesem Verhältnis nur 50% gebunden sind). (B) Elutionsprofil des NCP-Polβ-APE1-Komplexes aus einer Größenspalte. (C) Analyse von eluierten Fraktionen in einem 16%igen Tricin-Polyacrylamid-Gel; Die Fraktionen wurden, wie angegeben, zusammengefasst und konzentriert. (D) Die Probe wurde eingefroren und wie in Abbildung 5B beschrieben abgebildet. Die Datenverarbeitung ergab keine zusätzliche Dichte, die Polβ-APE1 entsprach (nicht dargestellt). "X" in den Bahnen 5 und 6 bezeichnet die Vernetzung mit Glutaraldehyd, wie im Protokoll angegeben. Maßstabsbalken = 100 nm (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Analyse des NCP-MBP-Polβ-APE1-Komplexes. (A) Proben aus den verschiedenen Schritten der in Abbildung 1 dargestellten Verfahren wurden in einem 6%igen Polyacrylamid-Gel elektrophoresiert. Beachten Sie, dass die Komplexbildung mit den beiden Methoden reproduzierbar ist. (B,C) Repräsentative Gitter-Loch-Kohlenstoff-Stützgitterbilder, die mit einem 300-kV-Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen wurden, wobei die roten Kästchen verschiedene Orientierungen des Komplexes hervorheben (von denen einige den in (D) gezeigten 2D-Klassen entsprechen). (E) Die von (C) verarbeiteten Daten zeigen eine 3D-Karte mit einer Auflösung von 3,2 Å des NCP-MBP-Polβ-APE1-Komplexes.). Maßstabsbalken = 100 nm (B, C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Oligonukleotid-Name | Sequenz (5'-->3') | Reinigungsskala | Methode der Reinigung | Anzahl der bestellten Fläschchen | ||
| UND komplementärer Strang | TGATGGACCCTATACGCGGCCGCCCTGGAGAAT CCCGGTGCCGAGGCCGCTCAATTGGTCGTAGA CAGCTCTAGCACCGCTTAAACGCACGTACGCGC TGTCCCCCGCGTTTTAACCGCCAAGGGGATTAC TCCCTAGTCTCCAGGCACGTCACGTCAGATATCAAC ATCCTGTGCATGTATTGAACAGCGACCTTGCCG |
20 nmole | PAGE gereinigt | 6 | ||
| 161mer | /5Phos/GATATCTGACACGTGCCTGGAGACTAGG GAGTAATCCCCTTGGCGGTTAAAACGCGGGGG ACAGCGCGTACGTGCGTTTAAGCGGTGCTAGA GCTGTCTACGACCAATTGAGCGGCCTCGGCA CCGGGATTCTCCAGGGCGGCCGCGTATAGGG TCCATCA |
20 nmole | PAGE gereinigt | 4 | ||
| 35mer | CGGCAAGGTCGCTGTTCAATACATGCACAGG ATGT |
250 nmole | HPLC (HPLC) | 1 | ||
Tabelle 1: DNA-Substrat. Drei Oligonukleotide wurden geglüht, um das dsDNA-Substrat zu erzeugen. Die unterstrichenen Abschnitte bestehen aus 25 bp Linker-DNA, die die 147 bp 601 DNA-Positionierungssequenz flankieren, die eine einzelne Nukleotidlücke enthält.
| Schritt | Temperatur (°C) | Zeit (min)/Schritt |
| 1 | 95 | 10 |
| 2-5 | 90, 85, 80, 75 | 5 |
| 6-41 | 69 Abnahme um 1 | 3 |
| 42 | 4 | halten |
Tabelle 2: Temperaturgradient beim Glühen. Oligos wurden in einem Thermocycler bei diesen Temperaturen inkubiert, um das dsDNA-Substrat zu erzeugen.
| Komponenten (Lagerbestand) | Volumen/Menge | Endkonzentration |
| 3M KCl | 167 mL | 0.250 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 20 ml | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 4 ml | 1 mM |
| 1 M DVB-T | 2 ml | 1 mM |
| CHAPS | 2 g | 1,6 mM |
| QS mit dH2O zur Herstellung von 2L | ||
Tabelle 3: RBniedriger Rekonstitutionspuffer. Anweisungen zur Herstellung von 2 l wie zuvor berichtet14, mit Ausnahme von 1,6 mM CHAPS wurde hinzugefügt.
| Komponenten (Lagerbestand) | Volumen/Menge | Endkonzentration |
| 3M KCl | 267 mL | ca. 2 m |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 4 ml | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 800 μL | 1 mM |
| 1 M DVB-T | 400 μL | 1 mM |
| CHAPS | 0,4 g | 1,6 mM |
| QS mit dH2O zur Herstellung von 400 ml | ||
Tabelle 4:RB-Puffer mit hoher Rekonstitution. Anweisungen zur Herstellung von 400 ml wie zuvor berichtet14, mit Ausnahme von 1,6 mM CHAPS wurde hinzugefügt.
| Komponenten (Lagerbestand) | Volumen | Endkonzentration |
| 3M KCl | 16,7 ml | 50 mM |
| 1 M HEPES, pH 8,0 | 10 ml | 10 mM |
| 0,5 M EDTA | 2 ml | 1 mM |
| 1 M DVB-T | 1 ml | 1 mM |
| QS mit dH2O zur Herstellung von 1L | ||
Tabelle 5: RB50mM Rekonstitutionspuffer. Anweisungen, um 1 l Rekonstitutionspuffer zum Einfrieren geeignet zu machen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ein spezifisches Protokoll zur Reinigung des DNA-Reparaturfaktors hängt von dem interessierenden Enzym ab. Es gibt jedoch einige allgemeine Empfehlungen, einschließlich der Verwendung rekombinanter Methoden zur Proteinexpression und -reinigung18; Wenn das interessierende Protein zu klein ist (<50 kDa), war die Strukturbestimmung durch Kryo-EM bis vor kurzem durch den Einsatz von Fusionssystemen19, Nanokörper-bindenden Gerüsten20 und der Optimierung von Bildgebungsstrategien21 nahezu unmöglich.
Es ist durchaus üblich, in der Anfangsphase Gitter von schlechter Qualität zu erhalten. Erste Versuche, die NCP-Homogenität und -Stabilität ohne Vernetzer unter Verwendung von Uranylacetat und kohlenstoffbeschichteten Kupfergittern für die Negativfärbung zu bestimmen, zeigten stabile, gut dispergierte NCPs mit minimaler Aggregation. Nachdem diese Probe jedoch (in 20-fach höherer Konzentration) in Kryo-EM-Gittern verglast wurde, wurden keine Partikel nachgewiesen. Die größte Hürde war die Stichprobenoptimierung, um zu verhindern, dass die NKS auseinanderfallen oder aggregieren. Zusätzlich werden zwei Zubereitungsverfahren separat beschrieben; Sie schließen sich jedoch nicht gegenseitig aus und können Rücken an Rücken verwendet werden, indem der NCP zuerst über ein präparatives Gel gereinigt, mit dem Reparaturfaktor komplexiert und der Komplex mit einer Größenausschlusssäule gereinigt wird. Dies erfordert doppelt so viel Material für den ersten Schritt, und es ist auch zeitaufwändiger, aber hilfreich für schwierige Proben (Abbildung 6).
Es war schwierig, einen Ausgangspunkt für die Vernetzerkonzentration zu finden, da die Vernetzungsmethoden und die von anderen verwendeten Vernetzermengen nicht einheitlich waren22,23. Versuche, die von Anderson et al. beschriebene weniger kontrollierte Vernetzungsreaktion auf dem Labortisch zu replizieren, führten zu keinen positiven Ergebnissen, und der Komplex war übermäßig vernetzt. Dies ist wahrscheinlich auf die Quelle von Glutaraldehyd zurückzuführen (frisch geöffnete Ampulle im Vergleich zu langfristig gelagertem Glutaraldehyd). Da dieser Detaillierungsgrad in Nicht-Methoden-Forschungsartikeln oft weggelassen wird, ist es schwierig, die genauen Bedingungen als Ausgangspunkt zu replizieren. Optimale Ergebnisse wurden erzielt, wenn der Komplex bei einer Konzentration von 1,2 μM in 150 mM KCl-Ionenstärke im Vergleich zur Vernetzung des Komplexes bei 10 μM NCP bei gleicher Glutaraldehydkonzentration von 0,005% für 13 min bei Raumtemperatur vernetzt wurde. Die Vernetzungseffizienz hängt wahrscheinlich auch von dem Komplex ab, der gebildet wird, da einige Chromatin-interagierende Faktoren eine stärkere Destabilisierung induzieren/erfordern können, was den Ort der Vernetzung und den Gesamteffekt auf die NCP-Stabilität beeinflusst. Während eine Optimierung dieser Bedingungen unvermeidlich ist, ist es daher von entscheidender Bedeutung, kritische Schritte wie die optimale NCP- und Salzkonzentration während der Vernetzungsreaktionen zu finden.
Ein weiterer wichtiger Parameter war das Verhältnis von NCP:DRF, das genügend Moleküle auf dem Gitter ergab, das den an den NCP gebundenen DRF enthielt. In der Tat wurde dieser Parameter auch von anderen als ein Parameter identifiziert, der für die Optimierung von Strukturstudien von entscheidender Bedeutung ist16 , da selbst für die Kryo-EM die Homogenität der Art und Weise, wie die DRF an das NCP bindet, für die 3D-Karte wichtig ist. Wenn Sie dies nicht optimieren, kann dies zu ungebundenen oder heterogenen, unspezifischen Bindungen führen. Wenn ein molares Verhältnis von 1:1 verwendet wurde, das nur 50 % des durch den DRF gebundenen NCP ergab (Abbildung 6), zeigte die 3D-Karte keine zusätzliche Dichte, die dem DRF entsprach. Daher ist es wichtig, das Verhältnis zu bestimmen, das eine einzelne Bande an der gleichen Stelle auf einem EMSA ergibt und einen einzelnen Peak auf dem Chromatogramm einer Größensäule zeigt, der dem Komplex entspricht. Mehrere Parameter für das Einfrieren der Gitter, einschließlich der Blot-Zeit, fügten mehrere Optimierungsrunden hinzu.
Zusammengenommen enthält dieses Protokoll zum ersten Mal detaillierte Anweisungen zu zwei verschiedenen Methoden zur Herstellung von Nukleosomenkomplexen für die Kryo-EM-Strukturbestimmung. Die bereitgestellten Basisparameter für die Netzvorbereitung können als Ausgangspunkt verwendet werden. Und obwohl keine einzige Methode für alle makromolekularen Komplexe gleich gut funktioniert, wird die Konzentration auf die Optimierung der in diesem Protokoll beschriebenen Parameter die Strategie für die maßgeschneiderte Optimierung anderer nukleosomaler Komplexe eingrenzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Mario Borgnia vom Kryo-EM-Kern am National Institute of Environmental Health Sciences und Dr. Joshua Strauss von der University of North Carolina in Chapel Hill für ihr Mentoring und ihre Ausbildung in der Kryo-EM-Netzvorbereitung. Wir danken auch Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende für die technische Unterstützung in der Anfangsphase dieses Projekts. Wir schätzen den wichtigen Beitrag und die Unterstützung des verstorbenen Dr. Samuel H. Wilson und seiner Labormitglieder, insbesondere Dr. Rajendra Prasad und Dr. Joonas Jamsen, für die Reinigung des genetisch fusionierten APE1-Polβ-Komplexes. Die Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm der National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [Förderkennzeichen Z01ES050158, Z01ES050159 und K99ES031662-01] unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640--6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S.
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. Guide to Protein Purification. 463, Academic Press. (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
