Summary
光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。
Abstract
生きた胚、幼虫または幼体のゼブラフィッシュの体全体の個々の細胞を視覚化するために、いくつかの方法を用いることができる。蛍光マークされた原形質膜を持つ生きた魚を共焦点レーザー走査顕微鏡でスキャンして、筋肉組織の体積と存在する筋線維の数を決定できることを示しています。生きた動物の細胞数とサイズを経時的に測定するための効率的なアプローチが説明され、より困難なセグメンテーション法に対して検証されています。筋肉の電気的、したがって収縮性の活動の制御を可能にする方法が記載されている。骨格筋収縮活動の喪失は、筋肉の成長を大幅に減少させました。幼虫では、パターン化された電気的誘発収縮活性の再導入を可能にするプロトコルが記載されている。記載された方法は、個体間変動の影響を最小限に抑え、生物の状況における様々な細胞および生理学的成長パラメータに対する電気的、遺伝的、薬物的、または環境刺激の効果の分析を可能にするであろう。その後、個人に対する定義された早期介入の測定された効果の長期フォローアップを行うことができます。
Introduction
細胞数の増加(過形成)および/または細胞サイズ(肥大)を含む調節された組織成長は、発生、再生、および生態学的および進化的適応における重要な要素です。ここ数十年で細胞生物学と発生生物学の両方の分子遺伝学的理解が大幅に進歩したにもかかわらず、組織と臓器のサイズの制御の機構的理解はまだ始まったばかりです。知識におけるこの不足の理由の1つは、必要な空間的および時間的精度で生物の組織成長を定量化することの難しさです。
生物全体の成長のさまざまな側面を経時的に繰り返し測定することができ、個々の成長曲線を明らかにすることができます1,2,3,4,5。二重X線吸収測定法(DXA)、コンピューター断層撮影(CT)、磁気共鳴画像法(MRI)などのますます洗練されたスキャン方法により、ヒトとモデル生物の両方の単一の個人における臓器全体および他の身体領域(たとえば、個々の識別された骨格筋)の成長の追跡が可能になります6,7,8,9,10.しかし、これらの方法では個々の細胞を明らかにする分解能がまだないため、細胞の挙動と組織レベルの成長との関連を特定することは困難でした。このようなリンクを作成するために、従来の研究では、類似した個々の動物のコホートに依存することが多く、そのうちのいくつかは連続した時点で犠牲にされ、細胞学的に詳細に分析されます。このようなアプローチでは、(できれば類似しているが、それでも変動する)個人のグループ間で観察された変化を平均化する必要があるため、時間的および空間的分解能の欠如に悩まされ、原因と結果を示唆する細胞レベルで相関イベントを見つけるのが困難です。
無脊椎動物のモデル生物に関する研究は、最初はC.エレガンスとD.メラノガスターでしたが、光学顕微鏡を開発して細胞分解能を達成し、単一の個体の経時的な成長を正確に測定することで、これらの問題を回避しました。このような研究は、これらの小さなモデル生物の成長における著しく不変な細胞系譜挙動を明らかにしました11、12、13、14、15、16、17。しかし、すべての脊椎動物を含む多くの動物は、不確定な細胞系譜を持ち、遺伝的にコードされた成長プログラムを、そのすべての構成組織と器官が適切に一致する機能的な3次元生物に変えるのに役立つ神秘的なフィードバックプロセスによって組織の成長を制御します。これらの複雑な成長過程を理解するためには、選択した時点で遺伝的、薬理学的または他の介入によって実験的に操作され、その後効果を分析できる単一の個体において、組織全体または臓器全体を経時的に画像化することが望ましい。
各脊椎動物の骨格筋は、定義されたサイズ、形状、機能、および骨、腱、神経などの隣接組織との十分に特徴付けられた相互作用を持っています。一部の筋肉は小さく、皮膚のすぐ下にあるため、高解像度の画像検査に適しています。ほとんどの臓器と同様に、各筋肉は、安定した成人のサイズに達する前に、胎児、出生後、および若年期を通じて成長します。しかし、筋肉には、使用と栄養に応じて、成人期にサイズを変える独自の能力もあり18、この特性は、生物のフィットネス、スポーツパフォーマンス、および自立生活に大きな影響を与えます。老年期の筋肉量と機能の低下であるサルコペニアは、人口の高齢化に直面している社会にとってますます懸念されている問題です19,20,21。
私たちらは、ゼブラフィッシュ幼虫のセグメント的に繰り返される体における骨格筋組織の定義されたブロックの成長に、組織の成長、維持、および修復を観察および操作できる数百の細胞を含む明らかに閉じたシステムとして焦点を当てました22,23,24,25,26。いくつかの定量的研究は以前に報告されていますが25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、個々の脊椎動物生物の細胞の詳細で筋肉成長を経時的に測定する詳細で検証された方法は利用できません。ここでは、そのような繰り返し測定を実行する方法のための効率的なプロトコルが検証とともに説明され、変化した電気的活動に応答して肥大および過形成成長の両方の変化を分析するためのその使用例が提供される。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
記載されているすべての研究は、1986年の動物(科学的手順)法およびその後の修正に従って、制度上のガイドラインに準拠し、英国内務省からの適切なライセンスの下で実施されました。胚/幼虫は原腸形成が完了するまで28.5°Cで飼育する必要がありますが、その後、発生速度を制御するために22〜31°Cに保つことができます。魚は室温でスキャンまたは刺激することができます。
1.ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔する
- Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg参照36またはTg(α-アクチン:mCherry-CAAX)pc22Tg参照37などの適切な蛍光レポーター成魚を交配し、38に記載のように胚を収集する。
- 受精後2日(dpf)などの選択時に、トリカイン含有魚培地(魚水またはE3培地のいずれか)を使用して胚を短時間麻酔し、ライカMZ16Fなどの蛍光顕微鏡下でEGFPまたはmCherryをスクリーニングします。胚が多い場合は、最も明るい信号を持つ胚を選択します。スクリーニング後すぐに胚を通常の魚培地に戻す。
2.共焦点スキャン用の魚の取り付け
- 共焦点レーザースキャンシステムとレーザーの電源を入れて、システムを30〜60分間安定させます。
注:ここでは、20倍/1.0 Wの水浸対物レンズを備えた直立材料スタンド(作動距離を延長する)を備えたツァイスLSM 5励起顕微鏡を使用しました。 - 1%低融点アガロース(LMA)を調製し、1.5 mLチューブで繰り返し使用するために37°Cのヒートブロックに保持します。ヒートショックを避けるために、ヒートブロックからLMAアリコートを取り出し、設定のすぐ上まで冷ましてから幼虫に塗布し、粉ミルクの温度を評価するときと同様に、皮膚に対してテストして適切な温度を判断します。
- マウントする魚を選択し、トリカイン(魚の培地で0.6 mM)で各魚を順番に一時的に麻酔します。
- 1%アガロースの層でコーティングされた直径60mmのペトリ皿を取り、解剖顕微鏡のステージに置きます。
- 幼虫を1 mLのプラスチックパスツールピペットで60 mmコーティングされたペトリ皿に移し、できるだけ多くの移した培地を取り除きます。次に、パスツールピペットを使用して、LMAを5〜10滴魚の上に置き、LMAが固まる前に鉗子(または火で磨かれた細かいガラス針)を使用して側面図で水平にすばやく配置します。最適なイメージングのためには、幼虫をLMAの上面近くに配置することが望ましい。
- あるいは、1 mLのプラスチックパスツールピペットを使用して、できるだけ少ない魚の培地で幼虫を収集し、幼虫を冷却されたLMAのアリコートに移します。幼虫を5秒間沈めて、LMAに完全に囲まれます。次に、幼虫を回収し、LMAを一滴入れてアガロースでコーティングしたペトリ皿に移します。上記のように幼虫の向きをすばやく調整して配置します。
- 前後軸と背腹側軸の両方を水平から10°以内に向ける幼虫の向きを変えます(以下のポイント4.6の「エラーとその修正について」のメモを参照)。
- 幼虫がアガロース液滴の表面近くに水平に正しく取り付けられていない場合は、取り外して再度埋め込みます。幼虫は、極細の1 mLプラスチックパスツールピペットを使用して穏やかに吸引することで簡単に回収でき、LMAはキムワイプを使用して穏やかに除去できます。練習は本当に取り付け手順で完璧になります。実際の実験でこれを試す前に、重要でない幼虫を埋め込む午後を過ごしてください。
注:顕微鏡の設計について:多くのラボでは、カバーガラス越しのイメージングに倒立共焦点顕微鏡を使用しています。倒立顕微鏡で観察するためにカバーガラスの下にアガロースに保持された魚を繰り返し埋め込んだり除去したりすると、正立顕微鏡で説明した手順よりも繰り返しスキャン中にサンプルの損失が大きくなることがわかりました。このため、可能であれば、直立システムの使用をお勧めします。それにもかかわらず、高品質のデータの鍵は、対物レンズとスキャンパラメータの適切な選択と使用であり、ここで議論するには大きすぎる主題です。
- 幼虫がアガロース液滴の表面近くに水平に正しく取り付けられていない場合は、取り外して再度埋め込みます。幼虫は、極細の1 mLプラスチックパスツールピペットを使用して穏やかに吸引することで簡単に回収でき、LMAはキムワイプを使用して穏やかに除去できます。練習は本当に取り付け手順で完璧になります。実際の実験でこれを試す前に、重要でない幼虫を埋め込む午後を過ごしてください。
3.共焦点スキャン
- LMAが固まったら、約10mLのトリカイン含有魚培地を皿に浸します。共焦点スタックをキャプチャする場合は、アガロースの腫れが発生するため、スキャンに進む前に、マウントされた魚を少なくとも10分間休ませてください。
- サンプル皿を共焦点系のステージにロードし、幼虫を見つけて、目的の体節に焦点を合わせます。Somite 17は、肛門ベント付近の局在化が容易で、イメージングが容易であるため、選択することができる。前部から体節を数えて確認してください。
注:最初の体節は耳の後ろで融合しており、前縁はありませんが、横紋筋線維があることが容易に観察できます。 - 上部(つまり、皮膚のすぐ上)と下部(つまり、魚がわずかに歪んで取り付けられていても、体節全体を含むように脊索のすぐ下)を定義することにより、 Zスタックをキャプチャするように設定します。左側と右側の両方を必要に応じてキャプチャできます。これにより、すべての高速 YZ スキャンが目的の領域を確実にキャプチャします。
- 次のようにXY画像をキャプチャします。共焦点ソフトウェアが許す限り、魚に対してスキャン領域の向きを設定します。補足ファイル1に示すように、画像化されたX軸に平行な前後軸とY軸に平行な背腹軸を持つ魚を配置し、体節17をフィールドの中央に配置します。最上部の筋腫の中層平面に着目し、上軸および催眠体節の半分全体が垂直および水平の筋中隔とともに表示され、高解像度のXY画像をキャプチャします。画像に名前を付けて保存することを忘れないでください。
- 次のように 1 つ以上の YZ イメージをキャプチャします。代表的な結果(下記)では、2スライス法と4スライス法の精度が比較されています。2スライスアプローチでは、単一の XY および YZ スキャンが採用されます。4スライスアプローチでは、3つの YZ スキャンを平均して、筋腫体積をより正確に推定します。共焦点ソフトウェアで必要な場合は、スキャンフィールドの向きを変えます。
- 選択した前後位置で魚の前後軸に垂直に、選択した体節を横切る正確な背側から腹側の線を引きます。 Z スタック ライン スキャンを実行します。
- 選択した筋腫に沿った定義された前後位置でYZラインスキャンを3回繰り返して、YZa、YZm、およびYZpをキャプチャします。代表的な結果を図2Aに示す。これらの画像に名前を付けて、関連するXY画像と一緒に保存します。
注:YZ平面の選択について:筋腫はV字型であり、その形態は成長中に変化します。4スライス法で筋腫17体積を最も正確に評価するには、YZaを筋腫の前端に、YZpを背側と腹側の筋腫の後端に、YZmをYZaとYZpの中間に配置します。 体節が均一に先細りになると仮定すると、各YZセクションからの測定値の平均は筋腫全体を表します。2スライス法の場合、単一のYZスキャンは、関心のある筋腫(YZmなど)の前後中心にほぼ対応する水平筋中隔の後端に配置する必要があります。あるいは、水平筋中隔の前部、中央部、後部に3つのYZ切片のセットを採取することもできますが、以下に示すように、そのような測定は筋腫の体積をわずかに過大または過小評価します(筋腫の漸減のため、それぞれ吻側および尾側体節の場合)。基本的に、魚と実験の間のYZスライス面の位置の一貫性は、再現性の鍵です。
4. 分析
- 筋腫は魚に沿って段階的にサイズが変化するため、比較研究では常に同じ体節で作業してください。
- 筋腫の体積を測定および計算するには、共焦点ソフトウェア(Zeiss ZEN顕微鏡ソフトウェアを使用して作成された.lsmファイルなど)またはFiji/ImageJなどのオープンソースのユニバーサル画像解析ソフトウェアを使用します。
注意: ファイル形式を変更する場合は、すべてのソフトウェアが独自の共焦点ファイル形式を正しく読み取ることができるわけではないため、Zステップサイズが正しく転送されていることを確認してください。たとえば、ZENラインスキャン画像をフィジーにインポートするには、最初に[ファイル/エクスポート]コマンドを使用して、[フル解像度の画像]ウィンドウ(シングルプレーン形式)に.tifとしてエクスポートしてから、フィジーにインポートします。YZ scan.lsm はフィジーで直接開くことができますが、Z ステップ サイズの評価が正しくないため、結果の YZ 画像は通常 Z 次元で圧縮されます。 - ZENを用いた分析
- まず、 XY scan.lsm ファイルを ZEN で開きます。 [グラフィックス ]タブに移動し、[線]ツールを選択します。体節17の2つの垂直筋中隔の間に、筋腫の長さ全体(魚の前後軸に平行)にまたがる線を引きます。Mボックスにチェックを入れて、測定値を表示します(長さ= 89.71 μm、 補足ファイル2を参照)。
- YZ スキャン .lsm ファイルを開きます。[グラフィックス] タブで、[閉じたベジェ] ツールを選択します。筋腫の周囲に描きます。完了すると、Mボックスをチェックすると、測定値が表示されます(面積= 11980.01 μm2、補足ファイル3を参照)。
- 各測定値の値をスプレッドシートに手動で記録します。必要に応じてCSA測定値を平均します。筋腫の体積は、体積=筋腫の長さx CSA、すなわち、89.71μm x 11980.01μm2 = 1.075 x 106 μm3として計算することができる。
- フィジー/ImageJを用いた解析
- フィジー/ImageJで XY scan.lsmファイルを開きます。フィジーで直接開かれた XY 画像が、本来あるべき縮尺で正しく校正されているかどうかを確認します。
- アイコンから 直線 ツールを選択します。ステップ4.3.1の説明に従って、体節17の長さに沿って線を引きます。[ 分析]に移動して測定パラメータを設定し、[ 測定値の設定]を選択して、次の[ 面積 ]と [表示ラベル]チェックボックスをオンにします。測定するには、ホット キーMを押すか、[ 分析 ]メニューに移動して [測定]を選択します。結果のポップアップウィンドウにすべての測定値が一覧表示されます(つまり、長さ= 90.023 μm、 補足ファイル4を参照)。結果は.csvの形式で保存し、その後の分析のためにMicrosoft Excelなどで開くことができます。
- YZ画像のCSAを測定するには、手順4.2の説明に従ってYZ画像を.tif形式で開きます。
- YZ.tif画像は、エクスポート時にキャリブレーションされていないため、キャリブレーションします。キャリブレーションのパラメータは、選択した画像の情報に移動することでZENで取得できます:スケーリングX(0.489 μm)とスケーリングZ値(0.890 μm、補足ファイル5を参照)を記録します。次に、フィジーで画像が開いている間に、[画像]に移動し、[プロパティ]を選択します。ピクセル幅とピクセル高さに 0.489 μm、ボクセル深度に 0.890 μm を入力します。YZ画像の繰り返し測定が予想される場合は、キャリブレーションを普遍的に適用するには、[グローバル]チェックボックスをオンにします(補足ファイル6を参照)。
注意: すべての YZ 画像が同じスキャンパラメータを使用してキャプチャされていることを確認してください。Fiji/ImageJを再起動するか、新しいキャリブレーションセットが必要な場合はキャリブレーション値を変更します。 - キャリブレーションされた YZ 画像のCSAを測定するには、アイコンから ポリゴン選択 ツールを選択します。体節の周囲を描き、 M を押して測定値を表示します(面積= 11980.395 μm2、 補足ファイル7を参照)。筋腫の体積は、体積=筋腫長x CSA、すなわち、90.023μm x 11980.395μm2 = 1.079 x 106 μm3として計算することができる。
- 他のXYおよびYZ画像で測定を繰り返します。一貫性を保つために、実験シリーズ内のすべての測定に同じソフトウェアを使用することをお勧めします。各ソフトウェアからの推定体積は類似していますが、ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3およびFiji/ImageJ = 1.079 × 106 μm3という異なる描画ツールのために同一ではありません。2つの時点(すなわち、3〜4 dpf)間の筋腫の成長は、(ボリューム4 dpf - ボリューム3 dpf)/ボリューム3 dpf × 100%として計算できます。
注:エラーとその修正について。マウント中、魚は矢状面(つまり、前後軸と背腹軸)をできるだけ水平に近づけて、それぞれヨーとロールを避けるために向ける必要があります。これは、 XY スキャンから測定された筋腫長Lと YZ スキャンから測定されたCSAの両方が、斜めの前後のマウントにより魚がヨー(背腹軸周りの回転)を示す場合、過大評価されるためです。取り付け中のピッチもロールも、セクション3で説明されているように、スキャン後の測定に影響を与えることはありません。それにもかかわらず、背腹回転(ロール)は画質を低下させます。単純な三角法は、測定されたLとCSAがそれぞれ(cosq)-1に比例して増加するため、最大10°のヨーが体積測定に3%の誤差を与えることを示しています(qは前後水平(ヨー)から離れた角度です)。15°と20°オフは、それぞれ7%と13%のボリュームの過大評価を与えます。
脊索は円筒形であるため、 YZ スキャンに脊索全体を含めることで、長軸と短軸の向きと大きさから傾斜角と傾斜範囲を計算し、それによって測定されたLとCSAを補正して精度を最大化できます。補正されたCSA = 測定されたCSA x ノートコード短軸/ノートコード長軸。補正されたL =顕微鏡 Z 方向のノートコード短軸/ノートコード軸を測定。
さらに検討すると、Lの追加修正が可能になります。筋腫が成長するにつれて、内側筋腫が外側筋腫のわずかに前方になるように、冠状平面(背腹軸に垂直)に歪む。背側から見ると、左右の垂直筋中隔は前方を指す広い山形を形成します。ヨーが低い場合、この形態はLの測定に影響しません。しかし、ヨーが有意な場合、三角補正は困難になり、より良いアプローチは、前方と後方の垂直筋中隔が水平筋中隔で脊索と出会う2点のXYZ座標を推定することによって真のLを直接測定することです。単純な三角法では、これらの座標から L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2] として真の L を計算できます。この最後のアプローチの弱点は、a)ポイントの選択がオペレータによって異なる可能性があること、およびb)選択されたポイントの視覚的な記録が保持されないことです。この考慮事項は、CSA の修正には影響しません。
5.オプションの方法:筋肉の電気的活動を削除して再導入します
- 刺激室を作成します。
- 6 x 35 mmのウェルプレートを取り、細いはんだごてを使用して、各ウェルの両側に2つの小さな開口部(直径<5 mm、1 cm間隔)を作成します(図1を参照)。
注意: 高温のはんだごては慎重に取り扱い、蒸気を吸い込まないように必要に応じてヒュームフードで作業してください。 - 銀または白金のワイヤー(長さ~20 cm)を各ウェルの開口部に通します(図1を参照)。再利用可能な接着剤(BluTackなど)を開口部の近くに塗布して、ワイヤーを所定の位置に保ち、ワイヤー間の1cmの間隔を確保できます(図1を参照)。
- 6 x 35 mmのウェルプレートを取り、細いはんだごてを使用して、各ウェルの両側に2つの小さな開口部(直径<5 mm、1 cm間隔)を作成します(図1を参照)。
- 3 dpfで、魚を3つの条件に分割します:魚のミディアムコントロール、非アクティブ、および非アクティブ+スティム。
- 非アクティブおよび非アクティブ+スティムグループの場合、受精後72時間(hpf)にトリカイン(0.6 mM)で幼虫を麻酔します。.
注:参考文献38に従って、トリカインストックの凍結アリコートを解凍し、魚に添加する前に希釈します(40 μL / mL魚培地、最終濃度0.6 mMまで)。一部の魚は高用量を受け取る可能性があるため、魚を含む水に直接トリカインを加えないでください。トリカインストックは1か月以内に使用する必要があり、再冷凍しないでください。 - 魚の培地コントロールフィッシュの場合は、麻酔をかけずに残します。
- 非アクティブおよび非アクティブ+スティムグループの場合、受精後72時間(hpf)にトリカイン(0.6 mM)で幼虫を麻酔します。.
- トリカイン曝露開始後の選択された時間(すなわち、80 hpf)に、刺激のために非アクティブ+スティムグループを準備します。.
- 60 mLの2%アガロース(60 mLの魚培地に1.2 gのアガロース粉末)を準備し、電子レンジを使用して完全に溶かし、冷却し、トリカインを加えて、刺激チャンバーの各ウェルに4 mLを注ぎます(図1)。
- 電極間にカスタムメイドの4ウェルコームをすぐに追加します(目的の寸法のプラスチック(ポリプロピレンなど)を切り取り、瞬間接着剤を使用してくっつくことによって作成されます; 図1を参照)。ゲルが固まるまで10分待ちます。櫛を慎重に取り外して、4つの長方形のウェルを作成します。
- 各ウェルをトリカイン水で満たし、マイクロピペットを使用して、電極に垂直な前後軸で、麻酔をかけたInactive+Stim幼虫を各ウェルに1つ配置します( 図1を参照)。
- 解剖蛍光顕微鏡で、各魚がチャンバーの各ウェル内で完全に麻酔されているかどうかを確認します。
- チャンバーの片側の各電極に接続されたワニのクリップを使用して、極性コントローラー を介して 調整可能な電気生理学的パターン生成刺激装置をチャンバーに接続します( 図1を参照)。
注意: 極性コントローラーは、電極の電気分解と腐食を防ぐために、5秒ごとに極性を反転するために使用されます。 - 魚を刺激します。たとえば、200、20 Vパルスの列、0.5 msのパルス持続時間、4.5 msのパルス分離で1秒、5秒ごとに効果的な繰り返し破傷風収縮抵抗レジームが得られます。
- 定期的に顕微鏡でチェックして、魚が刺激されていることを確認してください。電気刺激の例は、5秒に1回、目に見える両側収縮とわずかな動きを誘発するはずです。
- 抵抗/高力レジームの場合、魚を5分間、3回、5分間の発作で刺激し、各試合を5分間の休息で区切ります。
注:チャンバーの片側の魚が休んでいる間、ワニのクリップをチャンバーの反対側の電極ペアに接続し、それらの追加の魚を刺激することができます。 - 刺激後、プラスチック製のピペットで魚を静かに洗い流して各ウェルから魚を慎重に取り出し、新鮮なトリカイン含有魚培地でインキュベーターに戻します。
- チャンバー内からトリカイン水を注ぎ、鉗子を使用して各ウェルからアガロースを切断して除去します。井戸を水道水ですすぎ、乾燥させます。
注意: 銀線電極を使用する場合、刺激実験後に酸化銀が線の表面に蓄積することがあります。酸化銀は銀よりも導電性が低いため、再現性を維持するために、セットアップを再利用する前に、キムワイプを使用して酸化銀をワイヤーから慎重にこすり落としてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
体節体積の迅速かつ正確な測定
ゼブラフィッシュ幼虫の筋肉成長の迅速な測定を可能にするサンプル調製、データ収集、および体積分析の方法が記載されている。筋肉サイズは、膜標的GFP(β-アクチン:HRAS-EGFP) またはmCherry(α-アクチン:mCherry-CAAX )で原形質膜に標識された魚を使用して、生きた動物で測定できます。幼虫をトリカインを用いて一過性麻酔し、低融点アガロースに装着し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて画像化した。ソマイト17は、体幹尾界面31でのアクセス可能性を考慮して、筋肉サイズの分析のために選択された。実際には、理論と同様に、筋腫体積は、筋腫長(L)と3つの断面積測定値(CSA)の平均の積として計算できます(図2A、これは4スライス法と呼ばれます)。
この方法を検証するために、生きたゼブラフィッシュ幼虫の全筋腫共焦点Zスタック(図2B)を取得し、各スライス(80〜100スライス)の体節17プロファイル領域の合計にスライス間距離(1〜1.2μm)を掛けて体節体積を計算しました。4スライスとフルスタックの計算方法の間に強い相関関係が観察されました(図2C)。ただし、4スライス法では、一般的にわずかに大きい体積推定値(平均で~2%大きい)が得られました(図2D)。この違いは、a)誤って大きな体積測定を行うサンプルの傾斜、またはb)ゼブラフィッシュの筋腫が前後軸に沿って先細りになり、動物の尾に向かって小さくなるという観察のいずれかが原因である可能性があります。YZa、YZm、およびYZp CSA測定値は体節17筋腫山形の前部に向かっているため(図2A)、後者の解釈は、体節16および18の筋腫の体積分析によってテストされました。 各体節は後ろの体節よりも約7%大きかった(図2E)。さらなる分析により、単一のYZ測定のみを必要とする2スライス法は、上軸性および催眠性の半分が水平筋中隔(YZm)で出会う体節の中央に位置し、XYスライスが筋腫体積のかなり正確な推定値を与えることが明らかになりました(図2F、G)。2スライスアプローチは、時間の制約によりスキャンできる魚の数が制限されている場合に、より迅速なデータ取得を可能にします。要約すると、これらのデータは、生きたゼブラフィッシュ幼虫において筋腫体積を迅速かつ正確に測定できることを示している。単一の幼虫は、この方法で6日間にわたって首尾よく、繰り返し測定されました。
同定された組織単位の成長の比較研究のために、記載された方法は、信頼できる正確な体積推定を提供する。ただし、正確な絶対ボリュームを取得するには、いくつかの変更を適用できます。まず、ディッシュまたは顕微鏡ステージを傾けて、イメージング中により良い横方向のYZおよび傍矢状XYスライスを取得するか、YZスライスの脊索プロファイルを使用することにより、斜め取り付けによって引き起こされるエラーを修正できます。断面の短径は円筒形の脊索の真の直径を明らかにし、その長軸は傾斜角と大きさを明らかにします(上記のポイント4.6の注を参照)。第二に、スキャン中のXYおよびYZセクショニングの位置は、所望の筋腫を正確に反映するように選択されなければならない。(上記のポイント4.6の注を参照)。ただし、筋腫シェブロンの形態は発生段階によって変化するため、YZスキャンを選択する際にはこれを考慮する必要があります。最後に、筋腫17の変化が軸全体にわたる筋成長を反映しているかどうかを決定するために、体幹または尾部領域へのさらに筋腫を記載した方法によって測定してもよい。
繰り返し測定すると体節の成長が明らかになります
記載された方法の利点は、単一の魚に対する反復分析の容易さである。個々の胚と幼虫は、明らかな長期的な影響を被ることなく、繰り返し埋め込まれ、測定され、放出されます(図2H)。筋腫は、LとCSAの両方で2〜5 dpfの間で検出可能に成長し、体積が着実に増加します(図2H)。このようにして1〜8 dpfの成長が画像化され、幼虫も画像化後に放出され、成虫期に成長しました。幼虫期後期のさらなる解析は可能であると予想されるが、画像化されていない兄弟と比較して、摂食行動に対する反復画像の影響を注意深く監視する必要がある。重要なことに、色素沈着の発達はイメージングを不明瞭にする可能性があります。色素沈着は適切な向きの魚では問題になりませんが、メラノフォアの縞模様が必要な測定を妨げないため、斜めに取り付けられたサンプルでは色素がより問題になる可能性があります。 ロイ;ミトファ39などの色素沈着変異株の使用が予想され、実行可能な共焦点スキャン深度の限界に達するまで成長測定の時間枠が延長されます。
記載された手順のさらなる利点は、短期間にわたるそれらの全筋腫と比較して、単一繊維の成長の詳細な分析の容易さである。DNA注入による繊維のモザイク標識により、同定された個々の繊維の核獲得と成長を4時間にわたって検出し、その後の再分析を可能にする方法が開発されました(図2I)。また、筋腫全体の成長は、12時間以下26 時間にわたって測定することができる(およびデータは示さず)。同じ魚を繰り返し測定することにより、個体間の変動が排除され、少数の動物が統計的にロバストな結果をもたらすことができる26。
体節の体積を変える操作を容易に検出できます
現在のプロトコルでは、身体の不活動の変化など、さまざまな生物学的および生理学的条件下での筋肉成長の変化を調べることができます。電位依存性Na+ チャネル40を阻害することによって神経活動電位をブロックする麻酔トリカインは、 β-アクチン:HRAS-EGFP 幼虫の筋肉不活動を誘発するために使用されました。前に示したように26、3番目と4番目のdpfの間の24時間の不活動は筋腫体積を大幅に減少させ、幼虫の筋肉の成長が活動依存性であることを示しています(図3A)。不活性の影響は、mCherry-CAAX(トランスジェニックラインまたはmRNA注射のいずれか)や幼虫をBODIPY色素に一晩浸漬するなど、体節の構造を明らかにする他の検出方法を使用して調べることもできます(図3A)。後者のアプローチは、トランスジェニックバックグラウンドに魚を交配したり、胚を注入したりする必要性を排除しますが、BODIPYの毒性のために繰り返し測定には使用できません。したがって、現在の方法では、筋肉組織の体積の変化を再現可能に測定することができます。
上記のように、遺伝的マーキング法を使用して筋腫体積を繰り返し測定することができ、個々の魚の連続した数日間にわたる筋肉サイズの変化を追跡することができます。同じ発達段階にある個々の魚と産卵全体では、絶対筋腫体積が異なるため(図3A;おそらく卵のサイズまたは健康状態による)、各個体の成長を測定する能力は、ペアのサンプル統計分析を可能にすることにより、個体変動の影響を軽減します。同じ魚を繰り返し測定することで、効果を確実に検出するために必要な魚の数を減らします。この効果を説明するために、活動性幼虫と非活動性の幼虫の集団における各個体の成長を3 dpfから4 dpfに分析した結果を、4 dpfで作成された筋腫サイズの単一の測定値のみを使用して同じ2つの集団の分析と比較しました。レイからレイまで、筋腫体積を4 dpfのみで測定した場合、各個体の4/3 dpf体積を測定する場合と比較して、筋腫サイズの見かけの減少に大きなばらつきが観察されました(図3B)。4/3 dpf法(78%-89%)と比較して、4 dpfのみの測定では削減の範囲が広く(68%-91%)、2つの測定値間の相関が弱いことに注意してください。予想通り、13の生物学的反復すべてにわたる平均減少は、4/3 dpf法で82.62 ± 1.01%(±SEMの平均、n = 13)、4 dpfのみの方法で82.31 ± 1.92%と各評価で類似していましたが(図3C)、4 dpfのみの方法で推定誤差は4/3 dpf法のほぼ2倍でした。したがって、繰り返し測定することによって個々の成長を定量化することは、以前に実証されたように、同じ産卵内の魚間のサイズのばらつきを排除することによって、より正確な方法です26。それにもかかわらず、4 dpfのみで筋腫体積を測定した場合、不活動による筋腫体積の減少に有意差は見られなかったため(図3C)、データは、産卵中の個体間サイズ差を平均化するのに十分である~6〜8匹の魚が十分であることを示唆しています。明らかに、サイズの変化が小さい場合は、4/3 dpf法が好まれます。
細胞成長基盤の分析
筋腫CSAは、筋線維数と線維サイズによって決まります。繊維数は、3つのYZセクション(YZ a、YZ m、YZp)上の高速繊維および低速繊維の数を数えることによって推定することができる。2つの隣接する筋腫の領域はこのようなYZ切片に含まれるが、ほとんどの切片に垂直筋隔壁(VM)が存在することによって示されるように(図2A)、これらのカウントは繊維数を正確に反映している。オーバーカウントは、VMで隣接する各セグメントからのファイバのペアが先細りになっているため、VMで発生します(図4A)。このような過カウントは、次の式を用いて説明することができる:繊維数=総繊維数−(VMと接触する繊維)/2参照33。さらに、平均繊維体積は、筋腫体積を線維数で割ることによって決定することができる。これらの分析を使用して、活性が成長の両方の細胞的側面を制御することを明らかにしました(図4B、C)。
図2Aから、筋腫全体で繊維のサイズが異なることは明らかですが、計算された平均線維体積測定には反映されていない現実です。2匹の魚から体節17の各繊維を周囲に引き寄せることにより、測定された繊維断面積は28μm2から217μm2の範囲であることが示された(図4D)。しかし、実際には、多くの繊維は筋腫内で斜めに角度が付けられているため、このようなCSA測定値は、長軸に垂直な繊維の真のCSAを反映していません。逆に、筋腫内の線維の角度が異なるため、前後に整列していない向きで走るすべての線維は、筋腫の長さとは異なる長さを持ちます。これらの警告は、筋腫を単一繊維体積に完全にセグメンテーションすることによって、または各繊維の傾斜角を測定した後の計算によってのみ回避できるにもかかわらず、測定されたCSAは、各魚の繊維サイズの多様性の推定値を提供します。例えば、個々の繊維は、不活性でCSAにおいて減少し、その結果、活動性(麻酔されていない)対照幼虫に関して累積頻度曲線において左にシフトした(図4E)。不活性魚は活性魚よりも繊維が~10少ないため(図4B)、活性な無麻酔魚由来の最小の10本の繊維(新しい魚であると仮定)または最大の10本の繊維(代替の極値)のいずれかが比較から除外され、筋腫体積の損失のほとんどは繊維の成長の欠如によるものであることが示されました。 新しい繊維形成の失敗ではなく(図4F)。まとめると、これらのデータは、記載された方法が筋肉組織の形成および成長に対する身体活動の役割の詳細な調査を可能にすることを示している。
電気刺激による活動の再活性化
筋肉の成長には身体活動が必要です(図3A)。他の点では不活性な幼虫において電気刺激によって筋肉収縮を再課し、強い収縮応答を喚起する方法が記載されている(図5A、補足ファイル8)。ここでは、筋肉組織を最大限に活性化するための正確な刺激パラメータ(図5B)を説明していますが、プロトコルを変更して(電流振幅、周波数、パルス幅などを変更することにより)、筋肉の活性化と運動量を制御できます。したがって、現在の方法は、運動発作間の標準化された挙動を有する制御された活動刺激を提供し、運動18の現在の動物モデルの重要な制限を克服する。
記載された方法は、筋肉成長の様々な態様(例えば、過形成および肥大)を研究するためにゼブラフィッシュ幼虫を使用する可能性を実証する。特に、ゼブラフィッシュ幼生の筋形成は、薬理学的に誘発された不活性および電気的に誘導された収縮性を介して分析に適していることが示されています。このアプローチは、身体活動が in vivoで筋肉の成長につながる分子メカニズムの研究を可能にする。
図1:ゼブラフィッシュ幼生への筋電気活動の再導入のための刺激室の設計。 電極を取り付けた6ウェル細胞培養プレートにより、2%以内のアガロースゲルで作成されたウェル内の幼虫の維持が可能です。カスタム4ウェルコームは、個々の魚の幼虫の位置と向きを維持し、電気刺激時に激しいけいれん中に銀線に接触するのを防ぐために、アガロースで長方形のウェル(示されている寸法)を作成するために作られています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:生きたゼブラフィッシュα-アクチン:mCherry-CAAX(A、B、E)またはβ-アクチン:HRAS-EGFPトランスジェニック幼虫(H、I)の筋肉量の測定。側面図から画像化された幼虫は、上部パネル(A、B、E)で背側から上、前方から左に示されています。(A)4スライス法では、XY平面上の垂直筋隔壁(VM)間で測定された体節17(L)の長さ(青矢印)に、YZ平面上で測定された3つの断面積(CSA)の平均(YZm、YZa、YZp、黄色破線)を乗じて筋腫体積を計算した。(B)Full Stack法では、生きたゼブラフィッシュ仔魚のZスタック全体の各スライスにおいて、体節17筋腫の面積を測定し(例は黄色で概説)、筋腫面積の合計にスライス間距離を乗じた。(C)4スライス法とフルスタック法の間の高い一致率。色は個々のβ-アクチン:HRAS-EGFP(正方形)またはα-アクチン:mCherry-CAAX(円)魚を示します。(D)筋腫体積は、4スライス法を用いて計算すると、わずかに、しかし有意に大きくなる。(E)先細りゼブラフィッシュ幼生では、4スライス法で測定すると、後体節よりも前体節が多い。(F,G)3つのCSA切片の平均(4スライス法)または1つのYZm CSA(2スライス法)を用いて行われた体積測定の間に強い相関関係がある。p値は、等分散(D,G)の2つの尾側t検定、またはボンフェローニ事後検定(E)を使用した一元配置分散分析の結果を示します。NS、重要ではありません。(H)β-アクチン:HRAS-EGFPおよびmyog:H2B-mRFPを発現する3匹の魚(色)における2〜5 dpfの筋腫16の体積、長さ(L)および断面積(CSA)の測定。各時点での緑色の個体のYZm画像は上に示されています。(I)自動定閾値セグメンテーションによって測定された単一繊維の成長。β-アクチン:HRAS-EGFP;myog:H2B-mRFP魚を1-2細胞期にCMV:セルリアンプラスミドを注射してモザイク標識した魚。ソマイト10のセルリアンマークファイバーを、Zeiss LSM880上で高解像度のフルXYZスタックで繰り返しスキャンしました。示されている画像は、代表的な単一スライス(左)と3次元セグメント化されたボリュームの投影(右)です。グラフ上の各データポイントは、3 dpf (0 時間)、4 時間後、および 5 dpf (54 時間) での同じファイバーの 1 回のスキャンを表します。再現性を示すために、3回のスキャンが行われ、時点ごとにセグメント化されました。白い矢じりは繊維核を指しています。2つの核が3〜5dpfの間に追加されることに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:体節の活動依存的な筋肉成長 17. (A)トリカイン(ピンク)を3〜4 dpfで適用することにより24時間の活性を阻害すると、兄弟のビヒクルコントロールと比較して、トランスジェニック系統とBODIPYで染色された非トランスジェニック魚の両方で筋腫体積が減少します(青)。体積は4スライス法で定量した。シンボル形状は、異なる産卵(生物学的複製)からの複製実験を示す。大きな記号は、SEM値±平均値を示します。小さなかすかな記号は、個々の複製幼虫の量を示しています。(B)4 dpfでの筋腫体積の単一測定(4 dpfのみ、上の概略図)または3〜4 dpfの筋腫体積の変化(4/3 dpf、下の概略図)によって決定された対照兄弟と比較した不活性魚の筋腫体積の減少の比較。各記号は、単一の産卵からの~5匹の不活性魚の筋腫17の平均体積を、~5匹のアクティブな対照兄弟の平均筋腫17体積で割ったものを表します。(C)4 dpfのみまたは4/3 dpfの方法で測定した場合、非活動魚の筋肉成長の平均減少に差は見られませんでした。バー内の数字は、分析された魚の総数を表します。 p値は、ボンフェローニ 事後 検定(A)を使用した二元配置分散分析(A)または不等分散(C)を使用した両側 t検定の結果を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:不活動によって引き起こされる筋肉成長の細胞レベルの変化。 (A)青と赤の筋腫が出会う先細りの繊維の二重カウントによってVMでどのように過カウントが発生するかを示す概略図。平均ファイバー数は 6 ですが、真の平均値は 5.5 です。補正されたカウントは、より良い近似値を提供します。(B,C)繊維数(B)と平均繊維体積(C)は、活動的な(bue)幼虫と比較して、不活性(ピンク)で減少します。シンボル形状は、異なる産卵(生物学的複製)からの複製実験を示す。大きな記号は、SEM値±平均値を示します。小さいかすかなシンボルは、個々の複製幼虫の価値を示しています。バー内の数字は、分析された魚の総数を表します。(D)単一の幼虫では、筋腫17の各線維プロファイルが概説され、CSAが決定されました。ボックスはSEM±平均値を示し、 p値は、ボンフェローニ 事後 検定(B、C)または等分散(D)の両側 t検定を使用した二元配置分散分析の結果を示します。(E,F)アクティブコントロール(青)および非アクティブ(ピンク)幼虫における繊維サイズ分布を示す累積頻度曲線。全ての繊維(E)の比較、または推定新生の省略後、小さい、または別の極端なところでは、大きな繊維(F)は、線維サイズの増加が、繊維数の増加ではなく、主に筋腫の活動主導の成長を説明することを示している。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:短時間の電気刺激は、麻酔をかけたゼブラフィッシュ幼虫の破傷風性筋収縮を誘発します。 (A)電気刺激が麻酔された幼虫の最大収縮を3dpfでどのように引き起こすかを示す連続画像( 補足ファイル8のビデオからキャプチャ)。秒単位のタイム スケール。赤いボックスは、3つの連続した1秒の刺激トレインの開始時の動きを示します。各画像は40ミリ秒の露出です。(B)200高周波、20Vの電気インパルスの1秒列が5秒ごとに与えられる電気刺激レジームを示す概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1: 顕微鏡 XYZ 参照フレーム(黒軸)に対する完全(左上)および不完全に取り付けられた幼虫の撮影画像の概略図。筋腫(緑)、脊索(黄色)、神経管(黄褐色)、測定された筋腫パラメータ(赤)、測定された脊索パラメータ(黒い矢印)、および可能または実際の魚の回転(青)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2: ZEN の XY 画像から体節長を測定したスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3: ZEN の YZ 画像からの CSA 測定を示すスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4: フィジー/ImageJの XY 画像からの体節長測定を示すスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル: ZENからの YZ 画像のキャリブレーションパラメータの抽出を示すスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル6: フィジー/ImageJでの YZ 画像のキャリブレーションを示すスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル7: フィジー/ImageJの YZ 画像からのCSA測定を示すスクリーンショット。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル8: トリカイン麻酔をかけた3 dpf幼虫の直接電気刺激(長さ1秒)によって引き起こされる筋肉収縮を示す代表的なビデオ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本稿では,色素沈着が画像形成に大きな支障をきたさない段階や遺伝的変異において,一過性の麻酔や固定化が忍容性が高い場合に,生きたゼブラフィッシュ幼生の筋肉量を正確かつ効率的に推定する方法について報告する.これまではレーザー走査型共焦点顕微鏡を採用してきましたが、ここで説明するアプローチは、スピニングディスク共焦点顕微鏡やライトシート顕微鏡、および異なる焦点面で画像のスタックを作成するその他の方法に適用できます。組織サイズと細胞含有量の推定に対する一連のますます洗練されたアプローチについて説明します。それぞれの方法には利点と制限があり、定量化できることを示しています。組織成長の研究における主な制限は、急性投与された刺激によって触媒される一連の分子または細胞内イベントに応答して成長速度が変化するため、成長変化をリアルタイムで分析することの難しさです。さらに、個人差は、別々の個人を比較するときに問題を引き起こす可能性があります。現在のアプローチでは、単一の生きている個体における1日未満の期間にわたる組織成長の測定が可能です。このアプローチの適用は、分単位のタイムスケールで想定できます。
記載された方法は、これまで実行不可能であった分析を可能にする。4スライス法を使用すると、筋肉成長アッセイのイメージング部分は、訓練を受けたオペレーターによって1時間以内に約20匹の魚のサンプルサイズで完了することができます。これは、同じ数の魚に対して少なくとも3時間かかる(つまり、3倍長い)従来のフルスタック法とはまったく対照的です。その後の細胞内解析に高解像度の画像が必要な場合、フルスタック法は魚1匹あたり30分を簡単に必要とし、同様の発生段階にある動物のコホートの成長アッセイを不可能にします。対照的に、2スライスまたは4スライス法では、高速で高品質の画像キャプチャが可能です。画像解析の検討に移ると、フルスタック法に比べて、オペレーターの時間を節約する(自動画像セグメンテーションがない場合)2スライスまたは4スライス法の利点は非常に大きいです。各魚はフルスタック分析に約20分かかりますが、3スライス分析には4〜4分しかかかりません。オペレーターの時間は、ほぼ正確な2スライス法を使用してさらに節約できます。したがって、記載された方法は効率的であり、それによって実験計画における柔軟性を高める。
4スライス法または2スライス法の主な制限は、体節の山形形状が重なっているため、両方の方法が推定値であることです(たとえば、2つの隣接する体節の領域の体積(例:筋腫16および17)。これにより、 YZ スライスが選択された場所に応じて、実際の筋腫17の体積を約2%過大評価できる可能性があることが示されています。さらに、測定中の体節境界の手動トレースは、実験者間の差はほとんど見られなかったが、推定値の変動に寄与する可能性がある(データは示されていない)。測定誤差は、閾値化、フィルタリング、およびセグメンテーションアルゴリズムを使用して対処し、より客観的で再現性のある方法で表面積を取得できます。ただし、バックグラウンド蛍光の変動(LMAの埋め込みや厚さなど)および個々の幼虫の蛍光タンパク質の発現レベルの経時的な変化を考慮するために、カスタマイズが依然として必要になります。このような自動測定は、 β-actin:HRAS-EGFP ラインなどの非筋肉特異的レポーターを使用する場合、さらに困難になることに注意してください。それにもかかわらず、多くの状況下で、例えば、すべての筋肉組織に影響を与えると予想される異なる治療を受けた魚間の操作の効果を比較する場合、不正確さは重要ではないかもしれません。ただし、たとえば、筋腫17のみから数えた繊維番号または核番号との比較に最大限の精度が必要な場合は、「スライス」法を改善できます。これは、骨の折れるフルスタック法を使用するか、測定された4スライスボリュームに0.98を掛けることによる数学的補正、または YZ CSAスキャンの位置を後方に移動して筋腫17の真のCSAをより正確に反映することによって達成できます。
この方法の第2の制限は、魚の取り付け方向に対するその感度である。実際には、熟練したオペレーターは、多くのサンプルを埋め込むために迅速に作業している場合でも、ほとんどの場合、妥当な範囲内で魚を方向付けることができます。顕微鏡ステージ上の機器への変更は、スキャンの前にヨーとロールの補正を可能にすることが想定できます。そのような装置なしで、測定された体積を補正するために使用することができる方向のずれを定量化する方法が説明される。さらに、方向のずれによって測定体積のばらつきが大きくなり、小さな効果サイズが観察される機会が減少したとしても、多くの場合、そのような変動は対照サンプルと実験サンプルに同様に影響を及ぼします。したがって、オペレーターが問題を認識している場合、誤検知の結果が発生する可能性はほとんどありません。
記載された方法は、筋肉成長における電気的活動の役割を分析するために最初に適用されており、広範囲の種で分析の長い歴史を持つ主題である(18でレビュー)。この目的のために、内因的に引き起こされた活動をブロックする簡単な方法が詳細に説明され、ゼブラフィッシュの幼虫の制御されたパターン化された電気刺激に置き換えられます。このアプローチの利点は、神経フィードバックコントロール40の除去、栄養の変化の影響の排除、およびタンパク質代謝回転などの成長プロキシではなく、成長自体に対する概日効果を分析する能力です26。電気的活動の異なるパターンが明確な筋肉反応を引き起こし、繊維の種類、サイズ、および代謝を調節するため41,42,43,44,45,46,47,48、現在の方法はゼブラフィッシュをそのような分析に開放します。
記載された方法は、比較的未踏のゼブラフィッシュを利用することにより、筋肉生理学、細胞生物学、および病理学の多くの側面を前例のない時間的および空間的分解能で分析できる一連の技術を提供する。現在のアプローチは、他の種、体の領域、および発生段階に明確に適用できます。ゼブラフィッシュ幼虫の急速な早期成長は、組織の成長と形態形成に対する操作の急性の影響の検出を特に魅力的な研究分野にします。さらに、ゼブラフィッシュの筋肉は、哺乳類と様々な成長メカニズムと制御を共有することが示されています。ゼブラフィッシュは、筋肉の分子遺伝学、細胞、および人間との発生生物学の多くの側面を保存する脊椎動物ですが、筋肉の成長の制御にも大きな違いがあります。たとえば、魚では遅い繊維と速い繊維のタイプがより明確に空間的に分離されており、筋肉の神経支配に違いが見られます。さらに、これまでのところ、開発の初期段階しか分析できなかったことに留意する必要があります。後の段階で同様の分析が想定されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、記載されたプロトコルの開発のためのヒューズ研究室のメンバーであるSeetharamaiah Attili、Jana Koth、Fernanda Bajanca、Victoria C. Williams、Yaniv Hinits、Giorgia Bergamin、およびVladimir Snetkov博士の努力、およびプラスミドまたはゼブラフィッシュ系統を共有したHenry Roehl、Christina Hammond、David Langenau、Peter Currieに深く感謝しています。SMHは、プログラムグラントG1001029、MR / N021231 / 1、およびMR / W001381 / 1サポートを持つ医学研究評議会(MRC)の科学者です。MAは、キングスカレッジロンドンでMRC博士課程の博士課程の学生資格を取得しました。この研究は、学者、メンター、そして友人であるデビッドM.ロビンソンの三角関数の入力から恩恵を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive, Blu Tack | Bostik | - | - |
| Aerosol vacuum | - | - | - |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | - |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | A9414 | Once melted, keep at 37oC in a block heater to remain in liquid form for repeated use. |
| Block heater | Cole-Parmer | SBH130 | - |
| BODIPY FL C5-ceramide | Thermo Scientific | D3521 | To be diluted in fish water and used at 5 µM for overnight incubation. |
| Crocodile clips and wires | - | - | - |
| Fiji/imageJ | National Institutes of Health, NIH | - | - |
| Fish medium, Fish water | - | - | Circulating system water collected from the fish facility. |
| Fish medium, E3 medium | - | - | E3 is described in The Zebrafish Book. http://zfin.org (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, and 0.33 mM MgSO4 in distilled water). |
| Fluorescence microscope | Leica | Leica MZ16F | Fluorescence microscope of other kind are also expected to be suitable. |
| Glass needle | World Precision Instruments, Inc. | 1B100-6 | To be fire-polished to prevent damage of the embryos during manipulation. |
| Grass stimulator | Grass Instruments | S88 | Stimulators of other kind are also expected to be suitable. |
| Kimwipes, Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 13258179 | - |
| Laser scanning microscope (LSM) | Zeiss | Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880 |
LSM of other kind are also expected to be suitable. |
| Nunc Cell-Culture Treated, 6-well plate | Thermo Scientific | 140675 | - |
| Objective, 20×/1.0W water immersion | Zeiss | - | - |
| Pasteur Pipette, Graduated 1 mL | Starlab Group | E1414-0100 | - |
| Pasteur Pipette, Micro Fine Tip 1 mL | Starlab Group | E1414-1100 | - |
| Petri dish, 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | - |
| Plasmid, CMV-Cerulean | Christina L. Hammond (University of Bristol) | pCS2+_cerulean_kanR plasmid injected at 25-75 pg at one-cell stage. Citation: Bussman J, and Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080. | |
| Plasmid, pCS-mCherry-CAAX | Henry Roehl (University of Sheffield) | - | For in vitro transcription using the SP6 promoter (plasmids containing other membrane labelling markers can be used); synthesised capped mRNA to be injected at 100-200 pg at one-cell stage. |
| Pulse Controller | Hoefer Scientific Instruments | PC750 | - |
| Soldering iron | - | - | - |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate/ MS-222; to be dissolved in fish water and used at 0.6 mM. |
| Volocity | Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc | - | - |
| Watchmaker forceps, No. 5 | - | - | - |
| Wire, Platinum | Goodfellow | PT005142/12 | 0.40 mm in diameter; an expensive alternative of silver. |
| Wire, Silver | Acros Organics | 317730010 | 0.25 mm in diameter (a range of diameter i.e. 0.25-0.5 mm had been tested, which produced similar results). |
| Zebrafish, myog:H2B-mRFP | David M. Langenau (Massachusetts General Hospital; Harvard Stem Cell Institute) | - | ZFIN official name: Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2 Citation: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imaging tumour cell heterogeneity following cell transplantation into optically clear immune-deficient zebrafish. Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358. |
| Zebrafish, α-actin:mCherry-CAAX | Peter D. Currrie (ARMI, Monash University) | - | ZFIN official name: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citation: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, and Currie PD. Loss of Tropomodulin4 in the zebrafish mutant träge causes cytoplasmic rod formation and muscle weakness reminiscent of nemaline myopathy. Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376. |
| Zebrafish, β-actin:HRAS-EGFP | - | - | ZFIN official name: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2 Citation: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, and Kimelman D. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252. |
| ZEN software | Zeiss | - | - |
References
- Hammond, J. A discussion on the measurement of growth and form; measuring growth in farm animals. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 137 (889), 452-461 (1950).
- Hubal, M. J., et al. Variability in muscle size and strength gain after unilateral resistance training. Medicine and Science in Sports and Exercise. 37 (6), 964-972 (2005).
- Stillwell, R. C., Dworkin, I., Shingleton, A. W., Frankino, W. A. Experimental manipulation of body size to estimate morphological scaling relationships in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (56), e3162 (2011).
- Gupta, B. P., Rezai, P. Microfluidic approaches for manipulating, imaging, and screening C. elegans. Micromachines (Basel). 7 (7), 123 (2016).
- Duckworth, J., Jager, T., Ashauer, R. Automated, high-throughput measurement of size and growth curves of small organisms in well plates. Scientific Reports. 9 (1), 10 (2019).
- Erlandson, M. C., Lorbergs, A. L., Mathur, S., Cheung, A. M. Muscle analysis using pQCT, DXA and MRI. European Journal of Radiology. 85 (8), 1505-1511 (2016).
- Buckinx, F., et al. Pitfalls in the measurement of muscle mass: a need for a reference standard. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 9 (2), 269-278 (2018).
- Haun, C. T., et al. A critical evaluation of the biological construct skeletal muscle hypertrophy: Size matters but so does the measurement. Frontiers in Physiology. 10, 247 (2019).
- Tavoian, D., Ampomah, K., Amano, S., Law, T. D., Clark, B. C. Changes in DXA-derived lean mass and MRI-derived cross-sectional area of the thigh are modestly associated. Scientific Reports. 9 (1), 10028 (2019).
- Foessl, I., et al. phenotyping approaches in human, mice and zebrafish - Expert overview of the EU cost action GEMSTONE ("GEnomics of MusculoSkeletal traits TranslatiOnal NEtwork"). Frontiers in Endocrinology. 12, 720728 (2021).
- Epstein, H. F., Casey, D. L., Ortiz, I. Myosin and paramyosin of Caenorhabditis-Elegans embryos assemble into nascent structures distinct from thick filaments and multi-filament assemblages. Journal of Cell Biology. 122 (4), 845-858 (1993).
- Hresko, M. C., Williams, B. D., Waterston, R. H. Assembly of body wall muscle and muscle cell attachment structures in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 124 (4), 491-506 (1994).
- Bao, Z., Murray, J. I. Mounting Caenorhabditis elegans embryos for live imaging of embryogenesis. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Schnorrenberg, S., et al. In vivo super-resolution RESOLFT microscopy of Drosophila melanogaster. eLife. 5, 15567 (2016).
- Coquoz, S., et al. Label-free three-dimensional imaging of Caenorhabditis elegans with visible optical coherence microscopy. PloS One. 12 (7), 0181676 (2017).
- Laband, K., Lacroix, B., Edwards, F., Canman, J. C., Dumont, J. Live imaging of C. elegans oocytes and early embryos. Methods in Cell Biology. 145, 217-236 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Attwaters, M., Hughes, S. M. Cellular and molecular pathways controlling muscle size in response to exercise. FEBS Journal. 289 (6), 1428-1456 (2021).
- Morley, J. E., et al. Sarcopenia with limited mobility: an international consensus. Journal of the American Medical Directors Association. 12 (6), 403-409 (2011).
- Bauer, J., et al. Sarcopenia: A time for action. An SCWD position paper. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 10 (5), 956-961 (2019).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Knappe, S., Zammit, P. S., Knight, R. D. A population of Pax7-expressing muscle progenitor cells show differential responses to muscle injury dependent on developmental stage and injury extent. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 161 (2015).
- Gurevich, D. B., et al. Asymmetric division of clonal muscle stem cells coordinates muscle regeneration in vivo. Science. 353 (6295), (2016).
- Berberoglu, M. A., et al. Satellite-like cells contribute to pax7-dependent skeletal muscle repair in adult zebrafish. Developmental Biology. 424 (2), 162-180 (2017).
- Ganassi, M., et al. Myogenin promotes myocyte fusion to balance fiber number and size. Nature Communications. 9 (1), 4232 (2018).
- Kelu, J. J., Pipalia, T. G., Hughes, S. M. Circadian regulation of muscle growth independent of locomotor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (49), 31208-31218 (2020).
- Currie, P. D., Ingham, P. W. Induction of a specific muscle cell type by a hedgehog-like protein in zebrafish. Nature. 382, 452-455 (1996).
- Devoto, S. H., Melancon, E., Eisen, J. S., Westerfield, M. Identification of separate slow and fast muscle precursor cells in vivo, prior to somite formation. Development. 122 (11), 3371-3380 (1996).
- Blagden, C. S., Currie, P. D., Ingham, P. W., Hughes, S. M. Notochord induction of zebrafish slow muscle mediated by Sonic Hedgehog. Genes & Development. 11 (17), 2163-2175 (1997).
- Du, S. J., Devoto, S. H., Westerfield, M., Moon, R. T. Positive and negative regulation of muscle cell identity by members of the hedgehog and TGF-b gene families. Journal of Cell Biology. 139 (1), 145-156 (1997).
- Hinits, Y., et al. Defective cranial skeletal development, larval lethality and haploinsufficiency in Myod mutant zebrafish. Developmental Biology. 358 (1), 102-112 (2011).
- Pipalia, T. G., et al. Cellular dynamics of regeneration reveals role of two distinct Pax7 stem cell populations in larval zebrafish muscle repair. Disease Models & Mechanisms. 9 (6), 671-684 (2016).
- Roy, S. D., et al. Myotome adaptability confers developmental robustness to somitic myogenesis in response to fiber number alteration. Developmental Biology. 431 (2), 321-335 (2017).
- Zhang, W., Roy, S. Myomaker is required for the fusion of fast-twitch myocytes in the zebrafish embryo. Developmental Biology. 423 (1), 24-33 (2017).
- Osborn, D. P. S., et al. Fgf-driven Tbx protein activities directly induce myf5 and myod to initiate zebrafish myogenesis. Development. 147 (8), (2020).
- Cooper, M. S., et al. Visualizing morphogenesis in transgenic zebrafish embryos using BODIPY TR methyl ester dye as a vital counterstain for GFP. Developmental Dynamics. 232 (2), 359-368 (2005).
- Berger, J., Hall, T. E., Currie, P. D. Novel transgenic lines to label sarcolemma and myofibrils of the musculature. Zebrafish. 12 (1), 124-125 (2015).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book - A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PloS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Theriault, R., Boulay, M. R., Theriault, G., Simoneau, J. A. Electrical stimulation-induced changes in performance and fiber type proportion of human knee extensor muscles. European Journal of Applied Physiology. 74 (4), 311-317 (1996).
- Roy, D., Johannsson, E., Bonen, A., Marette, A. Electrical stimulation induces fiber type-specific translocation of GLUT-4 to T tubules in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (4), 688-694 (1997).
- Perez, M., et al. Effects of transcutaneous short-term electrical stimulation on M. vastus lateralis characteristics of healthy young men. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 443 (5-6), 866-874 (2002).
- Boncompagni, S., et al. Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19339-19344 (2007).
- Gundersen, K. Excitation-transcription coupling in skeletal muscle: the molecular pathways of exercise. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 86 (3), 564-600 (2011).
- Egan, B., Zierath, J. R. Exercise metabolism and the molecular regulation of skeletal muscle adaptation. Cell Metabolism. 17 (2), 162-184 (2013).
- Sillen, M. J. H., Franssen, F. M. E., Gosker, H. R., Wouters, E. F. M., Spruit, M. A. Metabolic and structural changes in lower-limb skeletal muscle following neuromuscular electrical stimulation: A systematic review. PloS One. 8 (9), 69391 (2013).
- Khodabukus, A., et al. Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle. Biomaterials. 198, 259-269 (2019).
