Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הדמיה של לוקליזציה תת-תאית של חלבון בלב באמצעות תיוג חיסוני בתיווך נקודות קוונטיות ואחריו מיקרוסקופיית אלקטרונים

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64085
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pathology and Translational Pathobiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, Louisiana State University Health Sciences Center-Shreveport

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לתיוג חיסוני של חלבון במקטעי רקמת הלב באמצעות נקודות קוונטיות. טכניקה זו מספקת כלי שימושי כדי לדמיין את לוקליזציה וביטוי תת-תאיים של כל חלבון ברמה האולטרה-סטרוקטורלית.

Abstract

לוקליזציה תת-תאית היא קריטית לתיחום תפקוד תקין ולקביעת המנגנונים המולקולריים של חלבון מסוים. מספר טכניקות איכותיות וכמותיות משמשות לקביעת לוקליזציה תת-תאית של חלבונים. אחת הטכניקות המתפתחות בקביעת הלוקליזציה התת-תאית של חלבון היא תיוג חיסוני בתיווך QD של חלבון ולאחר מכן הדמיה שלהם במיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). QD הוא ננו-גבישים מוליכים למחצה בעלי תכונה כפולה של מבנה גבישי וצפיפות אלקטרונים גבוהה, מה שהופך אותם לישימים למיקרוסקופיית אלקטרונים. שיטה זו המחישה את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון קולטן סיגמא 1 (Sigmar1) באמצעות QD-TEM ברקמת הלב ברמה האולטרה-סטרוקטורלית. קוביות קטנות של מקטעי רקמת הלב מעכבר מסוג בר היו קבועות ב 3% glutaraldehyde, לאחר מכן osmicated, מוכתם עם אורניל אצטט, ואחריו התייבשות רציפה עם אתנול ואצטון. מקטעי רקמת הלב המיובשים הללו הוטמעו בשרפים אפוקסיים בעלי צמיגות נמוכה, נחתכו למקטעים דקים בעובי 500 ננומטר, הוכנסו לרשת החשמל, ולאחר מכן נחשפו לחשיפת אנטיגן עם 5% נתרן מטאפריוטאט, ולאחר מכן מרווה של שאריות האלדהידים עם גליצין. הרקמות נחסמו, ולאחר מכן דגירה רציפה בנוגדן ראשוני, נוגדן משני ביוטינילציה ו-QD מצומד סטרפטאווידין. חלקים מוכתמים אלה יובשו ככתמים וצולמו בהגדלה גבוהה באמצעות TEM. טכניקת QD-TEM אפשרה הדמיה של לוקליזציה תת-תאית של חלבון Sigmar1 ברמה האולטרה-סטרוקטורלית בלב. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לדמיין את נוכחותו של כל חלבון לוקליזציה תת תאית בכל מערכת איברים.

Introduction

גוף האדם מורכב מחלבונים רבים האחראים על תפקודים גופניים רבים. הפונקציה של חלבונים תלויה במידה רבה לוקליזציה שלהם באיבר ובאברונים התאיים. מספר טכניקות, כולל פיצול תת-תאי, אימונופלואורסצנציה ומיצוי חלבונים בתיווך דטרגנט, משמשות בדרך כלל לקביעת הלוקליזציה התת-תאיתשל החלבון 1,2. מיקרוסקופיה באמצעות צבע אימונופלואורסצנטי היא השיטה הנפוצה ביותר מבין טכניקות אלה. עם זאת, הצבעים הפלואורסצנטיים המשמשים בטכניקה זו פחות יציבים ונוטים להלבנת תמונות3. טכניקות אחרות כללו מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה כדי לדמיין את החלבון ברמה אולטרה-סטרוקטורלית על ידי תיוג חיסוני של חלבונים עם מתכות כבדות צפופות אלקטרונים (זהב, פריטין) או נקודות קוונטיות ננו-גבישים ולאחר מכן הדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM)4,5.

QD הוא ננו-גביש מוליך למחצה המורכב מתרכובות מתכת מוליכות למחצה בעלות תכונות פוטו-לומינסנציה הניתנות לשליטה בעלות משמעות רבה במערכות ביולוגיות3. ננו-גבישים QD מיוצרים בתבנית מעטפת ליבה שבה ננו-גבישים עטופים ביצירת ננו-גבישים כדי להבטיח את יציבותם ותפקודם התקין. שילוב נפוץ של ננו-גבישי קליפת ליבה הם CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS ו-CdTe/CdS/ZnS (ליבה/מעטפת/מעטפת)3. מבין שילובי הננו-גבישים הללו, CdSe/ZnS ו-CdSe/CdS נחקרים במרץ רב ומשמשים לעתים קרובות כנוגדנים משנייםהמצומדים 3,6. לננו-חלקיקי QD אלה יש גם תכונות פלואורסצנטיות עם ספקטרום עירור ופליטה שונה מאשר פלואורופורים מסורתיים. QD משתמש בעירור של אלקטרונים מפס הערכיות בתפזורת כדי להציג תפוקות קוונטיות פלואורסצנטיות גבוהות יותר בהשוואה לפלואורופורים מסורתיים. הסידור הננו-גבישי של מתכות מוליכות למחצה הופך את התיוג בתיווך QD ליציב יותר ועמיד בפני הלבנת פוטו-הלבנה6. בנוסף, ליבת הננו-גבישים ב-QD והמבנה הגבישי שלה מאפשרים ל-QD בגדלים שונים להיות בעלי מגוון רחב של ספקטרום בליעה ופסגות פליטה צרות מאוד7. יתר על כן, חלקיקי QD אלה גדולים מספיק כדי להפיק צפיפות אלקטרונים גבוהה, מה שהופך אותם לשימושיים בטכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, כולל מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה 5,8,9. ננו-גבישי QD אלה זמינים מסחרית גם בגדלים מרובים עם ספקטרום פליטה פלואורסצנטי וצורות שונות, מה שהופך אותם למועמדים מצוינים לתיוג עם נוגדנים מרובים10,11.

טכנולוגיית QD זכתה לחשיבות רבה במחקר הביולוגי בשל תכונות תפקודיות מרובות, כולל שימוש בהדמיית תאים חיים, חקר מנגנוני הובלה בתא, הובלת ממברנה של תנועת הדיפוזיה של החלבון, הטרוגניות תפקודית של תאים וסימון אברונים תוך-תאיים 3,12,13,14,15,16 . QD שימושי גם באבחון מולקולרי למיקוד וגילוי רקמות סרטניות, אפיון הפרופיל המולקולרי של הגידול ומצבו החיסוני, והדמיית גוף הזגוגית והממברנות האפירטינליות 3,17,18. בנוסף, QD יכול לשמש גם בטיפולים רפואיים לטיפול בממאירויות גידול באמצעות טיפול פוטודינמי ואנומליות עיניים על ידי אספקת תרופות לעיניים 3,17,18,19.

באמצעות ננו-גבישי QD שימושיים אלה, המחקר הנוכחי קבע את הלוקליזציה התת-תאית של חלבון בשם קולטן סיגמא 1 (Sigmar1). Sigmar1 הוא חלבון מלווה מולקולרי רב-משימתי המתבטא בכל מקום. מחקרים מקיפים שהתמקדו בלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1 ברקמות ובאיברים שונים דיווחו על לוקליזציה תת-תאית ספציפית לתאים ולרקמות המעוררת תפקוד מולקולרי20. בתאים שונים (תאי עצב, פוטורצפטור ותאי מערכת החיסון) וברקמות (כבד ומוח) תוך שימוש בגישות ביוכימיות שונות, מחקרים דיווחו על לוקליזציה של Sigmar1 ברשתית אנדופלסמית (ER), קרום ER הקשור למיטוכונדריה (MAM), מעטפת גרעין, קרום פלזמה, רטיקולום נוקלאופלסמי, גרעין ומיטוכונדריה. למרות כל המחקרים הללו, הלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1 בלב נותרה לא ידועה20. לכן, הלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1 ברקמת הלב נקבעה באמצעות תיוג חיסוני בתיווך QD ואחריו הדמיית TEM.

Protocol

נהלי הטיפול בבעלי חיים בפרוטוקול זה תאמו את המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (מהדורה שמינית, המכונים הלאומיים לבריאות, בת'סדה, MD) ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת לואיזיאנה - שריבפורט. עכברים זכרים בני שישה חודשים עם רקע FVB/N, שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). העכברים שבהם נעשה שימוש שוכנו בסביבה מוסדרת היטב בכלובים שאפשרו מחזור אור-חושך של 12 שעות, סופקו עם מים ודיאטת צ'או קבועה ad libitum, וטופלו על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות המעבדה. התהליך הכולל מודגם באיור 1.

1. הכנת בעלי חיים

  1. הרדימו את העכברים באמצעות 3% איזופלורן. פתח את החזה על ידי ביצוע חתך אופקי באזור שמעל הבטן האמצעית ומשיכת העור. בזהירות, לעשות חתך נוסף כדי לפתוח את חלל החזה מבלי לנקב איברים אחרים21,22,23.
    1. יש לפרום24 את הלב דרך ה-apex תחילה, ולאחר מכן את החדר הימני באמצעות 3% glutaraldehyde קר בתמיסה קרדיופלגית (50 mM KCl, 5% דקסטרוז ב-PBS, ראה קובץ משלים 1) למשך 2 דקות כדי להבטיח הרפיה מלאה של שריר הלב.
  2. יש לחדור ללב באמצעות 3% גלוטראלדהיד קר כקרח ב-0.1 M של חיץ נתרן קקודילאט (pH 7.4, שלב 2.1.1) למשך 2 דקות נוספות. באמצעות לחץ כבידה, השתמש במחט 25 G 5/8" כדי להכניס את הקיבועים ללב. מיד לאחר שהלב מתחיל להתמלא בקיבוע, הרימו את קצה הלב וחתכו את כלי הדם שמתחתיו ב 1-2 מ"מ מהלב כדי להקל על הלחץ ולאפשר לנוזלים להתנקז.
  3. נתחו את הלב, הסירו את האטריה24 והורידו את החדרים לקור כקרח 3% גלוטראלדהיד/0.1 M נתרן קקודילאט בצלחת פטרי. הכינו חתך פרפר לאחר 30-60 דקות של קיבוע והניחו אותו בצלחת פטרי המכילה 3% גלוטראלדהיד/קקודילאט (ראו טבלת חומרים). קוצצים את הלב באמצעות להב כירורגי בקוביות קטנות של 1 מ"מ3 בזמן שהוא נמצא בתמיסת גלוטרלדהיד/קקודיט.
  4. תקן/טבל את רקמת הלב המנותקת בתמיסת גלוטרלדהיד/קקודילאט למשך 24 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.

2. עיבוד רקמת לב

  1. לאחר 24 שעות של קיבוע, לשטוף את הרקמות ב 0.1 M של חיץ נתרן cacodylate במשך 20 דקות.
    1. הכינו חיץ קקודילאט של 0.1 M לפי השלבים הבאים.
      1. כדי להכין חיץ נתרן קקודילאט 0.1 M, יש להכין ציר של 1 M נתרן קקודילאט על ידי המסת נתרן קקודילאט (21.4 גרם) ותמיסת קלציום כלוריד (3 מ"ל) ב-90 מ"ל מים מזוקקים. הגדל את נפח התמיסה ל -100 מ"ל על ידי הוספת המים המזוקקים. מערבבים היטב את התמיסה ומשאירים אותה למשך הלילה כדי להמיס את המומס.
      2. לאחר מכן, לקחת 10 מ"ל של 1 M נתרן cacodylate פתרון מלאי ולהוסיף אותו 80 מ"ל של מים מזוקקים. כוונן את ה-pH ל-7.4 באמצעות HCl ונפח שלו עד 100 מ"ל על ידי הוספת מים מזוקקים.
  2. חזור על הכביסה בחיץ נתרן קקודילאט 0.1 M למשך 20 דקות נוספות. הסר את הרקמות ממאגר נתרן קקודילאט וטבול אותן בתמיסת 2% אוסמיום טטרוקסיד למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. תהליך זה נקרא אוסמיקציה.
    1. הכן 2% תמיסת אוסמיום טטרוקסיד לפי השלבים הבאים.
      1. כדי להכין תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 2%, קח תמיסת אוסמיום טטרוקסיד 4%, 4 מ"ל (ראה טבלת חומרים), תמיסת מלאי נתרן קקודילאט 1 M (0.8 מ"ל) ומים מזוקקים (3.2 מ"ל) כדי ליצור תמיסה כוללת של 8 מ"ל.
        הערה: כל התהליך הזה והשלבים מכאן חייבים להתבצע במכסה המנוע.
  3. לאחר האוסמיקציה, יש לטבול את הרקמות בתמיסת 2% נתרן אצטט למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. הכינו תמיסת נתרן אצטט 2% על ידי המסת 4 גרם נתרן אצטט ב-20 מ"ל מים מזוקקים.
  4. לאחר מכן, לטבול את הרקמות בתמיסת 2% אורניל אצטט למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    1. הכינו תמיסת 2% אורניל אצטט על ידי המסת 4 גרם של אורניל אצטט ב-20 מ"ל מים מזוקקים.
  5. לאחר הכתמת אורניל אצטט, יש לייבש את הרקמות ברצף באמצעות האלכוהולים המדורגים והאצטון בסדר המוזכר בקובץ משלים 1.

3. הטמעת רקמת לב

  1. הטמע את הרקמות המיובשות בשרף אפוקסי בצמיגות נמוכה בהתאם לשלבים הבאים.
    1. כדי לייצר שרף אפוקסי בצמיגות נמוכה, יש לערבב 10.24 מ"ל של מונומר אפוקסי ויניל ציקלוהקסן דו-חמצני (ERL 4221), 6.74 מ"ל של אתר דיגליצידיל של פוליפרופילן גליקול (DER 732), ו-30.05 מ"ל של אנהידריד נוניל סוקציני (NSA) (ראו טבלת חומרים) בצינור של 50 מ"ל. מערבבים היטב את המתלים ביד במשך 2 דקות.
    2. הוסיפו 18 טיפות של מאיץ אפוקסי 2-דימתילאמינואתנול (DMAE, ראו טבלת חומרים) וערבבו את התרחיף כדי לערבב היטב את הרכיבים.
    3. ספוגים את הרקמות בשרף אפוקסי ברצף הבא של התערובת.
      1. החלף את 100% אצטון עם שרף 1:1: תרחיף אצטון לטבול את הרקמות בו במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
      2. החלף שרף 1:1: תרחיף אצטון עם שרף 6:1: תרחיף אצטון לטבול את הרקמות בו במשך 3 שעות.
      3. לבסוף, החלף את שרף 6:1: תרחיף אצטון עם 100% תרחיף שרף ולהשאיר רקמות שקועות בו לילה בטמפרטורת החדר.
  2. הכניסו את הרקמות לשרף טרי בתבניות מיקרו בקוטר 8 מ"מ (ראו טבלת חומרים) ורפאו את הרקמות המשובצות בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: ודא שהשרף קשה אך לא שביר לאחר הריפוי.

4. חיתוך רקמות באמצעות אולטרה מיקרוטום

  1. חותכים את גושי השרף עם הרקמה לגודל של לא יותר מ-1 מ"מ לפני הרכבתם על האולטרה-מיקרוטום (ראו טבלת חומרים). מניחים את התבנית בדיוק ככל האפשר בזרוע המקוטעת של האולטרה-מיקרוטום ומקדמים ידנית את תבנית הדגימה לעבר סכין היהלום.
  2. חותכים את החלקים בעובי של 500 ננומטר (חצי מיקרון) בעזרת סכין Histo (ראו טבלת חומרים), ובעזרת כלי לולאת EM, הרימו אותם והניחו אותם על מגלשת זכוכית.
  3. הניחו את מגלשת הזכוכית על צלחת חמה לכתם הכחולטולוידין 25 כדי למצוא את אזור העניין.
  4. לאחר מציאת אזור העניין, השתמש בסכין Ultra 45° (ראה טבלת חומרים) כדי לייצר חלקים אולטרה-דקים מזהב חיוור (100 ננומטר). מקם את החלקים האולטרה-דקים האלה בצד העמום של רשת נחושת של 200 רשת.

5. מכתים חתך לב דק במיוחד

  1. התחילו את הכתמים על ידי חשיפת האנטיגן באמצעות תמיסת תחריט, כלומר תמיסת 5% נתרן מטא-פריודיוט.
    1. הכינו תמיסת 500 μL של 5% נתרן מטא-פריודיאט (ראו טבלת חומרים) במים מזוקקים.
      הערה: יש להכין תמיסה טרייה לפני השימוש.
    2. שים 20 μL של תמיסת נתרן metaperiodate על סרט פרפין נקי. מניחים את הרשתות המיובשות לחלוטין עם מקטעי רקמות על הטיפות של תמיסת התחריט.
      הערה: הצד העמום של הרשת עם מקטע הרקמה חייב לפנות לכיוון תמיסת התחריט.
    3. השאירו את רשת המקטע על התמיסה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף את החלק רקמה חרוט על ידי הנחתו על טיפה של מים מזוקקים במשך 60 שניות.
  3. חסום את שאריות האלדהידים על ידי הנחת רשתות המקטעים על טיפה של תמיסת גליצין 0.05 M למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הכתימו את קצוות הרשת על נייר סינון כדי להסיר את תמיסת הגליצין השיורית.
    1. הכינו תמיסת גליצין של 0.05 M (ראו טבלת חומרים) על ידי המסת 3.75 מ"ג גליצין ב-1 מ"ל של 1x PBS (pH 7.4).
  4. מקם את רשתות המקטעים ב-10-20 מיקרולטר של תמיסת חסימה למשך 25 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: הרכב תמיסת חסימה: 2 μL של 1% סרום עיזים רגיל (NGS) + 20 μL של 1% BSA (ריכוז סופי: 10%) + 178 μL של 1x PBS (pH 7.4) כדי ליצור נפח סופי של 200 μL.
  5. הכתימו את קצוות הרשת על נייר סינון והניחו את מקטע הרשת על דילול נוגדנים לריכוך בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
  6. דגירה של מקטעי הרשת עם נוגדן ראשוני (Sigmar1 במקרה זה, ראה טבלת חומרים; מדולל 1:10 בדילול נוגדנים) במשך שעה ו-30 דקות בתא לחות.
  7. כתם לייבש את הרשת ולשטוף את קטעי הרשת עם נוגדנים מדולל פעמיים במשך 5 דקות כל אחד.
  8. דגירה של חלקי הרשת עם נוגדן משני ביוטינילציה (במקרה זה, נוגדן משני פוליקלונלי עז נגד ארנב, ראה טבלת חומרים; מדולל 1:10 בדילול נוגדנים) למשך שעה אחת בתא לח.
  9. כתם לייבש את הרשת ולשטוף את קטעי הרשת עם נוגדנים מדולל פעמיים במשך 5 דקות כל אחד.
  10. דגירה של מקטעי הרשת ב-QD מצומד סטרפטווידין זמין מסחרית (QD655nm, ראו טבלת חומרים; מדולל 1:10 בדילול נוגדנים) למשך שעה אחת בתא לח בטמפרטורת החדר. מנעו חשיפה לאור על ידי כיסוי התא ברדיד אלומיניום.
  11. כתם לייבש את קצוות הרשת באמצעות נייר סינון ולשטוף את קטעי הרשת על ידי הנחתם על טיפות מים במשך 2 דקות.
  12. מכתימים את קצוות הרשת לייבוש.

6. הדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM)

  1. מניחים את המקטעים האולטרה-דקים על רשתות נחושת במחזיק רביעיית דגימות ומהדקים אותם במיקום המאפשר בחירת רשתות בקרן האלקטרונים.
  2. הכנס את מחזיק הדגימה לעמודת המיקרוסקופ והפעל את מתג המשאבה כדי לפנות את הגוניומטר, ולאחר מכן הכנסה מלאה של מחזיק הדגימה בעמודת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים).
  3. הגדר את המתח ל-80 קילו-וולט לפני יצירת הקרן לתצפית בתמונה.
  4. התמקד היטב באזור הרצוי, צלם את התמונה באמצעות מצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה ושמור את הקובץ בפורמט .tif.
    הערה: הגדרת המיקרוסקופ לצילום תמונה במחקר זה הייתה האצת מתח או מתח גבוה של 80 קילו-וולט והגדלה של פי 20,000.

Representative Results

מתודולוגיית QD-TEM הנוכחית המחישה את נוכחותו של Sigmar1 ואת לוקליזציה שלו על תאי הלב התת-תאיים על ידי ביצוע תיוג QD ממוקד נגד Sigmar1 על מקטעי לב דקים במיוחד של עכברים בוגרים. אנטי-סיגמאר1 צפוף אלקטרונים המסומן QD על ממברנות מיטוכונדריאליות (פנימיות וחיצוניות), ליזוזומים, והממשק האנדופלסמי של הרשתית / הרשתית הסרקופלסמית (ER/SR) של הממברנה-מיטוכונדריה (איור 2A,B) הודגמו על-ידי תמונות QD-TEM. בנוסף, מקטעי לב תויגו גם עם IgG ו-QD של ארנב כבקרת איזוטיפ עבור נוגדן ראשוני נגד ארנב Sigmar1 (איור 2C,D). לכן, הדמיית QD-TEM הדגישה את הלוקליזציה של Sigmar1 אנדוגני והעשרתו בעיקר על הליזוזומים ועל קרומי המיטוכונדריה.

Figure 1
איור 1: איור סכמטי המציג את השלבים וההליכים הרציפים המשמשים לביצוע QD-TEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: QD עם תווית חיסונית של Sigmar1 ברקמות לב של עכברים בוגרים . (A,B) תמונות TEM מייצגות המציגות את Sigmar1 מסומן QD על מיטוכונדריה (קרום חיצוני ופנימי), רטיקולום אנדופלסמי הקשור למיטוכונדריה (ER) / ממברנות רשתית סרקופלסמית (SR) וליזוזומים. (ג,ד) תמונת TEM של מקטעי הלב של בקרת איזוטיפ המסומנים ב- QDs ו- IgG ארנב. סרגל קנה מידה: 200 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: הרכב PBS ותמיסות אחרות המשמשות להתייבשות רקמות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

במחקר הנוכחי, תיוג חיסוני בתיווך QD שימש כדי להראות באופן מובהק את הלוקליזציה התת-תאית של Sigmar1. באמצעות QD, לוקליזציה של Sigmar1 על קרום המיטוכונדריה, במיוחד הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית, תוארה ברקמת הלב. בנוסף, Sigmar1 נמצא גם על רשתית סרקופלסמית/אנדופלסמית (S/ER) וליזוזומים ברמה האולטרה-סטרוקטורלית, כפי שניתן לראות באיור 2A-D.

שלב קריטי בפרוטוקול זה הוא שלב חשיפת התחריט או האנטיגן באמצעות תמיסת נתרן מטא-פריודיאט מרוכזת מאוד כדי לחשוף את האנטיגן לאחר קיבוע גלוטרלדהיד ואוסמיקציה. פרוטוקול זה השתמש בטיפול יחיד עם ריכוז גבוה (5%) של נתרן metaperiodate במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. זהירות יתרה נדרשת בשלב זה שכן משך זמן ארוך יותר או ריכוז גבוה יותר עבור דגירה של נתרן metaperiodate יגרום צבירה של מבנים, אובדן הגדרת הממברנה עבור האברונים, ולגרום נקבים בסעיף, מה שמקשה על הדמיה של החלבון או המבנה. לחלופין, ניתן להשתמש גם בריכוז נמוך יותר של (3%) תמיסת מטא-פריודייט בשני שלבים למשך 30 דקות במקום ב-5% מטא-פריודיאט. מחקרים הראו כי אפשרות זו מציגה תוצאות דומות כמו עם תמיסת מטא-פריודיאט של 5% עבור דגירה של שלב אחד של 30 דקות. עם זאת, פתרון מטא-פריודיאט של 3% למשך 30 דקות של דגירה במשך פעמיים מספק שליטה טובה יותר על התהליך26,27,28. בתחילה, פרוטוקול זה השתמש דגירה של חלקים עם 10% metaperiodate פתרון במשך 30 דקות. עם זאת, בשל ניקובים רבים מדי שנוצרו במקטע הרקמה על ידי ריכוז זה, הריכוז הסופי ומשך הדגירה של תמיסת המטא-פריודיאט התחדדו והותאמו ל-5% למשך 30 דקות.

צעד נוסף דרש אופטימיזציה של זמן הקיבוע עם glutaraldehyde. קיבוע לא אופטימלי של רקמות גורם לתיוג QD לא מספק, ואילו קיבוע יתר של רקמות גורם לתיוג לא ספציפי גבוה יותר. לכן, יש לשקול היטב את קביעת וטיטרציה של רמה אופטימלית של קיבוע רקמות לסימון נכון וספציפי של חלבונים. בשיטה זו באמצעות רקמות לב, זמן הקיבוע עם glutaraldehyde היה titrated באמצעות 24 שעות ו 48 שעות כנקודות זמן. בהתבסס על תמונות הצביעה של המקטעים הקבועים עבור שתי נקודות הזמן, נמצא כי מקטעים שתוקנו במשך 24 שעות הציגו תוצאות טובות יותר. נכון להיום, ננו-גבישים QD זמינים במספר גדלים, כולל 525, 565, 585, 605, 655 ו-705 ננומטר11,29. לכל אחד מ-QD אלה יש ספקטרום פליטה משלו והוא פולט פלואורסצנטיות באורכי גל שונים. בנוסף, QDs אלה הזמינים מסחרית בגדלים שונים מציגים צורות שונות; לדוגמה, QD 525, 565 ו- 585 הם כדוריים כמעט בגדלים שונים, ואילו QD 605, 655 ו- 705 הם בעלי צורה מלבנית לא סדירה. מבין ננו-גבישי QD שונים אלה, QD 525, 565 ו-655 ניתנים להבחנה בקלות זה מזהב-11,29. הבדלים אלה בספקטרום הפליטה ובצורות הופכים את QD למועמד מצוין לתיוג מרובה של חלבונים ולהדמיה על ידי פלואורסצנציה ומיקרוסקופיית אלקטרונים. במחקר זה, QD זמין מסחרית, QD 655, שימש לתיוג החלבון Sigmar1 כדי להבדיל אותו מכל רקע לא ספציפי במקטעים המוכתמים.

מקבילה נוספת של QD לתיוג חלבונים במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה היא חלקיק אימונוגולד. חלקיקי האימונוגולד משמשים באופן מסורתי לתיוג חלבונים למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. חלקיקי זהב אלה צפופים מאוד באלקטרונים וניתנים לזיהוי בקלות בהשוואה לננו-גבישים QD. עם זאת, QD מפגין יעילות טובה יותר עם חדירה טובה יותר ברקמות, יציבות וחיי מדף גבוהים יותר, ושמירה טובה יותר של רכיבים אולטרה-סטרוקטורליים, מה שהופך אותם למועמדים טובים יותר לסימון חלבונים 4,5. ל-QD יש גם יכולת ייחודית להתגלות הן על ידי מיקרוסקופיית אור והן על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים, מה שמוסיף לערכו על פני תיוג אימונוגולד10.

מגבלה אחת של תיוג חיסוני זה בתיווך QD היא השימוש באוסמיום טטרוקסיד במהלך העיבוד. אוסמיום טטרוקסיד משמש להגדלת צפיפות האלקטרונים, מוליכות וניגודיות של מבני ממברנה ביולוגית פחות צפופים באלקטרונים ופחות מנוגדים 5,30. עם זאת, השימוש באוסמיום טטרוקסיד באופן מיידי ובלתי הפיך הורס את התכונה של הדגימה כדי ליצור פלואורסצנציה כאשר היא מסומנת ב- QD6. זה מגביל את השימוש ב- QD במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. גישה חלופית המשמיטה את השימוש באוסמיום טטרוקסיד תהיה יתרון בשמירה על התכונות הפלואורסצנטיות ומכאן היישום הכפול של תיוג חיסוני בתיווך QD. לחלק מהדגמים החדשים יותר של TEM יש אפשרות לחבר את מערכת ניתוח קרני הרנטגן פיזור האנרגיה (EDX) המאפשרת זיהוי של הרכב היסודות של חומרים. מגבלה נוספת של המחקר היא היעדר מיפוי יסודי של מדגם וניתוח תמונה באמצעות EDX. לכן, מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בניתוח EDX של ספקטרום QD כדי לנתח את הרכב היסודות.

תיוג QD של חלבונים זכה לתשומת לב רבה בתקופה האחרונה. QD מציעה מספר יישומים ויתרונות הן במחקר ביולוגי והן בטיפולים רפואיים. QD עטוף בנוסף בליגנד פולידנטי מפגין יציבות מוגברת השומרת על התפוקה הקוונטית. יתר על כן, עטיפת QD עם חומרים חיוביים ביולוגיים אלה גם מגבירה את הזמינות הביולוגית שלו ברקמות מה שהופך אותו למועמד טוב ליישום פוטנציאלי באיתור גידולים, הדמיית תאים חיים, אספקת תרופות והדמיית רקמות 3,31,32.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 ו- R01HL152723; פרס קו הסיום של LSUHSC-S CCDS, פרס מחקר COVID-19 ופרס מחקר LARC ל- MSB; מלגת LSUHSC-S מלקולם פייסט קרדיווסקולרי ופוסט-דוקטורט AHA ל- CSA (20POST35210789); ומלגת קדם-דוקטורט של LSUHSC-S מלקולם פייסט ל-RA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 Mesh copper grid Ted Pella G200HH
6-month-old male mice with FVB/N background Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME
Acetone 100% Fisher Chemicals A949
Antibody diluent Dako S3022
anti-Sigmar1 antibody Cell Signaling 61994S
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody Sigma Aldrich B7389
BSAc (10%) Electron Microscopy Sciences 25557
Calcium chloride Sigma Aldrich C7902
Cytoseal Xyl Thermo fisher 8312-4
DER 732C36AA10:C33 Electron Microscopy Sciences 13010
Dextrose Sigma Aldrich G7528
Diamond Knife Diatome Histo; Ultra 450
DMAE Electron Microscopy Sciences 13300
Electron microscope JEOL JEOL-1400 Flash
ERL 4221 Electron Microscopy Sciences 15004
Ethanol 100% Fisher Chemicals A405P
Glutaraldehyde 3% Electron Microscopy Sciences 16538-15
Glycine Alfa Aesar A13816
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA56
Micromolds Ted Pella 10505
Microtome Leica Microsystem EM UC7
Normal goat serum Invitrogen PCN5000
NSA Electron Microscopy Sciences 19050
Osmium tetroxide Electron Microscopy Sciences 19150
Parafilm Genesse Scientific 16-101
Potassium Chloride Sigma Aldrich P5655
Potassium Phosphate monobasic Sigma Aldrich 71640
Qdot 655 Streptavidin Conjugate Invitrogen Q10121MP
Sodium Acetate Fisher Scientific BP334
Sodium Cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358
Sodium metaperiodate Sigma Aldrich 71859
Sodium Phosphate dibasic Sigma Aldrich P9541
Surgical blade (size 10) Aspen surgical 371110
TEM  image software AMT-V700 AMT TEM imaging systems
TEM imaging camera XR80 TEM series AMT TEM imaging systems
Toluidine Blue O solution (0.5%) Fisher Scientic S25612
Uranyl acetate Polysciences 21447

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lidke, D. S., Lidke, K. A. Advances in high-resolution imaging - techniques for three-dimensional imaging of cellular structures. Journal of Cell Science. 125 (11), 2571-2580 (2012).
  2. de Duve, C. Tissue fraction-past and present. The Journal of Cell Biology. 50 (1), 20 (1971).
  3. Pleskova, S., Mikheeva, E., Gornostaeva, E. Cellular and Molecular Toxicology of Nanoparticles. Saquib, Q., Faisal, M., Al-Khedhairy, A. A., Alatar, A. A. , Springer International Publishing. 323-334 (2018).
  4. Mayhew, T. M., Mühlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs. Annals of Anatomy - Anatomischer Anzeiger. 191 (2), 153-170 (2009).
  5. Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. G. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Experimental Cell Research. 337 (2), 202-207 (2015).
  6. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  7. Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 52 (1), 13-18 (2004).
  8. Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 (5709), 538-544 (2005).
  9. Killingsworth, M. C., Bobryshev, Y. V. Correlative light- and electron microscopy using quantum dot nanoparticles. Journal of Visualized Experiments. (114), e54307 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Giepmans, B. N. G., Smarr, B. L., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Quantum Dots: Applications in Biology. Bruchez, M. P., Hotz, C. Z., Ellisman, M. H. , Humana Press. 43-53 (2007).
  11. Giepmans, B. N. G., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
  12. Lidke, D. S., et al. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nature Biotechnology. 22 (2), 198-203 (2004).
  13. Pleskova, S. N., et al. Differences in the functional activity of human neutrophilic granulocytes in their interactions with semiconductor quantum dots. Morfologiia. 135 (3), Saint Petersburg, Russia. 47-49 (2009).
  14. Crane, J., Haggie, P., Verkman, A. Quantum dot single molecule tracking reveals a wide range of diffusive motions of membrane transport proteins. Proceedings of SPIE. 7189, (2009).
  15. Hanaki, K. -i, et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker. Biochemical and Biophysical Research Communications. 302 (3), 496-501 (2003).
  16. Lim, Y. T., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging. 2, 50-64 (2003).
  17. Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
  18. Åkerman, M. E., Chan, W. C. W., Laakkonen, P., Bhatia, S. N., Ruoslahti, E. Nanocrystal targeting in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (20), 12617-12621 (2002).
  19. Sarwat, S. A. -O. X., Stapleton, F., Willcox, M., Roy, M. A. -O. Quantum dots in ophthalmology: A literature review. Current Eye Research. 44 (10), 1037-1046 (2019).
  20. Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Morshed, M., Remex, N. S., Bhuiyan, M. S. Sigmar1's molecular, cellular, and biological functions in regulating cellular pathophysiology. Frontiers in Physiology. 12, 705575 (2021).
  21. Bohne, B., Harding, G. Processing the mouse temporal bone for gross, cellular and subcellular evaluation poster. , (2004).
  22. Roszkowski, M. The effects of acute stress on Apold1 gene expression and blood-brain barrier permeability. , (2014).
  23. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-protocol. 11 (5), 3988 (2021).
  24. Jones, W. K., et al. Ablation of the murine alpha myosin heavy chain gene leads to dosage effects and functional deficits in the heart. Journal of Clinical Investigation. 98 (8), 1906-1917 (1996).
  25. Hunter, E. E. Practical Electron Microscopy: A Beginner's Illustrated Guide. , Cambridge University Press. (1993).
  26. Morris, R. E., Ciraolo, G. M. A universal post-embedding protocol for immunogold labelling of osmium-fixed, epoxy resin-embedded tissue. Journal of Electron Microscopy. 46 (4), 315-319 (1997).
  27. Brorson, S. H. Deplasticizing or etching of epoxy sections with different concentrations of sodium ethoxide to enhance the immunogold labeling. Micron. 32 (2), 101-105 (2001).
  28. Lobo, M. V. T., et al. Ultrastructural Staining with Sodium Metaperiodate and Sodium Borohydride. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (1), 11-19 (2002).
  29. Bruchez, M., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A. P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 (5385), 2013-2016 (1998).
  30. Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
  31. Smith, A. M., Duan, H., Mohs, A. M., Nie, S. Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellular imaging. Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (11), 1226-1240 (2008).
  32. Gour, A., Ramteke, S., Jain, N. K. Pharmaceutical applications of quantum dots. AAPS PharmSciTech. 22 (7), 233 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 187
הדמיה של לוקליזציה תת-תאית של חלבון בלב באמצעות תיוג חיסוני בתיווך נקודות קוונטיות ואחריו מיקרוסקופיית אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aishwarya, R., Abdullah, C. S.,… More

Aishwarya, R., Abdullah, C. S., Remex, N. S., Nitu, S., Hartman, B., King, J., Bhuiyan, M. S. Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (187), e64085, doi:10.3791/64085 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter