Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות לביצוע הדמיית תהודה מגנטית, ניקוי ותיוג חיסוני של מוחות עכברים שלמים באמצעות iDISCO+, ולאחר מכן תיאור מפורט של הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה של יריעות אור, וניתוחים במורד הזרם באמצעות NuMorph.

Abstract

ניקוי רקמות ואחריו מיקרוסקופיה של יריעות אור (LSFM) מאפשרים הדמיה ברזולוציה תאית של מבנה מוח שלם, ומאפשרים ניתוח כמותי של שינויים מבניים הנגרמים על ידי הפרעות גנטיות או סביבתיות. הדמיה של מוח שלם מביאה לכימות מדויק יותר של תאים ולחקר הבדלים ספציפיים לאזור שעלולים להתפספס במיקרוסקופיה נפוצה של רקמות שנחתכו פיזית. שימוש במיקרוסקופיה של יריעות אור כדי לצלם מוחות מנוקים מגביר מאוד את מהירות הרכישה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. אף על פי שתמונות אלה מייצרות כמויות גדולות מאוד של נתונים מבניים על המוח, רוב הכלים החישוביים המבצעים כימות תכונות בתמונות של רקמות מנוקות מוגבלים לספירת אוכלוסיות תאים דלילות, ולא לכל הגרעינים.

כאן אנו מדגימים את NuMorph (מורפומטריה מבוססת גרעין), קבוצה של כלי ניתוח, כדי לכמת את כל הגרעינים והסמנים הגרעיניים באזורים מבוארים במוח עכבר ביום 4 (P4) לאחר הלידה לאחר ניקוי והדמיה במיקרוסקופ של יריעת אור. אנו מתארים דימות תהודה מגנטית (MRI) למדידת נפח המוח לפני התכווצות הנגרמת על ידי שלבי התייבשות של ניקוי רקמות, ניקוי רקמות בשיטת iDISCO+, כולל תיוג חיסוני, ולאחר מכן מיקרוסקופיה של יריעות אור באמצעות פלטפורמה זמינה מסחרית לצילום מוחות עכברים ברזולוציה תאית. לאחר מכן אנו מדגימים את צינור ניתוח התמונות הזה באמצעות NuMorph, המשמש לתיקון הבדלי עוצמה, לתפירת אריחי תמונה, יישור ערוצים מרובים, ספירת גרעינים וביאור אזורי מוח באמצעות רישום לאטלסים הזמינים לציבור.

עיצבנו גישה זו תוך שימוש בפרוטוקולים ובתוכנות הזמינים לציבור, ומאפשרים לכל חוקר בעל המיקרוסקופ והמשאבים החישוביים הדרושים לבצע טכניקות אלה. כלים אלה של ניקוי רקמות, הדמיה וחישוב מאפשרים מדידה וכימות של הארגון התלת-ממדי (3D) של סוגי תאים בקליפת המוח, והם אמורים להיות ישימים באופן נרחב לכל תכנון מחקר של עכברי בר/נוקאאוט.

Introduction

דימות מוחי שלם ברזולוציה של תא בודד הוא אתגר חשוב במדעי המוח. תמונות מוח ברזולוציה תאית מאפשרות ניתוח מפורט ומיפוי ברמת המערכת של מעגלי המוח וכיצד מעגלים אלה מופרעים על ידי גורמי סיכון גנטיים או סביבתיים להפרעות נוירופסיכיאטריות, התנהגות תאית בעוברים מתפתחים, כמו גם מעגלים עצביים במוח הבוגר 1,2,3. ישנן שיטות היסטולוגיות מרובות המאפשרות תמונות ברזולוציה גבוהה של המוח התלת-ממדי המשוחזר; עם זאת, טכניקות אלה דורשות ציוד מיוחד ויקר, ייתכן שאינן תואמות את התווית החיסונית, והאופי הדו-ממדי (2D) של שיטות מסוימות עלול להוביל לנזק לרקמות ולגזירה במהלך חתך 4,5.

ההתקדמות האחרונה סיפקה גישה חלופית להדמיית מוחות שלמים שאינה דורשת חיתוך רקמות; הם כוללים שימוש בניקוי רקמות כדי להפוך את המוחות לשקופים. שקיפות מושגת ברוב שיטות ניקוי הרקמות הן על ידי הסרת שומנים, מכיוון שהם מקור עיקרי לפיזור אור, והן על ידי התאמת מקדם השבירה (RI) של האובייקט ל- RI של תמיסת טבילת הדגימה במהלך ההדמיה. האור יכול לעבור את הגבול בין החומרים מבלי להיות מפוזר 6,7,8,9.

שיטות ניקוי רקמות, כגון iDISCO+, משולבות לעתים קרובות עם הדמיה תלת-ממדית מהירה באמצעות מיקרוסקופיית עירור של פוטון יחיד, כגון LSFM 6,7,10. בתוך רקמות שקופות המסומנות בפלואורופור, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור מצלמת מקטעים על ידי עירור עם מישור דק של אור11. היתרון העיקרי של LSFM הוא שמקטע אופטי יחיד מואר בכל פעם, כאשר כל הפלואורסצנטיות מהמולקולות בתוך אותו מקטע נרגשות, מה שממזער את הפוטו-הלבנה. יתר על כן, הדמיית פרוסה אופטית שלמה מאפשרת זיהוי מבוסס מצלמה של אותה פרוסה נרגשת, מה שמגדיל את המהירות ביחס לסריקת נקודה12. LSFM מייצרת באופן לא פולשני חלקים אופטיים רשומים היטב המתאימים לשחזור תלת-ממדי.

בעוד ששיטת iDISCO+ מאפשרת ניקוי רקמות זול תוך ~3 שבועות, שלבי התייבשות בתוך הפרוטוקול עלולים להוביל להתכווצות רקמות ולשינוי פוטנציאלי במורפולוגיה של הדגימה, ובכך להשפיע על מדידות נפחיות 6,10. הוספת שיטת הדמיה משנית, כגון MRI, לשימוש לפני הליך ניקוי הרקמות יכולה למדוד את מידת ההתכווצות הנגרמת על ידי ניקוי רקמות על פני הדגימה. במהלך שלבי ההתייבשות, הבדלים בתכונות המכניות בין החומר האפור והלבן עלולים להוביל לעיוותים לא אחידים של חומר מוחי, וכתוצאה מכך לעיוותי נפח שונים הנגרמים על ידי ניקוי רקמות בין דגימות מסוג בר לדגימות מוטנטיות, ועלולים לבלבל פרשנויות של הבדלים נפחיים בדגימות אלה10,13 . MRI מבוצע על ידי החדרת החיה תחילה עם חומר ניגוד (למשל, גדוליניום), ולאחר מכן דגירה של הרקמה המופקת המעניינת בתמיסת טבילה (למשל, פומבלין) לפני הדמיה14. MRI תואם לניקוי רקמות וביצוע LSFM על אותה דגימה.

LSFM משמש לעתים קרובות ליצירת תמונות מיקרוסקופיה בקנה מידה גדול להדמיה איכותית של רקמת המוח המעניינת, במקום להערכה כמותית של מבנה המוח (איור 1). ללא הערכה כמותית, קשה להדגים הבדלים מבניים הנובעים מעלבונות גנטיים או סביבתיים. ככל שטכנולוגיות ניקוי הרקמות וההדמיה משתפרות, יחד עם ירידה בעלויות האחסון וכוח המחשוב, כימות לוקליזציות של סוגי תאים בתוך הרקמה המעניינת הופך לנגיש יותר, ומאפשר ליותר חוקרים לכלול נתונים אלה במחקריהם.

עם למעלה מ-100 מיליון תאים במוח העכבר15 ומפגשי הדמיה של מוח שלם שיכולים לייצר טרה-בייטים של נתונים, יש ביקוש מוגבר לכלי ניתוח תמונה מתקדמים המאפשרים כימות מדויק של תכונות בתוך התמונות, כגון תאים. קיימות שורה של שיטות סגמנטציה לתמונות מנוקות רקמות המיישמות סף לעוצמת צביעה גרעינית ומסננות עצמים עם צורות, גדלים או צפיפויותמוגדרים מראש 10,16,17,18. עם זאת, פרשנויות לא מדויקות של תוצאות יכולות לנבוע מווריאציות בפרמטרים כגון גודל התא, ניגודיות התמונה ועוצמת התיוג. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול המבוסס שלנו לכימות גרעיני תאים במוח העכבר. ראשית, אנו מפרטים שלבים לאיסוף רקמות של מוח עכבר P4, ולאחר מכן פרוטוקול ניקוי רקמות ותיוג חיסוני המותאם לשיטת iDISCO+10 הזמינה לציבור. שנית, אנו מתארים רכישת תמונות באמצעות MRI ומיקרוסקופיה של יריעות אור, כולל הפרמטרים המשמשים ללכידת תמונות. לבסוף, אנו מתארים ומדגימים את NuMorph19, סט של כלי ניתוח תמונה שהקבוצה שלנו פיתחה המאפשר כימות ספציפי של סוג התא לאחר ניקוי רקמות, תיוג חיסוני עם סמנים גרעיניים והדמיית יריעות אור של אזורים מבוארים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים שימשו בהתאם ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ'אפל היל.

1. דיסקציה של עכבר וזלוף

הערה: הניתוחים הבאים בוצעו בעכברי P4 ו-P14 באמצעות מזרק. נפח נוזל הזלוף ישתנה בהתאם לגיל החיה.

  1. פרפוזיה
    אזהרה: פרפורמלדהיד (PFA) הוא כימיקל מסוכן. בצעו את כל שלבי הזלוף במכסה אדים כימיים.
    1. לפני הניתוח יש לתת פנטוברביטל באמצעות הזרקה תוך-צפקית (100 מ"ג/ק"ג) ולאפשר להרדמה להיכנס לתוקף.
    2. לאחר שבעל החיים הגיע למישור ניתוחי של הרדמה, השתמש בשיטת התגובה לצביטת הבוהן כדי לאשר חוסר תגובה.
    3. בצע חתך לרוחב מתחת לכלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל החזה של החיה.
    4. באמצעות מספריים מעוקלים וכירורגיים, חותכים בזהירות דרך כלוב הצלעות עד לעצם הבריח בצד אחד של החיה ומבצעים חתך זהה בצד הנגדי, המאפשר להרים את עצם החזה, ולחשוף את הלב.
    5. מבלי לפגוע באבי העורקים היורד, יש לחתוך בזהירות כל רקמה המחוברת ללב לפני ביצוע חתך קטן באטריום הימני כדי לאפשר לדם לזרום מתוך כלי הדם.
    6. בשיטה המבוססת על מזרק, מעבירים את העכבר דרך החדר השמאלי עם 10 מ"ל ו-7 מ"ל של תמיסת מלח עם פוספט (PBS) עבור P14 ו-P4, בהתאמה, עם קצב זלוף של 1.5 מ"ל/דקה דרך המערכת.
    7. לאחר ניקוי הדם, יש לפזר שוב עם 10 מ"ל של PBS + 4% PFA ו-7 מ"ל של PBS + 4% PFA עבור P14 ו-P4, בהתאמה, ב-4 מעלות צלזיוס עם קצב זלוף של 1.5 מ"ל/דקה כדי לתקן את החיה.
      הערה: רעידות קיבוע ייצפו, והחיה תהיה נוקשה עם השלמתה. אם משתמשים ב-MRI על דגימות, יש להשתמש בנפחים דומים של PBS ו-PFA עבור כל נקודת זמן + 20% חומר ניגוד MRI מבוסס גדוליניום בתמיסת ה-PFA.
    8. הסר את הראש באמצעות מספריים כירורגיים ושחרר לתקן עם PBS + 4% PFA במשך 24 שעות ב 4 °C לקיבוע מלא.
      הערה: בשלב זה, המוח נשאר שלם עם הגולגולת דולקת (ראה סעיף 2). נקודת השהיה: המוח יכול להיות מאוחסן במשך מספר חודשים בשלב זה PBS + 0.1% נתרן אזיד ב 4 °C (64 °F).

2. הדמיית מבנה מוח ברוטו מבוססת MR עם גולגולת שלמה וניתוח

הערה: יש לחדור למוח ולדגירה בגדוליניום כמתואר לעיל מבלי להסירו מהגולגולת. כל MRI מתרחשת לפני הסרת המוח מן הגולגולת כדי למנוע אובדן רקמות לא מכוון במהלך דיסקציה. הדמיה עם גולגולת שלמה מספקת גם תמיכה למוח במחזיק הדגימה (כלומר, מזרק) במהלך הכנת הדגימה והדמיה.

  1. הכנת דוגמאות
    הערה: השלבים הבאים ממוטבים עבור דגימות מוח של עכברי P4 ו-P14. גודל המזרק הדרוש יהיה תלוי בגודל הפיזי של המדגם.
    1. אם מבצעים MRI על הדגימה, מסירים את העור מהגולגולת ודוגרים ב-PBS + 3% גדוליניום במשך 23 יום ב-4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיהב-14 מעלות צלזיוס. לאחר 23 יום, יש לשטוף את הדגימות במהירות ב-PBS.
    2. השתמש במזרקים של 5 מ"ל כדי ליצור מחזיק לדוגמה ל- MRI, תוך שימוש בבוכנות מזרק כדי לסגור כל קצה של המחזיק המיוצר עם המזרק20. השתמשו בחתיכות פלסטיק כדי להחזיק את הגולגולת בחוזקה במקומה במחזיק (איור 2A). הסר את הסימונים על המזרק עם אתנול כדי למנוע חפצים בעת ההדמיה.
    3. הנח את הגולגולת בבטחה במחזיק הדגימה ומלא בתמיסת טבילה התואמת ל-MRI (ראה טבלת חומרים). סגור את המחזיק והסר את כל בועות האוויר באמצעות מזרק.
      הערה: נקודת השהיה: ניתן לאחסן את הגולגולת בתמיסת הטבילה במשך מספר חודשים לפני ההדמיה.
  2. דימות מבנה מוח גס (MRI)
    1. צלם את הדגימות עם מערכת MRI של בעלי חיים בגודל 9.4T/30 ס"מ באמצעות סליל נפח של 15 מ"מ ורצף מבוסס ספין-הד עם הפרמטרים הבאים: רזולוציה מרחבית: 60 מיקרומטר x 60 מיקרומטר x 60 מיקרומטר; זמן סריקה כולל: 7 שעות ו-12 דקות; זמן להד (TE): 6.83 אלפיות השנייה; זמן חזרה (TR): 40 ms; עירור/מיקוד מחדש זוויות היפוך: 90/180 מעלות; גודל תמונה: 166 x 168 x 209 voxels; שדה ראייה (FOV): 9.9 מ"מ x 10.1 מ"מ x 12.4 מ"מ; רוחב פס: 100,000 קילוהרץ.
  3. ניתוח מבנה מוח ברוטו חישובי
    1. הסר את הגולגולת המקיפה מתמונות MRI גולמיות על ידי מעקב ידני אחר מוח העכבר באמצעות תוכנת סגמנטציה. לאחר מכן, החל את פעולת הכפל מבחינת ווקסל בין תמונת המסכה לתמונת ה- MRI הגולמית כדי ליצור את תמונת ה- MRI המוחית שהופשטה בגולגולת.
      הערה: הפלט הוא תמונת מסיכה בינארית שבה העוצמה של ווקסלים מוחיים מוגדרת ל- 1 ו- 0 אחרת.
    2. החל רישום תמונה נוקשה (הערכה של תרגום וסיבוב בלבד) באמצעות 'פלירטוט' בחבילת FSL21,22 כדי ליישר את תמונת ה-MRI המופשטת מגולגולת (תמונה נעה) לתמונת המיקרוסקופיה המתאימה של גיליון האור (תמונת ייחוס).
    3. החל רישום לא קשיח (באמצעות 'SyN' בתוכנת ANTS23) כדי למצוא את ההתאמות מנקודה לנקודה בין תמונת ה-MRI המיושרת בצורה קשיחה בשלב 2.3.2 לתמונת גיליון האור (אותה תמונת ייחוס בשלב 2.3.2).
      הערה: הפלט כולל את תמונת ה-MRI המעוותת ואת שדה העיוות המשויך לשינויים בעוצמת הקול מ-MRI לתמונות בגיליון האור.
    4. חישוב הדטרמיננטה היעקוביאנית על שדה העיוות שנוצר בשלב 2.3.3, אשר מכמת את שינוי הנפח בשכונה מקומית של 3 x 3 x 3 ווקסל.
    5. יישר תמונות מופשטות גולגולת לאטלס המוח של העכבר ההתפתחותי של אלן באמצעות רישום תמונה מעוות.
      הערה: ההתאמה המרחבית שנקבעה מנקודה לנקודה מאפשרת ביאור אוטומטי של אזורי מוח בעלי עניין בתמונת העכבר החדשה (איור 2C-H).

3. דיסקציה מוחית מהגולגולת

  1. בצע חתך בקו האמצע לאורך החלק העליון של הגולגולת מהצוואר ועד לאף כדי לחשוף את הגולגולת.
  2. חשוף את בסיס הגולגולת על ידי חיתוך שריר הצוואר הנותר וכל שאר השרירים השיוריים.
  3. באמצעות מספריים כירורגיים חדים, לחתוך בזהירות לאורך המשטח הפנימי של הגולגולת, נזהר לא לפגוע במוח על ידי שמירה על לחץ עדין כלפי מעלה תוך חיתוך עם ציוד כירורגי חד.
  4. השתמשו בפינצטה כדי לקלף את שני חצאי הגולגולת החתוכים הרחק מהמוח ולקצץ בזהירות את עודפי השומן המחוברים למוח.
  5. השתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך כל דורה המחברת את המוח לגולגולת, ולאחר מכן השתמש במרית כדי להסיר בעדינות את המוח מהראש.
  6. הסר את המוח, לשטוף עם PBS, ולאחר מכן להחליף PBS עם 0.1% נתרן אזיד ולשמור על 4 °C לאחסון לטווח ארוך.

4. ניקוי רקמות

הערה: פרוטוקול זה מותאם מפרוטוקול iDISCO+ לעכברי P46, עם שינויים קלים. פרטים מסוימים עשויים להשתנות עבור נקודות זמן / מינים / ניסויים שונים). אזהרה: מתנול, דיכלורומתאן (DCM) ודיבנזיל אתר (DBE) הם כימיקלים מסוכנים. שלבי ניקוי רקמות אלה מבוצעים במכסה אדים כימי.

  1. אימות נוגדנים
    הערה: יש לבדוק את תאימות המתנול של נוגדנים שלא נבדקו, שכן הם עלולים להיות מושפעים לרעה משטיפת המתנול הקשה הנדרשת בפרוטוקול iDISCO+. לרשימת נוגדנים שהוכח כי הם פועלים ב-iDISCO+, ראו באתר24.
    1. קציר 10 מיקרומטר מקטעים קפואים של הרקמה הקבועה PFA של עניין על שקופיות סטריאולוגיות.
    2. לדגום את החלקים ב 100% מתנול במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
    3. התייבשו מחדש ב-PBS לפני שתמשיכו עם פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים כדי לקבוע אם הנוגדן מראה את התבנית הצפויה של פלואורסצנציה לאחר שטיפת מתנול. לשליטה חיובית, השתמש בשקופית שאינה מטופלת במתנול.
  2. הכנת חיץ
    1. הכן מאגרים על פי פרוטוקול iDISCO הרשמי. עיין בטבלת החומרים להרכבת המאגרים ופתרונות אחרים המשמשים בפרוטוקול זה.
  3. טיפול מקדים
    1. לייבש את הדגימה עם סדרת מתנול/PBS: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; שעה כל אחד בטמפרטורת החדר.
      הערה: שימוש ב-PBS במהלך התייבשות מסייע במניעת סדקים של הדגימות בתרחיצי מתנול.
    2. יש לשטוף את הדגימה ב-100% מתנול למשך שעה אחת, ולאחר מכן לצנן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני הדגירה למשך הלילה עם ניעור ב-66% DCM/33% מתנול בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף את הדגימה 2x ב 100% מתנול בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לצנן אותו ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. יש להשתמש טרי 5%H 2 O2 במתנול כדי להלבין את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    5. לייבש את הדגימה עם סדרת מתנול/PBS: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; שעה אחת כל אחד בטמפרטורת החדר ולשטוף 2x במשך שעה אחת ב-PTx.2 בטמפרטורת החדר.
    6. דגירה של הדגימה ב-1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. דגירה של הדגימה ב-1x PBS/0.1% Tween-20/0.1% TritonX-100/0.1% Deoxycholate/0.1% NP40/20% DMSO ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    8. יש לשטוף ב-PTx.2 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת פעמיים.
  4. תיוג חיסוני
    1. דגירה את הדגימות בתמיסת Permeabilization ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים (~ 48 שעות).
    2. חסום את הדגימות בתמיסת חסימה ב- 37 °C למשך יומיים (~ 48 שעות).
    3. דגירה של הדגימות עם נוגדן ראשוני ב- PTwH / 5% DMSO / 3% סרום ב- 37 °C למשך 4 ימים (~ 96 שעות) (למשל, ארנב (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) ונוגדן נגד Ctip2 חולדה (Rt) (1:400) (טבלת חומרים).
    4. יש לשטוף 3 x 1 שעות ב-PTwH. יש לשטוף במשך שעתיים נוספות ב-PTwH. השאירו בתמיסת הכביסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    5. לדגום את הדגימות עם נוגדן משני וצבע גרעיני, כגון TO-PRO-3, בסרום PTwH / 3% ב 37 °C במשך 4 ימים (~ 96 שעות; למשל, עז anti-Rb (1:50) ו (עז anti-Rt(1:200)) (טבלת חומרים).
    6. יש לכבס 3 x 1 שעות בשטיפת PTwH למשך שעתיים נוספות ב-PTwH. השאירו בתמיסת הכביסה למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  5. ניקוי
    1. התייבשות בסדרת מתנול/PBS - 20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 שעות כל אחד בטמפרטורת החדר. דגירה במשך 3 שעות, עם רעידות, ב 66% DCM / 33% מתנול בטמפרטורת החדר.
      הערה: ניתן להשאיר את הדגימה למשך הלילה בטמפרטורת החדר מיד לאחר התייבשות ב-100% מתנול.
    2. יש לדגור ב-100% DCM למשך 15 דקות פעמיים בטמפרטורת החדר (עם רעידות) כדי לשטוף את ה-MeOH.
    3. דגירה באתר דיבנזיל (DBE) מבלי לרעוד בטמפרטורת החדר. ודא כי הצינור מלא כמעט לחלוטין עם DBE כדי למנוע חמצון של הדגימה. סיים לערבב את הפתרון על ידי היפוך כמה פעמים לפני ההדמיה.

5. הדמיית יריעות אור

הערה: מוחות מנוקים של רקמות iDISCO צולמו באמצעות מיקרוסקופ בעל יריעת אור, המצויד במטרה של 2X/0.5 NA, מצלמת מוליכים למחצה משלימה של תחמוצת מתכת, ותוכנת הפעלה ורכישת תמונה של מיקרוסקופ ברזולוציה של 0.75 x 0.75 x 4 μm/voxel עבור נקודת הזמן P4 מכיוון שזה איפשר רזולוציה של תא בודד בתוך קליפת המוח (איור 3A,B).

  1. הרכבה לדוגמה
    1. הרכב בזהירות את הדגימה במחזיק גודל המדגם הנכון כך שהדגימה מכוונת עם ממד z לא יותר מ 5.2 מ"מ עומק בשל מרחק העבודה המדורג של מיקרוסקופ גיליון האור (5.7 מ"מ פחות 0.5 מ"מ מרווח בטיחות)25.
    2. הנח את המחזיק בעריסת הדגימה עם הבורג של המחזיק בזווית של 45° לתמיכות העריסה (איור 1B). מקמו את העריסה כך שנתיב האור יהיה בניצב לדגימה (איור 1C).
  2. פרמטרי הדמיה
    1. הגדר את גוף הזום במיקרוסקופ להגדלה של פי 4 ומעלה המניבה 0.75 מיקרומטר/פיקסל.
      הערה: ניתן לבצע ניתוחים חישוביים של תאים בודדים בתמונות גיליון אור P4 עם כל מיקרוסקופ גיליון אור זמין מסחרית המאפשר רזולוציה של 0.75 x 0.75 x 4 מיקרומטר/ווקסל ומעלה. רזולוציה נמוכה יותר מספיקה למוחות בנקודות זמן מאוחרות יותר שבהן גרעינים מפוזרים בדלילות רבה יותר.
    2. בתוכנת רכישת התמונה, בחר גיליון אור יחיד עם NA = ~0.08 (עובי 9 מיקרומטר / 4 מיקרומטר z שלב).
      הערה: הגדרה זו בשילוב עם מיקוד דינמי אופקי מאפשרת הדמיה של מוח שלם ברזולוציה של תא בודד של מוח עכבר תוך זמן סביר. עבור מוח ביום 4 (P4) לאחר הלידה, זמן רכישת התמונה מוערך ב-11-15 שעות עבור שלושה ערוצים, בהתאם לגודל המוח.
    3. כדי להבטיח שמירה על רזולוציה צירית לאורך רוחב התמונה, בחרו ' מיקוד דינמי אופקי' והחלו את מספר הצעדים המומלץ בהתאם לאורך גל הלייזר. עבור מוח שלם של עכבר P4, הגדר את המיקוד הדינמי האופקי ל-11. התאם את המיקוד העדין לכל ערוץ ביחס לערוץ הרישום.
      הערה: כאן, ערוץ TO-PRO-3 (647 ננומטר) רשום באטלס המוח של העכבר ההתפתחותי של אלן מכיוון שהוא מתייג את כל הגרעינים.
    4. התאם את עוצמת הלייזר לכל ערוץ ביחס למאפייני הערוץ.
      הערה: אורכי גל ארוכים יותר דורשים עוצמת לייזר גבוהה יותר בהשוואה לאורכי גל קצרים יותר. לדוגמה, יש לצלם את ה-780 ננומטר בעוצמת לייזר גבוהה (70% - 75%) ובחשיפה נמוכה (50 אלפיות השנייה), בעוד שערוץ 647 ננומטר דורש עוצמת לייזר ממוצעת (40% - 45%) וחשיפה נמוכה (50 אלפיות השנייה).
    5. התאם את רוחב גיליון האור ל - ~50% כדי להבטיח שעוצמת הגיליון תחולק באופן מיטבי בממד y עבור גודל מדגם זה.
      הערה: בשילוב עם המיקוד הדינמי האופקי, רוחב גיליון של 50% מספק התפלגות כוח ממוצעת על פני התמונה עם סיכון מופחת להלבנת תמונות25.
    6. הגדר את מספר האריחים ביחס לגודל המדגם עם חפיפה מומלצת של 15% בין אריחים, ולכוד תמונות עבור כל ערוץ ברצף עבור כל ערימה במיקום אריח נתון.

6. עיבוד תמונה באמצעות NuMorph

הערה: צינור NuMorph כולל שלושה חלקים עיקריים לניתוח תמונה תלת-ממדית: עיבוד מקדים, ניתוח והערכה. חלקים אלה אורגנו ב-NMp_template.m, NMa_template.m ו-NMe_template.m, בהתאמה, אשר נדונו להלן. בנוסף, NM_setup.m נוסף כדי להוריד ולהתקין חבילות תוכנה הדרושות ל- NuMorph כדי לפעול בצורה חלקה. NM_samples.m מספק גם תבנית להזנת מידע על רכישת תמונות.

  1. הגדרת NuMorph
    1. הורד והתקן את מנהל הסביבה של conda עבור Linux26. הורד והתקן את כלי עיבוד התמונה NuMorph19 .
    2. בשורת הפקודה, הפעל את Matlab. הפעל NM_setup.m מ- NuMorph כדי להוריד ולהתקין חבילות תוכנה לניתוח תמונות הדרושות לניתוחים.
      הערה: שלב זה מבטיח שסביבת conda מוגדרת כראוי וכן מבטיח שכל הכלים וההרחבות הדרושים להפעלת Matlab להפעלת כל אחד משלושת הצינורות יורדו ויותקנו כהלכה. הבולטים ביותר כאן הם Elastix לרישום ריצה ו- 3D-Unet לזיהוי וספירת תאים.
  2. ציין שמות לדוגמה, ספריות קלט ופלט, פרטי ערוץ ופרמטרים של הדמיית גיליון אור על-ידי עריכת הקובץ NM_samples.m.
    הערה: כאן, מומלץ לבדוק שוב כדי לוודא שהמידע הנכון, במיוחד ספריית קלט התמונה, מוגדר כראוי. שגיאות אינן נקראות בדרך כלל כאן עד להפעלת השלבים הבאים.
  3. עיבוד מקדים של תמונה
    1. התאמת עוצמה
      1. בשנת NMp_template, הגדר התאמת עוצמה = true.
        הערה: הגדר ל- true אם נדרשת התאמת עוצמה. אם לא, הגדר התאמת עוצמה = false. יש גם אפשרות להשתמש ב'עדכון ' כדי להחליף פרמטרים קודמים של התאמה.
      2. הגדר השתמש בתמונות מעובדות = false בעת עבודה עם קבוצת תמונות חדשה. אחרת, ציין ערכות נתונים של תמונות שנשמרו בעבר בספריית הפלט (לדוגמה, "מיושר", "תפור") לשימוש בשלבי העיבוד הבאים.
        הערה: אפשרות זו מסופקת במקרה שבו תמונות קלט כבר עובדו מראש. במקרה זה, תמונות מעובדות מראש ישמשו כתמונות קלט והאפשרות תוגדר לשם ספריית המשנה בספריית הפלט.
      3. הגדר תמונות שמורות = true.
        הערה: שימוש באפשרות זו מבטיח שתמונות מעובדות יישמרו בספריית הפלט; אחרת, רק פרמטרים יחושבו ויישמרו.
      4. הגדר דוגמאות שמירה = true.
        הערה: אפשרות זו מבטיחה שתוצאות לדוגמה יישמרו עבור כל שלב משמעותי.
      5. הגדר התאמת הצללת אריחים = בסיסית להחלת תיקון הצללה באמצעות אלגוריתם BaSiC27 או ידני להחלת תיקון הצללת אריחים באמצעות מדידות ממיקרוסקופ גיליון האור ברוחב גיליון אור ספציפי.
        הערה: אפשרות זו מתקנת את התאורה הלא אחידה לאורך ממד y הנגרמת על ידי צורת מותני היריעה.
    2. יישור ערוץ תמונה
      1. ב- NMp_template, הגדר יישור ערוץ = true. הגדר אפשרות זו ל- true אם נדרש יישור ערוץ. אם לא, הגדר כלא נכון. הגדר את שיטת יישור הערוצים לתרגום (קשיח) או ל- elastix (nonrigid).
        הערה: שיטת התרגום משתמשת בגישות רישום דו-ממדיות נוקשות ביישור ערוצים מרובים, בעוד ששיטת elastix משתמשת ב-B-splines28 שאינם קשיחים כדי לתקן סחף סיבובי, שעלול להתרחש במהלך רכישת תמונה ארוכה19.
    3. תפירת תמונה איטרטיבית
      1. ב- NMp_template, הגדר תמונות תפר = true.
        הערה: הגדר אפשרות זו כנכונה אם נדרשת תפירה.
      2. הגדר עידון ניפוי = נכון.
        הערה: אפשרות זו משמשת לעידון נוסף של התרגום ב- xy באמצעות שינוי הצורה של התכונה 'קנה מידה אינווריאנטי29'.
      3. הגדר פרמטרים ליישור עומס = true.
        הערה: אפשרות זו משתמשת בתרגומים של יישור הערוצים במהלך התפירה. אפשרות זו מומלצת עם הדמיה רב-ערוצית. אחרת, הגדר כ- false.
      4. הגדר חפיפה = 0.15 כדי להתאים לחפיפת אריחים במהלך ההדמיה.
    4. כדי להפעיל כל אחד משלבי עיבוד מקדים אלה, הפעל את הפעולות הבאות ב- Matlab מחוץ לסביבת NMp_template:
      1. ציין שם לדוגמה. הגדר תצורה = NM_config(תהליך, מדגם).
      2. הפעל כל אחד משלבי העיבוד מראש על-ידי ציון NM_process(configure,stage) וציין את השלב באמצעות עוצמה, יישור או תפירה עבור כל אחד מהתהליכים. בדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט עבור כל אחד מהשלבים (איור 3 ואיור 4).
  4. ניתוח תמונות
    1. לפני נומורף
      1. התחל עם תמונת אטלס תלת-ממדית ותמונת ביאור משויכת שמקצה כל ווקסל למבנה מסוים.
        הערה: אטלס המוח של עכבר התפתחותי P4 אלן שנוצר מ- MagellanMapper30 משמש כאן.
      2. יישר הן את תמונת האטלס והן את קובץ הביאור כדי לוודא שהם תואמים כהלכה בכיוון הנכון.
    2. בתוך נומורף
      הערה: כעת, לאחר שהאטלס וביאוריו מיושרים כהלכה, יש "לדחוס" את הקבצים או לעבד אותם בתוך NuMorph כדי שניתן יהיה לשמור אותם לשימוש מאוחר יותר. לשם כך, השתמש בפונקציה munge_atlas כדי לציין קלטים כמוצג להלן.
      1. ציין Atlas_file: (מחרוזת). ספק את הנתיב המלא לקובץ האטלס.
      2. ציין Annotation_file: (מחרוזת). ספק את הנתיב המלא לביאורים המשויכים.
      3. ציין רזולוציה: (1x3 מספרי). ציין את רזולוציית האטלס y,x,z כמיקרון לפיקסל.
      4. ציין כיוון: (1 x 3 char). ספק את כיוון האטלס וודא שהוא תואם את הגדרת הדגימה בעריסה (קדמית(a)/אחורית(p), מעולה(ים)/נחותה(i),שמאל(l)/ימין(r)).
      5. ציין את ההמיספרה: ציין איזו המיספרה מוחית צולמה ("שמאל", "ימין", "שניהם", "אף אחד").
      6. ציין out_resolution:(int). ציין את הרזולוציה האיזוטרופית של פלט האטלס במיקרונים. (ברירת מחדל: 25).
      7. הפעל את הפקודה "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, רזולוציה, כיוון, חצי כדור)" כדי ליצור ביאורים משובשים ב- /data/annotation_data ועותק של תמונת האטלס ב- /data/atlas.
      8. קרא את מבנה Matlab ואת קובץ האטלס כדי לוודא ששני הקבצים מוכנסים כראוי בכיוון הנכון.
        הערה: ניתן לבצע שלב סיווג תאים נוסף כדי לכמת סוגי תאים בהתבסס על לוקליזציה משותפת של סמני חלבון עם תווית חיסונית.
    3. דגימה מחדש
      1. ב- NMa_template, הגדר תמונות דגימה מחדש = true, אם אתה מבצע רישום תמונה כדי להפנות לאטלס או כדי ליצור נפחים עם דגימת הפחתה של ערכות נתונים ברזולוציה גבוהה.
        הערה: NMa_template.m ישמש להגדרת הפרמטרים לדגימה מחדש, רישום, זיהוי גרעינים וספירת תאים.
      2. הגדר רזולוציה של דגימה מחדש כך שתתאים לאטלס.
        הערה: כאן, נעשה שימוש ברזולוציה איזוטרופיתשל 25 מיקרומטר 3/ווקסל מכיוון שאטלס הייחוס נמצא ברזולוציה זו.
      3. ציין את מספר הערוץ שיש לדגום מחדש באמצעות ערוצי דגימה מחדש = [ ].
        הערה: כאן, מספר הערוץ מוגדר כך שיתאים לערוץ הגרעיני. אם אפשרות זו ריקה, רק ערוץ הרישום יידגם מחדש.
    4. הרשמה
      1. ב- NMa_template, הגדר תמונות רישום = true. הגדר ל- true אם נדרשת הרשמה. אם לא, הגדר רישום = false.
      2. ציין את קובץ האטלס שיתאים לקובץ בספריית האטלס.
      3. הגדר פרמטרי רישום = ברירת מחדל.
        הערה: אפשרות זו משתמשת באפין ואחריו טרנספורמציית ספין B כדי להעריך התכתבות מרחבית. אחרת, הגדר קבוצה חדשה של פרמטרי רישום באמצעות Elastix ב- /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. הגדר שמור תמונות רשומות = true.
        הערה: ניתן להוריד קבצי פלט מרישום ודגימה מחדש ולבדוק חזותית ב- Matlab או בכלי הדמיה אחרים כגון FIJI31.
    5. זיהוי גרעינים, ספירת תאים וסיווגם
      הערה: שגיאות המתרחשות כאן עשויות לנבוע מאי ציון קובץ הביאורים כראוי או אי התאמה של גיל המדגם לביאור הנכון.
      1. ב- NMa_template, הגדר גם לספור גרעינים וגם לסווג תאים = true.
      2. הגדרת שיטת ספירה = 3dunet.
        הערה: אפשרות זו מאפשרת שימוש בדגם 3D-Unet המאומן19. אחרת, בחר הסיאן המשתמש בשיטת זיהוי הכתמים של הסיאן.
      3. קבעו min_intensity להגדרת סף עוצמה מינימלי לאובייקטים שזוהו.
        הערה: סף מתאים נקבע באופן אמפירי בהתבסס על יחס האות לרעש של תיוג גרעיני.
      4. הגדר classify_method לאחת מהסף, המבוסס על עוצמות פלואורסצנטיות לא מפוקחות במיקומים צנטרואידים או svm, אשר מדגים מסווג מכונת וקטור תמיכה ליניארית מפוקחת (SVM).
        הערה: שלב זה יסווג את כל התאים שזוהו לארבע מחלקות עיקריות עם הדמיה תלת-ערוצית. באמצעות פרוטוקול זה, נוצרים Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2-, ו-Outliers.
    6. שלבי ניתוח
      1. ציין שם לדוגמה. הגדר תצורה =NM_config(ניתוח, מדגם).
      2. הפעל כל אחד משלבי הניתוח על-ידי ציון NM_analyze(configure,stage) וציין את השלב באמצעות דגימה מחדש, רישום, ספירה או סיווג. בדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט עבור כל אחד מהשלבים (איור 5).
    7. סיווג סוג תא וניתוח קבוצתי
      1. ב- NMe_template, הגדר עדכון = true והחלף את כל הנתונים הסטטיסטיים הקודמים שחושבו.
        הערה: NMe_template.m מספק את האפשרות לבצע ניתוח קבוצתי מסוג תא על פני אזורים במוח של אותו מוח המנותח.
      2. הגדר compare_structures_by לאינדקס להשוואה לפי כל הביאורים הייחודיים או לטבלה להשוואת מבנים בהתאם לטבלה.
      3. הגדר את template_file, המציין את כל אינדקסי המבנה האפשריים וחייב להתקיים ב- /annotations.
      4. הגדר structure_table וציין מבנים להערכה.
      5. ציין ספירת תאים וסיווג סוגי תאים כמתואר ב- NMa_template.m.
      6. הגדר compare_groups לציין קבוצות להשוואה.
      7. הגדר את השיוך ל- true או false כדי לבצע בדיקת t זוגית או בדיקת t של שתי דוגמאות.
    8. הפעל ניתוח.
      הערה: כדי לבצע שלב זה, הפעל את הפעולות הבאות ב- Matlab מחוץ לסביבת NMe_template.m.
      1. ציין שם לדוגמה. הגדר תצורה =NM_config(הערכה, מדגם).
      2. הפעל את שלב הניתוח על-ידי ציון NM_evaluate(configure,stage) וציין את השלב. בדוק את ספריית הפלט עבור קבצי פלט לניתוח הקבוצה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מכיוון שפרוטוקול iDISCO+ מציג התכווצות משמעותית של רקמות, שניתן להבחין בה בקלות בעין (איור 2B), הוספנו שלב MRI לצינור זה לפני פינוי הרקמות כדי לכמת את ההתכווצות הנגרמת על-ידי ניקוי רקמות. תהליך העבודה מתחיל בהסרת הרקמה שאינה במוח מתמונת ה-MR (איור 2C). לאחר מכן, טרנספורמציה נוקשה (3 זוויות תרגום ו-3 זוויות סיבוב) מוחלת כדי ליישר את תמונת ה-MR לתמונת גיליון האור (איור 2D). על ידי כך, ראינו אובדן נפח כולל של 60% שנגרם על-ידי הליך ניקוי הרקמות (איור 2E), שהיה עקבי עם הערכות שינוי נפח לפי עין (איור 2B). תוצאה זו שונה לגמרי מדו"ח קודם שבו דווח על התכווצות של 5%-10%10,32. ההבדל בהתכווצות עשוי להיגרם על ידי ההבדל בגיל בעלי החיים בין שני המחקרים (P4 לעומת מוחות בוגרים) או בשל הפרשי זמן בשטיפת המתנול בשלב הניקוי של פרוטוקול iDISCO+ (16 שעות לעומת 2 שעות). כדי למפות דרגות של התכווצות רקמות באזורים שונים במוח, פרסנו עוד יותר רישום תמונה מעוות שבו תמונת גיליון האור משמשת כהפניה. תמונת ה-MR הרשומה מוצגת ב-(איור 2F). השינוי המשוער בנפח כתוצאה מהליך ניקוי הרקמות מקודד בצבע, שבו נצפתה מידה גדולה יותר של כיווץ בקליפת המוח בהשוואה לאזורים אחרים במוח (איור 2G).

כדי למדוד נפחים של אזורי מוח, ביצענו סגמנטציה של ה-MRI באמצעות רישום לאטלס מבואר. סגמנטציה של מוחות עם תמונת MR נחשבה למוצלחת אם שכבת האטלס של הייחוס תאמה באופן הדוק את הגבולות האנטומיים שזוהו על-ידי הבדלים בניגודיות בתמונות ה-MRI הגולמיות (איור 2H). שכבת העל במהלך הרישום תלויה בהכנת דגימה טובה (איור 2A), ברכישת תמונה ובהפשטת גולגולת. שלב הפשטת הגולגולת הוא קריטי לתוצאות רישום טובות מכיוון שהרישום ינסה לעקם את תמונת הייחוס מהאטלס לתמונת MR כולה, כולל כל גולגולת שנותרה בתמונה. הכללת גולגולת ברישום עלולה לעוות את התוצאות ולייצר עיבוד נפח תלת-ממדי רשום באופן שגוי של הסגמנטציה. לאחר מכן ניתן להמחיש את עיבוד אמצעי האחסון התלת-ממדי הסופי באמצעות ITK-SNAP33 (איור 2H). שיטה זו משמשת להערכת הבדלים בנפח המוח ברוטו בין קבוצות מדגם. את הבסיס התאי להבדלי נפח שהתגלו באמצעות MRI ניתן לבצע באמצעות ספירת תאים באמצעות ניקוי רקמות, מיקרוסקופיה קלה ו-NuMorph.

המטרה של ניקוי וניתוח רקמות היא להעריך את התרומות של סוגי תאים שונים להבדלים בין תנאי ניסוי (למשל, גנוטיפ, חשיפה סביבתית) על ידי ספירת גרעינים בודדים באמצעות NuMorph. ניקוי רקמות באמצעות פרוטוקול iDISCO+ וסמני גרעינים ספציפיים לשכבה העצבית הביא לקבוצות תאים מוגדרות בבירור של נוירונים בשכבה העליונה והתחתונה באיזוקורטקס (איור 3).

ספירת תאים באמצעות NuMorph תלויה בשלבי עיבוד מקדים מוצלחים הכוללים התאמת עוצמה, יישור ערוצים ותפירה (איור 4A). שגיאות המתרחשות בכל אחד מהשלבים האלה עלולות לגרום לתפירה לא תקינה (איור 4B,C). לדוגמה, רכישת תמונה לא נכונה יכולה לגרום לתמונות עם דפוסים ממוקדים ולא ממוקדים במהלך עיבוד מקדים (איור 4C). כדי לספור גרעינים מאזורים מסוימים במוח, התמונות התפורות מבוארות באמצעות אטלס זמין לציבור. רשמנו את התמונות התפורות שלנו לגרסה מתוקנת של אטלס המוח של עכבר התפתחותי P4 אלן34. כאן, התמונות התפורות הודגמו מרזולוציה גבוהה (0.75 x 0.75 x 4 μm³/voxel) לרזולוציה נמוכה יותר (רזולוציה איזוטרופית של 25 μm³/voxel) כדי להתאים לרזולוציה של האטלס. התאמת הרזולוציה של האטלס מבטיחה רישום נכון של התמונות לאטלס ומספקת ביאורים אזוריים בתמונות שנרכשו (איור 5A).

כדי לבצע ספירה ספציפית של תאים ספציפיים, תייגנו תאי עצב בשכבה העליונה המבטאים Brn2, תאי עצב בשכבה התחתונה המבטאים Ctip2, ואת כל הגרעינים עם TO-PRO-3 (איור 3B). ההדמיה מתבצעת ברזולוציה מרחבית מספקת כדי להפריד גרעינים בודדים (0.75 x 0.75 x 4 מיקרומטר3/ווקסל). הצנטרואידים של גרעינים מזוהים באמצעות מודל תלת-ממדי מאומן ב-NuMorph (איור 5B,C). זיהינו ~12 × 10 6 גרעינים סה"כ שהיו To-Pro-3+ באיזוקורטקס, כולל ~2.6 × 10 6 Brn2+ ו-1.6 × 106 Ctip2+ גרעינים. זיהינו גם ~3.7 × 10 6 ו-2.9 × 106 To-Pro-3+ גרעינים כוללים בגרעיני הבסיס ובאלוקורטקס ההיפוקמפוס, בהתאמה. כ-1.5 תאי × 10 6 ו-<1 × 106 Ctip2+ נספרו בגרעיני הבסיס ובאלוקורטקס בהיפוקמפוס, בהתאמה, אם כי זוהה מספר זניח של תאי Brn2+ (איור 5D). ספירת הגרעינים הכוללת באיזוקורטקס ובהיפוקמפוס אלוקורטקס יחד (~15 מיליון תאים) דומה לספירת התאים הכוללת שדווחה בעבר בקליפת המוחשל העכבר 15. תוצאות אלה מדגימות את התועלת של דימות MRI, מתודולוגיית ניקוי רקמות iDISCO+ וניתוח חישובי של NuMorph כדי לחשוף ספירות נפחיות, ספירת תאים כוללת וספירת תאים ספציפית לסוג התא העומדות בבסיס ההבדלים במבנה המוח של עכברים בין קבוצות ניסוי.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של ניתוח חד-תאי של מוח שלם של רקמות תלת-ממדיות שלמות של ילודים שפינו מוחות של עכברים . (A) סקירה כללית של ניקוי רקמות iDISCO+ , הדמיית גיליון אור וניתוח תמונות תלת-ממדיות. (B) תמונות המציגות הרכבה נכונה של דגימה על מיקרוסקופ יריעת האור. (C) קריקטורה המציגה הרכבה לדוגמה ביחס לנתיב גיליון אור. קיצור: ab = נוגדן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מדידות מבנה המוח ברוטו באמצעות MRI . (A) תמונה המציגה הכנה לדוגמה ל-MRI. (B) תמונות של מוחות P4 מייצגים לפני ואחרי ניקוי רקמות iDISCO+ . סרגל קנה מידה = 5.0 ס"מ. (C) תמונת MR גולמית עם גולגולת מחוברת בגודל 60 x 60 x 60 μm³. סרגל קנה מידה = 800 μm. (D) תמונת גיליון אור של מוח עכבר בגודל 25 x 25 x 25 μm³. נפח כולל = 68.7 מ"מ3. שים לב שחלק קטן של האיזוקורטקס הגבי הוסר שלא במתכוון במהלך הדיסקציה המסומנת על ידי ראש חץ (לבן). סרגל קנה מידה = 800 μm. (E) תמונת MR של מוח עכבר לאחר הפשטת גולגולת ורישום נוקשה. נפח כולל = 171.9 מ"מ3. הוספה (בצהוב) מציגה קווי מתאר מוחיים מתמונת יריעת האור. סרגל קנה מידה = 800 μm. (F) תמונת MR רשומה בהתייחס לתמונת גיליון אור להערכת דפורמציה. סרגל קנה מידה = 800 μm. (G) מיפוי מוח חכם של Voxel כדי להעריך שינויים בנפח בין תמונת גיליון אור לתמונת MR כאשר כחול ואדום מצביעים על התכווצות והתרחבות מתמונת MR לתמונת גיליון האור, בהתאמה. בסך הכל היה אובדן נפח של 60%, אך אזורים מסוימים כמו האיזוקורטקס הראו התכווצות גדולה יותר ביחס לאחרים. (H) פאנל שמאלי: תצוגה צירית של תמונת MRI עם סגמנטציות רשומות מתוך אטלס המוח ההתפתחותי של אלן. לוח ימני: עיבוד אמצעי אחסון תלת-ממדי של סגמנטציה. סרגל קנה מידה = 800 מיקרומטר. קיצורים: OB = נורת חוש הריח; Dpall = פליום גבי/איזוקורטקס; Mb = מוח אמצע; Cb = המוח הקטן. אוריינטציה: R = רוסטרל; L = לרוחב; D = הגב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תמונות ברזולוציית תאים ויישור ערוצים. (A) מקטע צירי אופטי של TO-PRO-3 (TP3) מכתים גרעיניים ותיוג חיסוני עבור סמני Ctip2 (נוירון בשכבה התחתונה) ו-Brn2 (נוירון בשכבה העליונה) במוח עכבר P4. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) כניסה מוגדלת של אזורים בקליפת המוח ב- A (תיבה) המציגה יישור ערוצים נכון עם לוקליזציה צפויה של שכבה עליונה עם תווית Brn2 ותאי עצב בשכבה התחתונה עם תווית חיסונית של Ctip2. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: דוגמאות לתפירת תמונות . (A) תוצאות הדגימה מתמונה דו-ממדית איטרטיבית תפורה כהלכה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. הוספה מציגה דוגמה לתפירה נכונה מוגדלת. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) הדגימה מתקבלת מתמונה דו-ממדית איטרטיבית שנתפרה באופן שגוי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. הוספה מציגה דוגמה לתפירה שגויה מוגדלת (תקרה). סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) הדגימה מתקבלת מתמונה דו-ממדית איטרטיבית שנתפרה באופן שגוי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. הוספה מציגה דוגמה לתפירה שגויה מוגדלת (לא ממוקדת). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: רישום תמונה ברזולוציה נמוכה, זיהוי גרעינים ברזולוציה גבוהה וספירת תאים במוח של עכבר P4. (A) פאנל שמאלי: דוגמה לפרוסת z מתוך כל גיליון אור המוח תמונות תלת-ממדיות שנדגמו מחדש לרזולוציה איזוטרופית של 25 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. הפאנל האמצעי: ביאורים מאטלס המוח ההתפתחותי של אלן (P4) הרשומים בתמונת המיקרוסקופיה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. החלונית הימנית: שכבת-על של החלונית השמאלית והאמצעית. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) דוגמה לתמונה תפורה מותאמת עוצמה בתצוגה צירית. האזור המסומן בתיבות מוצג ב-(C). סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) זיהוי אוטומטי של גרעינים (אדום). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (D) כימות של סוגי תאים באזורי מוח שונים במוח P4 (גרעיני הבסיס, אלוקורטקס ההיפוקמפוס ואיזוקורטקס). אדום = נוירונים בשכבה העליונה המסומנים ב- Brn2, ירוק = נוירונים בשכבה התחתונה המסומנים ב- Ctip2, וכחול = כל הגרעינים המסומנים בצבע To-Pro-3. קיצורים: DPall = פליום גב (איזוקורטקס); MPall = פאליום מדיאלי (אלוקורטקס היפוקמפלי); CSPall = תת-פליום מרכזי (גרעיני בסיס קלאסיים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שלב ניתוח NuMorph זמן משוער
התאמת עוצמה 1 שעה
יישור ערוצים 2 דק'
תפירה איטרטיבית דו-ממדית 12 שעות
דגימה מחדש 3 דק'
הרשמה 3 דק'
ספירת תאים 5 שעות
סיווג תאים 10 דק'

טבלה 1: זמני ניתוח NuMorph.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטות ניקוי רקמות הן טכניקות שימושיות למדידת ארגון תאי תלת-ממדי של המוח. ישנן שורה של שיטות ניקוי רקמות המתוארות בספרות, כל אחת עם היתרונות והמגבלות שלה 6,7,8,9. האפשרויות לכלים חישוביים לניתוח סוגי התאים בתמונות המנוקות מהרקמות מוגבלות יחסית. כלים זמינים אחרים יושמו כדי לדלות אוכלוסיות תאים שבהן הפילוח פחות קשה10,35 או ניצלו את הרחבת הרקמה16. מאמר זה מתאר את ההכנה של מוח עכבר להדמיה עם ניקוי רקמות iDISCO+ ומדגים את NuMorph, צינור חישובי לעיבוד וכימות גרעינים בתוך מבנים של קליפת עכבר שנלכדו על ידי LSFM. הוא נועד למצוא איזון מתאים בין משך זמן ההדמיה, דיוק הגילוי של גרעיני התא ומשאבים חישוביים. צינור זה מנוגד לכלים אחרים הזמינים כיום על ידי פילוח אמין של כל הגרעינים, במקום אוכלוסיות דלילות של תאים מסומנים 10,36,37. בעבר הראינו כי דיוק זיהוי התאים גבוה, עם זמני הדמיה קצרים משמעותית וגודלי נתונים נרכשים מופחתים בהרבה לרכישת חצי כדור שלם בהשוואה לשיטות אחרות19. NuMorph מטפל במספר אתגרים חשובים לניתוח תמונות גיליון אור רב-ערוציות, כגון מתן כלים ליישור ערוצים, תיקון לתנועות שלב באמצעות כלי תפירה ותיקון בהירות האות באריחי התמונה. תהליך העבודה המוצג במאמר זה שימושי עבור הקהילה המדעית הרחבה יותר ונגיש לכל הקבוצות במוסדות המחקר. סקירה כללית של התהליך ניתן לראות באיור 1.

ישנם מספר שלבים קריטיים לאורך תהליך זה, החל מזילוף העכבר ועד לניתוח החישובי שיכולים להשפיע על איכות התמונות, הכימות והתוצאות. זה חיוני כי הזלוף מבוצע כך שכל הדם מוסר מהמוח, כמו כלי הדם יש autofluorescence טבעי שישפיע על עוצמת התמונות ידרוש התאמות בצנרת, להשפיע לרעה על התוצאות. משך קיבוע ה-PFA הוא גם קריטי, שכן השארת המוחות שקועים ב-4% PFA למשך יותר מ-24 שעות עלולה לגרום ל"תיקון יתר" של הדגימה ולהוביל לפיצוח המוח, שהופך שביר במהלך תהליך iDISCO+. פרוטוקול iDISCO שתואר לעיל שונה מעט מהפרוטוקול הרשמי שנמצא באתר24. שינוי חשוב אחד הוא הוספת PBS לסדרת מתנול/PBS, במקום מים בפרוטוקול המקורי. זאת כדי למנוע סדקים בקליפת המוח במוח העוברי והמוקדם שלאחר הלידה, שככל הנראה מתרחשת בגלל התפתחות לא שלמה של תאי גלייה, הקרנות אקסונאליות ומטריצה חוץ-תאית. בהתאם לרקמה המשמשת בפרוטוקול זה, ייתכן שיהיה צורך לבצע שינויים בכל שלב של פרוטוקול iDISCO+, כגון שינוי ריכוזי נוגדנים והגדלת זמני הדגירה של דגימות רקמה גדולות יותר, כדי לייעל את הפרמטרים האידיאליים כדי ללכוד את סמן הבחירה ולנתח אותו במדויק.

ידוע כי התכווצות רקמות מתרחשת במהלך תהליך ניקוי הרקמות של iDISCO+, אשר לאחר מכן עשוי לשנות את המדידות הנפחיות במורד הזרם 6,10. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות, כגון MRI שנערך לפני ניקוי רקמות, כדי לקבוע את מידת השינוי בגודל הרקמה בבקרות לעומת חיות ניסוי כדי לקבוע אם הבדלים נפחיים כלשהם נובעים מפנוטיפ שנחקר ולא מתהליך ניקוי הרקמות. שינויים הטרוגניים בנפחים של אזורי קליפת המוח של המוטנטים עשויים להשתנות בהתאם לתוכן התאי האזורי, שכן החומר האפור והלבן של המוח עשויים להיות מושפעים באופן דיפרנציאלי על ידי התייבשות מתנול. ניתן להשתמש בנתוני ה-MRI כדי לקבוע אם התכווצות הרקמות אינה אחידה בכל אזורי המשנה של המוח (איור 2G), וכל שינוי שנגרם על-ידי פרוטוקול הניקוי יכול להיות מותאם בניתוח החישובי במורד הזרם. יתר על כן, תהליך iDISCO+ משתמש בשטיפות מתנול קשות כדי לייבש את הדגימה, מה שעלול לגרום לנזק או לשינויים באנטיגנים מסוימים על פני הגרעינים. מומלץ שכל נוגדנים שנעשה בהם שימוש ייבדקו תחילה על מקטעי רקמת מוח שנשטפו במשך ~3 שעות ב-100% מתנול כדי לוודא שהנוגדן תואם לפרוטוקול iDISCO+.

עבור מערכי ביג דאטה הדורשים זמני עיבוד ארוכים, אנו ממליצים להשתמש בגרסה ללא חלון של MATLAB בלינוקס המאפשרת אסטרטגיות כגון יישום הפקודה "nohup", שתמשיך להריץ תהליך גם לאחר אובדן החיבור לשרת. יתר על כן, NuMorph דורש עוצמת מחשוב גבוהה, ולכן אנו ממליצים על זיכרון של 10 GB לפחות לניתוחים. אנו מנתחים את הדוגמאות באמצעות תחנת עבודה של לינוקס המפעילה את CentOS 7, המצוידת במעבד 2.6 GHz בעל 14 ליבות, זיכרון DDR4 2400 LRDIMM של 8 x 64 GB, 4 x 11 GB GPUs ו- 2 כונני SSD חיצוניים של 4TB. נתוני גיליון האור הגולמיים ששימשו כאן היו 620 GB ודרישת הזיכרון עבור התהליכים הייתה 10 GB. כאן, כללנו טבלה עם הזמנים המשוערים להשלמת כל שלב בניתוחי NuMorph כפי שניתן לראות בטבלה 1.

שלבי העיבוד המקדים של התמונה כוללים התאמת עוצמה בממד xy עבור כל מישור z, יישור ערוצים ותפירה. עוצמת התמונה מותאמת כדי להסביר את הבדלי העוצמה בין האריחים ואת התאורה הלא אחידה לאורך ממד y. ההבדל בעוצמה מתרחש בגלל התכונות הטכניות המובנות של יריעת האור כאשר היא מדמיינת בין אריחים25. לאחר מכן, יישור ערוצים מתבצע כדי להבטיח שערוצי התמונה יתיישרו כראוי בהדמיה רב-ערוצית. שלב זה מומלץ מכיוון שכל ערוץ בהדמיה רב-ערוצית נרכש בנפרד ותנועות עדינות של השלב עלולות לגרום לסחף דגימה ולגרום לאי-התאמה מרחבית19. לבסוף, האריחים לכל מישור z נתפרים יחד כדי ליצור תמונה אחת בכל מישור z. בסופו של דבר, תהיה ערימה של תמונות תפורות בכל ערוץ המייצגות את כל נפח הדגימה. תפירת התמונה האיטרטיבית מבוססת על שיטה מותאמת אישית לארגון כל התמונות הדו-ממדיות בכל ערוץ בנפח תלת-ממדי שלדגימה 19. השיטה מיישמת תחילה התכתבות z זוגית בכיוון הצירי כדי להתאים לאזורי אריח החופפים הן בכיוון האופקי והן בכיוון האנכי. תזוזת z הסופית של כל אריח נקבעת באמצעות העץ המשתרע המינימלי38. תפירה איטרטיבית דו-ממדית מתבצעת בערימה המתחילה במיקום במרכז המחסנית עם פחות אות רקע. האריח השמאלי העליון ממוקם ראשון עבור כל איטרציית תפירה כדי למנוע הזזה עדינה של תמונות בממד z.

אנו ממליצים להפעיל כל אחד מצינורות העיבוד המקדים ברצף, במיוחד בעת מיטוב לתיקון שגיאות. הבעיות העיקריות מתרחשות לעתים קרובות במהלך שלבי התפירה. בעיה אחת שיכולה להתעורר היא רכישת תמונה שגויה על גיליון האור. בעיה זו עלולה להתרחש כאשר המיקוד הדינמי האופקי אינו מוגדר כראוי על יריעת האור ועלולה לגרום לתבניות מתחלפות בפאזה/מחוץ לפאזה בתמונות (איור 4B,C). טעויות נוספות עלולות להתעורר אם המדגם לא היה מאובטח היטב, ותנועת מדגם משמעותית התרחשה במהלך הרכישה. במקרים אלה, ייתכן שלא ניתן יהיה לבצע תפירה מדויקת בשל היעדר התאמה זוגית בין אריחים סמוכים. טעויות פוטנציאליות אחרות יכולות לנבוע מאתר התחלת התפירה. NuMorph קובע את אתר התחלת התפירה בערך באמצע הערימה. עם זאת, כאשר יש רקע משמעותי באתר הפרוסה ההתחלתי, עלולות להתרחש שגיאות בהשוואה זוגית באריחי תמונה. מומלץ כאן לבחור אתר התחלה בעל יחס אות לרעש גבוה.

ניתוח התמונות המתואר כאן כולל דגימה מחדש של תמונות תפורות מרזולוציה גבוהה (0.75 x 0.75 x 4 μm³/voxel) לרזולוציה איזוטרופית נמוכה יותר של 25 μm³/voxel. אנו דוגמים מחדש את התמונות התפורות מהתעלה הגרעינית כדי לרשום את התמונות התפורות לאטלס המוח של העכבר ההתפתחותי של אלן בשלבהבא 34. לאחר מכן נספרים התאים עבור כל ערוץ באזורים מבוארים של התמונות בהתייחס לאטלס ברזולוציה גבוהה (0.75 x 0.75 x 4 μm³/voxel) באמצעות מודל 3D-Unet מאומן19. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות ולספור אובייקטים כתמים. כאשר פיתחנו את NuMorph, בדקנו את דיוק הסגמנטציה ביחס לתמונות חדשות לחלוטין שמעולם לא נראו במהלך האימון שהיו מאותו הליך ניקוי רקמות, אותו מיקרוסקופ ואותו דיוק מציאת תווית גרעינית של 0.99 וזכירה של 0.9419. דיוק NuMorph עדיין לא נבדק על הליכי ניקוי רקמות שונים, מיקרוסקופים או סמנים; לפיכך, דיוק הסגמנטציה בעיצובים ניסיוניים אחרים אינו ידוע. אטלס ברירת המחדל ב- NM_setup.m הוא אטלס אלן ייחוס39 הבוגר המוכתם בניסל עם האיטרציה השלישית של מסגרת הקואורדינטות המשותפת של מוח אלן עכבר (CCFv3) כביאור המותאם אישית.

למרות ש-NuMorph מנתחת ביעילות רקמות, שהן צפופות יחסית, כגון קליפת המוח של העכבר הבוגר, עיצובים ניסיוניים מאתגרים יותר (כגון מוחות עכברים עובריים או מבנים צפופים מאוד כגון המוח הקטן) עשויים לדרוש פיתוח של כלים חישוביים נוספים. המאמצים הנוכחיים המבוססים על הקהילה מנסים לייצר נתוני ביאור נאותים לאימון מודלים של למידה עמוקה המשמשים לפלח מקרים קשים יותראלה 40. ההתקדמות בטכנולוגיות הדמיה של יריעות אור מאפשרת חקירה כמותית בתפוקה גבוהה של מבנים תת-תאיים, כאשר גישות חדשות כגון מיקרוסקופיית תאורה מישורית סלקטיבית הפוכה (diSPIM) מובילה לרזולוציה ודיוק מוגברים באזורי מוח צפופים בתאים40,41. ככל שההתקדמות בניקוי רקמות, הדמיה וכלים חישוביים המעורבים במחקר זה מתפתחת, אנו מקווים שהם יובילו לשימוש נרחב יותר בשיטות ניקוי רקמות לניתוחים כמותיים על האופן שבו הפרעות נוירופסיכיאטריות יכולות לנבוע משינויים במבנה המוח המושרים על ידי גורמי סיכון גנטיים או סביבתיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי ה-NIH (R01MH121433, R01MH118349 ו-R01MH120125 ל-JLS ו-R01NS110791 ל-GW) וקרן התקווה. אנו מודים לפבלו אריאל מהמעבדה לשירותי מיקרוסקופיה על הסיוע בהדמיית דגימות. המעבדה לשירותי מיקרוסקופיה במחלקה לפתולוגיה ורפואה מעבדתית נתמכת בחלקה על ידי מענק התמיכה המרכזי של מרכז הסרטן P30 CA016086 למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת צפון קרוליינה (UNC) ליינברגר. ליבת המיקרוסקופיה של מדעי המוח נתמכת על ידי מענק P30 NS045892. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך בחלקו על ידי מענק התמיכה המוסדית של מרכז הביוטק של צפון קרוליינה 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Tags

מדעי המוח גיליון 186
הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter