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Neuroscience

Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve métodos para a realização de ressonância magnética, limpeza e imunomarcação de cérebros de camundongos intactos usando iDISCO+, seguido por uma descrição detalhada de imagens usando microscopia de folha de luz e análises a jusante usando NuMorph.

Abstract

A limpeza tecidual seguida de microscopia de folha de luz (LSFM) permite a imagem de resolução celular da estrutura cerebral intacta, permitindo a análise quantitativa de mudanças estruturais causadas por perturbações genéticas ou ambientais. A imagem de todo o cérebro resulta em quantificação mais precisa das células e no estudo de diferenças específicas da região que podem ser perdidas com a microscopia comumente usada de tecido fisicamente seccionado. O uso de microscopia de folha de luz para visualizar cérebros limpos aumenta muito a velocidade de aquisição em comparação com a microscopia confocal. Embora essas imagens produzam quantidades muito grandes de dados estruturais cerebrais, a maioria das ferramentas computacionais que realizam a quantificação de características em imagens de tecido limpo são limitadas à contagem de populações de células esparsas, em vez de todos os núcleos.

Aqui, demonstramos o NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), um grupo de ferramentas de análise, para quantificar todos os núcleos e marcadores nucleares dentro de regiões anotadas de um cérebro de rato pós-natal dia 4 (P4) após limpeza e imagem em um microscópio de folha de luz. Descrevemos a ressonância magnética (RM) para medir o volume cerebral antes do encolhimento causado pelas etapas de desidratação da limpeza do tecido, limpeza do tecido usando o método iDISCO +, incluindo imunomarcação, seguida de microscopia de folha de luz usando uma plataforma comercialmente disponível para visualizar cérebros de camundongos em resolução celular. Em seguida, demonstramos esse pipeline de análise de imagem usando o NuMorph, que é usado para corrigir diferenças de intensidade, costurar blocos de imagem, alinhar vários canais, contar núcleos e anotar regiões cerebrais por meio do registro em atlas disponíveis publicamente.

Projetamos essa abordagem usando protocolos e softwares disponíveis publicamente, permitindo que qualquer pesquisador com o microscópio e os recursos computacionais necessários para realizar essas técnicas. Essas ferramentas de limpeza de tecidos, imagens e computação permitem a medição e quantificação da organização tridimensional (3D) dos tipos de células no córtex e devem ser amplamente aplicáveis a qualquer projeto de estudo de camundongo do tipo selvagem / knockout.

Introduction

A imagem de todo o cérebro em resolução de célula única é um desafio importante na neurociência. As imagens cerebrais de resolução celular permitem a análise detalhada e o mapeamento em nível de sistema dos circuitos cerebrais e como esses circuitos são interrompidos por fatores de risco genéticos ou ambientais para distúrbios neuropsiquiátricos, comportamento celular em embriões em desenvolvimento, bem como circuitos neurais no cérebro adulto 1,2,3. Existem vários métodos histológicos que permitem imagens de alta resolução do cérebro 3D reconstruído; no entanto, essas técnicas requerem equipamentos caros e especializados, podem não ser compatíveis com a imunomarcação e a natureza bidimensional (2D) de alguns métodos pode levar a danos teciduais e cisalhamento durante a seccionamento 4,5.

Avanços recentes forneceram uma abordagem alternativa para a imagem de cérebros inteiros que não requer seccionamento de tecidos; eles envolvem o uso de limpeza de tecidos para tornar os cérebros transparentes. A transparência é alcançada na maioria dos métodos de limpeza tecidual tanto pela remoção de lipídios, pois eles são uma importante fonte de espalhamento de luz, quanto pela correspondência do índice de refração (IR) do objeto com o IR da solução de imersão da amostra durante a imagem. A luz pode então passar através da fronteira entre os materiais sem ser espalhada 6,7,8,9.

Métodos de clareamento tecidual, como o iDISCO+, são frequentemente combinados com imagens 3D rápidas usando microscopia de excitação de fóton único, como LSFM 6,7,10. Dentro de tecidos transparentes marcados com fluoróforo, as imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz são seções por excitação com um plano fino de luz11. A principal vantagem do LSFM é que uma única seção óptica é iluminada de cada vez, com toda a fluorescência das moléculas dentro dessa seção sendo excitada, o que minimiza o fotobranqueamento. Além disso, a imagem de uma fatia óptica inteira permite a detecção baseada em câmera dessa fatia excitada, aumentando a velocidade em relação à varredura pontual12. O LSFM produz de forma não destrutiva seções ópticas bem registradas que são adequadas para reconstrução 3D.

Embora o método iDISCO+ permita a limpeza de tecidos de baixo custo dentro de ~3 semanas, as etapas de desidratação dentro do protocolo podem levar ao encolhimento tecidual e potencial alteração da morfologia da amostra, afetando assim as medidas volumétricas 6,10. A adição de um método de imagem secundário, como a ressonância magnética, a ser usado antes do procedimento de limpeza de tecidos pode medir o grau de encolhimento induzido pela limpeza tecidual em toda a amostra. Durante as etapas de desidratação, diferenças nas propriedades mecânicas entre a substância cinzenta e a substância branca podem levar a deformações não uniformes da substância cerebral, resultando em deformações de volume induzidas por clareamento tecidual diferentes entre amostras do tipo selvagem e mutantes e podem confundir interpretações de diferenças volumétricas nessas amostras10,13 . A RNM é realizada primeiro perfundindo o animal com um agente de contraste (por exemplo, gadolínio), seguido pela incubação do tecido extraído de interesse em uma solução de imersão (por exemplo, fomblin) antes da imagem14. A RNM é compatível com a limpeza tecidual e a realização de LSFM na mesma amostra.

O LSFM é frequentemente usado para criar imagens de microscopia em larga escala para visualização qualitativa do tecido cerebral de interesse, em vez de avaliação quantitativa da estrutura cerebral (Figura 1). Sem avaliação quantitativa, é difícil demonstrar diferenças estruturais resultantes de insultos genéticos ou ambientais. À medida que as tecnologias de limpeza de tecidos e imagem melhoram, juntamente com a diminuição dos custos de armazenamento e poder de computação, a quantificação das localizações de tipo celular dentro do tecido de interesse está se tornando mais acessível, permitindo que mais pesquisadores incluam esses dados em seus estudos.

Com mais de 100 milhões de células no cérebro do rato15 e sessões de imagem de todo o cérebro que podem gerar terabytes de dados, há uma demanda crescente por ferramentas avançadas de análise de imagem que permitem a quantificação precisa de recursos dentro das imagens, como células. Existe uma série de métodos de segmentação para imagens limpas por tecidos que aplicam limiares para intensidade de coloração nuclear e filtram objetos com formas, tamanhos ou densidades predefinidos10,16,17,18. No entanto, interpretações imprecisas dos resultados podem surgir de variações em parâmetros como tamanho da célula, contraste da imagem e intensidade da rotulagem. Este artigo descreve nosso protocolo estabelecido para quantificar núcleos celulares no cérebro de camundongos. Primeiro, detalhamos as etapas para a coleta de tecidos do cérebro de camundongo P4, seguidas por um protocolo de limpeza tecidual e imunomarcação otimizado a partir do método iDISCO+disponível publicamente 10. Em segundo lugar, descrevemos a aquisição de imagens usando ressonância magnética e microscopia de folha de luz, incluindo os parâmetros utilizados para a captura de imagens. Finalmente, descrevemos e demonstramos o NuMorph19, um conjunto de ferramentas de análise de imagens que nosso grupo desenvolveu que permite quantificação específica do tipo celular após a limpeza tecidual, imunomarcação com marcadores nucleares e imagem de folha de luz de regiões anotadas.

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Protocol

Todos os camundongos foram utilizados de acordo com e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1. Dissecção e perfusão do rato

NOTA: As seguintes dissecções foram realizadas em camundongos P4 e P14 usando uma seringa. O volume de fluido de perfusão irá variar dependendo da idade do animal.

  1. Perfusão
    CUIDADO: O paraformaldeído (PFA) é um produto químico perigoso. Execute todas as etapas de perfusão em um exaustor químico.
    1. Antes da cirurgia, administrar pentobarbital via injeção intraperitoneal (100 mg/kg) e permitir que o anestésico faça efeito.
    2. Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia, use o método de resposta de beliscar o dedo do pé para confirmar a falta de resposta.
    3. Faça uma incisão lateral sob a caixa torácica para expor a cavidade torácica do animal.
    4. Usando uma tesoura cirúrgica curva, corte cuidadosamente a caixa torácica até a clavícula de um lado do animal e faça um corte idêntico no lado oposto, permitindo que o esterno seja levantado, expondo o coração.
    5. Sem danificar a aorta descendente, corte cuidadosamente qualquer tecido conectado ao coração antes de fazer uma pequena incisão no átrio direito para permitir que o sangue flua para fora da vasculatura.
    6. Usando um método baseado em seringa, perfundir o camundongo através do ventrículo esquerdo com 10 mL e 7 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para P14 e P4, respectivamente, com uma taxa de perfusão de 1,5 mL/min através do sistema.
    7. Uma vez que o sangue esteja limpo, perfundir novamente com 10 mL de PBS + 4% PFA e 7 mL de PBS + 4% PFA para P14 e P4, respectivamente, a 4 °C com uma taxa de perfusão de 1,5 mL/min para fixar o animal.
      NOTA: Tremores de fixação serão observados, e o animal ficará rígido após a conclusão. Se estiver usando a RNM em amostras, perfunda com volumes semelhantes de PBS e PFA para cada ponto de tempo + agente de contraste de RM à base de gadolínio a 20% na solução de PFA.
    8. Retirar a cabeça com tesoura cirúrgica e drop-fix com PBS + 4% PFA durante 24 h a 4 °C para fixação completa.
      NOTA: Nesta fase, o cérebro permanece intacto com o crânio ligado (ver secção 2). Ponto de pausa: os cérebros podem ser armazenados por vários meses nesta fase em PBS + azida de sódio a 0,1% a 4 °C.

2. Imagem da estrutura cerebral grosseira baseada em RM com crânio intacto e análise

NOTA: O cérebro deve ser perfundido e incubado em gadolínio, conforme descrito acima, sem ser removido do crânio. Toda a ressonância magnética ocorre antes da remoção do cérebro do crânio para evitar a perda de tecido não intencional durante a dissecção. A imagem com um crânio intacto também fornece suporte ao cérebro no suporte da amostra (ou seja, seringa) durante a preparação da amostra e a imagem.

  1. Preparação da amostra
    Observação : as etapas a seguir são otimizadas para amostras de cérebro de mouse P4 e P14. O tamanho da seringa necessário dependerá do tamanho físico da amostra.
    1. Ao realizar a RM na amostra, retire a pele do crânio e incube em PBS + gadolínio a 3% por 23 dias a 4 °C antes da imagem14. Após 23 dias, enxaguar as amostras rapidamente em PBS.
    2. Use seringas de 5 mL para criar um suporte de amostra para ressonância magnética, usando pistões de seringa para fechar cada extremidade do suporte feito com a seringa20. Use peças de plástico para manter o crânio firmemente no lugar no suporte (Figura 2A). Remova as marcas na seringa com etanol para evitar artefatos após a imagem.
    3. Coloque com segurança o crânio no suporte da amostra e preencha com uma solução de imersão compatível com ressonância magnética (ver Tabela de Materiais). Feche o suporte e remova todas as bolhas de ar usando uma seringa.
      NOTA: Ponto de pausa: O crânio pode ser armazenado na solução de imersão por vários meses antes da imagem.
  2. Imagem da estrutura cerebral grosseira (MRI)
    1. Fotografar as amostras com um sistema de RM animal de 9,4T/30 cm de diâmetro horizontal, utilizando uma bobina de volume de 15 mm e uma sequência baseada em spin-echo com os seguintes parâmetros: Resolução espacial: 60 μm x 60 μm x 60 μm; tempo total de varredura: 7 h 12 min; tempo de eco (TE): 6,83 ms; tempo de repetição (TR): 40 ms; excitação/refocalização dos ângulos de inversão: 90/180 graus; tamanho da imagem: 166 x 168 x 209 voxels; Campo de visão (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; largura de banda: 100.000 kHz.
  3. Análise computacional da estrutura cerebral grosseira
    1. Remova o crânio circundante de imagens brutas de ressonância magnética rastreando manualmente o cérebro do rato usando um software de segmentação. Em seguida, aplique a operação de multiplicação em termos de voxel entre a imagem da máscara e a imagem de ressonância magnética bruta para gerar a imagem de ressonância magnética cerebral despojada do crânio.
      NOTA: A saída é uma imagem de máscara binária onde a intensidade para voxels cerebrais é definida como 1 e 0 caso contrário.
    2. Aplicar registro de imagem rígido (estimando apenas translação e rotação) usando 'flerte' no pacote FSL21,22 para alinhar a imagem de ressonância magnética despojada do crânio (imagem em movimento) à imagem de microscopia de folha de luz correspondente (imagem de referência).
    3. Aplique o registro não rígido (usando 'SyN' no software ANTS23) para encontrar as correspondências ponto-a-ponto entre a imagem de ressonância magnética alinhada rigidamente na etapa 2.3.2 para a imagem da folha de luz (mesma imagem de referência na etapa 2.3.2).
      NOTA: A saída inclui a imagem de ressonância magnética distorcida e o campo de deformação associado às mudanças de volume da ressonância magnética para as imagens da folha de luz.
    4. Calcule o determinante jacobiano no campo de deformação gerado na etapa 2.3.3, que quantifica a mudança de volume em uma vizinhança local de voxel 3 x 3 x 3.
    5. Alinhe imagens despojadas de crânio ao Allen Developmental Mouse Brain Atlas usando registro de imagem deformável.
      NOTA: A correspondência espacial ponto-a-ponto estabelecida permite a anotação automática de regiões cerebrais de interesse na nova imagem do mouse (Figura 2C-H).

3. Dissecção cerebral do crânio

  1. Faça uma incisão na linha média ao longo do topo do crânio, do pescoço ao nariz, para expor o crânio.
  2. Exponha a base do crânio aparando o músculo restante do pescoço e todos os outros músculos residuais.
  3. Usando tesoura cirúrgica afiada, cuidadosamente cortada ao longo da superfície interna do crânio, tomando cuidado para não danificar o cérebro, mantendo uma pressão ascendente suave durante o corte com o equipamento cirúrgico afiado.
  4. Use pinças para descascar as duas metades cortadas do crânio para longe do cérebro e cortar cuidadosamente o excesso de gordura ligado ao cérebro.
  5. Use uma tesoura cirúrgica para aparar qualquer dura-máter que conecte o cérebro ao crânio e, em seguida, use uma espátula para remover suavemente o cérebro da cabeça.
  6. Remova o cérebro, lave com PBS e, em seguida, troque para PBS com azida de sódio a 0,1% e mantenha a 4 °C para armazenamento a longo prazo.

4. Limpeza de tecidos

NOTA: Este protocolo é adaptado do protocolo iDISCO+ para ratos P46, com pequenas alterações. Alguns detalhes podem mudar para diferentes pontos de tempo/espécies/experimentos). CUIDADO: Metanol, diclorometano (DCM) e éter dibenzílico (DBE) são produtos químicos perigosos. Essas etapas de limpeza de tecido são realizadas em um exaustor químico.

  1. Validação de anticorpos
    NOTA: A compatibilidade com metanol de anticorpos não testados precisa ser verificada, pois eles podem ser afetados negativamente pelas lavagens severas de metanol exigidas no protocolo iDISCO+. Para obter uma lista de anticorpos que demonstraram funcionar no iDISCO+, consulte o site24.
    1. Colha 10 μm de seções congeladas do tecido fixo em PFA de interesse em lâminas estereológicas.
    2. Incubar as seções em metanol a 100% por 3 h à temperatura ambiente.
    3. Reidratar em PBS antes de prosseguir com protocolos imuno-histoquímicos padrão para determinar se o anticorpo mostra o padrão esperado de fluorescência após lavagens com metanol. Para controle positivo, use uma lâmina não tratada com metanol.
  2. Preparação do buffer
    1. Prepare buffers de acordo com o protocolo oficial iDISCO. Consulte a Tabela de Materiais para composição dos buffers e outras soluções utilizadas neste protocolo.
  3. Pré-tratamento
    1. Desidratar a amostra com metanol/PBS série: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 h cada à temperatura ambiente.
      NOTA: O uso de PBS durante a desidratação ajuda a evitar rachaduras das amostras em lavagens com metanol.
    2. Lavar a amostra em metanol a 100% durante 1 h e, em seguida, arrefecer a 4 °C durante 1 h antes de incubar durante a noite com agitação em metanol a 66% DCM/33% à temperatura ambiente.
    3. Lavar a amostra 2x em metanol a 100% à temperatura ambiente e, em seguida, arrefecer a 4 °C.
    4. Utilizar 5% H 2 O2frescos em metanol para branquear a amostra durante a noite a 4 °C.
    5. Reidratar a amostra com metanol/PBS série: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 h cada à temperatura ambiente e lavar 2x por 1 h em PTx.2 à temperatura ambiente.
    6. Incubar a amostra em 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO a 37 °C durante a noite.
    7. Incubar a amostra em 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Desoxicolato/0,1% NP40/20% DMSO a 37 °C durante a noite.
    8. Lavar em PTx.2 à temperatura ambiente durante 1 h duas vezes.
  4. Imunomarcação
    1. Incubar as amostras em Solução de Permeabilização a 37 °C durante 2 dias (~48 h).
    2. Bloquear as amostras em Solução de Bloqueio a 37 °C durante 2 dias (~48 h).
    3. Incubar as amostras com anticorpo primário em PTwH / 5%DMSO / 3% de soro a 37 °C por 4 dias (~96 h) (por exemplo, coelho (Rb) Brn2/POU3F2 mAb (1:100) e anticorpo anti-Ctip2 rato(Rt) (1:400) (Tabela de Materiais).
    4. Lave 3 x 1 h em PTwH. Lave por mais 2 h em PTwH. Deixe na solução de lavagem durante a noite à temperatura ambiente.
    5. Incubar as amostras com anticorpo secundário e um corante nuclear, como TO-PRO-3, em PTwH/soro a 3% a 37 °C por 4 dias (~96 h; por exemplo, anti-Rb de cabra(1:50) e (anti-Rt(1:200)) (Tabela de Materiais).
    6. Lave 3 x 1 h em PTwH Lave por mais 2 h em PTwH. Deixe na solução de lavagem durante a noite à temperatura ambiente.
  5. Clareira
    1. Desidratar em metanol/PBS série -20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h cada um à temperatura ambiente. Incubar por 3 h, com agitação, em 66% DCM / 33% metanol à temperatura ambiente.
      NOTA: A amostra pode ser deixada durante a noite à temperatura ambiente imediatamente após a desidratação em metanol a 100%.
    2. Incubar em 100% DCM durante 15 min duas vezes à temperatura ambiente (com agitação) para lavar o MeOH.
    3. Incubar em éter dibenzílico (DBE) sem agitar à temperatura ambiente. Certifique-se de que o tubo está preenchido quase completamente com DBE para evitar a oxidação da amostra. Termine de misturar a solução invertendo algumas vezes antes da imagem.

5. Imagem de folha de luz

NOTA: Os cérebros limpos por tecido iDISCO foram fotografados com um microscópio de folha de luz, equipado com uma objetiva de NA 2X/0,5, uma câmera semicondutora complementar de óxido metálico e software de operação e aquisição de imagens de microscópio a 0,75 x 0,75 x 4 μm/voxel para o ponto de tempo P4, pois isso permitiu a resolução de célula única dentro do córtex (Figura 3A,B).

  1. Montagem da amostra
    1. Montar cuidadosamente a amostra no suporte de tamanho de amostra correto de modo que a amostra seja orientada com a dimensão z não superior a 5,2 mm de profundidade devido à distância nominal de trabalho do microscópio de folha de luz (5,7 mm menos margem de segurança de 0,5 mm)25.
    2. Coloque no suporte da amostra com o parafuso do suporte em um ângulo de 45° em relação aos suportes do berço (Figura 1B). Posicione o berço de modo que o caminho da luz seja perpendicular à amostra (Figura 1C).
  2. Parâmetros de imagem
    1. Defina o corpo de zoom no microscópio para ampliação de 4x ou superior, produzindo 0,75 μm/pixel.
      NOTA: As análises computacionais de célula única em imagens de folha de luz P4 podem ser feitas com qualquer microscópio de folha de luz comercialmente disponível que permita uma resolução de 0,75 x 0,75 x 4 μm/voxel ou superior. Uma resolução mais baixa é suficiente para cérebros em pontos de tempo posteriores em que os núcleos são mais esparsamente distribuídos.
    2. No software de aquisição de imagem, selecione uma única folha de luz com um NA = ~0,08 (espessura de 9 μm/passo z de 4 μm).
      NOTA: Esta configuração combinada com o foco dinâmico horizontal permite imagens de todo o cérebro em uma resolução de célula única de um cérebro de rato dentro de um tempo razoável. Para um dia pós-natal 4 (P4) cerebral, o tempo de aquisição de imagem é estimado em 11-15 h para três canais, dependendo do tamanho do cérebro.
    3. Para garantir que a resolução axial seja mantida ao longo da largura da imagem, selecione Foco dinâmico horizontal e aplique o número recomendado de etapas, dependendo do comprimento de onda do laser. Para um cérebro inteiro de rato P4, defina o foco dinâmico horizontal para 11. Ajuste o foco fino para cada canal em relação ao canal de registro.
      NOTA: Aqui, o canal TO-PRO-3 (647 nm) é registrado no Allen Developmental Mouse Brain Atlas, pois isso rotula todos os núcleos.
    4. Ajuste a potência do laser por canal em relação às propriedades do canal.
      NOTA: Comprimentos de onda mais longos requerem maior potência do laser em comparação com comprimentos de onda mais curtos. Por exemplo, o 780 nm precisa ser fotografado com uma alta potência de laser (70% - 75%) e baixa exposição (50 ms), enquanto o canal de 647 nm requer uma potência média do laser (40% - 45%) e baixa exposição (50 ms).
    5. Ajuste a largura da folha de luz para ~50% para garantir que a potência da folha seja distribuída de forma ideal na dimensão y para esse tamanho de amostra.
      NOTA: Em combinação com o foco dinâmico horizontal, uma largura de folha de 50% fornece uma distribuição média de energia em toda a imagem com um risco reduzido de fotobranqueamento25.
    6. Defina o Número de Blocos em relação ao tamanho da amostra com uma Sobreposição recomendada de 15% entre blocos e capture imagens para cada canal sequencialmente para cada pilha em uma determinada posição de bloco.

6. Processamento de imagens usando NuMorph

NOTA: O pipeline NuMorph tem três partes principais para análise de imagens 3D: pré-processamento, análise e avaliação. Essas partes foram organizadas em NMp_template.m, NMa_template.m, e NMe_template.m, respectivamente, que são discutidas abaixo. Além disso, NM_setup.m é adicionado para baixar e instalar pacotes de software necessários para que o NuMorph funcione sem problemas. NM_samples.m também fornece um modelo para inserir informações de aquisição de imagens.

  1. Configuração do NuMorph
    1. Baixe e instale o gerenciador de ambiente conda para Linux26. Baixe e instale as ferramentas de processamento de imagem do NuMorph19 .
    2. Na linha de comando, execute o Matlab. Execute NM_setup.m do NuMorph para baixar e instalar pacotes de software de análise de imagem necessários para análises.
      NOTA: Esta etapa garante que o ambiente conda esteja configurado corretamente, bem como garante que todas as ferramentas e complementos necessários para o Matlab executar cada um dos três pipelines sejam baixados e instalados corretamente. Os mais notáveis aqui são Elastix para executar o registro e 3D-Unet para detecção e contagem de células.
  2. Especifique nomes de amostra, diretórios de entrada e saída, informações de canal e parâmetros de imagem de folha de luz editando o arquivo NM_samples.m.
    Observação : aqui, recomenda-se verificar novamente para certificar-se de que as informações corretas, especialmente o diretório de entrada de imagem, são especificadas corretamente. Os erros geralmente não são chamados aqui até a execução das etapas subsequentes.
  3. Pré-processamento de imagem
    1. Ajuste de intensidade
      1. No NMp_template, defina ajuste de intensidade = verdadeiro.
        NOTA: Defina como true se o ajuste de intensidade for necessário. Caso contrário, defina ajuste de intensidade = false. Há também uma opção para usar 'update' para substituir os parâmetros de ajuste anteriores.
      2. Defina usar imagens processadas = false ao trabalhar com um novo conjunto de imagens. Caso contrário, indique quaisquer conjuntos de dados de imagem salvos anteriormente no diretório de saída (por exemplo, "alinhado", "costurado") a ser usado para as etapas de processamento subsequentes.
        Observação : essa opção é fornecida no caso em que as imagens de entrada já foram pré-processadas. Nesse caso, as imagens pré-processadas serão usadas como imagens de entrada e a opção será definida como o nome do subdiretório no diretório de saída.
      3. Defina salvar imagens = true.
        Observação : usando essa opção garante que as imagens processadas são salvas no diretório de saída; caso contrário, somente os parâmetros serão calculados e salvos.
      4. Defina salvar amostras = true.
        Observação : essa opção garante que os resultados de exemplo sejam salvos para cada etapa principal.
      5. Defina ajustar sombreamento de azulejo = básico para aplicar a correção de sombreamento usando o algoritmo BaSiC27 ou manual para aplicar a correção de sombreamento de azulejo usando medições do microscópio de folha de luz em larguras específicas de folha de luz.
        NOTA: Esta opção corrige a iluminação irregular ao longo da dimensão y causada pela forma da cintura da folha.
    2. Alinhamento do canal de imagem
      1. Em NMp_template, defina alinhamento de canal = true. Defina essa opção como true se o alinhamento do canal for necessário. Caso contrário, defina como false. Defina o método de alinhamento do canal para tradução (rígida) ou elastix (não rígida).
        NOTA: O método de translação utiliza abordagens rígidas de registro 2D no alinhamento de múltiplos canais, enquanto o método elastix utiliza B-splines não rígidas28 para corrigir a deriva rotacional, o que pode ocorrer durante a aquisição de imagens longas19.
    3. Costura de imagem iterativa
      1. Em NMp_template, defina stitch images = true.
        Observação : defina essa opção como true se a costura for necessária.
      2. Definir refinamento de peneira = verdadeiro.
        Observação : essa opção é usada para refinar ainda mais a tradução em xy usando a transformação de recurso invariante de escala29.
      3. Defina parâmetros de alinhamento de carga = true.
        NOTA: Esta opção utiliza as traduções de alinhamento de canal durante a costura. Essa opção é recomendada com imagens multicanal. Caso contrário, defina como false.
      4. Defina sobreposição = 0,15 para corresponder às sobreposições de blocos durante a geração de imagens.
    4. Para executar qualquer uma dessas etapas de pré-processamento, execute o seguinte no Matlab fora NMp_template ambiente:
      1. Especifique o nome do exemplo. Defina config = NM_config(process,sample).
      2. Execute qualquer uma das etapas de pré-processamento especificando NM_process(config,stage) e especifique o estágio usando intensidade, alinhamento ou ponto para qualquer um dos processos. Verifique se há arquivos de saída no diretório de saída para cada um dos estágios (Figura 3 e Figura 4).
  4. Análise de imagem
    1. Antes do NuMorph
      1. Comece com uma imagem de atlas 3D e uma imagem de anotação associada que atribui cada voxel a uma estrutura específica.
        NOTA: O P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas gerado a partir do MagellanMapper30 é usado aqui.
      2. Alinhe a imagem do atlas e o arquivo de anotações para garantir que eles correspondam corretamente na orientação correta.
    2. Dentro do NuMorph
      NOTA: Agora que o atlas e suas anotações estão alinhados corretamente, os arquivos precisam ser "enfeitados" ou processados no NuMorph para que possam ser salvos para uso posterior. Para fazer isso, use a função munge_atlas para especificar entradas, conforme mostrado abaixo.
      1. Especifique Atlas_file: (cadeia de caracteres). Forneça o caminho completo para o arquivo atlas.
      2. Especifique Annotation_file: (cadeia de caracteres). Forneça o caminho completo para as anotações associadas.
      3. Especifique a resolução: (1x3 numérico). Especifique a resolução do atlas y, x, z como mícron por pixel.
      4. Especifique a orientação: (1 x 3 caracteres). Forneça a orientação do atlas e certifique-se de que ela corresponda à configuração da amostra no berço (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),esquerda(l)/direita(r)).
      5. Especificar Hemisfério: Especifique qual hemisfério cerebral foi fotografado ("esquerda", "direita", "ambos", "nenhum").
      6. Especifique out_resolution:(int). Especifique a resolução isotrópica da saída do atlas em mícrons. (padrão: 25).
      7. Execute o comando "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolution, orientation, hemisphere)" para gerar anotações munged em /data/annotation_data e uma cópia da imagem do atlas em /data/atlas.
      8. Leia a estrutura do Matlab e o arquivo atlas para verificar se ambos os arquivos estão corretamente na orientação correta.
        NOTA: Uma etapa adicional de classificação celular pode ser realizada para quantificar os tipos de células com base na co-localização de marcadores proteicos imunomarcados.
    3. Reamostragem
      1. Em NMa_template, defina resample images = true, se estiver executando o registro de imagem para fazer referência ao atlas ou para gerar volumes reduzidos de conjuntos de dados de alta resolução.
        NOTA: O NMa_template.m será usado para definir os parâmetros para reamostragem, registro, detecção de núcleos e contagem de células.
      2. Defina a resolução de nova amostra para corresponder ao atlas.
        NOTA: Aqui, a resolução isotrópicade 25 μm 3/voxel é usada porque o atlas de referência está nessa resolução.
      3. Especifique o número do canal a ser reamostrado usando a reamostragem de canais = [ ].
        NOTA: Aqui, o número do canal é definido para corresponder ao canal nuclear. Se essa opção estiver vazia, somente o canal de registro será reamostrado.
    4. Inscrição
      1. Em NMa_template, defina registrar imagens = true. Defina como true se o registro for necessário. Caso contrário, defina registro = false.
      2. Especifique o arquivo atlas para corresponder ao arquivo no diretório atlas.
      3. Defina parâmetros de registro = padrão.
        NOTA: Esta opção utiliza uma transformação afim seguida de spline B para estimar a correspondência espacial. Caso contrário, defina um novo conjunto de parâmetros de registro via Elastix em /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Defina salvar imagens registradas = true.
        NOTA: Os arquivos de saída do registro e da reamostragem podem ser baixados e inspecionados visualmente no Matlab ou em outras ferramentas de visualização, como o FIJI31.
    5. Detecção de Núcleos, Contagem de Células e Classificação
      Observação : erros que ocorrem aqui podem ser devido a não especificar o arquivo de anotações corretamente ou não corresponder a idade da amostra com a anotação correta.
      1. Em NMa_template, defina ambos os núcleos de contagem e classifique as células = verdadeiro.
      2. Método de contagem de conjunto = 3dunet.
        NOTA: Esta opção permite o uso do modelo19 3D-Unet treinado. Caso contrário, selecione Hessian que utiliza o método de detecção de blobo Hessian.
      3. Defina min_intensity para definir um limite de intensidade mínima para objetos detectados.
        NOTA: Um limiar apropriado é determinado empiricamente com base na relação sinal-ruído da rotulagem nuclear.
      4. Defina classify_method para qualquer um dos limites, que é baseado em intensidades de fluorescência não supervisionadas em posições de centroide ou svm, que modela um classificador SVM (Support Vector Machine) linear supervisionado.
        Observação : esta etapa classificará todas as células detectadas em quatro classes principais com imagens de 3 canais. Com esse protocolo, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2-, e Outliers são gerados.
    6. Etapas de análise
      1. Especifique o nome do exemplo. Defina config =NM_config(analyze,sample).
      2. Execute qualquer uma das etapas de análise especificando NM_analyze(config,stage) e especifique o estágio usando reamostragem, registrar, contar ou classificar. Verifique se há arquivos de saída no diretório de saída para cada um dos estágios (Figura 5).
    7. Classificação do tipo celular e análise de grupo
      1. Em NMe_template, defina update = true e substitua todas as estatísticas anteriores calculadas.
        NOTA: O NMe_template.m fornece a opção de realizar análises de grupo de tipo celular em regiões cerebrais do mesmo cérebro que está sendo analisado.
      2. Defina compare_structures_by para índice para comparar por todas as anotações exclusivas ou tabela para comparar estruturas de acordo com a tabela.
      3. Defina o template_file, que especifica todos os índices de estrutura possíveis e deve existir em /annotations.
      4. Defina structure_table e especifique as estruturas a serem avaliadas.
      5. Especifique a contagem de células e a classificação do tipo de célula, conforme descrito em NMa_template.m.
      6. Defina compare_groups para especificar grupos a serem comparados.
      7. Defina emparelhado como verdadeiro ou falso para executar o teste t emparelhado ou o teste t de duas amostras.
    8. Executar análise.
      Observação : para executar esta etapa, execute o seguinte no Matlab fora NMe_template ambiente .m.
      1. Especifique o nome do exemplo. Defina config =NM_config(avaliar,amostra).
      2. Execute a etapa de análise especificando NM_evaluate(config,stage) e especifique o estágio. Verifique o diretório de saída para arquivos de saída para a análise de grupo.

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Representative Results

Como o protocolo iDISCO+ introduz um encolhimento significativo do tecido, que é facilmente perceptível pelo olho (Figura 2B), adicionamos uma etapa de ressonância magnética a esse pipeline antes da limpeza do tecido para quantificar o encolhimento induzido pelo clareamento tecidual. O fluxo de trabalho começa com a remoção do tecido não cerebral da imagem de RM (Figura 2C). Em seguida, uma transformação rígida (3 ângulos de translação e 3 ângulos de rotação) é aplicada para alinhar a imagem MR à imagem da folha de luz (Figura 2D). Ao fazê-lo, observou-se uma perda de volume total de 60% induzida pelo procedimento de clareamento tecidual (Figura 2E), o que foi consistente com as estimativas de mudança de volume por olho (Figura 2B). Esse resultado é bem diferente de um relatório anterior, onde foi relatado um encolhimento de 5%-10%10,32. A diferença no encolhimento pode ser causada pela diferença na idade animal entre os dois estudos (P4 vs. cérebros adultos) ou devido a diferenças de tempo na lavagem com metanol na etapa de limpeza do protocolo iDISCO+ (16 h vs. 2 h). Para mapear os graus de encolhimento do tecido em diferentes regiões do cérebro, implantamos ainda um registro de imagem deformável onde a imagem da folha de luz é usada como referência. A imagem de RM registrada é mostrada em (Figura 2F). A mudança de volume estimada devido ao procedimento de limpeza de tecidos é codificada por cores, onde um maior grau de encolhimento é observado no córtex em comparação com outras regiões do cérebro (Figura 2G).

Para medir os volumes das regiões cerebrais, foi realizada a segmentação da RM por meio do registro em um atlas anotado. A segmentação de cérebros com imagens de RM foi considerada bem-sucedida se a sobreposição do atlas de referência correspondesse estreitamente aos limites anatômicos identificados por diferenças de contraste nas imagens brutas de RM (Figura 2H). A sobreposição durante o registro depende do bom preparo da amostra (Figura 2A), da aquisição da imagem e da decapagem do crânio. A etapa de remoção do crânio é crucial para bons resultados de registro, pois o registro tentará deformar a imagem de referência do atlas para toda a imagem de RM, incluindo qualquer crânio que permaneça na imagem. A inclusão do crânio no registro pode distorcer os resultados e produzir uma renderização de volume 3D registrada incorretamente da segmentação. A renderização final do volume 3D pode então ser visualizada usando o ITK-SNAP33 (Figura 2H). Este método é usado para avaliar as diferenças de volume cerebral grosso entre os grupos de amostra. A base celular subjacente às diferenças de volume descobertas com a ressonância magnética pode ser perseguida usando a contagem celular com limpeza de tecido, microscopia de folha de luz e NuMorph.

O objetivo da limpeza e análise de tecidos é avaliar as contribuições de diferentes tipos de células para as diferenças entre condições experimentais (por exemplo, genótipo, exposição ambiental) contando núcleos individuais usando NuMorph. A limpeza tecidual usando o protocolo iDISCO+ e marcadores de núcleos específicos da camada neuronal resultou em grupos celulares claramente definidos de neurônios da camada superior e inferior no isocórtex (Figura 3).

A contagem de células usando NuMorph depende de etapas de pré-processamento bem-sucedidas envolvendo ajuste de intensidade, alinhamento de canais e costura (Figura 4A). Erros que ocorrem em qualquer uma dessas etapas podem resultar em costura inadequada (Figura 4B,C). Por exemplo, a aquisição inadequada de imagens pode resultar em imagens com padrões em foco e fora de foco durante o pré-processamento (Figura 4C). Para contar núcleos de regiões específicas do cérebro, as imagens costuradas são anotadas usando um atlas disponível publicamente. Registramos nossas imagens costuradas em uma versão corrigida do P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. Aqui, as imagens costuradas foram reduzidas de uma resolução alta (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) para uma resolução mais baixa (resolução isotrópica de 25 μm³/voxel) para corresponder à resolução do atlas. A correspondência da resolução do atlas garante o registro correto das imagens no atlas e fornece anotações regionais nas imagens adquiridas (Figura 5A).

Para realizar a contagem específica do tipo celular específico, marcamos neurônios da camada superior expressando Brn2, neurônios da camada inferior expressando Ctip2 e todos os núcleos com TO-PRO-3 (Figura 3B). A imagem é realizada em resolução espacial suficiente para separar núcleos individuais (0,75 x 0,75 x 4 μm3/voxel). Os centroides dos núcleos são detectados com um modelo 3D-Unet treinado em NuMorph (Figura 5B,C). Detectamos ~12 × 10 6 núcleos totais que eram To-Pro-3+ no isocórtex, incluindo ~2,6 × 10 6 Brn2+ e 1,6 × 106 núcleos Ctip2+. Também detectamos ~3,7 × 10 6 e 2,9 × 106 núcleos totais To-Pro-3+ nos gânglios da base e alocórtex hipocampal, respectivamente. Aproximadamente 1,5 × 10 6 e <1 × 106 células Ctip2+ foram contadas nos gânglios da base e no alocórtex hipocampal, respectivamente, embora um número insignificante de células Brn2+ tenha sido detectado (Figura 5D). As contagens totais de núcleos no isocórtex e no alocórtex do hipocampo combinadas (~ 15 milhões de células) são semelhantes às contagens totais de células relatadas anteriormente no córtex cerebral do camundongo15. Esses resultados demonstram a utilidade da ressonância magnética, da metodologia de limpeza tecidual iDISCO+ e da análise computacional NuMorph para revelar contagens volumétricas, totais de células e contagens específicas de tipo celular subjacentes às diferenças na estrutura cerebral de camundongos entre grupos experimentais.

Figure 1
Figura 1: Visão geral da análise de células únicas de todo o cérebro de tecidos 3D neonatais intactos limpos cérebros de camundongos. (A) Visão geral da limpeza de tecido iDISCO +, imagem de folha de luz e análise de imagem 3D. (B) Imagens que mostrem a montagem correta da amostra no microscópio de folha de luz. (C) Desenho animado mostrando a montagem da amostra em relação ao caminho da folha de luz. Abreviação: ab = anticorpo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Medidas da estrutura cerebral macroscópica com RM. (A) Imagem mostrando o preparo da amostra para a RM. (B) Imagens de cérebros P4 representativos antes e após a depuração tecidual iDISCO+. Barra de escala = 5,0 cm. (C) Imagem bruta de RM com crânio ligado a 60 x 60 x 60 μm³. Barra de escala = 800 μm. (D) Imagem de folha de luz do cérebro do rato a 25 x 25 x 25 μm³. Volume total = 68,7 mm3. Note-se que uma pequena seção do isocórtex dorsal foi removida involuntariamente durante a dissecação marcada por ponta de seta (branca). Barra de escala = 800 μm. (E) Imagem de RM do cérebro do rato após a remoção do crânio e registro rígido. Volume total = 171,9 mm3. Inserir (amarelo) mostra o contorno cerebral da imagem da folha de luz. Barra de escala = 800 μm. (F) Imagem de RM registrada em referência à imagem de folha de luz para avaliar a deformação. Barra de escala = 800 μm. (G) Mapeamento cerebral em nível de Voxel para avaliar as mudanças de volume entre a imagem da folha de luz e a imagem de RM, onde azul e vermelho indicam encolhimento e expansão da imagem de RM para a imagem de folha de luz, respectivamente. No geral, houve uma perda de volume de 60%, mas algumas regiões, como o isocórtex, apresentaram maior encolhimento em relação a outras. (H) Painel esquerdo: Vista axial da imagem de RM com segmentações registradas do Allen Developmental Brain Atlas sobreposto. Painel direito: renderização de volume 3D de segmentação. Barra de escala = 800 μm. Abreviaturas: OB = bulbo olfatório; Dpall = pálio dorsal/isocórtex; Mb = mesencéfalo; Cb = cerebelo. Orientação: R = Rostral; L = Lateral; D = Dorsal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens de resolução celular e alinhamento de canais. (A) Seção axial óptica da coloração nuclear TO-PRO-3 (TP3) e imunomarcação para marcadores Ctip2 (neurônio da camada inferior) e Brn2 (neurônio da camada superior) no cérebro de camundongo P4. Barra de escala = 1 mm. (B) Inserção aumentada de áreas corticais em A (caixa) mostrando alinhamento correto dos canais com localização esperada de neurônios da camada superior imunomarcados com Brn2 e da camada inferior imunomarcados com Ctip2. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Exemplos de costura de imagem. (A) A amostra resulta de uma imagem iterativa 2D e corretamente costurada. Barra de escala = 1 mm. Inserir mostra um exemplo de costura correta ampliada. Barra de escala = 500 μm. (B) A amostra resulta de uma imagem iterativa 2D costurada incorretamente. Barra de escala = 1 mm. Inserir mostra um exemplo de costura incorreta ampliada (saliência). Barra de escala = 100 μm. (C) A amostra resulta de uma imagem iterativa 2D costurada incorretamente. Barra de escala = 1 mm. Inserir mostra um exemplo de costura incorreta ampliada (fora de foco). Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Registro de imagens de baixa resolução, detecção de núcleos de alta resolução e contagem de células no cérebro de camundongos P4. (A) Painel esquerdo: Um exemplo de uma fatia z de imagens 3D de toda a folha de luz cerebral reamostrada para resolução isotrópica de 25 μm. Barra de escala = 1 mm. Painel do meio: Anotações do Allen Developmental Brain Atlas (P4) registradas na imagem de microscopia. Barra de escala = 1 mm. Painel direito: Sobreposição dos painéis esquerdo e do meio. Barra de escala = 1 mm. (B) Exemplo de uma imagem costurada ajustada à intensidade em vista axial. A região encaixotada é mostrada em (C). Barra de escala = 1 mm. (C) Detecção automatizada de núcleos (vermelho). Barra de escala = 50 μm. (D) Quantificação de tipos de células em diferentes regiões cerebrais do cérebro P4 (gânglios da base, alocórtex hipocampal e isocórtex). Vermelho = Neurônios da camada superior marcados com Brn2, Verde = Neurônios da camada inferior marcados com Ctip2 e Azul = todos os núcleos marcados com corante To-Pro-3. Abreviaturas: DPall = Pálio dorsal (isocórtex); MPall = Pálio medial (alocórtex hipocampal); CSPall = Subfálio central (gânglios basais clássicos). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estágio de análise NuMorph Tempo estimado
Ajuste de Intensidade 1 h
Alinhamento de canais 2 min
Costura iterativa 2D 12 horas
Reamostragem 3 min
Inscrição 3 min
Contagem de células 5 h
Classificação celular 10 min

Tabela 1: Tempos de análise do NuMorph.

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Discussion

Os métodos de limpeza de tecidos são técnicas úteis para medir a organização celular 3D do cérebro. Há uma série de métodos de clareamento tecidual descritos na literatura, cada um com suas vantagens e limitações 6,7,8,9. As opções de ferramentas computacionais para analisar os tipos de células nas imagens limpas por tecidos são relativamente limitadas. Outras ferramentas disponíveis têm sido implementadas para populações celulares esparsas nas quais a segmentação é menos difícil 10,35 ou têm aproveitado a expansão tecidual16. Este artigo descreve a preparação de um cérebro de rato para imagens com limpeza de tecido iDISCO+ e demonstra o NuMorph, um pipeline computacional para processar e quantificar núcleos dentro de estruturas de um córtex de rato capturado por LSFM. Ele é projetado para encontrar um equilíbrio apropriado entre o tempo de imagem, a precisão de detecção de núcleos celulares e recursos computacionais. Este pipeline contrasta com outras ferramentas atualmente disponíveis, segmentando de forma confiável todos os núcleos, em vez de populações esparsas de células marcadas 10,36,37. Mostramos anteriormente que a precisão da detecção celular é alta, com tempos de imagem significativamente mais curtos e tamanhos de dados adquiridos muito reduzidos para aquisição de todo o hemisfério em comparação com outros métodos19. O NuMorph aborda uma série de desafios importantes para a análise de imagens de folha de luz multicanal, como fornecer ferramentas para alinhamento de canais, corrigir movimentos de palco com uma ferramenta de costura e corrigir o brilho do sinal nos blocos de imagem. O fluxo de trabalho apresentado neste artigo é útil para a comunidade científica mais ampla e acessível a todos os grupos em instituições de pesquisa. Uma visão geral do processo pode ser vista na Figura 1.

Existem várias etapas críticas ao longo desse processo, desde a perfusão do mouse até a análise computacional, que podem afetar a qualidade a jusante das imagens, quantificação e resultados. É essencial que a perfusão seja realizada de tal forma que todo o sangue seja removido do cérebro, pois os vasos sanguíneos possuem uma autofluorescência natural que afetará a intensidade nas imagens e exigirá ajustes no pipeline, afetando negativamente os resultados. A duração da fixação do PFA também é crucial, pois deixar os cérebros submersos em 4% de PFA por mais de 24 h pode resultar em "overfixing" da amostra e levar a rachaduras do cérebro, que se torna frágil durante o processo iDISCO+. O protocolo iDISCO descrito acima foi ligeiramente modificado em relação ao protocolo oficial encontrado no site24. Uma modificação importante é a adição de PBS à série metanol/PBS, em vez de água no protocolo original. Isso é para evitar rachaduras corticais nos cérebros embrionários e pós-natais precoces, o que provavelmente ocorre devido ao desenvolvimento incompleto de células gliais, projeções axonais e matriz extracelular. Dependendo do tecido utilizado neste protocolo, modificações podem ter que ser feitas em cada etapa do protocolo iDISCO+, como alterar as concentrações de anticorpos e aumentar os tempos de incubação de amostras de tecido maiores, para otimizar os parâmetros ideais para capturar o marcador de escolha e analisá-lo com precisão.

Sabe-se que o encolhimento tecidual ocorre durante o processo de clareamento tecidual iDISCO+, que pode então alterar as medidas volumétricas a jusante 6,10. Métodos alternativos, como a ressonância magnética realizada antes da limpeza tecidual, podem ser usados para determinar a extensão de qualquer alteração no tamanho do tecido em controles versus animais experimentais para determinar se quaisquer diferenças volumétricas são devidas ao fenótipo estudado e não ao processo de limpeza tecidual. Alterações heterogêneas nos volumes das regiões corticais dos mutantes podem diferir dependendo do conteúdo celular regional, pois a substância cinzenta e branca do cérebro pode ser diferencialmente afetada pelas desidratações do metanol. Os dados de ressonância magnética podem ser usados para determinar se o encolhimento do tecido não é uniforme em todas as sub-regiões do cérebro (Figura 2G), e quaisquer alterações incorridas pelo protocolo de limpeza podem ser ajustadas na análise computacional a jusante. Além disso, o processo iDISCO+ usa lavagens severas de metanol para desidratar a amostra, o que pode resultar em danos ou alterações em certos antígenos nas superfícies dos núcleos. Recomenda-se que todos os anticorpos que estão sendo usados sejam testados primeiro em seções de tecido cerebral que foram lavadas por ~ 3 h em metanol a 100% para garantir que o anticorpo seja compatível com o protocolo iDISCO +.

Para grandes conjuntos de dados que exigem longos tempos de processamento, recomendamos o uso da versão sem janela do MATLAB no Linux que permite estratégias como a implementação do comando "nohup", que continuará executando um processo mesmo depois que a conexão com um servidor for perdida. Além disso, o NuMorph requer alto poder de computação, por isso recomendamos pelo menos uma memória de 10 GB para análises. Analisamos as amostras usando uma estação de trabalho Linux executando o CentOS 7, que é equipada com um processador de 14 núcleos de 2,6 GHz, memória DDR4 2400 LRDIMM de 8 x 64 GB, GPUs 4 x 11 GB e SSDs externos de 2 x 4 TB. Os dados brutos da folha de luz usados aqui foram de 620 GB e o requisito de memória para os processos foi de 10 GB. Aqui, incluímos uma tabela com os tempos estimados para completar cada etapa das análises do NuMorph, conforme visto na Tabela 1.

As etapas de pré-processamento de imagem envolvem ajuste de intensidade na dimensão xy para cada plano z, alinhamento de canal e costura. A intensidade da imagem é ajustada para levar em conta as diferenças de intensidade entre as telhas e a iluminação irregular ao longo da dimensão y. A diferença de intensidade ocorre devido às propriedades técnicas inerentes da folha de luz, uma vez que ela se apresenta entre as telhas25. Em seguida, o alinhamento do canal é realizado para garantir que os canais de imagem se alinhem corretamente em uma imagem multicanal. Essa etapa é recomendada, uma vez que cada canal na imagem multicanal é adquirido individualmente e movimentos sutis do palco podem causar desvios na amostra e resultar em desalinhamento espacial19. Finalmente, os blocos por plano z são então costurados para formar uma única imagem em cada plano z. No final, haverá uma pilha de imagens costuradas por canal representando todo o volume da amostra. A costura de imagem iterativa é baseada em um método personalizado para organizar todas as imagens 2D por canal em um volume 3D da amostra19. O método primeiro implementa uma correspondência z par a par na direção axial para corresponder às regiões do bloco que estão se sobrepondo na direção horizontal e vertical. O deslocamento z final de cada telha é determinado usando a árvore de abrangência mínima38. A costura iterativa 2D é realizada em uma pilha começando em um local no centro da pilha com menos sinal de fundo. O bloco superior esquerdo é colocado primeiro para cada iteração de costura para evitar o deslocamento sutil de imagens na dimensão z.

Recomendamos executar cada um dos pipelines de pré-processamento sequencialmente, especialmente ao otimizar para corrigir erros. Os principais problemas geralmente ocorrem durante as etapas de costura. Um problema que pode surgir é a aquisição incorreta de imagens na folha de luz. Esse problema pode ocorrer quando o foco dinâmico horizontal é definido incorretamente na folha de luz e pode resultar em padrões alternados em fase/fora de fase nas imagens (Figura 4B,C). Erros adicionais podem surgir se a amostra não estiver firmemente fixada e se ocorrer um movimento significativo da amostra durante a aquisição. Nestes casos, a costura precisa pode não ser possível devido à falta de correspondência par a par entre as telhas adjacentes. Outros erros potenciais podem resultar do local de início do ponto. O NuMorph determina o local de início do ponto aproximadamente no meio da pilha. No entanto, quando há um plano de fundo significativo no local da fatia inicial, podem ocorrer erros na comparação par a par em blocos de imagem. Recomenda-se aqui escolher um local de partida que tenha uma alta relação sinal-ruído.

A análise de imagem aqui descrita inclui a reamostragem de imagens costuradas de alta resolução (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) para uma resolução isotrópica mais baixa de 25 μm³/voxel. Reamostramos as imagens costuradas do canal nuclear para registrar as imagens costuradas no Allen Developmental Mouse Brain Atlas na próxima etapa34. As células são então contadas para cada canal em regiões anotadas das imagens em referência ao atlas em alta resolução (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) usando um modelo 3D-Unet treinado19. Esse método também pode ser usado para detectar e contar objetos de blob. Ao desenvolver o NuMorph, testamos a precisão de segmentação em relação a imagens completamente novas nunca vistas durante o treinamento que eram do mesmo procedimento de limpeza de tecido, mesmo microscópio e mesmo rótulo nuclear, encontrando precisão de 0,99 e recordação de 0,9419. A precisão do NuMorph ainda não foi testada em diferentes procedimentos de limpeza de tecidos, microscópios ou marcadores; portanto, a precisão da segmentação em outros desenhos experimentais é desconhecida. O atlas padrão no NM_setup.m é o Allen Reference Atlas39 com coloração Nissl adulta com a terceira iteração do Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3) como anotação personalizada.

Embora o NuMorph analise efetivamente tecidos, que são comparativamente densos, como o córtex adulto do camundongo, projetos experimentais mais desafiadores (como cérebros embrionários de camundongos ou estruturas altamente densas, como o cerebelo) podem exigir o desenvolvimento de ferramentas computacionais adicionais. Os esforços atuais baseados na comunidade estão tentando produzir dados de anotação adequados para o treinamento de modelos de aprendizagem profunda usados para segmentar esses casos mais difíceis40. Os avanços nas tecnologias de imagem de folha de luz permitem a investigação quantitativa de alto rendimento de estruturas subcelulares, com novas abordagens, como a microscopia de iluminação seletiva plana invertida de visão dupla (diSPIM), levando a uma maior resolução e precisão em regiões cerebrais densas em células40,41. À medida que os avanços na limpeza de tecidos, imagens e ferramentas computacionais envolvidas nesta pesquisa evoluem, esperamos que eles levem a um uso mais amplo de métodos de limpeza de tecidos para análises quantitativas sobre como os distúrbios neuropsiquiátricos podem resultar de alterações na estrutura cerebral induzidas por fatores de risco genéticos ou ambientais.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 para JLS e R01NS110791 para GW) e pela Fundação da Esperança. Agradecemos a Pablo Ariel, do Laboratório de Serviços de Microscopia, por auxiliar na imagem da amostra. O Laboratório de Serviços de Microscopia no Departamento de Patologia e Medicina Laboratorial é apoiado em parte pelo Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 para o Centro Abrangente de Câncer Lineberger da Universidade da Carolina do Norte (UNC). O Núcleo de Microscopia de Neurociência é suportado pela concessão P30 NS045892. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada em parte pelo North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurociência Edição 186
Imagem de célula única de cérebro inteiro e análise de cérebros de camundongos neonatais intactos usando ressonância magnética, limpeza de tecidos e microscopia de folha de luz
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