Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Helhjerne enkeltcelleavbildning og analyse av intakte neonatale musehjerner ved bruk av MR, vevsrydding og lysarkmikroskopi

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver metoder for å utføre magnetisk resonansavbildning, clearing og immunolabeling av intakte musehjerner ved hjelp av iDISCO +, etterfulgt av en detaljert beskrivelse av avbildning ved hjelp av lysarkmikroskopi og nedstrømsanalyser ved hjelp av NuMorph.

Abstract

Vevsrydding etterfulgt av lysarkmikroskopi (LSFM) muliggjør cellulær oppløsningsavbildning av intakt hjernestruktur, noe som muliggjør kvantitativ analyse av strukturelle endringer forårsaket av genetiske eller miljømessige forstyrrelser. Helhjerneavbildning resulterer i mer nøyaktig kvantifisering av celler og studiet av regionspesifikke forskjeller som kan bli savnet med vanlig mikroskopi av fysisk seksjonert vev. Bruk av lysarkmikroskopi til bildeklarerte hjerner øker anskaffelseshastigheten betydelig sammenlignet med konfokalmikroskopi. Selv om disse bildene produserer svært store mengder hjernestrukturdata, er de fleste beregningsverktøy som utfører funksjonskvantifisering i bilder av ryddet vev, begrenset til å telle sparsomme cellepopulasjoner, i stedet for alle kjerner.

Her demonstrerer vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en gruppe analyseverktøy, for å kvantifisere alle kjerner og nukleære markører innenfor kommenterte regioner i en postnatal dag 4 (P4) musehjerne etter rydding og avbildning på et lysarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonansavbildning (MRI) for å måle hjernevolum før krymping forårsaket av vevsrydding dehydreringstrinn, vevsrydding ved hjelp av iDISCO + -metoden, inkludert immunmerking, etterfulgt av lysarkmikroskopi ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig plattform for å avbilde musehjerner ved cellulær oppløsning. Vi demonstrerer deretter denne bildeanalysepipelinen ved hjelp av NuMorph, som brukes til å korrigere intensitetsforskjeller, sy bildefliser, justere flere kanaler, telle kjerner og kommentere hjernegrupper gjennom registrering til offentlig tilgjengelige atlas.

Vi designet denne tilnærmingen ved hjelp av offentlig tilgjengelige protokoller og programvare, slik at enhver forsker med de nødvendige mikroskop- og beregningsressursene kan utføre disse teknikkene. Disse vevsryddings-, bilde- og beregningsverktøyene tillater måling og kvantifisering av den tredimensjonale (3D) organisasjonen av celletyper i cortex og bør være allment anvendelig for enhver wild-type / knockout musestudiedesign.

Introduction

Helhjerneavbildning ved encelleoppløsning er en viktig utfordring i nevrovitenskap. Hjernebilder med celleoppløsning tillater detaljert analyse og kartlegging på systemnivå av hjernekretser og hvordan kretsene forstyrres av genetiske eller miljømessige risikofaktorer for nevropsykiatriske lidelser, cellulær oppførsel i utvikling av embryoer, samt nevrale kretser i den voksne hjernen 1,2,3. Det finnes flere histologiske metoder som tillater høyoppløselige bilder av den rekonstruerte 3D-hjernen; Imidlertid krever disse teknikkene dyrt, spesialisert utstyr, kan ikke være kompatible med immunmerking, og den todimensjonale (2D) naturen til enkelte metoder kan føre til vevskader og skjæring under seksjonering 4,5.

Nylige fremskritt har gitt en alternativ tilnærming for avbildning av hele hjerner som ikke krever vevsseksjonering; de innebærer å bruke vevsrydding for å gjøre hjernen gjennomsiktig. Gjennomsiktighet oppnås i de fleste vevsryddingsmetoder ved både å fjerne lipider, da de er en viktig kilde til lysspredning, og matche brytningsindeksen (RI) til objektet med RI av prøvenedsenkingsløsningen under avbildning. Lys kan da passere gjennom grensen mellom materialer uten å bli spredt 6,7,8,9.

Vevsryddingsmetoder, som iDISCO+, kombineres ofte med rask 3D-avbildning ved hjelp av enkeltfotoneksitasjonsmikroskopi, for eksempel LSFM 6,7,10. Innenfor gjennomsiktige vev merket med en fluorofor, lys-ark fluorescens mikroskopi bilder seksjoner ved eksitasjon med et tynt plan av lys11. Den største fordelen med LSFM er at en enkelt optisk seksjon er opplyst om gangen, med all fluorescens fra molekylene i den delen som er begeistret, noe som minimerer fotobleking. Videre muliggjør avbildning av en hel optisk skive kamerabasert deteksjon av den eksiterte skiven, og øker hastigheten i forhold til punktskanning12. LSFM produserer ikke-destruktivt godt registrerte optiske seksjoner som er egnet for 3D-rekonstruksjon.

Mens iDISCO + -metoden tillater billig vevsrydding innen ~ 3 uker, kan dehydreringstrinn i protokollen føre til vevskrymping og potensiell endring av prøvemorfologien, og dermed påvirke volumetriske målinger 6,10. Å legge til en sekundær avbildningsmetode, for eksempel MR, som skal brukes før vevsklareringsprosedyren, kan måle graden av vevsclearing-indusert krymping over prøven. Under dehydreringstrinnene kan forskjeller i mekaniske egenskaper mellom grå og hvit substans føre til ikke-ensartede deformasjoner av hjernemateriale, noe som resulterer i forskjellige vevsclearing-induserte volumdeformasjoner mellom villtype- og mutantprøver og kan forvirre tolkninger av volumetriske forskjeller i disse prøvene10,13 . MR utføres ved først å perfusere dyret med et kontrastmiddel (f.eks. Gadolinium), etterfulgt av inkubering av det ekstraherte vevet av interesse i en nedsenkningsløsning (f.eks. Fomblin) før avbildning14. MR er kompatibel med vevsrydding og utførelse av LSFM på samme prøve.

LSFM brukes ofte til å lage storskala mikroskopibilder for kvalitativ visualisering av hjernevevet av interesse i stedet for kvantitativ evaluering av hjernestruktur (figur 1). Uten kvantitativ evaluering er det vanskelig å demonstrere strukturelle forskjeller som følge av genetiske eller miljømessige fornærmelser. Etter hvert som vevsrydding og bildebehandlingsteknologier forbedres, sammen med reduserte kostnader for lagring og datakraft, blir kvantifisering av celletypelokaliseringer i vevet av interesse blitt mer tilgjengelig, slik at flere forskere kan inkludere disse dataene i sine studier.

Med over 100 millioner celler i musehjernen15 og helhjerneavbildningsøkter som kan generere terabyte med data, er det økt etterspørsel etter avanserte bildeanalyseverktøy som tillater nøyaktig kvantifisering av funksjoner i bildene, for eksempel celler. Det finnes en rekke segmenteringsmetoder for vevsklarerte bilder som bruker terskel for kjernefysisk fargeintensitet og filtrerer objekter med forhåndsdefinerte former, størrelser eller tettheter10,16,17,18. Unøyaktige tolkninger av resultater kan imidlertid oppstå fra variasjoner i parametere som cellestørrelse, bildekontrast og merkingsintensitet. Dette papiret beskriver vår etablerte protokoll for å kvantifisere cellekjerner i musehjernen. Først beskriver vi trinn for vevssamling av P4-musehjernen, etterfulgt av en vevsryddings- og immunmerkingsprotokoll optimalisert fra den offentlig tilgjengelige iDISCO + -metoden10. For det andre beskriver vi bildeinnhenting ved hjelp av MR og lysarkmikroskopi, inkludert parametrene som brukes til å ta bilder. Til slutt beskriver og demonstrerer vi NuMorph19, et sett med bildeanalyseverktøy vår gruppe har utviklet som tillater celletypespesifikk kvantifisering etter vevsrydding, immunmerking med nukleære markører og lysarkavbildning av kommenterte regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus ble brukt i samsvar med og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of North Carolina i Chapel Hill.

1. Musdisseksjon og perfusjon

MERK: Følgende disseksjoner ble utført på P4- og P14-mus ved bruk av en sprøyte. Volumet av perfusjonsvæske vil variere avhengig av dyrets alder.

  1. Perfusjon
    FORSIKTIG: Paraformaldehyd (PFA) er et farlig kjemikalie. Utfør alle perfusjonstrinn i en kjemisk avtrekkshette.
    1. Før kirurgi, administrer pentobarbital via intraperitoneal injeksjon (100 mg / kg) og la bedøvelsen tre i kraft.
    2. Når dyret har nådd et kirurgisk anestesiplan, bruk tå-klemmende responsmetode for å bekrefte manglende respons.
    3. Lag et lateralt snitt under ribbeholderen for å eksponere dyrets thoraxhule.
    4. Bruk buet, kirurgisk saks, kutt forsiktig gjennom ribbe buret opp til kragebenet på den ene siden av dyret og gjør et identisk kutt på motsatt side, slik at brystbenet kan løftes bort, og utsetter hjertet.
    5. Uten å skade den synkende aorta, forsiktig trimme eventuelle vev som er koblet til hjertet før du gjør et lite snitt på høyre atrium for å tillate blod å strømme ut av vaskulaturen.
    6. Ved hjelp av en sprøytebasert metode, perfuse musen gjennom venstre ventrikel med 10 ml og 7 ml fosfatbufret saltvann (PBS) for henholdsvis P14 og P4, med en perfusjonshastighet på 1,5 ml / min gjennom systemet.
    7. Når blodet er renset, perfuse igjen med 10 ml PBS + 4% PFA og 7 ml PBS + 4% PFA for henholdsvis P14 og P4 ved 4 ° C med en perfusjonshastighet på 1,5 ml / min for å fikse dyret.
      MERK: Fikseringsskjelvinger vil bli observert, og dyret vil være stivt etter ferdigstillelse. Hvis du bruker MR på prøver, perfuse med tilsvarende volumer PBS og PFA for hvert tidspunkt + 20% gadoliniumbasert MR-kontrastmiddel i PFA-løsningen.
    8. Fjern hodet med kirurgisk saks og drop-fix med PBS + 4% PFA i 24 timer ved 4 ° C for fullstendig fiksering.
      MERK: På dette stadiet forblir hjernen intakt med skallen på (se avsnitt 2). Pausepunkt: hjernen kan lagres i flere måneder på dette stadiet i PBS + 0,1% natriumazid ved 4 ° C.

2. MR-basert brutto hjernestruktur avbildning med intakt hodeskalle og analyse

MERK: Hjernen må perfunderes og inkuberes i gadolinium som beskrevet ovenfor uten å bli fjernet fra skallen. All MR skjer før fjerning av hjernen fra skallen for å unngå utilsiktet vevstap under disseksjon. Avbildning med en intakt hodeskalle gir også støtte til hjernen i prøveholderen (dvs. sprøyte) under prøvepreparering og avbildning.

  1. Forberedelse av prøver
    MERK: Følgende trinn er optimalisert for P4 og P14 musehjerneprøver. Sprøytestørrelsen som trengs vil avhenge av prøvens fysiske størrelse.
    1. Hvis du utfører MR på prøven, fjern huden fra skallen og inkuber i PBS + 3% gadolinium i 23 dager ved 4 ° C før avbildning14. Etter 23 dager, skyll prøvene raskt i PBS.
    2. Bruk 5 ml sprøyter til å lage en prøveholder for MR, ved hjelp av sprøytestempler for å lukke hver ende av holderen laget med sprøyten20. Bruk plastbiter til å holde skallen tett på plass i holderen (figur 2A). Fjern markeringene på sprøyten med etanol for å forhindre artefakter ved avbildning.
    3. Plasser skallen sikkert i prøveholderen og fyll med en nedsenkningsløsning som er kompatibel med MR (se materialtabellen). Lukk holderen og fjern alle luftboblene med en sprøyte.
      MERK: Pausepunkt: Skallen kan lagres i nedsenkningsoppløsningen i flere måneder før avbildning.
  2. Brutto hjernestruktur avbildning (MR)
    1. Bilde prøvene med et 9.4T / 30 cm horisontalt boring, dyr MR-system ved hjelp av en 15 mm volumspole og en spinn-ekkobasert sekvens med følgende parametere: Romlig oppløsning: 60 μm x 60 μm x 60 μm; total skannetid: 7 t 12 min; tid til ekko (TE): 6,83 ms; repetisjonstid (TR): 40 ms; eksitasjon / refokusering av flippvinkler: 90/180 grader; bildestørrelse: 166 x 168 x 209 voxels; Synsfelt (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; båndbredde: 100 000 kHz.
  3. Beregningsorientert brutto hjernestrukturanalyse
    1. Fjern den omkringliggende skallen fra rå MR-bilder ved å spore musehjernen manuelt ved hjelp av segmenteringsprogramvare. Deretter bruker du den voxel-kloke multiplikasjonsoperasjonen mellom maskebildet og rå MR-bildet for å generere det skallestrippede hjerne-MR-bildet.
      MERK: Utgangen er et binært maskebilde der intensiteten for hjernevoxels er satt til 1 og 0 ellers.
    2. Bruk stiv bilderegistrering (estimering av kun oversettelse og rotasjon) ved hjelp av "flørt" i FSL-pakken21,22 for å justere det skallestrippede MR-bildet (bevegelig bilde) til det tilsvarende lysarkmikroskopibildet (referansebilde).
    3. Bruk ikke-stiv registrering (ved hjelp av 'SyN' i ANTS-programvare23) for å finne punkt-til-punkt-korrespondansen mellom det stivjusterte MR-bildet i trinn 2.3.2 til lysarkbildet (samme referansebilde i trinn 2.3.2).
      MERK: Utgangen inkluderer det forvridde MR-bildet og deformasjonsfeltet knyttet til volumendringene fra MR til lysarkbildene.
    4. Beregn den jakobianske determinanten på deformasjonsfeltet generert i trinn 2.3.3, som kvantifiserer volumendringen i et 3 x 3 x 3 voxel lokalt nabolag.
    5. Juster hodeskalle-strippede bilder til Allen Developmental Mouse Brain Atlas ved hjelp av deformerbar bilderegistrering.
      MERK: Den etablerte romlige punkt-til-punkt-korrespondansen tillater automatisk merknad av hjernegrupper av interesse i det nye musebildet (figur 2C-H).

3. Hjernedisseksjon fra skallen

  1. Lag et midtlinjesnitt langs toppen av skallen fra nakken til nesen for å eksponere skallen.
  2. Utsett bunnen av skallen ved å trimme bort den gjenværende nakkemuskelen og all annen gjenværende muskel.
  3. Bruk skarp kirurgisk saks, klipp forsiktig langs den indre overflaten av skallen, pass på at du ikke skader hjernen ved å opprettholde et forsiktig oppadgående trykk mens du skjærer med det skarpe kirurgiske utstyret.
  4. Bruk pinsett til å skrelle de to kuttede halvdelene av skallen vekk fra hjernen og forsiktig trimme bort overflødig fett festet til hjernen.
  5. Bruk en kirurgisk saks for å trimme enhver dura som forbinder hjernen til skallen, og bruk deretter en slikkepott for å forsiktig fjerne hjernen fra hodet.
  6. Fjern hjernen, vask med PBS, og bytt deretter til PBS med 0,1% natriumazid og hold ved 4 ° C for langtidsoppbevaring.

4. Rydding av vev

MERK: Denne protokollen er tilpasset fra iDISCO + -protokollen for P4 mus6, med mindre endringer. Noen detaljer kan endres for forskjellige tidspunkter / arter / eksperimenter). FORSIKTIG: Metanol, diklormetan (DCM) og dibenzyleter (DBE) er farlige kjemikalier. Disse vevsryddingstrinnene utføres i en kjemisk avtrekkshette.

  1. Validering av antistoffer
    MERK: Metanolkompatibiliteten til uprøvde antistoffer må kontrolleres, da de kan bli negativt påvirket av de harde metanolvaskene som kreves i iDISCO+-protokollen. For en liste over antistoffer som har vist seg å fungere i iDISCO+, se nettsiden24.
    1. Høst 10 μm frosne deler av PFA-fast vev av interesse på stereologiske lysbilder.
    2. Inkuber seksjonene i 100% metanol i 3 timer ved romtemperatur.
    3. Rehydrer i PBS før du fortsetter med standard immunhistokjemiprotokoller for å avgjøre om antistoffet viser det forventede mønsteret av fluorescens etter metanolvask. For positiv kontroll, bruk et lysbilde som ikke er behandlet med metanol.
  2. Buffer forberedelse
    1. Forbered buffere i henhold til den offisielle iDISCO-protokollen. Se materialtabellen for sammensetning av buffere og andre løsninger som brukes i denne protokollen.
  3. Forbehandling
    1. Dehydrer prøven med metanol/PBS-serien: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 time hver ved romtemperatur.
      MERK: Bruk av PBS under dehydrering bidrar til å forhindre sprekker i prøvene i metanolvask.
    2. Vask prøven i 100 % metanol i 1 time, og avkjøl deretter ved 4 °C i 1 time før den ruges over natten med risting i 66 % DCM/33 % metanol ved romtemperatur.
    3. Vask prøven 2x i 100% metanol ved romtemperatur, og avkjøl den deretter ved 4 °C.
    4. Bruk fersk 5% H 2O2 i metanol for å bleke prøven over natten ved 4 ° C.
    5. Rehydrer prøven med metanol / PBS-serien: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 time hver ved romtemperatur og vask 2x i 1 time i PTx.2 ved romtemperatur.
    6. Inkuber prøven i 1x PBS/0,2 % TritonX-100/20 % DMSO ved 37 °C over natten.
    7. Inkuber prøven i 1x PBS / 0,1% Tween-20 / 0,1% TritonX-100 / 0,1% Deoxycholate / 0,1% NP40 / 20% DMSO ved 37 ° C over natten.
    8. Vask i PTx.2 ved romtemperatur i 1 time to ganger.
  4. Immunmerking
    1. Inkuber prøvene i Permeabilization Solution ved 37 °C i 2 dager (~48 timer).
    2. Blokker prøvene i blokkeringsløsning ved 37 °C i 2 dager (~48 timer).
    3. Inkuber prøvene med primært antistoff i PTwH / 5% DMSO / 3% serum ved 37 ° C i 4 dager (~ 96 timer) (f.eks. kanin (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) og anti-Ctip2 rotte (Rt) antistoff (1:400) (materialtabell).
    4. Vask 3 x 1 time i PTwH. Vask i ytterligere 2 timer i PTwH. La i vaskeoppløsningen over natten ved romtemperatur.
    5. Inkuber prøvene med sekundært antistoff og et nukleært fargestoff, slik som TO-PRO-3, i PTwH / 3% serum ved 37 ° C i 4 dager (~ 96 timer; f.eks. geit anti-Rb (1:50) og (geit anti-Rt (1: 200)) (materialtabell).
    6. Vask 3 x 1 time i PTwH Vask i ytterligere 2 timer i PTwH. La vaskeoppløsningen stå over natten ved romtemperatur.
  5. Lysning
    1. Dehydrer i metanol/PBS-serien-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 time hver ved romtemperatur. Inkuber i 3 timer, med risting, i 66% DCM / 33% metanol ved romtemperatur.
      MERK: Prøven kan stå over natten ved romtemperatur umiddelbart etter dehydrering i 100% metanol.
    2. Inkuber i 100% DCM i 15 minutter to ganger ved romtemperatur (med risting) for å vaske MeOH.
    3. Inkuber i dibenzyleter (DBE) uten å riste ved romtemperatur. Sørg for at røret er fylt nesten helt med DBE for å forhindre oksidasjon av prøven. Fullfør blandingen av løsningen ved å invertere et par ganger før avbildning.

5. Bildebehandling av lysark

MERK: iDISCO vevsklarerte hjerner ble avbildet med et lysarkmikroskop, utstyrt med et 2X / 0,5 NA-objektiv, et komplementært halvlederkamera for metalloksid og mikroskopdrift og bildeinnsamlingsprogramvare ved 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel for P4-tidspunktet, da dette tillot enkeltcelleoppløsning i cortex (figur 3A, B).

  1. Prøvemontering
    1. Monter prøven forsiktig i riktig prøvestørrelsesholder slik at prøven er orientert med z-dimensjonen ikke mer enn 5,2 mm i dybden på grunn av den nominelle arbeidsavstanden til lysarkmikroskopet (5,7 mm minus 0,5 mm sikkerhetsmargin)25.
    2. Plasser holderen i prøveholderen med skruen på holderen i en vinkel på 45° mot holderstøttene (figur 1B). Plasser vuggen slik at lysbanen er vinkelrett på prøven (figur 1C).
  2. Imaging parametere
    1. Sett zoomlegemet på mikroskopet til 4x forstørrelse eller høyere som gir 0,75 μm / piksel.
      MERK: Enkeltcellede beregningsanalyser på P4-lysarkbilder kan gjøres med et hvilket som helst kommersielt tilgjengelig lysarkmikroskop som tillater oppløsning på 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel eller høyere. En lavere oppløsning er tilstrekkelig for hjerner på senere tidspunkter der kjerner er mer sparsomt fordelt.
    2. I bildeinnsamlingsprogramvaren velger du et enkelt lysark med en NA = ~ 0,08 (9 μm tykkelse / 4 μm z trinn).
      MERK: Denne innstillingen kombinert med horisontal dynamisk fokusering tillater helhjerneavbildning ved en enkeltcelleoppløsning av en musehjerne innen rimelig tid. For en postnatal dag 4 (P4) hjerne, er bildeinnsamlingstiden estimert til å være 11-15 timer for tre kanaler, avhengig av størrelsen på hjernen.
    3. For å sikre at aksialoppløsningen opprettholdes langs bildets bredde, velg Horisontal dynamisk fokusering og bruk det anbefalte antallet trinn avhengig av laserbølgelengden. For en hel P4-musehjerne setter du den horisontale dynamiske fokuseringen til 11. Juster finfokus for hver kanal i forhold til registreringskanalen.
      MERK: Her er TO-PRO-3-kanalen (647 nm) registrert på Allen Developmental Mouse Brain Atlas, da dette merker alle kjerner.
    4. Juster lasereffekten per kanal i forhold til kanalegenskapene.
      MERK: Lengre bølgelengder krever høyere laserkraft sammenlignet med kortere bølgelengder. For eksempel må 780 nm avbildes med høy lasereffekt (70% - 75%) og lav eksponering (50 ms), mens 647 nm-kanalen krever en gjennomsnittlig lasereffekt (40% - 45%) og lav eksponering (50 ms).
    5. Juster Light-Sheet Width til ~ 50 % for å sikre at arkets effekt fordeles optimalt i y-dimensjonen for denne prøvestørrelsen.
      MERK: I kombinasjon med horisontal dynamisk fokusering gir en bredde på 50 % en gjennomsnittlig fordeling av kraften over bildet med redusert risiko for fotobleking25.
    6. Angi antall fliser i forhold til størrelsen på prøven med en anbefalt overlapping på 15 % mellom fliser, og ta bilder for hver kanal sekvensielt for hver stakk på en gitt flisposisjon.

6. Bildebehandling ved hjelp av NuMorph

MERK: NuMorph-rørledningen har tre hoveddeler for 3D-bildeanalyse: forbehandling, analyse og evaluering. Disse delene er organisert i henholdsvis NMp_template, NMa_template.m og NMe_template.m, som er omtalt nedenfor. I tillegg er NM_setup.m lagt til for å laste ned og installere programvarepakker som trengs for at NuMorph skal fungere problemfritt. NM_samples.m gir også en mal for å legge inn informasjon om bildeinnhenting.

  1. NuMorph-oppsett
    1. Last ned og installer conda environment manager for Linux26. Last ned og installer NuMorph19 bildebehandlingsverktøy.
    2. Kjør Matlab på kommandolinjen . Kjør NM_setup.m fra NuMorph for å laste ned og installere programvarepakker for bildeanalyser som trengs for analyser.
      MERK: Dette trinnet sikrer at conda-miljøet er riktig konfigurert, samt sikrer at alle verktøy og tillegg som trengs for at Matlab skal kjøre hver av de tre pipelinene, lastes ned og installeres riktig. Mest bemerkelsesverdige her er Elastix for å kjøre registrering og 3D-Unet for celledeteksjon og telling.
  2. Angi eksempelnavn, inndata- og utdatakataloger, kanalinformasjon og lysarkbildeparametere ved å redigere filen NM_samples.m.
    MERK: Her anbefales det å dobbeltsjekke for å sikre at riktig informasjon, spesielt bildeinngangskatalogen, er spesifisert riktig. Feil kalles vanligvis ikke her før du kjører påfølgende trinn.
  3. Forbehandling av bilder
    1. Justering av intensitet
      1. I NMp_template angir du intensitetsjustering = sant.
        MERK: Sett til sann hvis intensitetsjustering er nødvendig. Hvis ikke, sett intensitetsjustering = falsk. Det er også et alternativ å bruke 'oppdater' for å overskrive tidligere justeringsparametere.
      2. Sett bruk behandlede bilder = false når du arbeider med et nytt sett med bilder. Ellers angir du eventuelle tidligere lagrede bildedatasett i utdatakatalogen (for eksempel "justert", "sydd") som skal brukes til påfølgende behandlingstrinn.
        MERK: Dette alternativet er gitt i tilfelle der inndatabilder allerede er forhåndsbehandlet. I dette tilfellet vil forhåndsbehandlede bilder bli brukt som inndatabilder, og alternativet vil bli satt til navnet på underkatalogen i utdatakatalogen.
      3. Sett lagre bilder = sant.
        MERK: Bruk av dette alternativet sikrer at behandlede bilder lagres i utdatakatalogen; Ellers beregnes og lagres bare parametere.
      4. Angi lagringsprøver = sant.
        MERK: Dette alternativet sikrer at eksempelresultater lagres for hvert hovedtrinn.
      5. Angi juster flisskygging = grunnleggende for å bruke skyggeleggingskorrigering ved hjelp av BaSiC-algoritmen27 eller manuell for å bruke flisskyggekorreksjon ved hjelp av målinger fra lysarkmikroskopet ved bestemte lysarkbredder.
        MERK: Dette alternativet korrigerer for ujevn belysning langs y-dimensjonen forårsaket av formen på arkmidjen.
    2. Justering av bildekanal
      1. I NMp_template angir du kanaljustering = sant. Sett dette alternativet til sann hvis kanaljustering er nødvendig. Hvis ikke, sett til false. Angi kanaljusteringsmetode til enten oversettelse (stiv) eller elastix (nonrigid).
        MERK: Oversettelsesmetoden bruker stive 2D-registreringsmetoder for å justere flere kanaler, mens elastix-metoden bruker ikke-stive B-splines28 for å korrigere for rotasjonsdrift, noe som kan oppstå under lang bildeinnsamling19.
    3. Iterativ bildesøm
      1. I NMp_template angir du sømbilder = sant.
        MERK: Sett dette alternativet til sann hvis søm er nødvendig.
      2. Sett siktavgrensning = sant.
        MERK: Dette alternativet brukes til å finjustere oversettelsen ytterligere i xy ved hjelp av skaleringsinvariantfunksjonen Transformer29.
      3. Angi belastningsjusteringsparammer = sant.
        MERK: Dette alternativet bruker kanaljusteringsoversettelsene under søm. Dette alternativet anbefales med flerkanalsbilder. Ellers satt til false.
      4. Angi overlapping = 0,15 for å samsvare med overlapping av fliser under bildebehandling.
    4. Hvis du vil kjøre noen av disse forbehandlingstrinnene, kjører du følgende i Matlab utenfor NMp_template miljø:
      1. Angi eksempelnavn. Sett config = NM_config(prosess, prøve).
      2. Kjør et av trinnene for forbehandling ved å angi NM_process(konfig,trinn) og angi trinnet ved hjelp av intensitet, justering eller søm for noen av prosessene. Kontroller utdatakatalogen for utdatafiler for hvert av trinnene (figur 3 og figur 4).
  4. Bilde analyse
    1. Før NuMorph
      1. Start med et 3D-atlasbilde og et tilhørende merknadsbilde som tilordner hver voxel til en bestemt struktur.
        MERK: P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas generert fra MagellanMapper30 brukes her.
      2. Juster både atlasbildet og merknadsfilen for å sikre at de samsvarer riktig i riktig retning.
    2. Innenfor NuMorph
      MERK: Nå som atlaset og dets merknader er riktig justert, må filene "munged" eller behandles i NuMorph slik at de kan lagres for senere bruk. For å gjøre dette, bruk munge_atlas-funksjonen til å spesifisere innganger som vist nedenfor.
      1. Angi Atlas_file: (streng). Oppgi hele banen til atlasfilen.
      2. Angi Annotation_file: (streng). Angi den fullstendige banen til de tilknyttede merknadene.
      3. Angi oppløsning: (1x3 numerisk). Angi oppløsningen for atlaset y, x, z som mikron per piksel.
      4. Angi retning: (1 x 3 tegn). Oppgi atlasretningen og sørg for at den samsvarer med oppsettet av prøven i vuggen (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),left(l)/right(r)).
      5. Spesifiser halvkule: Angi hvilken hjernehalvdel som ble avbildet ("venstre", "høyre", "begge", "ingen").
      6. Angi out_resolution:(int). Angi den isotrope oppløsningen til atlasutgangen i mikron. (standard: 25).
      7. Kjør kommandoen "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolution, orientation, hemisphere)" for å generere munged merknader i /data/annotation_data og en kopi av atlasbildet i /data/atlas.
      8. Les Matlab-strukturen og atlasfilen for å bekrefte at begge filene er munged riktig i riktig retning.
        MERK: Et ekstra celleklassifiseringstrinn kan utføres for å kvantifisere celletyper basert på samlokalisering av immunmerkede proteinmarkører.
    3. Omsampling
      1. I NMa_template angir du oppdateringsbilder = sann hvis du utfører bilderegistrering for å referere til atlaset eller for å generere nedsamplede volumer av datasett med høy oppløsning.
        MERK: NMa_template.m vil bli brukt til å angi parametrene for omsampling, registrering, kjernedeteksjon og celletelling.
      2. Angi oppdateringsoppløsningen slik at den samsvarer med atlaset.
        MERK: Her brukes 25 μm3/voxel isotrop oppløsning fordi referanseatlaset er ved denne oppløsningen.
      3. Angi kanalnummeret som skal oppdateres ved hjelp av resample-kanaler = [ ].
        MERK: Her er kanalnummeret satt til å matche atomkanalen. Hvis dette alternativet er tomt, blir bare registreringskanalen omsamplet.
    4. Registrering
      1. I NMa_template angir du registerbilder = sant. Sett til sann hvis registrering er nødvendig. Hvis ikke, sett registrering = usann.
      2. Angi atlasfilen slik at den samsvarer med filen i atlaskatalogen.
      3. Angi registreringsparametere = standard.
        MERK: Dette alternativet bruker en affine etterfulgt av B spline transformasjon for å estimere romlig korrespondanse. Ellers definerer du et nytt sett med registreringsparametere via Elastix i /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Angi lagre registrerte bilder = sant.
        MERK: Utdatafiler fra registrering og omsampling kan lastes ned og inspiseres visuelt i Matlab eller andre visualiseringsverktøy som FIJI31.
    5. Kjernedeteksjon, celletelling og klassifisering
      MERK: Feil som oppstår her kan skyldes at du ikke spesifiserer merknadsfilen riktig eller ikke samsvarer med utvalgets alder med riktig merknad.
      1. I NMa_template angir du både tellekjerner og klassifiserer celler = sant.
      2. Sett tellemetode = 3dunet.
        MERK: Dette alternativet tillater bruk av den trente 3D-Unet modell19. Ellers velger du Hessian som bruker den hessiske blobdeteksjonsmetoden.
      3. Angi min_intensity for å definere en minimumsintensitetsterskel for oppdagede objekter.
        MERK: En passende terskel bestemmes empirisk basert på signal-til-støy-forholdet mellom kjernefysisk merking.
      4. Sett classify_method til en av terskelene, som er basert på en uovervåket fluorescensintensitet ved sentroidposisjoner eller svm, som modellerer en overvåket lineær Support Vector Machine (SVM) klassifisering.
        MERK: Dette trinnet vil klassifisere alle de oppdagede cellene i fire hovedklasser med 3-kanals bildebehandling. Med denne protokollen genereres Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2-, og Outliers.
    6. Analyse trinn
      1. Angi eksempelnavn. Sett config = NM_config (analyse, prøve).
      2. Kjør et av analysetrinnene ved å angi NM_analyze(config,stage) og angi fasen ved hjelp av resample, registrer, tell eller klassifiser. Kontroller utdatakatalogen for utdatafiler for hvert av trinnene (figur 5).
    7. Celletypeklassifisering og gruppeanalyse
      1. I NMe_template angir du oppdatering = sann og overskriver all tidligere statistikk beregnet.
        MERK: NMe_template.m gir muligheten til å utføre celletypegruppeanalyse på tvers av hjernegrupper i samme hjerne som analyseres.
      2. Angi compare_structures_by til indeksen for å sammenligne med alle unike merknader eller tabell for å sammenligne strukturer i henhold til tabellen.
      3. Angi template_file, som angir alle mulige strukturindekser og må finnes i /merknader.
      4. Angi structure_table og angi strukturer som skal evalueres.
      5. Angi celletelling og celletypeklassifisering som beskrevet i NMa_template.m.
      6. Angi compare_groups for å angi grupper som skal sammenlignes.
      7. Sett paret til enten sann eller usann for å utføre paret t-test eller to-prøve t-test.
    8. Kjør analyse.
      MERK: For å utføre dette trinnet, kjør følgende i Matlab utenfor NMe_template.m-miljø.
      1. Angi eksempelnavn. Sett config = NM_config (evaluere, prøve).
      2. Kjør analysetrinnet ved å angi NM_evaluate(config,stage) og angi fasen. Kontroller utdatakatalogen for utdatafiler for gruppeanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Siden iDISCO+-protokollen introduserer betydelig vevskrymping, som lett kan merkes med øyet (figur 2B), la vi til et MR-trinn til denne rørledningen før vevsrydding for å kvantifisere krympingen forårsaket av vevsrydding. Arbeidsflyten starter med fjerning av ikke-hjernevevet fra MR-bildet (figur 2C). Deretter påføres en stiv transformasjon (3 oversettelses- og 3 rotasjonsvinkler) for å justere MR-bildet til lysarkbildet (figur 2D). Ved å gjøre dette observerte vi et totalt volumtap på 60% indusert av vevsryddingsprosedyren (figur 2E), som var forenlig med volumendringsestimater etter øye (figur 2B). Dette resultatet er ganske forskjellig fra en tidligere rapport hvor en krymping på 5% -10% 10,32 ble rapportert. Forskjellen i krymping kan skyldes forskjellen i dyrealder mellom de to studiene (P4 vs. voksne hjerner) eller på grunn av tidsforskjeller i metanolvasken i clearingtrinnet i iDISCO+-protokollen (16 timer vs. 2 timer). For å kartlegge grader av vevskrymping over ulike områder av hjernen, distribuerte vi videre en deformerbar bilderegistrering der lysarkbildet brukes som referanse. Det registrerte MR-bildet er vist i (figur 2F). Den estimerte volumendringen på grunn av vevsryddingsprosedyren er fargekodet, hvor en større grad av krymping observeres i cortex sammenlignet med andre hjernegrupper (figur 2G).

For å måle volum av hjernegrupper utførte vi segmentering av MR gjennom registrering i et annotert atlas. Segmentering av MR-avbildede hjerner ble ansett som vellykket dersom referanseatlasoverlegget stemte godt overens med de anatomiske grensene som ble identifisert ved forskjeller i kontrast i de rå MR-bildene (figur 2H). Overlegget under registreringen er avhengig av god prøvepreparering (figur 2A), bildeinnhenting og stripping av hodeskallen. Strippetrinnet for hodeskallen er avgjørende for gode registreringsresultater, da registreringen vil forsøke å fordreie referansebildet fra atlaset til hele MR-bildet, inkludert eventuelle hodeskaller som forblir i bildet. Skalleinkludering i registrering kan forvrenge resultatene og gi en feil registrert 3D-volumgjengivelse av segmenteringen. Den endelige 3D-volumgjengivelsen kan deretter visualiseres ved hjelp av ITK-SNAP33 (figur 2H). Denne metoden brukes til å vurdere brutto hjernevolumforskjeller på tvers av utvalgsgrupper. De cellulære grunnlagsmessige underliggende volumforskjellene oppdaget med MR kan forfølges ved hjelp av celletelling med vevsrydding, lysarkmikroskopi og NuMorph.

Målet med vevsrydding og analyse er å vurdere bidragene fra forskjellige celletyper til forskjeller på tvers av eksperimentelle forhold (f.eks. Genotype, miljøeksponering) ved å telle individuelle kjerner ved hjelp av NuMorph. Vevsrydding ved hjelp av iDISCO+-protokollen og nevronlagsspesifikke kjernemarkører resulterte i klart definerte cellegrupper av øvre og nedre lagnevroner i isocortex (figur 3).

Celletelling ved hjelp av NuMorph er avhengig av vellykkede forbehandlingstrinn som involverer intensitetsjustering, kanaljustering og søm (figur 4A). Feil som oppstår i noen av disse trinnene kan føre til feil søm (figur 4B, C). For eksempel kan feil bildeinnhenting føre til bilder med in-focus og out-of-focus mønstre under forbehandling (figur 4C). For å telle kjerner fra bestemte hjernegrupper, blir de sydde bildene kommentert ved hjelp av et offentlig tilgjengelig atlas. Vi registrerte våre sydde bilder til en korrigert versjon av P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. Her ble de sydde bildene redusert fra en høy oppløsning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) til en lavere oppløsning (25 μm³/voxel isotrop oppløsning) for å matche oppløsningen til atlaset. Tilpasning av atlasets oppløsning sikrer korrekt registrering av bildene til atlaset og gir regionale merknader i de innhentede bildene (figur 5A).

For å utføre spesifikk celletypespesifikk telling, merket vi øvre lagneuroner som uttrykker Brn2, nedre lagneuroner som uttrykker Ctip2, og alle kjerner med TO-PRO-3 (figur 3B). Avbildning utføres med tilstrekkelig romlig oppløsning til å skille individuelle kjerner (0,75 x 0,75 x 4 μm3 / voxel). Centroidene til kjerner oppdages med en trent 3D-Unet-modell i NuMorph (figur 5B, C). Vi oppdaget ~ 12 × 10 6 totale kjerner som var To-Pro-3 + i isocortex, inkludert ~ 2,6 × 10 6 Brn2 + og 1,6 × 10 6 Ctip2 + kjerner. Vi påviste også ~3,7 × 10 6 og 2,9 × 106 To-Pro-3+ totalkjerner i henholdsvis basalgangliene og hippocampal allocortex. Omtrent 1,5 × 106 og <1 × 106 Ctip2+-celler ble talt i henholdsvis basalgangliene og hippocampal allocortex, selv om det ble påvist et ubetydelig antall Brn2+-celler (figur 5D). De totale kjernetallene i isocortex og hippocampal allocortex kombinert (~ 15 millioner celler) ligner tidligere rapporterte totale celletall i hjernebarken til musen15. Disse resultatene demonstrerer nytten av MR-avbildning, iDISCO + vevsryddingsmetodikk og NuMorph-beregningsanalyse for å avsløre volumetrisk, totalt celletall og celletypespesifikke teller underliggende forskjeller i musehjernestruktur på tvers av eksperimentelle grupper.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over helhjerne encelleanalyse av intakt neonatalt 3D-vev ryddet musehjerner. (A) Oversikt over iDISCO+ vevsrydding, lysplateavbildning og 3D-bildeanalyse. (B) Bilder som viser riktig prøvemontering på lysarkmikroskopet. (C) Tegneserie som viser prøvemontering i forhold til lysplatebane. Forkortelse: ab = antistoff. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Brutto hjernestrukturmålinger med MR. (A) Bilde som viser prøvepreparering for MR. (B) Bilder av representative P4-hjerner før og etter iDISCO+ vevsrydding. Skalastang = 5,0 cm. (C) Rå MR-bilde med hodeskalle festet til 60 x 60 x 60 μm³. Skalalinje = 800 μm. (D) Lysarkbilde av musehjerne ved 25 x 25 x 25 μm³. Totalt volum = 68,7 mm3. Merk at en liten del av dorsal isocortex utilsiktet ble fjernet under disseksjon merket med pilspiss (hvit). Skalabar = 800 μm. (E) MR-bilde av musehjerne etter hodeskallestripping og stiv registrering. Totalt volum = 171,9 mm3. Sett inn (gul) viser hjernekontur fra lysarkbildet. Skalalinje = 800 μm. (F) Registrert MR-bilde i referanse til lysarkbilde for å vurdere deformasjon. Skalalinje = 800 μm. (G) Voxel-vis hjernekartlegging for å vurdere volumendringer mellom lysarkbilde og MR-bilde der henholdsvis blått og rødt indikerer krymping og ekspansjon fra MR-bilde til lysarkbilde. Totalt var det et volumtap på 60%, men noen regioner som isocortex viste større krymping i forhold til andre. (H) Venstre panel: Aksial visning av MR-bilde med registrerte segmenteringer fra Allen Developmental Brain Atlas overlaid. Høyre panel: 3D-volumgjengivelse av segmentering. Skala bar = 800 μm. Forkortelser: OB = olfaktorisk pære; Dpall = dorsal pallium/isocortex; Mb = midtveis; Cb = lillehjernen. Orientering: R = Rostral; L = Lateral; D = Dorsal. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bilder med mobiloppløsning og kanaljustering. (A) Optisk aksial seksjon av TO-PRO-3 (TP3) kjernefarging og immunmerking for Ctip2 (nedre lag nevron) og Brn2 (øvre lag neuron) markører i P4 musehjerne. Skalalinje = 1 mm. (B) Forstørret innfelt av kortikale områder i A (boks) som viser riktig kanaljustering med forventet lokalisering av Brn2-immunmerkede øvre lag og Ctip2-immunmerkede nedre lagneuroner. Skala bar = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på bildesøm . (A) Eksempelresultater fra et 2D-iterativt, riktig sydd bilde. Skala bar = 1 mm. Sett inn viser et eksempel på riktig søm zoomet inn. Skalalinje = 500 μm. (B) Eksempelresultater fra et 2D-iterativt, feil sydd bilde. Skala bar = 1 mm. Sett inn viser et eksempel på feil søm zoomet inn (overheng). Skalalinje = 100 μm. (C) Eksempelresultater fra et 2D-iterativt feil sydd bilde. Skala bar = 1 mm. Sett inn viser et eksempel på feil søm zoomet inn (ute av fokus). Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bilderegistrering med lav oppløsning, høyoppløselig kjernedeteksjon og celletelling i P4-musehjernen. (A) Venstre panel: Et eksempel på et z-stykke fra hele hjernelysarket 3D-bilder resamplet til 25 μm isotropisk oppløsning. Skala bar = 1 mm. Midtpanel: Merknader fra Allen Developmental Brain Atlas (P4) registrert på mikroskopibildet. Skala bar = 1 mm. Høyre panel: Overlegg av venstre og midtre panel. Skalalinje = 1 mm. (B) Eksempel på et intensitetsjustert sydd bilde i aksial visning. Boksområdet vises i (C). Skalalinje = 1 mm. (C) Automatisk deteksjon av kjerner (rød). Skalabar = 50 μm. (D) Kvantifisering av celletyper i forskjellige hjernegrupper i P4-hjernen (Basal ganglia, Hippocampal Allocortex og Isocortex). Rød = Øvre lag nevroner merket med Brn2, Grønn = Nedre lag nevroner merket med Ctip2, og Blå = alle kjerner merket med To-Pro-3 fargestoff. Forkortelser: DPall = Dorsal pallium (isocortex); MPall = Medialt pallium (hippocampal allocortex); CSPall = Sentralt subpallium(klassiske basalganglier). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

NuMorph Analyse Stage Beregnet tid
Justering av intensitet 1 time
Kanaljustering 2 min
2D iterativ søm 12 timer
Omsampling 3 minutter
Registrering 3 minutter
Cell Telling 5 timer
Cell Klassifisering 10 minutter

Tabell 1: NuMorph analysetider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vevsryddingsmetoder er nyttige teknikker for å måle 3D-cellulær organisering av hjernen. Det finnes en rekke vevsryddingsmetoder beskrevet i litteraturen, hver med sine fordeler og begrensninger 6,7,8,9. Alternativene for beregningsverktøy for å analysere celletypene i de vevsklarerte bildene er relativt begrensede. Andre tilgjengelige verktøy er implementert for å sparsomme cellepopulasjoner der segmentering er mindre vanskelig 10,35 eller har utnyttet vevsutvidelsen16. Dette papiret beskriver utarbeidelsen av en musehjerne for avbildning med iDISCO + vevsrydding og demonstrerer NuMorph, en beregningsrørledning for behandling og kvantifisering av kjerner i strukturer av en musebark fanget av LSFM. Den er designet for å finne en passende balanse mellom lengden på bildebehandlingstid, deteksjonsnøyaktighet av cellekjerner og beregningsressurser. Denne rørledningen står i kontrast til andre tilgjengelige verktøy ved pålitelig segmentering av alle kjerner, i stedet for sparsomme populasjoner av merkede celler 10,36,37. Vi har tidligere vist at celledeteksjonsnøyaktigheten er høy, med betydelig kortere avbildningstider og mye reduserte innhentede datastørrelser for hel-halvkule-innsamling sammenlignet med andre metoder19. NuMorph adresserer en rekke viktige utfordringer for analyse av flerkanals lysarkbilder, for eksempel å gi verktøy for kanaljustering, korrigere for scenebevegelser med et sømverktøy og korrigere signallysstyrken i bildeflisene. Arbeidsflyten som presenteres i denne artikkelen er nyttig for det bredere vitenskapelige samfunnet og tilgjengelig for alle grupper i forskningsinstitusjoner. En oversikt over prosessen kan ses i figur 1.

Det er flere kritiske trinn gjennom denne prosessen fra museperfusjon til beregningsanalyse som kan påvirke nedstrøms kvalitet på bilder, kvantifisering og resultater. Det er viktig at perfusjonen utføres slik at alt blodet fjernes fra hjernen, da blodkarene har en naturlig autofluorescens som vil påvirke intensiteten i bildene og vil kreve justeringer i rørledningen, noe som påvirker resultatene negativt. Varigheten av PFA-fiksering er også avgjørende, da det å la hjernen være nedsenket i 4% PFA i mer enn 24 timer kan føre til "overfiksering" av prøven og føre til sprekker i hjernen, som blir sprø under iDISCO + -prosessen. iDISCO-protokollen beskrevet ovenfor er litt modifisert fra den offisielle protokollen som finnes på nettstedet24. En viktig modifikasjon er tilsetningen av PBS til metanol / PBS-serien, i stedet for vann i den opprinnelige protokollen. Dette er for å forhindre kortikal sprekkdannelse i embryonale og tidlige postnatale hjerner, som sannsynligvis oppstår på grunn av ufullstendig utvikling av glialceller, aksonale fremspring og ekstracellulær matrise. Avhengig av vevet som brukes i denne protokollen, kan det hende at modifikasjoner må gjøres på hvert trinn i iDISCO + -protokollen, for eksempel endring av antistoffkonsentrasjoner og økende inkubasjonstider for større vevsprøver, for å optimalisere de ideelle parametrene for å fange markøren og analysere den nøyaktig.

Vevskrymping er kjent for å forekomme under iDISCO + vevsryddingsprosessen, som deretter kan endre volumetriske målinger nedstrøms 6,10. Alternative metoder, for eksempel MR utført før vevsclearing, kan brukes til å bestemme omfanget av enhver endring i vevsstørrelse hos kontroller versus eksperimentelle dyr for å avgjøre om noen volumetriske forskjeller skyldes studert fenotype og ikke fra vevsryddingsprosessen. Heterogene endringer i volumene av mutantens kortikale regioner kan variere avhengig av det regionale cellulære innholdet, da hjernens grå og hvite substans kan påvirkes differensielt av metanoldehydreringene. MR-dataene kan brukes til å avgjøre om vevskrympingen er ujevn i alle underregionene i hjernen (figur 2G), og eventuelle endringer i clearingprotokollen kan justeres for i nedstrøms beregningsanalysen. Videre bruker iDISCO+-prosessen harde metanolvasker for å dehydrere prøven, noe som kan føre til skade eller endringer i visse antigener på kjerneoverflatene. Det anbefales at eventuelle antistoffer som brukes, først testes på hjernevevsseksjoner som er vasket for ~ 3 timer i 100% metanol for å sikre at antistoffet er kompatibelt med iDISCO + -protokollen.

For store datasett som krever lange behandlingstider, anbefaler vi å bruke no-window-versjonen av MATLAB i Linux som tillater strategier som implementering av "nohup" -kommandoen, som vil fortsette å kjøre en prosess selv etter at forbindelsen til en server er tapt. Videre krever NuMorph høy datakraft, så vi anbefaler minst 10 GB minne for analyser. Vi analyserer prøvene ved hjelp av en Linux-arbeidsstasjon som kjører CentOS 7, som er utstyrt med en 2.6 GHz 14-kjerneprosessor, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM-minne, 4 x 11 GB GPUer og 2 x 4 TB eksterne SSD-er. De rå lysarkdataene som ble brukt her var 620 GB og minnekravet for prosessene var 10 GB. Her har vi inkludert en tabell med estimerte tider for å fullføre hvert trinn i NuMorph-analysene som vist i tabell 1.

Bildeforbehandlingstrinnene involverer intensitetsjustering i xy-dimensjonen for hvert z-plan, kanaljustering og søm. Bildeintensiteten justeres for å ta hensyn til forskjeller i intensitet mellom fliser og ujevn belysning langs y-dimensjonen. Forskjellen i intensitet oppstår på grunn av lysarkets iboende tekniske egenskaper når det avbildes mellom fliser25. Deretter utføres kanaljustering for å sikre at bildekanalene justeres riktig i et flerkanalsbilde. Dette trinnet anbefales siden hver kanal i flerkanals bildebehandling er anskaffet individuelt og subtile bevegelser av scenen kan forårsake prøvedrift og resultere i romlig feiljustering19. Til slutt blir flisene per z-plan deretter sydd sammen for å danne et enkelt bilde i hvert z-plan. Til slutt vil det være en stabel med sydde bilder per kanal som representerer hele volumet av prøven. Den iterative bildesømmen er basert på en egendefinert metode for å organisere alle 2D-bildene per kanal i et 3D-volum av prøven19. Metoden implementerer først en parvis z-korrespondanse i aksial retning for å matche flisregioner som overlapper i både horisontal og vertikal retning. Den endelige z-forskyvningen av hver flis bestemmes ved hjelp av minimum spennende tre38. 2D iterativ søm utføres i en stabel som starter på et sted i midten av stabelen med mindre bakgrunnssignal. Flisen øverst til venstre plasseres først for hver søm-iterasjon for å forhindre subtil forskyvning av bilder i z-dimensjonen.

Vi anbefaler at du kjører hvert av forløpbåndene sekvensielt, spesielt når du optimaliserer for å korrigere for feil. De store problemene oppstår ofte under sømtrinnene. Et problem som kan oppstå er feil bildeinnhenting på lysarket. Dette problemet kan oppstå når den horisontale dynamiske fokuseringen er feil innstilt på lysarket og kan føre til vekslende inn- / utfasemønstre i bildene (figur 4B, C). Ytterligere feil kan oppstå hvis prøven ikke var tett sikret, og det oppstod betydelig prøvebevegelse under oppkjøpet. I disse tilfellene kan det hende at nøyaktig søm ikke er mulig på grunn av mangel på parvis korrespondanse mellom tilstøtende fliser. Andre potensielle feil kan stamme fra stingstartstedet. NuMorph bestemmer startstedet for sømmen omtrent midt i stabelen. Men når det er betydelig bakgrunn i startskiveområdet, kan det oppstå feil i den parvise sammenligningen i bildefliser. Det anbefales her å velge et startsted som har et høyt signal-til-støy-forhold.

Bildeanalysen som er beskrevet her, inkluderer bildeomsampling av sydde bilder fra høy oppløsning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) til en lavere isotrop oppløsning på 25 μm³/voxel. Vi resample de sydde bildene fra atomkanalen for å registrere de sydde bildene til Allen Developmental Mouse Brain Atlas i neste trinn34. Celler telles deretter for hver kanal i kommenterte områder av bildene i referanse til atlaset med høy oppløsning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) ved hjelp av en trent 3D-Unet modell19. Denne metoden kan også brukes til å oppdage og telle blob-objekter. Ved utvikling av NuMorph testet vi segmenteringsnøyaktighet i forhold til helt nye bilder som aldri ble sett under trening som var fra samme vevsryddingsprosedyre, samme mikroskop og samme kjernefysiske etikettfunnpresisjon på 0,99 og tilbakekalling av 0,9419. NuMorph-nøyaktighet er ennå ikke testet på forskjellige vevsklareringsprosedyrer, mikroskoper eller markører; Derfor er nøyaktigheten av segmentering i andre eksperimentelle design ukjent. Standardatlaset i NM_setup.m er den voksne Nissl-fargede Allen Reference Atlas39 med den tredje iterasjonen av Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3) som den tilpassede merknaden.

Selv om NuMorph effektivt analyserer vev, som er relativt tette, for eksempel den voksne musebarken, kan mer utfordrende eksperimentelle design (som embryonale musehjerner eller svært tette strukturer som cerebellum) kreve utvikling av ytterligere beregningsverktøy. Nåværende samfunnsbasert innsats forsøker å produsere tilstrekkelige merknadsdata for opplæring av dype læringsmodeller som brukes til å segmentere disse vanskeligere tilfellene40. Fremskritt innen lysarkavbildningsteknologier tillater kvantitativ undersøkelse av subcellulære strukturer med høy gjennomstrømning, med nye tilnærminger som dual-view invertert selektiv planbelysningsmikroskopi (diSPIM) som fører til økt oppløsning og nøyaktighet i cellulære tette hjernegrupper40,41. Etter hvert som fremskritt innen vevsrydding, bildebehandling og beregningsverktøy involvert i denne forskningen utvikler seg, håper vi at de vil føre til bredere bruk av vevsklareringsmetoder for kvantitative analyser av hvordan nevropsykiatriske lidelser kan stamme fra endringer i hjernestruktur indusert av genetiske eller miljømessige risikofaktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01MH121433, R01MH118349, og R01MH120125 til JLS og R01NS110791 til GW) og Foundation of Hope. Vi takker Pablo Ariel fra Microscopy Services Laboratory for å hjelpe til med prøveavbildning. Mikroskopitjenestelaboratoriet ved Institutt for patologi og laboratoriemedisin støttes delvis av Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 til University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core støttes av tilskudd P30 NS045892. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet delvis av North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Tags

Nevrovitenskap utgave 186
Helhjerne enkeltcelleavbildning og analyse av intakte neonatale musehjerner ved bruk av MR, vevsrydding og lysarkmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter