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Neuroscience

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l'immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell'imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Abstract

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l'imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l'analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L'imaging dell'intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L'uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.

Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all'interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l'imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l'immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell'immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.

Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell'organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

Introduction

L'imaging dell'intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un'analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto 1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; tuttavia, queste tecniche richiedono attrezzature costose e specializzate, potrebbero non essere compatibili con l'immunomarcatura e la natura bidimensionale (2D) di alcuni metodi può portare a danni tissutali e taglio durante il sezionamento 4,5.

I recenti progressi hanno fornito un approccio alternativo per l'imaging di interi cervelli che non richiede il sezionamento dei tessuti; Implicano l'uso della pulizia dei tessuti per rendere trasparente il cervello. La trasparenza si ottiene nella maggior parte dei metodi di pulizia dei tessuti sia rimuovendo i lipidi, in quanto sono una delle principali fonti di diffusione della luce, sia abbinando l'indice di rifrazione (RI) dell'oggetto con il RI della soluzione di immersione del campione durante l'imaging. La luce può quindi passare attraverso il confine tra i materiali senza essere dispersa 6,7,8,9.

I metodi di pulizia dei tessuti, come iDISCO+, sono spesso combinati con l'imaging 3D rapido utilizzando la microscopia a eccitazione a singolo fotone, come LSFM 6,7,10. All'interno di tessuti trasparenti marcati con un fluoroforo, la microscopia a fluorescenza a foglio di luce immagini sezioni per eccitazione con un sottile piano di luce11. Il vantaggio principale di LSFM è che una singola sezione ottica viene illuminata alla volta, con tutta la fluorescenza delle molecole all'interno di quella sezione eccitata, il che riduce al minimo il fotosbiancamento. Inoltre, l'imaging di un'intera fetta ottica consente il rilevamento basato su telecamera di quella fetta eccitata, aumentando la velocità rispetto alla scansione puntuale12. LSFM produce in modo non distruttivo sezioni ottiche ben registrate che sono adatte per la ricostruzione 3D.

Mentre il metodo iDISCO+ consente una pulizia dei tessuti economica entro ~ 3 settimane, le fasi di disidratazione all'interno del protocollo possono portare al restringimento del tessuto e alla potenziale alterazione della morfologia del campione, influenzando così le misurazioni volumetriche 6,10. L'aggiunta di un metodo di imaging secondario, come la risonanza magnetica, da utilizzare prima della procedura di pulizia del tessuto può misurare il grado di restringimento indotto dalla pulizia del tessuto attraverso il campione. Durante le fasi di disidratazione, le differenze nelle proprietà meccaniche tra la materia grigia e bianca possono portare a deformazioni non uniformi della materia cerebrale, con conseguenti deformazioni di volume indotte dalla pulizia dei tessuti dissimili tra campioni wild-type e mutanti e possono confondere le interpretazioni delle differenze volumetriche in questi campioni10,13 . La risonanza magnetica viene eseguita prima perfondendo l'animale con un agente di contrasto (ad esempio, gadolinio), seguita dall'incubazione del tessuto estratto di interesse in una soluzione di immersione (ad esempio, fomblin) prima di imaging14. La risonanza magnetica è compatibile con la pulizia dei tessuti e l'esecuzione di LSFM sullo stesso campione.

LSFM viene spesso utilizzato per creare immagini di microscopia su larga scala per la visualizzazione qualitativa del tessuto cerebrale di interesse piuttosto che la valutazione quantitativa della struttura cerebrale (Figura 1). Senza una valutazione quantitativa, è difficile dimostrare differenze strutturali derivanti da insulti genetici o ambientali. Con il miglioramento delle tecnologie di pulizia dei tessuti e di imaging, insieme alla riduzione dei costi di archiviazione e potenza di calcolo, la quantificazione delle localizzazioni dei tipi di cellule all'interno del tessuto di interesse sta diventando più accessibile, consentendo a più ricercatori di includere questi dati nei loro studi.

Con oltre 100 milioni di cellule nel cervello del topo15 e sessioni di imaging dell'intero cervello in grado di generare terabyte di dati, vi è una crescente domanda di strumenti avanzati di analisi delle immagini che consentano una quantificazione accurata delle caratteristiche all'interno delle immagini, come le cellule. Esistono numerosi metodi di segmentazione per le immagini con eliminazione tissutale che applicano soglie per l'intensità della colorazione nucleare e filtrano oggetti con forme, dimensioni o densità predefinite10,16,17,18. Tuttavia, interpretazioni imprecise dei risultati possono derivare da variazioni di parametri quali dimensioni delle celle, contrasto dell'immagine e intensità dell'etichettatura. Questo articolo descrive il nostro protocollo stabilito per quantificare i nuclei cellulari nel cervello del topo. In primo luogo, descriviamo in dettaglio i passaggi per la raccolta dei tessuti del cervello del topo P4, seguiti da un protocollo di pulizia dei tessuti e immunoetichettatura ottimizzato dal metodo iDISCO +10 disponibile pubblicamente. In secondo luogo, descriviamo l'acquisizione delle immagini utilizzando la risonanza magnetica e la microscopia a foglio leggero, compresi i parametri utilizzati per l'acquisizione delle immagini. Infine, descriviamo e dimostriamo NuMorph19, una serie di strumenti di analisi delle immagini che il nostro gruppo ha sviluppato che consente la quantificazione specifica del tipo di cellula dopo la pulizia dei tessuti, l'immunomarcatura con marcatori nucleari e l'imaging a foglio luminoso di regioni annotate.

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Protocol

Tutti i topi sono stati utilizzati in conformità e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill.

1. Dissezione e perfusione del topo

NOTA: Le seguenti dissezioni sono state eseguite su topi P4 e P14 utilizzando una siringa. Il volume del liquido di perfusione varierà a seconda dell'età dell'animale.

  1. Perfusione
    ATTENZIONE: La paraformaldeide (PFA) è una sostanza chimica pericolosa. Eseguire tutte le fasi di perfusione in una cappa aspirante chimica.
    1. Prima dell'intervento chirurgico, somministrare pentobarbital tramite iniezione intraperitoneale (100 mg/kg) e lasciare che l'anestetico abbia effetto.
    2. Una volta che l'animale ha raggiunto un piano chirurgico di anestesia, utilizzare il metodo di risposta del pizzicamento delle dita dei piedi per confermare la mancata risposta.
    3. Fai un'incisione laterale sotto la gabbia toracica per esporre la cavità toracica dell'animale.
    4. Usando forbici chirurgiche curve, tagliare con cura la gabbia toracica fino alla clavicola su un lato dell'animale e fare un taglio identico sul lato opposto, permettendo allo sterno di essere sollevato, esponendo il cuore.
    5. Senza danneggiare l'aorta discendente, tagliare con cura qualsiasi tessuto collegato al cuore prima di praticare una piccola incisione sull'atrio destro per consentire al sangue di fluire fuori dal sistema vascolare.
    6. Utilizzando un metodo basato su siringa, perfondere il mouse attraverso il ventricolo sinistro con 10 ml e 7 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per P14 e P4, rispettivamente, con una velocità di perfusione di 1,5 ml / min attraverso il sistema.
    7. Una volta eliminato il sangue, perfondere nuovamente con 10 ml di PBS + 4% PFA e 7 mL di PBS + 4% PFA per P14 e P4, rispettivamente, a 4 °C con una velocità di perfusione di 1,5 mL/min per fissare l'animale.
      NOTA: Si osserveranno tremori di fissazione e l'animale sarà rigido al termine. Se si utilizza la risonanza magnetica su campioni, perfondere con volumi simili di PBS e PFA per ciascun timepoint + 20% di mezzo di contrasto MRI a base di gadolinio nella soluzione PFA.
    8. Rimuovere la testa con le forbici chirurgiche e drop-fix con PBS + 4% PFA per 24 ore a 4 °C per una fissazione completa.
      NOTA: In questa fase, il cervello rimane intatto con il cranio acceso (vedere Sezione 2). Punto di pausa: i cervelli possono essere conservati per diversi mesi in questa fase in PBS + 0,1% di azoturo di sodio a 4 °C.

2. Imaging della struttura cerebrale grossolana basato su RM con cranio intatto e analisi

NOTA: Il cervello deve essere perfuso e incubato in gadolinio come descritto sopra senza essere rimosso dal cranio. Tutta la risonanza magnetica si verifica prima della rimozione del cervello dal cranio per evitare la perdita di tessuto involontaria durante la dissezione. L'imaging con un cranio intatto fornisce anche supporto al cervello nel supporto del campione (cioè siringa) durante la preparazione del campione e l'imaging.

  1. Preparazione del campione
    NOTA: i seguenti passaggi sono ottimizzati per i campioni di cervello di topo P4 e P14. La dimensione della siringa necessaria dipenderà dalla dimensione fisica del campione.
    1. Se si esegue la risonanza magnetica sul campione, rimuovere la pelle dal cranio e incubare in PBS + 3% gadolinio per 23 giorni a 4 °C prima di eseguire l'imaging14. Dopo 23 giorni, sciacquare rapidamente i campioni in PBS.
    2. Utilizzare siringhe da 5 ml per creare un portacampioni per la risonanza magnetica, utilizzando pistoni per siringhe per chiudere ciascuna estremità del supporto realizzato con la siringa20. Utilizzare pezzi di plastica per tenere il cranio saldamente in posizione nel supporto (Figura 2A). Rimuovere i segni sulla siringa con etanolo per evitare artefatti durante l'imaging.
    3. Posizionare saldamente il cranio nel supporto del campione e riempire con una soluzione ad immersione compatibile con la risonanza magnetica (vedere la tabella dei materiali). Chiudere il supporto e rimuovere tutte le bolle d'aria usando una siringa.
      NOTA: Punto di pausa: il cranio può essere conservato nella soluzione di immersione per diversi mesi prima dell'imaging.
  2. Imaging della struttura cerebrale grossolana (MRI)
    1. Immagini dei campioni con un sistema di risonanza magnetica animale a foro orizzontale di 9,4 T/30 cm utilizzando una bobina di volume di 15 mm e una sequenza basata su spin-eco con i seguenti parametri: Risoluzione spaziale: 60 μm x 60 μm x 60 μm; Tempo totale di scansione: 7 h 12 min; tempo di eco (TE): 6,83 ms; tempo di ripetizione (TR): 40 ms; angoli di eccitazione/rimessa a fuoco: 90/180 gradi; dimensione dell'immagine: 166 x 168 x 209 voxel; Campo visivo (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; larghezza di banda: 100.000 kHz.
  3. Analisi computazionale della struttura cerebrale grossolana
    1. Rimuovere il cranio circostante dalle immagini di risonanza magnetica grezze tracciando manualmente il cervello del topo utilizzando il software di segmentazione. Quindi, applicare l'operazione di moltiplicazione voxel-saggio tra l'immagine della maschera e l'immagine MRI grezza per generare l'immagine MRI cerebrale spogliata del cranio.
      NOTA: l'output è un'immagine maschera binaria in cui l'intensità per i voxel cerebrali è impostata su 1 e 0 in caso contrario.
    2. Applicare la registrazione rigida dell'immagine (stimando solo la traslazione e la rotazione) utilizzando "flirt" nel pacchetto FSL21,22 per allineare l'immagine MRI spogliata del cranio (immagine in movimento) alla corrispondente immagine al microscopio a foglio luminoso (immagine di riferimento).
    3. Applicare la registrazione non rigida (utilizzando 'SyN' nel software ANTS23) per trovare le corrispondenze punto-punto tra l'immagine MRI allineata rigidamente nel passaggio 2.3.2 e l'immagine del foglio luminoso (stessa immagine di riferimento nel passaggio 2.3.2).
      NOTA: L'output include l'immagine MRI deformata e il campo di deformazione associato alle variazioni di volume dalla risonanza magnetica alle immagini del foglio di luce.
    4. Calcolare il determinante jacobiano sul campo di deformazione generato nel passo 2.3.3, che quantifica la variazione di volume in un quartiere locale di voxel 3 x 3 x 3.
    5. Allinea le immagini spogliate del cranio all'Atlante del cervello del topo di Allen Developmental utilizzando la registrazione delle immagini deformabili.
      NOTA: La corrispondenza spaziale punto-punto stabilita consente l'annotazione automatica delle regioni cerebrali di interesse nella nuova immagine del topo (Figura 2C-H).

3. Dissezione cerebrale dal cranio

  1. Fai un'incisione sulla linea mediana lungo la parte superiore del cranio dal collo al naso per esporre il cranio.
  2. Esporre la base del cranio tagliando via il muscolo del collo rimanente e tutti gli altri muscoli residui.
  3. Utilizzando forbici chirurgiche affilate, tagliare con cura lungo la superficie interna del cranio, facendo attenzione a non danneggiare il cervello mantenendo una leggera pressione verso l'alto durante il taglio con l'attrezzatura chirurgica affilata.
  4. Usa le pinzette per staccare le due metà tagliate del cranio dal cervello e tagliare con cura il grasso in eccesso attaccato al cervello.
  5. Usa una forbice chirurgica per tagliare qualsiasi dura che collega il cervello al cranio, quindi usa una spatola per rimuovere delicatamente il cervello dalla testa.
  6. Rimuovere il cervello, lavare con PBS, quindi passare a PBS con azoturo di sodio allo 0,1% e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

4. Pulizia dei tessuti

NOTA: Questo protocollo è adattato dal protocollo iDISCO+ per i mouse P46, con modifiche minori. Alcuni dettagli possono cambiare per diversi punti temporali / specie / esperimenti). ATTENZIONE: Metanolo, diclorometano (DCM) ed etere dibenzilico (DBE) sono sostanze chimiche pericolose. Queste fasi di pulizia dei tessuti vengono eseguite in una cappa aspirante chimica.

  1. Validazione anticorpale
    NOTA: La compatibilità con metanolo degli anticorpi non testati deve essere controllata in quanto potrebbero essere influenzati negativamente dai lavaggi aggressivi del metanolo richiesti nel protocollo iDISCO+. Per un elenco degli anticorpi che hanno dimostrato di funzionare in iDISCO+, vedere il sito web24.
    1. Raccogliere sezioni congelate di 10 μm del tessuto di interesse fissato con PFA su vetrini stereologici.
    2. Incubare le sezioni in metanolo al 100% per 3 ore a temperatura ambiente.
    3. Reidratare in PBS prima di procedere con i protocolli immunoistochimici standard per determinare se l'anticorpo mostra il modello atteso di fluorescenza dopo i lavaggi con metanolo. Per un controllo positivo, utilizzare un vetrino non trattato con metanolo.
  2. Preparazione del buffer
    1. Preparare i buffer secondo il protocollo ufficiale iDISCO. Vedere la tabella dei materiali per la composizione dei buffer e delle altre soluzioni utilizzate in questo protocollo.
  3. Pretrattamento
    1. Disidratare il campione con metanolo/serie PBS: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 h ciascuno a temperatura ambiente.
      NOTA: L'uso di PBS durante la disidratazione aiuta a prevenire la rottura dei campioni nei lavaggi a metanolo.
    2. Lavare il campione in metanolo al 100% per 1 ora, quindi raffreddare a 4 °C per 1 ora prima di incubare per una notte agitando in 66% DCM / 33% metanolo a temperatura ambiente.
    3. Lavare il campione 2 volte in metanolo al 100% a temperatura ambiente, quindi raffreddarlo a 4 °C.
    4. Utilizzare H2O2 fresco al 5% in metanolo per sbiancare il campione durante la notte a 4 °C.
    5. Reidratare il campione con metanolo/serie PBS: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 h ciascuno a temperatura ambiente e lavare 2x per 1 ora in PTx.2 a temperatura ambiente.
    6. Incubare il campione in 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO a 37 °C durante la notte.
    7. Incubare il campione in 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Deossicolato/0,1% NP40/20% DMSO a 37 °C durante la notte.
    8. Lavare in PTx.2 a temperatura ambiente per 1 h due volte.
  4. Immunomarcatura
    1. Incubare i campioni in soluzione di permeabilizzazione a 37 °C per 2 giorni (~48 h).
    2. Bloccare i campioni in soluzione bloccante a 37 °C per 2 giorni (~48 h).
    3. Incubare i campioni con anticorpo primario in PTwH / 5% DMSO / 3% siero a 37 °C per 4 giorni (~96 h) (ad esempio, coniglio (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) e anticorpo anti-Ctip2 rat (Rt) (1:400) (Tabella dei materiali).
    4. Lavare 3 x 1 h in PTwH. Lavare per altre 2 ore in PTwH. Lasciare nella soluzione di lavaggio per una notte a temperatura ambiente.
    5. Incubare i campioni con anticorpi secondari e un colorante nucleare, come TO-PRO-3, in PTwH / siero al 3% a 37 °C per 4 giorni (~96 h; ad esempio, capra anti-Rb(1:50) e (capra anti-Rt(1:200)) (Tabella dei materiali).
    6. Lavare 3 x 1 h in PTwH Lavare per altre 2 ore in PTwH. Lasciare nella soluzione di lavaggio per una notte a temperatura ambiente.
  5. Spurgo
    1. Disidratare in metanolo/serie PBS-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h ciascuno a temperatura ambiente. Incubare per 3 ore, con agitazione, in 66% DCM / 33% metanolo a temperatura ambiente.
      NOTA: Il campione può essere lasciato durante la notte a temperatura ambiente immediatamente dopo la disidratazione in metanolo al 100%.
    2. Incubare in DCM al 100% per 15 minuti due volte a temperatura ambiente (con agitazione) per lavare il MeOH.
    3. Incubare in etere dibenzilico (DBE) senza agitare a temperatura ambiente. Assicurarsi che il tubo sia riempito quasi completamente con DBE per evitare l'ossidazione del campione. Terminare di miscelare la soluzione invertendo un paio di volte prima dell'imaging.

5. Imaging a foglio luminoso

NOTA: i cervelli iDISCO con eliminazione dei tessuti sono stati ripresi con un microscopio a foglio di luce, dotato di un obiettivo 2X/0.5 NA, una telecamera complementare a semiconduttore di ossido di metallo e un software di acquisizione di immagini e funzionamento al microscopio a 0,75 x 0,75 x 4 μm/voxel per il timepoint P4 in quanto ciò consentiva la risoluzione di una singola cellula all'interno della corteccia (Figura 3A,B).

  1. Montaggio del campione
    1. Montare con cura il campione nel supporto della dimensione del campione corretto in modo che il campione sia orientato con la dimensione z non superiore a 5,2 mm di profondità a causa della distanza di lavoro nominale del microscopio a foglio di luce (5,7 mm meno 0,5 mm margine di sicurezza)25.
    2. Posizionare il portaposto nella culla del campione con la vite del supporto con un angolo di 45° rispetto ai supporti della culla (Figura 1B). Posizionare la culla in modo che il percorso della luce sia perpendicolare al campione (Figura 1C).
  2. Parametri di imaging
    1. Impostare il corpo dello zoom sul microscopio su un ingrandimento 4x o superiore con un rendimento di 0,75 μm/pixel.
      NOTA: Le analisi computazionali a singola cellula su immagini a foglio di luce P4 possono essere eseguite con qualsiasi microscopio a foglio di luce disponibile in commercio che consente una risoluzione di 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel o superiore. Una risoluzione inferiore è sufficiente per i cervelli in punti temporali successivi in cui i nuclei sono più scarsamente distribuiti.
    2. Nel software di acquisizione immagini, selezionare un singolo foglio luminoso con un NA = ~0,08 (spessore 9 μm / passo z 4 μm).
      NOTA: Questa impostazione combinata con la messa a fuoco dinamica orizzontale consente l'imaging dell'intero cervello con una risoluzione a singola cellula del cervello di un topo entro un tempo ragionevole. Per un cervello postnatale giorno 4 (P4), il tempo di acquisizione delle immagini è stimato in 11-15 ore per tre canali a seconda delle dimensioni del cervello.
    3. Per garantire che la risoluzione assiale venga mantenuta lungo la larghezza dell'immagine, selezionare Messa a fuoco dinamica orizzontale e applicare il numero consigliato di passaggi a seconda della lunghezza d'onda del laser. Per un intero cervello di topo P4, impostare la messa a fuoco dinamica orizzontale su 11. Regolare la messa a fuoco fine per ciascun canale rispetto al canale di registrazione.
      NOTA: Qui, il canale TO-PRO-3 (647 nm) è registrato nell'Allen Developmental Mouse Brain Atlas in quanto etichetta tutti i nuclei.
    4. Regolare la potenza del laser per canale rispetto alle proprietà del canale.
      NOTA: lunghezze d'onda più lunghe richiedono una potenza laser maggiore rispetto alle lunghezze d'onda più corte. Ad esempio, il canale a 780 nm deve essere ripreso con una potenza laser elevata (70% - 75%) e una bassa esposizione (50 ms), mentre il canale a 647 nm richiede una potenza laser media (40% - 45%) e una bassa esposizione (50 ms).
    5. Regolare la larghezza del foglio luminoso su ~50% per garantire che la potenza del foglio sia distribuita in modo ottimale nella dimensione y per questa dimensione campione.
      NOTA: In combinazione con la messa a fuoco dinamica orizzontale, una larghezza del foglio del 50% fornisce una distribuzione media della potenza sull'immagine con un rischio ridotto di sbiancamento fotografico25.
    6. Impostare il numero di riquadri rispetto alle dimensioni del campione con una sovrapposizione consigliata del 15% tra i riquadri e acquisire immagini per ogni canale in sequenza per ogni pila in una determinata posizione del riquadro.

6. Elaborazione delle immagini utilizzando NuMorph

NOTA: la pipeline NuMorph ha tre parti principali per l'analisi delle immagini 3D: pre-elaborazione, analisi e valutazione. Queste parti sono state organizzate in NMp_template.m, NMa_template.m. e NMe_template.m, rispettivamente, che sono discusse di seguito. Inoltre, NM_setup.m viene aggiunto per scaricare e installare i pacchetti software necessari per il corretto funzionamento di NuMorph. NM_samples.m fornisce anche un modello per inserire informazioni sull'acquisizione delle immagini.

  1. Configurazione di NuMorph
    1. Scarica e installa il gestore dell'ambiente conda per Linux26. Scarica e installa gli strumenti di elaborazione delle immagini NuMorph19 .
    2. Nella riga di comando, esegui Matlab. Esegui NM_setup.m da NuMorph per scaricare e installare i pacchetti software di analisi delle immagini necessari per le analisi.
      NOTA: Questo passaggio garantisce che l'ambiente conda sia configurato correttamente e che tutti gli strumenti e i componenti aggiuntivi necessari per Matlab per eseguire ciascuna delle tre pipeline siano scaricati e installati correttamente. I più importanti qui sono Elastix per la registrazione in esecuzione e 3D-Unet per il rilevamento e il conteggio delle cellule.
  2. Specificare i nomi dei campioni, le directory di input e output, le informazioni sul canale e i parametri di imaging del foglio luminoso modificando il file NM_samples.m.
    NOTA: Qui, si consiglia di ricontrollare per assicurarsi che le informazioni corrette, in particolare la directory di input dell'immagine, siano specificate correttamente. Gli errori non vengono in genere chiamati qui fino a quando non si eseguono i passaggi successivi.
  3. Pre-elaborazione delle immagini
    1. Regolazione dell'intensità
      1. Nella NMp_template, impostare la regolazione dell'intensità = true.
        NOTA: impostare su true se è necessaria la regolazione dell'intensità. In caso contrario, impostare la regolazione dell'intensità = false. C'è anche un'opzione per utilizzare 'update' per sovrascrivere i parametri di regolazione precedenti.
      2. Imposta usa immagini elaborate = false quando si lavora con un nuovo set di immagini. In caso contrario, indicare eventuali set di dati di immagini salvati in precedenza nella directory di output (ad esempio, "allineati", "cuciti") da utilizzare per le successive fasi di elaborazione.
        NOTA: questa opzione è disponibile nel caso in cui le immagini di input siano già state pre-elaborate. In questo caso, le immagini preelaborate verranno utilizzate come immagini di input e l'opzione verrà impostata sul nome della sottodirectory nella directory di output.
      3. Imposta salva immagini = true.
        NOTA: l'utilizzo di questa opzione garantisce che le immagini elaborate vengano salvate nella directory di output; In caso contrario, verranno calcolati e salvati solo i parametri.
      4. Imposta salva campioni = true.
        NOTA: questa opzione garantisce che i risultati del campione vengano salvati per ogni passaggio principale.
      5. Imposta regola ombreggiatura piastrelle = base per applicare la correzione dell'ombreggiatura utilizzando l'algoritmo BaSiC27 o manuale per applicare la correzione dell'ombreggiatura delle piastrelle utilizzando misurazioni dal microscopio a fogli di luce a specifiche larghezze del foglio di luce.
        NOTA: questa opzione corregge l'illuminazione irregolare lungo la dimensione y causata dalla forma della vita del foglio.
    2. Allineamento dei canali immagine
      1. In NMp_template, impostare l'allineamento dei canali = true. Impostate questa opzione su true se è richiesto l'allineamento dei canali. In caso contrario, impostare su false. Impostare il metodo di allineamento dei canali su traslazione (rigido) o elastix (non rigido).
        NOTA: Il metodo di traslazione utilizza approcci rigidi di registrazione 2D nell'allineamento di più canali, mentre il metodo elastix utilizza B-spline28 non rigide per correggere la deriva rotazionale, che può verificarsi durante l'acquisizione di immagini lunghe19.
    3. Stitching iterativo delle immagini
      1. In NMp_template, impostare le immagini del punto = true.
        Nota : impostare questa opzione su true se è necessaria la cucitura.
      2. Imposta raffinamento setaccio = true.
        NOTA: questa opzione viene utilizzata per perfezionare ulteriormente la traslazione in xy utilizzando la feature Scala invariante Transform29.
      3. Imposta parametri di allineamento del carico = true.
        NOTA: questa opzione utilizza le traslazioni di allineamento dei canali durante la cucitura. Questa opzione è consigliata con l'imaging multicanale. In caso contrario, impostare su false.
      4. Imposta sovrapposizione = 0,15 per abbinare le sovrapposizioni dei riquadri durante l'imaging.
    4. Per eseguire uno di questi passaggi di pre-elaborazione, esegui quanto segue in Matlab al di fuori dell NMp_template ambiente:
      1. Specificare il nome del campione. Set config = NM_config(process,sample).
      2. Eseguire uno qualsiasi dei passaggi di pre-elaborazione specificando NM_process(config,stage) e specificare lo stage utilizzando intensità, allineamento o stitch per uno qualsiasi dei processi. Controllare la directory di output per i file di output per ciascuna delle fasi (Figura 3 e Figura 4).
  4. Analisi delle immagini
    1. Prima di NuMorph
      1. Inizia con un'immagine dell'atlante 3D e un'immagine di annotazione associata che assegna ogni voxel a una particolare struttura.
        NOTA: Qui viene utilizzato il P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas generato dal MagellanMapper30 .
      2. Allineare sia l'immagine dell'atlante che il file di annotazione per assicurarsi che corrispondano correttamente con il giusto orientamento.
    2. All'interno di NuMorph
      NOTA: Ora che l'atlante e le sue annotazioni sono allineati correttamente, i file devono essere "munged" o elaborati all'interno di NuMorph in modo che possano essere salvati per un uso successivo. A tale scopo, utilizzare la funzione munge_atlas per specificare gli input come illustrato di seguito.
      1. Specificare Atlas_file: (stringa). Fornire il percorso completo del file dell'atlante.
      2. Specificare Annotation_file: (stringa). Fornire il percorso completo delle annotazioni associate.
      3. Specificare Risoluzione: (1x3 numerico). Specificate la risoluzione dell'atlante y,x,z come micron per pixel.
      4. Specificate l'orientamento: (1 x 3 caratteri). Fornire l'orientamento dell'atlante e assicurarsi che corrisponda alla configurazione del campione nella culla (anteriore(a)/posteriore(p),superiore/i/inferiore(i),sinistra(l)/destra(r)).
      5. Specifica emisfero: specifica quale emisfero cerebrale è stato ripreso ("sinistra", "destra", "entrambi", "nessuno").
      6. Specificate out_resolution:(int). Specificare la risoluzione isotropica dell'output dell'atlante in micron. (valore predefinito: 25).
      7. Eseguire il comando "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, risoluzione, orientamento, emisfero)" per generare annotazioni munged in /data/annotation_data e una copia dell'immagine dell'atlante in /data/atlas.
      8. Leggi la struttura Matlab e il file dell'atlante per verificare che entrambi i file siano correttamente mappati con il giusto orientamento.
        NOTA: È possibile eseguire un'ulteriore fase di classificazione cellulare per quantificare i tipi cellulari in base alla co-localizzazione di marcatori proteici immunomarcati.
    3. Ricampionamento
      1. In NMa_template, impostare ricampionare le immagini = true, se si esegue la registrazione delle immagini per fare riferimento all'atlante o per generare volumi di set di dati ad alta risoluzione.
        NOTA: Il NMa_template.m verrà utilizzato per impostare i parametri per il ricampionamento, la registrazione, il rilevamento dei nuclei e il conteggio delle cellule.
      2. Impostate la risoluzione di ricampionamento in modo che corrisponda all'atlante.
        NOTA: Qui, viene utilizzata la risoluzione isotropa di 25 μm3/voxel perché l'atlante di riferimento si trova a questa risoluzione.
      3. Specificare il numero di canale da ricampionare utilizzando i canali di ricampionamento = [ ].
        NOTA: qui, il numero del canale è impostato in modo che corrisponda al canale nucleare. Se questa opzione è vuota, verrà ricampionato solo il canale di registrazione.
    4. Registrazione
      1. In NMa_template, impostare le immagini del registro = true. Impostare su true se è richiesta la registrazione. In caso contrario, impostare registration = false.
      2. Specificate il file dell'atlante in modo che corrisponda al file nella directory dell'atlante.
      3. Imposta parametri di registrazione = default.
        NOTA: questa opzione utilizza una trasformazione affine seguita da B spline per stimare la corrispondenza spaziale. Altrimenti, definire un nuovo set di parametri di registrazione tramite Elastix in /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Imposta salva immagini registrate = true.
        NOTA: i file di output dalla registrazione e dal ricampionamento possono essere scaricati e ispezionati visivamente in Matlab o in altri strumenti di visualizzazione come FIJI31.
    5. Rilevamento dei nuclei, conteggio e classificazione delle cellule
      NOTA: gli errori che si verificano qui potrebbero essere dovuti alla mancata specifica corretta del file delle annotazioni o alla mancata corrispondenza dell'età del campione con l'annotazione corretta.
      1. In NMa_template, impostare entrambi i nuclei di conteggio e classificare le cellule = vero.
      2. Imposta il metodo di conteggio = 3dunet.
        NOTA: questa opzione consente l'uso del modello 3D-Unet addestrato19. In caso contrario, selezionare Hessian che utilizza il metodo di rilevamento BLOB dell'Assia.
      3. Impostare min_intensity per definire una soglia minima di intensità per gli oggetti rilevati.
        NOTA: Una soglia appropriata è determinata empiricamente in base al rapporto segnale-rumore dell'etichettatura nucleare.
      4. Impostare classify_method su una delle due soglie, che si basa su intensità di fluorescenza non supervisionate in posizioni centroidi o svm, che modella un classificatore SVM (Support Vector Machine) lineare supervisionato.
        NOTA: questo passaggio classificherà tutte le celle rilevate in quattro classi principali con imaging a 3 canali. Con questo protocollo vengono generati Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- e Outliers.
    6. Fasi dell'analisi
      1. Specificare il nome del campione. Imposta config =NM_config(analyze,sample).
      2. Eseguite uno qualsiasi dei passi di analisi specificando NM_analyze(config,stage) e specificate lo stage utilizzando ricampionare, registrare, contare o classificare. Controllare la directory di output per i file di output per ciascuna delle fasi (Figura 5).
    7. Classificazione del tipo di cellula e analisi dei gruppi
      1. In NMe_template, impostare update = true e sovrascrivere tutte le statistiche calcolate in precedenza.
        NOTA: Il NMe_template.m offre la possibilità di eseguire l'analisi di gruppi di tipo cellulare attraverso regioni cerebrali dello stesso cervello analizzato.
      2. Impostare compare_structures_by su uno dei due indici per confrontare con tutte le annotazioni univoche o una tabella per confrontare le strutture in base alla tabella.
      3. Impostare il template_file, che specifica tutti i possibili indici di struttura e deve esistere in /annotations.
      4. Impostare structure_table e specificare le strutture da valutare.
      5. Specificare il conteggio delle celle e la classificazione del tipo di cella come descritto in NMa_template.m.
      6. Impostare compare_groups per specificare i gruppi da confrontare.
      7. Impostare accoppiato su true o false per eseguire il test t accoppiato o il test t a due campioni.
    8. Eseguire l'analisi.
      NOTA: per eseguire questo passaggio, eseguire quanto segue in Matlab al di fuori dell'ambiente NMe_template.m.
      1. Specificare il nome del campione. Set config =NM_config(evaluate,sample).
      2. Eseguite il passo di analisi specificando NM_evaluate(config,stage) e specificate lo stage. Controllare la directory di output per i file di output per l'analisi di gruppo.

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Representative Results

Poiché il protocollo iDISCO+ introduce un significativo restringimento tissutale, che è facilmente visibile ad occhio nudo (Figura 2B), abbiamo aggiunto una fase di risonanza magnetica a questa pipeline prima della pulizia dei tessuti per quantificare il restringimento indotto dalla pulizia dei tessuti. Il flusso di lavoro inizia con la rimozione del tessuto non cerebrale dall'immagine MR (Figura 2C). Successivamente, viene applicata una trasformazione rigida (3 angoli di traslazione e 3 angoli di rotazione) per allineare l'immagine MR all'immagine del foglio luminoso (Figura 2D). In questo modo, abbiamo osservato una perdita di volume totale del 60% indotta dalla procedura di pulizia dei tessuti (Figura 2E), che era coerente con le stime di variazione del volume ad occhio (Figura 2B). Questo risultato è molto diverso da un rapporto precedente in cui è stata riportata una contrazione del 5% -10% 10,32. La differenza di restringimento può essere causata dalla differenza di età animale tra i due studi (P4 vs. cervello adulto) o a causa di differenze di tempo nel lavaggio del metanolo nella fase di compensazione del protocollo iDISCO+ (16 h vs. 2 h). Per mappare i gradi di restringimento dei tessuti in diverse regioni del cervello, abbiamo ulteriormente implementato una registrazione dell'immagine deformabile in cui l'immagine del foglio luminoso viene utilizzata come riferimento. L'immagine MR registrata è mostrata in (Figura 2F). La variazione di volume stimata dovuta alla procedura di pulizia dei tessuti è codificata a colori, dove si osserva un grado maggiore di restringimento nella corteccia rispetto ad altre regioni del cervello (Figura 2G).

Per misurare i volumi delle regioni cerebrali, abbiamo eseguito la segmentazione della risonanza magnetica attraverso la registrazione a un atlante annotato. La segmentazione dei cervelli con immagini MR è stata considerata un successo se la sovrapposizione dell'atlante di riferimento corrispondeva strettamente ai confini anatomici identificati dalle differenze di contrasto nelle immagini MRI grezze (Figura 2H). La sovrapposizione durante la registrazione dipende da una buona preparazione del campione (Figura 2A), dall'acquisizione delle immagini e dallo striping del cranio. La fase di stripping del cranio è fondamentale per ottenere buoni risultati di registrazione in quanto la registrazione tenterà di deformare l'immagine di riferimento dall'atlante all'intera immagine MR, incluso qualsiasi cranio che rimane nell'immagine. L'inclusione del cranio nella registrazione può distorcere i risultati e produrre un rendering del volume 3D registrato in modo errato della segmentazione. Il rendering finale del volume 3D può quindi essere visualizzato utilizzando ITK-SNAP33 (Figura 2H). Questo metodo viene utilizzato per valutare le differenze di volume lordo del cervello tra i gruppi di campioni. La base cellulare alla base delle differenze di volume scoperte con la risonanza magnetica può essere perseguita utilizzando il conteggio delle cellule con la pulizia dei tessuti, la microscopia a foglio luminoso e NuMorph.

L'obiettivo della pulizia e dell'analisi dei tessuti è valutare i contributi dei diversi tipi di cellule alle differenze tra le condizioni sperimentali (ad esempio, genotipo, esposizione ambientale) contando i singoli nuclei utilizzando NuMorph. La pulizia dei tessuti utilizzando il protocollo iDISCO+ e marcatori di nuclei specifici dello strato neuronale ha portato a gruppi cellulari chiaramente definiti di neuroni dello strato superiore e inferiore nell'isocorteccia (Figura 3).

Il conteggio delle celle utilizzando NuMorph dipende dal successo delle fasi di pre-elaborazione che coinvolgono la regolazione dell'intensità, l'allineamento dei canali e lo stitching (Figura 4A). Gli errori che si verificano in uno di questi passaggi possono causare cuciture improprie (Figura 4B,C). Ad esempio, l'acquisizione impropria delle immagini può causare immagini con modelli a fuoco e fuori fuoco durante la pre-elaborazione (Figura 4C). Per contare i nuclei di specifiche regioni del cervello, le immagini cucite vengono annotate utilizzando un atlante disponibile pubblicamente. Abbiamo registrato le nostre immagini cucite in una versione corretta del P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. Qui, le immagini cucite sono state sottoposte a downsampling da una risoluzione elevata (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) a una risoluzione inferiore (risoluzione isotropa 25 μm³/voxel) per corrispondere alla risoluzione dell'atlante. La corrispondenza della risoluzione dell'atlante garantisce la corretta registrazione delle immagini nell'atlante e fornisce annotazioni regionali nelle immagini acquisite (Figura 5A).

Per eseguire un conteggio specifico del tipo di cellula, abbiamo etichettato i neuroni dello strato superiore che esprimono Brn2, i neuroni dello strato inferiore che esprimono Ctip2 e tutti i nuclei con TO-PRO-3 (Figura 3B). L'imaging viene eseguito con una risoluzione spaziale sufficiente a separare i singoli nuclei (0,75 x 0,75 x 4 μm3/voxel). I centroidi dei nuclei vengono rilevati con un modello 3D-Unet addestrato in NuMorph (Figura 5B,C). Abbiamo rilevato ~ 12 × 10 6 nuclei totali che erano To-Pro-3+ nell'isocorteccia, inclusi ~ 2,6 × 10 6 Brn2 + e 1,6 × 106 nuclei Ctip2 +. Abbiamo anche rilevato ~ 3,7 × 10 6 e 2,9 × 106 To-Pro-3+ nuclei totali rispettivamente nei gangli della base e nell'allocorteccia ippocampale. Circa 1,5 × 10 6 e <1 × 106 cellule Ctip2+ sono state contate rispettivamente nei gangli della base e nell'allocorteccia ippocampale, sebbene sia stato rilevato un numero trascurabile di cellule Brn2+ (Figura 5D). I conteggi totali dei nuclei nell'isocorteccia e nell'allocorteccia ippocampale combinati (~ 15 milioni di cellule) sono simili ai conteggi totali delle cellule precedentemente riportati nella corteccia cerebrale del topo15. Questi risultati dimostrano l'utilità dell'imaging MRI, della metodologia di pulizia dei tessuti iDISCO + e dell'analisi computazionale NuMorph per rivelare conteggi volumetrici, totali delle cellule e conteggi specifici del tipo di cellula alla base delle differenze nella struttura del cervello del topo tra i gruppi sperimentali.

Figure 1
Figura 1: Panoramica dell'analisi unicellulare dell'intero cervello di cervelli di topo eliminati da tessuto 3D neonatale intatto. (A) Panoramica della pulizia dei tessuti iDISCO+, dell'imaging del foglio luminoso e dell'analisi delle immagini 3D. (B) Immagini che mostrano il corretto montaggio del campione sul microscopio a foglio ottico. (C) Cartone animato che mostra il montaggio del campione rispetto al percorso del foglio luminoso. Abbreviazione: ab = anticorpo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Misurazioni della struttura cerebrale grossolana con la risonanza magnetica. (A) Immagine che mostra la preparazione del campione per la risonanza magnetica. (B) Immagini di cervelli rappresentativi di P4 prima e dopo la pulizia tissutale di iDISCO+. Barra della scala = 5,0 cm. (C) Immagine MR grezza con cranio attaccato a 60 x 60 x 60 μm³. Barra della scala = 800 μm. (D) Immagine del foglio luminoso del cervello del topo a 25 x 25 x 25 μm³. Volume totale = 68,7 mm3. Si noti che una piccola sezione dell'isocorteccia dorsale è stata involontariamente rimossa durante la dissezione contrassegnata da punta di freccia (bianca). Barra di scala = 800 μm. (E) Immagine MR del cervello del topo dopo lo spogliamento del cranio e la registrazione rigida. Volume totale = 171,9 mm3. L'inserto (giallo) mostra il contorno del cervello dall'immagine del foglio di luce. Barra di scala = 800 μm. (F) Immagine MR registrata in riferimento all'immagine del foglio luminoso per valutare la deformazione. Barra di scala = 800 μm. (G) Mappatura del cervello voxel-wise per valutare le variazioni di volume tra l'immagine del foglio di luce e l'immagine MR dove il blu e il rosso indicano rispettivamente il restringimento e l'espansione dall'immagine MR all'immagine del foglio di luce. Nel complesso c'è stata una perdita di volume del 60%, ma alcune regioni come l'isocorteccia hanno mostrato un maggiore restringimento rispetto ad altre. (H) Pannello di sinistra: vista assiale dell'immagine MRI con segmentazioni registrate dall'Allen Developmental Brain Atlas sovrapposto. Pannello di destra: rendering del volume 3D della segmentazione. Barra della scala = 800 μm. Abbreviazioni: OB = bulbo olfattivo; Dpall = pallio dorsale/isocorteccia; Mb = mesencefalo; Cb = cervelletto. Orientamento: R = Rostral; L = laterale; D = dorsale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini con risoluzione cellulare e allineamento dei canali. (A) Sezione assiale ottica della colorazione nucleare TO-PRO-3 (TP3) e immunomarcatura per marcatori Ctip2 (neurone dello strato inferiore) e Brn2 (neurone dello strato superiore) nel cervello del topo P4. Barra di scala = 1 mm. (B) Inserimento allargato delle aree corticali in A (riquadro) che mostra il corretto allineamento del canale con la localizzazione prevista dei neuroni dello strato superiore marcati con Brn2 e Ctip2-immunomarcati dello strato inferiore. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Esempi di cucitura di immagini . (A) Risultati di esempio da un'immagine iterativa 2D cucita correttamente. Barra di scala = 1 mm. Inserisci mostra un esempio di cucitura corretta ingrandita. Barra della scala = 500 μm. (B) Risultati di esempio da un'immagine iterativa 2D cucita in modo errato. Barra di scala = 1 mm. Inserisci mostra un esempio di cucitura errata ingrandita (sporgenza). Barra della scala = 100 μm. (C) Risultati di esempio da un'immagine iterativa 2D cucita in modo errato. Barra di scala = 1 mm. Inserisci mostra un esempio di cucitura errata ingrandita (sfocata). Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Registrazione di immagini a bassa risoluzione, rilevamento di nuclei ad alta risoluzione e conteggio delle cellule nel cervello del topo P4. (A) Pannello di sinistra: un esempio di una z-slice da immagini 3D dell'intero foglio di luce cerebrale ricampionate a una risoluzione isotropa di 25 μm. Barra di scala = 1 mm. Pannello centrale: annotazioni dall'Allen Developmental Brain Atlas (P4) registrate nell'immagine al microscopio. Barra di scala = 1 mm. Pannello destro: sovrapposizione dei pannelli sinistro e centrale. Barra della scala = 1 mm. (B) Esempio di immagine cucita con regolazione dell'intensità nella vista assiale. L'area ricasella è mostrata in (C). Barra della scala = 1 mm. (C) Rilevamento automatico dei nuclei (rosso). Barra di scala = 50 μm. (D) Quantificazione dei tipi di cellule in diverse regioni cerebrali del cervello P4 (gangli della base, allocorteccia ippocampale e isocorteccia). Rosso = neuroni dello strato superiore marcati con Brn2, verde = neuroni dello strato inferiore etichettati con Ctip2 e blu = tutti i nuclei marcati con colorante To-Pro-3. Abbreviazioni: DPall = Pallio dorsale (isocorteccia); MPall = Pallio mediale (allocorteccia ippocampale); CSPall = Subpallio centrale (gangli della base classici). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Fase di analisi NuMorph Tempo stimato
Regolazione dell'intensità 1 h
Allineamento dei canali 2 minuti
Cuciture iterative 2D 12 ore
Ricampionamento 3 minuti
Registrazione 3 minuti
Conteggio delle celle 5 ore
Classificazione delle celle 10 minuti

Tabella 1: tempi di analisi NuMorph.

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Discussion

I metodi di pulizia dei tessuti sono tecniche utili per misurare l'organizzazione cellulare 3D del cervello. Ci sono una miriade di metodi di pulizia dei tessuti descritti in letteratura, ognuno con i suoi vantaggi e limiti 6,7,8,9. Le opzioni per gli strumenti computazionali per analizzare i tipi di cellule nelle immagini tessutali sono relativamente limitate. Altri strumenti disponibili sono stati implementati per popolazioni cellulari sparse in cui la segmentazione è meno difficile 10,35 o hanno sfruttato l'espansione tissutale16. Questo articolo descrive la preparazione di un cervello di topo per l'imaging con iDISCO + tissue clearing e dimostra NuMorph, una pipeline computazionale per l'elaborazione e la quantificazione dei nuclei all'interno delle strutture di una corteccia di topo catturata da LSFM. È progettato per trovare un equilibrio appropriato tra la durata del tempo di imaging, l'accuratezza del rilevamento dei nuclei cellulari e le risorse computazionali. Questa pipeline contrasta con altri strumenti attualmente disponibili segmentando in modo affidabile tutti i nuclei, piuttosto che popolazioni sparse di cellule etichettate 10,36,37. Abbiamo precedentemente dimostrato che l'accuratezza del rilevamento delle cellule è elevata, con tempi di imaging significativamente più brevi e dimensioni dei dati acquisiti molto ridotte per l'acquisizione dell'intero emisfero rispetto ad altri metodi19. NuMorph affronta una serie di sfide importanti per l'analisi delle immagini multicanale, come fornire strumenti per l'allineamento dei canali, correggere i movimenti del palcoscenico con uno strumento di cucitura e correggere la luminosità del segnale nei riquadri dell'immagine. Il flusso di lavoro presentato in questo documento è utile per la più ampia comunità scientifica e accessibile a tutti i gruppi negli istituti di ricerca. Una panoramica del processo può essere vista nella Figura 1.

Ci sono diversi passaggi critici durante questo processo, dalla perfusione del mouse all'analisi computazionale che possono influenzare la qualità a valle delle immagini, la quantificazione e i risultati. È essenziale che la perfusione venga eseguita in modo tale che tutto il sangue venga rimosso dal cervello, poiché i vasi sanguigni hanno un'autofluorescenza naturale che influenzerà l'intensità nelle immagini e richiederà aggiustamenti nella pipeline, influenzando negativamente i risultati. Anche la durata della fissazione del PFA è cruciale, poiché lasciare il cervello immerso nel 4% di PFA per più di 24 ore può causare un "overfixing" del campione e portare al cracking del cervello, che diventa fragile durante il processo iDISCO +. Il protocollo iDISCO sopra descritto è stato leggermente modificato dal protocollo ufficiale trovato sul sito web24. Una modifica importante è l'aggiunta di PBS alla serie metanolo/PBS, al posto dell'acqua nel protocollo originale. Questo per prevenire il cracking corticale nel cervello embrionale e postnatale precoce, che probabilmente si verifica a causa dello sviluppo incompleto delle cellule gliali, delle proiezioni assonali e della matrice extracellulare. A seconda del tessuto utilizzato in questo protocollo, potrebbe essere necessario apportare modifiche in ogni fase del protocollo iDISCO+, come l'alterazione delle concentrazioni di anticorpi e l'aumento dei tempi di incubazione di campioni di tessuto più grandi, per ottimizzare i parametri ideali per catturare il marcatore di scelta e analizzarlo accuratamente.

È noto che il restringimento tissutale si verifica durante il processo di eliminazione dei tessuti iDISCO+, che può quindi alterare le misurazioni volumetriche a valle 6,10. Metodi alternativi, come la risonanza magnetica condotta prima della pulizia dei tessuti, possono essere utilizzati per determinare l'entità di qualsiasi cambiamento nelle dimensioni del tessuto nei controlli rispetto agli animali da esperimento per determinare se eventuali differenze volumetriche sono dovute al fenotipo studiato e non al processo di pulizia del tessuto. Cambiamenti eterogenei nei volumi delle regioni corticali dei mutanti possono differire a seconda del contenuto cellulare regionale, poiché la materia grigia e bianca del cervello può essere influenzata in modo differenziale dalle disidratazioni del metanolo. I dati della risonanza magnetica possono essere utilizzati per determinare se il restringimento tissutale non è uniforme in tutte le sottoregioni del cervello (Figura 2G) e qualsiasi cambiamento sostenuto dal protocollo di compensazione può essere regolato nell'analisi computazionale a valle. Inoltre, il processo iDISCO+ utilizza lavaggi aggressivi a metanolo per disidratare il campione, il che può causare danni o alterazioni in alcuni antigeni sulle superfici dei nuclei. Si raccomanda che tutti gli anticorpi utilizzati vengano prima testati su sezioni di tessuto cerebrale che sono state lavate per ~ 3 ore in metanolo al 100% per garantire che l'anticorpo sia compatibile con il protocollo iDISCO +.

Per set di dati di grandi dimensioni che richiedono lunghi tempi di elaborazione, consigliamo di utilizzare la versione no-window di MATLAB in Linux che consente strategie come l'implementazione del comando "nohup", che continuerà a eseguire un processo anche dopo la perdita della connessione a un server. Inoltre, NuMorph richiede un'elevata potenza di calcolo, quindi consigliamo almeno una memoria da 10 GB per le analisi. Analizziamo i campioni utilizzando una workstation Linux con CentOS 7, dotata di un processore 14-core da 2,6 GHz, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM di memoria, 4 x 11 GB GPU e 2 x 4TB SSD esterni. I dati grezzi del foglio di luce utilizzati qui erano 620 GB e il requisito di memoria per i processi era di 10 GB. Qui, abbiamo incluso una tabella con i tempi stimati per completare ogni fase delle analisi NuMorph come mostrato nella Tabella 1.

Le fasi di pre-elaborazione dell'immagine comportano la regolazione dell'intensità nella dimensione xy per ogni piano z, l'allineamento dei canali e la cucitura. L'intensità dell'immagine viene regolata per tenere conto delle differenze di intensità tra le piastrelle e dell'illuminazione non uniforme lungo la dimensione y. La differenza di intensità si verifica a causa delle proprietà tecniche intrinseche del foglio luminoso come immagini tra le piastrelle25. Successivamente, viene eseguito l'allineamento dei canali per garantire che i canali dell'immagine si allineino correttamente in un'immagine multicanale. Questo passaggio è consigliato poiché ogni canale nell'imaging multicanale viene acquisito individualmente e movimenti sottili dello stadio possono causare derive del campione e causare disallineamento spaziale19. Infine, le tessere per piano z vengono quindi cucite insieme per formare una singola immagine in ogni piano z. Alla fine, ci sarà una pila di immagini cucite per canale che rappresentano l'intero volume del campione. Lo stitching iterativo delle immagini si basa su un metodo personalizzato per organizzare tutte le immagini 2D per canale in un volume 3D del campione19. Il metodo implementa innanzitutto una corrispondenza z a coppie nella direzione assiale per abbinare le regioni delle piastrelle che si sovrappongono sia in direzione orizzontale che verticale. Lo spostamento z finale di ogni piastrella viene determinato utilizzando l'albero di copertura minimo38. La cucitura iterativa 2D viene eseguita in una pila a partire da una posizione al centro della pila con meno segnale di fondo. Il riquadro in alto a sinistra viene posizionato per primo per ogni iterazione di cucitura per evitare uno spostamento sottile delle immagini nella dimensione z.

È consigliabile eseguire ogni pipeline di pre-elaborazione in sequenza, soprattutto durante l'ottimizzazione per correggere gli errori. I problemi maggiori si verificano spesso durante le fasi di cucitura. Un problema che può sorgere è l'errata acquisizione dell'immagine sul foglio luminoso. Questo problema può verificarsi quando la messa a fuoco dinamica orizzontale è impostata in modo errato sul foglio luminoso e può causare l'alternanza di modelli in fase / fuori fase nelle immagini (Figura 4B, C). Ulteriori errori possono verificarsi se il campione non è stato fissato saldamente e si è verificato un movimento significativo del campione durante l'acquisizione. In questi casi, una cucitura accurata potrebbe non essere possibile a causa della mancanza di corrispondenza a coppie tra piastrelle adiacenti. Altri potenziali errori possono derivare dal sito di avvio del punto. NuMorph determina il sito iniziale del punto approssimativamente al centro della pila. Tuttavia, quando è presente uno sfondo significativo nel sito della sezione iniziale, possono verificarsi errori nel confronto a coppie nei riquadri immagine. Si consiglia qui di scegliere un sito di partenza che abbia un elevato rapporto segnale-rumore.

L'analisi delle immagini qui descritta include il ricampionamento delle immagini cucite da alta risoluzione (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) a una risoluzione isotropa inferiore di 25 μm³/voxel. Ricampioniamo le immagini cucite dal canale nucleare per registrare le immagini cucite nell'Atlante del cervello del topo dello sviluppo di Allen nel prossimo passo34. Le celle vengono quindi contate per ciascun canale in regioni annotate delle immagini in riferimento all'atlante ad alta risoluzione (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) utilizzando un modello 3D-Unet addestrato19. Questo metodo può essere utilizzato anche per rilevare e contare oggetti BLOB. Durante lo sviluppo di NuMorph, abbiamo testato l'accuratezza della segmentazione relativa a immagini completamente nuove mai viste durante l'addestramento che provenivano dalla stessa procedura di pulizia dei tessuti, dallo stesso microscopio e dalla stessa precisione di rilevamento dell'etichetta nucleare di 0,99 e richiamo di 0,9419. L'accuratezza di NuMorph non è stata ancora testata su diverse procedure di pulizia dei tessuti, microscopi o marcatori; Quindi, l'accuratezza della segmentazione in altri progetti sperimentali è sconosciuta. L'atlante predefinito in NM_setup.m è l'Atlante di riferimento Allen39 con colorazione Nissl adulto con la terza iterazione di Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3) come annotazione personalizzata.

Sebbene NuMorph analizzi efficacemente i tessuti, che sono relativamente densi, come la corteccia del topo adulto, progetti sperimentali più impegnativi (come il cervello embrionale di topo o strutture altamente dense come il cervelletto) possono richiedere lo sviluppo di ulteriori strumenti computazionali. Gli attuali sforzi basati sulla comunità stanno tentando di produrre dati di annotazione adeguati per l'addestramento dei modelli di deep learning utilizzati per segmentare questi casi più difficili40. I progressi nelle tecnologie di imaging a foglio luminoso consentono un'indagine quantitativa ad alto rendimento delle strutture subcellulari, con nuovi approcci come la microscopia a illuminazione piana selettiva invertita a doppia vista (diSPIM) che porta a una maggiore risoluzione e precisione nelle regioni cerebrali densamente cellulari40,41. Man mano che i progressi nella pulizia dei tessuti, nell'imaging e negli strumenti computazionali coinvolti in questa ricerca si evolvono, speriamo che porteranno a un uso più ampio dei metodi di pulizia dei tessuti per analisi quantitative su come i disturbi neuropsichiatrici possono derivare da alterazioni nella struttura del cervello indotte da fattori di rischio genetici o ambientali.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 a JLS e R01NS110791 a GW) e dalla Foundation of Hope. Ringraziamo Pablo Ariel del Laboratorio Servizi di Microscopia per l'assistenza nell'imaging dei campioni. Il Laboratorio di Servizi di Microscopia presso il Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio è supportato in parte dal Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 al Lineberger Comprehensive Cancer Center dell'Università della Carolina del Nord (UNC). Il nucleo di microscopia neuroscientifica è supportato dalla sovvenzione P30 NS045892. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata in parte dal North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

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Neuroscienze Numero 186
Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso
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