Summary
La biopsia líquida ha revolucionado nuestro enfoque de los estudios traslacionales oncológicos, siendo la recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento pasos cruciales para su aplicación clínica exitosa. Aquí describimos un protocolo estandarizado y validado para aplicaciones de ADN libre de circulación aguas abajo que se puede aplicar en la mayoría de los laboratorios de investigación traslacional.
Abstract
El término biopsia líquida (LB) se refiere a moléculas como proteínas, ADN, ARN, células o vesículas extracelulares en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario y / o metastásico. LB se ha convertido en un pilar en la investigación traslacional y ha comenzado a formar parte de la práctica de oncología clínica, proporcionando una alternativa mínimamente invasiva a la biopsia sólida. El LB permite el monitoreo en tiempo real de un tumor a través de una extracción de muestra mínimamente invasiva, como la sangre. Las aplicaciones incluyen la detección temprana del cáncer, el seguimiento del paciente para la detección de la progresión de la enfermedad, la evaluación de la enfermedad residual mínima y la identificación potencial de la progresión molecular y el mecanismo de resistencia. Para lograr un análisis confiable de estas muestras que se puede informar en la clínica, los procedimientos preanalíticos deben considerarse cuidadosamente y seguirse estrictamente. La recolección de muestras, la calidad y el almacenamiento son pasos cruciales que determinan su utilidad en aplicaciones posteriores. Aquí, presentamos protocolos estandarizados de nuestro módulo de trabajo de biopsia líquida para recolectar, procesar y almacenar muestras de plasma y suero para el análisis de biopsia líquida aguas abajo basado en ADN libre de circulación. Los protocolos presentados aquí requieren equipos estándar y son lo suficientemente flexibles para ser aplicados en la mayoría de los laboratorios centrados en procedimientos biológicos.
Introduction
El término "biopsia líquida" se definió en 20101 como la presencia de moléculas (por ejemplo, proteína, ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN)), células o vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas) en la sangre y otros fluidos corporales que se originan en el tumor primario. El uso de muestras de biopsia líquida ha revolucionado la investigación oncológica traslacional, ya que las biopsias de tejido, limitadas a una región particular en un momento determinado, pueden perder clones relevantes debido a la heterogeneidad tumoral. Además, la biopsia líquida juega un papel relevante en los tipos de tumores donde el tejido primario es escaso o no accesible, ya que puede evitar una biopsia invasiva, reduciendo los costos y el riesgo para los pacientes. Además, las características moleculares del tumor están en constante evolución debido principalmente a la presión de la terapia, y las muestras de biopsia líquida pueden capturar la dinámica clonal del tumor, ya que se pueden tomar longitudinalmente, en diferentes momentos clínicos y terapéuticos de la enfermedad, como la línea de base, en el tratamiento, la mejor respuesta y en la progresión de la enfermedad o incluso antes. El concepto de "biopsia líquida en tiempo real" significa que los cambios dinámicos en el tumor se pueden monitorear en tiempo real, lo que permite la medicina de precisión en esta enfermedad. La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en la clínica, incluyendo el cribado y la detección precoz del cáncer, la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la detección de la enfermedad residual mínima, el estudio de los mecanismos de resistencia al tratamiento y la estratificación de los pacientes a nivel terapéutico1. La detección precoz de la recurrencia y progresión de la enfermedad es una necesidad clínica insatisfecha en muchos tipos de tumores y es un factor clave para aumentar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cáncer. Las modalidades de diagnóstico por imágenes de rutina y los marcadores tumorales solubles pueden carecer de la sensibilidad y/o especificidad requerida para esta tarea. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos marcadores predictivos en la clínica, como los basados en ácidos nucleicos libres circulantes.
Los tipos de muestras que se utilizan para los estudios de biopsia líquida incluyen, entre otros, muestras de sangre, orina, saliva y heces. Otras muestras específicas del tumor pueden ser aspirados celulares, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido de quistes y ascitis, esputo y jugo pancreático2. Los primeros líquidos pueden contener diferentes tipos de materiales derivados del cáncer, células tumorales circulantes (CTC) o fragmentos como exosomas y ADN tumoral circulante libre de células (ctDNA). Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en vesículas extracelulares (EV) o liberarse en los fluidos corporales debido a la muerte y el daño celular. El ADN libre circulante (cfDNA) se libera principalmente en el torrente sanguíneo desde células apoptóticas o necróticas y está presente en todos los individuos, mostrando niveles aumentados en enfermedades inflamatorias u oncológicas3. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contienen ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Estas vesículas forman parte de la red de comunicación intercelular y se encuentran comúnmente en muchos tipos de fluidos corporales2. Los ácidos nucleicos encerrados dentro de los EV están protegidos del ambiente hostil dentro de los fluidos corporales, proporcionando así una forma más robusta de estudiar estas moléculas en el entorno de biopsia líquida.
En general, los niveles de ácidos nucleicos circulantes en las muestras de biopsia líquida son muy bajos y, por lo tanto, se necesitan métodos sensibles para la detección, como la PCR digital o la secuenciación de próxima generación (NGS). El manejo preanalítico de la muestra es crucial para prevenir la lisis de las células sanguíneas y la liberación de ADN intacto, causando la contaminación del cfDNA con el ADN genómico. Además, se debe tener cuidado al extraer muestras para evitar la presencia de inhibidores de los métodos de análisis basados en enzimas.
Aquí presentamos un método estandarizado para la recolección y almacenamiento de muestras de plasma y suero, que es un primer paso crucial para las aplicaciones posteriores basadas en biopsia líquida, incluidos los análisis de ácidos nucleicos circulantes.
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Protocol
Se obtuvo la aprobación ética previa de los centros participantes antes de la extracción de muestras de sangre. Los siguientes protocolos para el aislamiento de suero y plasma se realizaron de acuerdo con los principios éticos para la investigación biomédica.
NOTA: Aquí se proporcionan consideraciones previas antes de comenzar el protocolo. Se requiere la aprobación ética previa para el uso de muestras humanas en investigación biomédica, con el correspondiente consentimiento informado. Se requiere un gabinete de bioseguridad de clase II para manejar muestras de sangre. Se debe usar una bata de laboratorio, guantes protectores y anteojos durante todo el procedimiento para evitar la infección por patógenos transmitidos por la sangre. Se requiere un mínimo de 30 minutos para el procesamiento de muestras de suero. Después de la extracción de sangre en tubos sin anticoagulante, mantener a temperatura ambiente (RT) durante 30-45 min para permitir la formación de coágulos. Se requiere un mínimo de 40 minutos para la preparación del plasma, y las muestras deben procesarse dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción cuando se utilizan tubos de ácido tetraacético de etilendiamina (EDTA) o dentro de las 24-48 h si se utilizan tubos de recolección estabilizadores celulares o tubos específicos de recolección de ADN libre de células. Sin embargo, según algunos fabricantes, las muestras son estables hasta por 2 semanas en estos tubos especializados. Es importante verificar si hay hemólisis, lo que le dará al plasma o a la fracción sérica una apariencia rojiza. Consulte la sección de solución de problemas para ver los ejemplos hemolizados en la discusión.
1. Preparación de suero para estudios de biopsia líquida
NOTA: El tiempo total necesario para realizar este paso es de 30 min (Figura 1).
- Extraiga 4-10 ml de sangre en tubos que no contengan anticoagulante (tapa roja o roja / gris-negra) y manténgala en RT durante 30-45 min. Procese estas muestras dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción.
- Registre la hora y la fecha de la extracción de la muestra y la identificación del sujeto (ID) en una base de datos de muestras diseñada adecuadamente.
- Usando una bata de laboratorio, guantes protectores y gafas, centrifugue el tubo que contiene sangre fresca a RT (15 °C-25 °C) durante 10 min a 1.600 (± 150) x g, con la rotura máxima aplicada.
- Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga; la fase superior del sobrenadante sérico aparecerá clara y amarillenta (Figura 2). Compruebe si la muestra muestra muestra signos de hemólisis (Figura 3) y registre la presencia de hemólisis cuando sea apropiado.
- En un gabinete de bioseguridad de clase II, transfiera el suero a los tubos de recolección como alícuotas de 250 μL.
NOTA: El volumen de las alícuotas debe ajustarse a los requisitos del estudio. - Congele inmediatamente el suero en posición vertical en una caja de almacenamiento a -80 °C y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra.
- Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de 4 horas.
2. Preparación plasmática para estudios de biopsia líquida
NOTA: El tiempo total necesario para realizar este paso es de 40 min (Figura 4).
- Extraiga 4-10 ml de sangre en tubos que contengan ácido etilendiamina tetraacético (EDTA). Procese las muestras dentro de 4 h desde el momento de la extracción.
- Registre la hora y la fecha de la extracción de la muestra y el ID del sujeto en una base de datos de muestras diseñada adecuadamente.
- Usando una bata de laboratorio, guantes protectores y gafas, centrifugue el tubo EDTA a RT (15 °C-25 °C) durante 10 min a 1.600 (± 150) x g, con la rotura máxima aplicada.
NOTA: Consulte las instrucciones del fabricante cuando utilice otros tubos de recogida. - Después de la centrifugación, el sobrenadante de plasma aparecerá claro y amarillento. Compruebe si la muestra muestra muestra signos de hemólisis (Figura 3) y transfiera el plasma (sobrenadante) a un tubo de centrífuga de 15 ml sin perturbar la capa celular utilizando una pipeta serológica desechable (o pipetas de bombilla desechable o pipetas p1000 con punta de filtro). Deje un pequeño volumen residual de plasma por encima de la capa celular (aproximadamente 5 mm).
- Si se observa hemólisis, deseche la muestra para análisis adicionales. (Figura 5). Consulte la sección de solución de problemas en la Discusión para evaluar la hemólisis.
- Centrifugar el plasma en un tubo centrífugo de 15 ml a RT (15 °C-25 °C) durante 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Realice este paso para eliminar cualquier célula sanguínea intacta residual arrastrada desde el primer paso de centrifugación.
- Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga y transfiera 1-4 ml de plasma a viales criogénicos de polipropileno de 1-4 ml utilizando una pipeta serológica desechable (o pipeta de bombilla desechable o pipetas p1000 con punta de filtro). Se debe dejar un volumen residual de plasma (aproximadamente 0,3 ml o 7 mm de altura) en la parte inferior del tubo para evitar contaminar el plasma con células sanguíneas (Figura 5).
- Congele inmediatamente el plasma en posición vertical en la caja de almacenamiento a -80 °C y registre el tiempo de almacenamiento de la muestra. Verifique que las muestras se procesaron dentro del plazo requerido de 4 horas.
- Recoge la capa celular (capa buffy) usando un P1000 y una punta filtrada y transfiérela a un tubo de 2 ml. Congelar y conservar inmediatamente a -80 °C.
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Representative Results
Después de la centrifugación de los tubos sanguíneos sin anticoagulante, la fase superior aparece de un amarillo pálido y corresponde a la fracción sérica (Figura 2). Esta fracción se retira cuidadosamente y se alicita para su posterior análisis.
La hemólisis puede estar presente en la fracción plasmática o sérica, y la fase superior tendrá un aspecto rojizo, lo que indica la presencia y el grado de hemólisis (Figura 3).
Después de la centrifugación de los tubos de EDTA, varias fases o capas serán evidentes; la fase superior (amarillo pálido) es la fracción plasmática, que representa el 55% del volumen total de sangre; la interfaz delgada de color blanco grisáceo es la capa de pelaje buffy que contiene glóbulos blancos y plaquetas, y representa el <1% del volumen total de sangre; la fase inferior (color rojo) contiene glóbulos rojos, que representan el 45% del volumen total de sangre). Aspire 1 cm por encima de la capa leucocitaria y asegúrese de que la capa celular no se altere para reducir la contaminación del plasma con células sanguíneas (Figura 5). Esta fracción debe ser cuidadosamente removida y alicitada para su posterior análisis.
La concentración e integridad del cfDNA extraído de muestras de plasma debe evaluarse mediante métodos basados en electroforesis. cfDNA se extrajo utilizando un kit basado en columnas disponible comercialmente. La cuantificación se realizó utilizando un kit disponible comercialmente a base de gel específico para aplicaciones de cfDNA (Tabla de Materiales). La Figura 6A muestra un ejemplo de una extracción de cfDNA de alta calidad que se puede utilizar para aplicaciones posteriores. Considerando que, la Figura 6B muestra un ejemplo de una muestra inadecuada con un alto nivel de contaminación genómica.
Figura 1: Preparación de suero para estudios de biopsia líquida. Se muestra un esquema del proceso de preparación del suero, desde la centrifugación de la muestra hasta el almacenamiento de alícuotas. Paso 1: Muestra de sangre en un tubo sin anticoagulante para el aislamiento del suero. Paso 2: Centrifugar el tubo de sangre para obtener suero dentro de las 4 h posteriores a la extracción. Paso 3: Retire la fase superior del sobrenadante sérico para su posterior almacenamiento. Paso 4: Congele el tubo de suero en posición vertical a -80 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Muestras de sangre recogidas en tubos sin anticoagulante después de la centrifugación. La fase superior corresponde a la fracción sérica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un ejemplo de una muestra hemolizada después de la centrifugación. La fase superior correspondiente a la fracción plasma/suero aparece roja debido a la hemólisis. Idealmente, estas muestras deben descartarse, o al menos se debe registrar la presencia de hemólisis en la muestra, ya que esto puede afectar algunas aplicaciones posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Preparación plasmática para estudios de biopsia líquida. Se muestra un esquema del proceso de preparación del suero, desde la centrifugación de la muestra hasta el almacenamiento de alícuotas y la recolección de capas buffy. Paso 1: Muestra de sangre en un tubo que contiene ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) para el aislamiento del plasma. Paso 2: Centrifugar el tubo de sangre para obtener plasma dentro de las 4 h posteriores a la extracción. Paso 3: Transfiera el sobrenadante de plasma a un tubo centrífugo de 15 ml sin perturbar la capa celular. Paso 4: Centrifugar el plasma para eliminar las células sanguíneas arrastradas desde el primer paso de centrifugación. Paso 5: Transfiera el plasma a viales criogénicos y congele el tubo de plasma en posición vertical a -80 °C. Paso 6: Recoja la capa celular (capa buffy) y guárdela a -80 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Muestras de sangre de EDTA después de la centrifugación. Tres capas visibles son visibles después de la centrifugación de los tubos que contienen sangre fresca. La fase superior corresponde a la fracción plasmática, la interfaz delgada de color blanco grisáceo corresponde a la capa buffy y contiene glóbulos blancos y plaquetas, y la fase inferior contiene glóbulos rojos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis basado en electroforesis de cfDNA aislado de plasma. (A) Un ejemplo de un experimento óptimo. (B) Un ejemplo de un experimento subóptimo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La biopsia líquida tiene numerosas aplicaciones potenciales en diferentes momentos durante el tratamiento del cáncer. Primero, en el momento del diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorales que sugieran la presencia de una posible lesión tumoral que podría investigarse más a fondo clínicamente. En segundo lugar, durante el tratamiento para la monitorización en tiempo real de la enfermedad, la evaluación de la respuesta molecular del tratamiento, la evolución clonal y la detección precoz de recaídas de la enfermedad o resistencia al tratamiento. Finalmente, después del tratamiento quirúrgico, como herramienta para la detección de enfermedad residual mínima. La Sociedad Europea de Oncología Médica (ESMO) ha publicado recientemente directrices para la implementación de pruebas de mutación ctDNA en el cáncer de pulmón metastásico de células no pequeñas (NSCLC) para identificar objetivos terapéuticos procesables. Estas guías incluyen las consideraciones metodológicas, la evaluación técnica y la validación del perfil de ctDNA, y la discusión de algunos desafíos como el mosaicismo somático, la baja frecuencia de alelos variantes (VAF) y la detección incidental de variantes patógenas de la línea germinal4. Las Guías de Práctica Clínica ESMO recientemente publicadas para el diagnóstico, estadificación y tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico indican un análisis basado en ctDNA en los casos en que hay un cambio en el enfoque del tratamiento o si es un requisito para ingresar a un ensayo clínico5.
Las muestras deben procesarse dentro de las 4 h posteriores al momento de la extracción. El procesamiento de muestras fuera de este período de tiempo puede conducir a la degradación de la muestra y dar lugar a un aumento de la hemólisis, lo que puede afectar la concentración de cfDNA y afectar las aplicaciones posteriores, como el perfil de miRNA. Se recomienda el uso de 2-4 ml de plasma para obtener suficiente sensibilidad para el análisis posterior. Las aplicaciones basadas en cfDNA contienen un conservante que estabiliza las células sanguíneas nucleadas y evita la liberación de ADN genómico contaminante (gDNA); El ADN es estable en estos tubos durante un máximo de 14 días a 6 °C a 37 °C después de la extracción de sangre. Sin embargo, las muestras deben procesarse dentro de las 24-48 h para evitar la contaminación con glóbulos blancos lisados.
Se deben utilizar alícuotas de un volumen adecuado para evitar la congelación-descongelación de las muestras de suero y plasma. El volumen y el número de alícuotas dependerán del uso posterior de las muestras y también de la capacidad de almacenamiento del congelador de -80 °C. Las alícuotas de 1 ml son útiles, ya que este es el volumen estándar utilizado para muchos protocolos de extracción de cfDNA y se pueden descongelar varias alícuotas si se requiere más volumen.
La hemólisis de una muestra se puede estimar midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm de la muestra hemolizada sospechosa en comparación con una muestra no hemolizada con una apariencia amarillenta clara. La hemólisis relativa de una muestra se calcula como la relación entre la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm de una muestra no hemolizada (con un aspecto amarillento claro) y de la muestra hemolizada (con un aspecto rojizo). Se aconseja a los lectores que consulten el artículo de TylerVan Buren et al, para obtener más información6.
La integridad de la muestra es crucial en todas las aplicaciones de biopsia líquida aguas abajo, y el tiempo desde la extracción de la muestra hasta el procesamiento y el tipo de tubo de recolección de muestras son dos factores críticos que deben considerarse, ya que influyen en la calidad y el rendimiento de los marcadores ctDNA. Como regla general, todas las muestras deben recogerse en un tubo específico de cfDNA o tubo de EDTA y procesarse dentro de las 48 h y 4 h posteriores a la extracción, respectivamente. Por lo tanto, es importante tener una buena coordinación con el personal y los servicios involucrados en la recolección de muestras. Idealmente, se debe establecer un circuito detallado de recolección de muestras que defina claramente las tareas de todas las personas implicadas, con instrucciones detalladas de manejo y transferencia de muestras. Se prefiere el plasma al suero para aplicaciones de cfDNA, ya que el suero tiende a contaminarse con ADN genómico debido a la lisis de glóbulos blancos durante el proceso de coagulación7. Por otro lado, el plasma generalmente contiene inhibidores de la PCR como heparina, hemoglobina, hormonas, inmunoglobulina G y lactoferrina8. Sin embargo, la dilución de la muestra puede ayudar a superar este problema, siempre que la muestra tenga una concentración suficiente de cfDNA. Un estudio reciente reporta un flujo de trabajo preanalítico para aplicaciones de biopsia líquida, comparando diferentes tubos estabilizadores y medidas de cuantificación y calidad de ácidos nucleicos aislados del plasma, demostrando la importancia de un protocolo de procesamiento estandarizado para el análisis reproducible aguas abajo9. Las pautas de análisis de cfDNA del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) recomiendan que los tubos de EDTA se procesen dentro de 2-4 h y aquellos con un conservante especial dentro de los 3 días10. Los biobancos pueden ser una instalación útil para los investigadores sin el equipo necesario para el procesamiento y almacenamiento de muestras. Idealmente, las muestras no deben congelarse y descongelarse más de una vez y no almacenarse durante más de 3 años antes de su uso; por lo tanto, debe prestarse especial atención al volumen de alícuotas para aplicaciones posteriores a fin de evitar ciclos de congelación-descongelación.
Otro paso crítico en el procesamiento de plasma es la centrifugación; el primero determina el aislamiento correcto del plasma de las células mononucleares, la fuente de contaminación por gDNA que puede diluir en gran medida la abundancia relativa de ctDNA. La segunda centrifugación llevada a cabo a velocidades más rápidas está destinada a eliminar aún más los glóbulos blancos lisados11. El uso del freno una vez finalizada la centrifugación no parece tener ningún efecto sobre la calidad de las muestras de plasma12. Otra consideración importante al procesar muestras de sangre es el tipo de rotor de centrífuga a utilizar, ya sea un rotor oscilante o fijo. Para procesar muestras de sangre, se recomienda un rotor oscilante. Este formato permite una mejor separación de los componentes sanguíneos en función de los gradientes de densidad, y la ubicación del pellet celular después de la centrifugación está en la parte inferior del tubo de la centrífuga, mientras que, con una centrífuga de rotor fijo, el pellet celular se forma a lo largo del lado del tubo. Los rotores fijos permiten utilizar más fuerza gravitacional y una más adecuada para separar proteínas y ácidos nucleicos, aunque suelen permitir procesar más muestras al mismo tiempo.
El rendimiento final de cfDNA es crítico para la sensibilidad de la aplicación aguas abajo. En consecuencia, con datos anteriores, se necesita un mínimo de 3,6 nanogramos (ng) de cfDNA para lograr una sensibilidad de <0,1% y 36 ng para obtener una sensibilidad de <0,01% para la detección de alelos mutantes13. Se debe tener en cuenta la calidad, pero también la cantidad de cfDNA, al decidir sobre un volumen de muestra para la recolección y extracción. Por ejemplo, estudios previos mostraron que la concentración media/mediana de cfDNA extraída de 1 ml de plasma es de 21 ng/ml en el cáncer de endometrio14, 14,3 (rango 7-204) ng/mL en el linfoma de Hodgkin15, 8,02 (± 7,81) ng/ml en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC)16 y 1,35 ng/ml en los casos de cáncer de páncreas17. El volumen plasmático requerido dependerá de la tecnología aguas abajo empleada, pero se recomienda el uso de 2-4 ml para alcanzar una sensibilidad suficiente.
La trazabilidad de la muestra es un aspecto importante que debe tenerse en cuenta al crear colecciones de muestras; todas las muestras y alícuotas deben estar correctamente y claramente etiquetadas, lo que permite su posterior identificación. Los biobancos también pueden ser utilizados ya que cuentan con un Sistema de Gestión de Calidad acreditado, que garantiza la calidad, seguridad y trazabilidad de los datos y muestras biológicas almacenadas, cumpliendo con la legislación y normativa local e internacional aplicable. Idealmente, los datos asociados con las muestras deberían almacenarse en una base de datos adecuada para este propósito, como Research Electronic Data Capture (REDCap), una aplicación basada en la web desarrollada por la Universidad de Vanderbilt para capturar datos para la investigación clínica y crear bases de datos y proyectos (https://www.project-redcap.org/). El uso de un servidor seguro con cifrado de datos también es muy recomendable.
Los desafíos relacionados con la implementación de la biopsia líquida en la clínica han sido revisados recientemente10, y un tema clave destacado fue la estandarización de condiciones preanalíticas como la recolección, procesamiento y almacenamiento de muestras, que impactan directamente la validación analítica y clínica, así como la reproducibilidad de los resultados. Los consorcios de biopsia líquida como CANCER-ID, la European Liquid Biopsy Society (ELBS) y el Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) tienen como objetivo estandarizar los pasos preanalíticos y definir las mejores prácticas para los estudios de biopsia líquida en el entorno clínico18,19.
La biopsia líquida es una herramienta muy flexible y útil con gran potencial en el contexto del diagnóstico, tratamiento y seguimiento del cáncer20. Un creciente cuerpo de evidencia muestra su vasta relevancia, y para su correcta implementación y uso la importancia de recolectar muestras de manera estandarizada es clave para obtener datos valiosos y comparables. Trabajar con protocolos estandarizados es crucial para evitar impedimentos técnicos en los análisis posteriores, lo que ha sido una limitación real en el pasado con el uso de muestras de archivo antiguas. Aquí, proporcionamos protocolos validados que pueden ayudar a garantizar procedimientos preanalíticos óptimos para estudios clínicos y de investigación de biopsia líquida basada en cfDNA.
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Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB recibió honorarios por papel de orador, consultoría o asesoramiento de Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer y BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL recibió honorarios por papel de ponente, consultoría o asesoramiento de Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline y Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT recibió honorarios por papel de orador, consultoría o asesoramiento de Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM y ESMO. Javier Hernández-Losa (JHL): recibió honorarios por ponente, consultoría o asesoría de Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly y Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) informa haber recibido becas de investigación relacionadas con este estudio de Novartis y becas de investigación no relacionadas con este estudio de AstraZeneca y Beigene. Los autores restantes no tienen revelaciones con respecto al manuscrito.
Acknowledgments
Queremos agradecer a la Red de Investigación Biomédica en Cáncer (CIBERONC) su apoyo y la siguiente subvención del proyecto: LB PLATAFORMA CIBERONC: Plataforma CIBERONC para la estandarización y promoción de la biopsia líquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
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