Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64136
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,4,5
1Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, 2Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, 4Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology, University of California San Diego, 5Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר סכמה כללית וקלה ליישום לאיסוף נתונים מוטים של חלקיק יחיד בניסויי cryo-EM. הליך כזה שימושי במיוחד לקבלת מפת EM באיכות גבוהה עבור דגימות הסובלות מהטיה אוריינטציה מועדפת עקב היצמדות לממשק אוויר-מים.

Abstract

ניתוח חלקיק יחיד (SPA) על ידי מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryo-EM) הוא כיום טכניקה מקובלת לביולוגיה מבנית ברזולוציה גבוהה. קביעת מבנה על ידי SPA מסתמכת על קבלת תצוגות שונות מרובות של עצם מקרומולקולרי המזוגג בתוך שכבה דקה של קרח. באופן אידיאלי, אוסף של כיווני הקרנה אקראיים המפוזרים באופן אחיד יסתכם בכל התצוגות האפשריות של האובייקט, ויולידו שחזורים המאופיינים ברזולוציה כיוונית איזוטרופית. עם זאת, במציאות, דגימות רבות סובלות מחלקיקים בעלי אוריינטציה מועדפת הנצמדים לממשק אוויר-מים. זה מוביל להתפלגויות אוריינטציה זוויתית לא אחידות במערך הנתונים ולדגימת מרחב פורייה לא הומוגנית בשחזור, המתורגמת למפות המאופיינות ברזולוציה אנאיזוטרופית. הטיית שלב הדגימה מספקת פתרון הניתן להכללה להתגברות על אנאיזוטרופיה ברזולוציה מכוח שיפור אחידות התפלגות הכיוון, ובכך האיזוטרופיה של דגימת מרחב פורייה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיית איסוף נתונים אוטומטית בשלב מוטה באמצעות Leginon, תוכנה לרכישת תמונות אוטומטית. ההליך פשוט ליישום, אינו דורש ציוד או תוכנה נוספים, ותואם לרוב מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטי (TEMs) המשמש להדמיית מקרומולקולות ביולוגיות.

Introduction

הופעתם של גלאי אלקטרונים ישירים במהלך העשור האחרון 1,2,3 דרבנה עלייה אקספוננציאלית במספר מבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות ומכלולים מקרומולקולריים שנפתרו באמצעות קריו-EM 4,5,6 של חלקיק יחיד. כמעט כל המינים המקרומולקולריים המטוהרים צפויים להיות מקובלים לקביעת מבנה באמצעות cryo-EM, למעט החלבונים הקטנים ביותר ~ 10 kDa בגודל או מתחת ל -7. כמות חומר המוצא הדרושה להכנת רשת ולקביעת מבנה היא לפחות בסדר גודל קטן יותר מטכניקות אחרות לקביעת מבנה, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן 4,5,6.

עם זאת, אתגר עיקרי לקביעת מבנה על ידי cryo-EM כרוך בהכנת רשת מתאימה להדמיה. מחקר מקיף שהעריך דגימות מגוונות באמצעות אסטרטגיות ויטריפיקציה ורשתות שונות הציע כי רוב הגישות לדגימות ויטריפיקציה ברשתות cryo-EM מובילות להיצמדות מועדפת של מקרומולקולות לממשק אוויר-מים8. היצמדות כזו עלולה לגרום לארבע תוצאות תת-אופטימליות: (1) הדגימה המקרומולקולרית מתפרקת לחלוטין, ובמקרה כזה לא ניתן לאסוף ולעבד נתונים מוצלחים; (2) הדגימה מנטרלת חלקית, ובמקרה כזה ניתן יהיה לקבל תובנות מבניות מאזורים במקרומולקולה שאינם פגומים; (3) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, אך רק קבוצה אחת של כיווני חלקיקים ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגת בתמונות; (4) הדגימה שומרת על מבנה מקורי, וחלק מכיווני החלקיקים האפשריים, אם כי לא כולם, ביחס לכיוון קרן האלקטרונים מיוצגים בתמונות. במקרים (3) ו-(4), איסוף נתונים מוטים יסייע במזעור אנאיזוטרופיה ברזולוציה כיוונית המשפיעה על מפת cryo-EM המשוחזרת ומספק פתרון הניתן להכללה למגוון רחב של דגימות9. מבחינה טכנית, הטיה יכולה להועיל גם במקרה (2), מכיוון שהדנטורציה מתרחשת ככל הנראה בממשק אוויר-מים ומגבילה באופן דומה את מספר הכיוונים השונים המיוצגים בתוך הנתונים. ניתן לשנות את מידת הטיית ההתמצאות במערך הנתונים באופן פוטנציאלי על ידי ניסויים בתוספי תמיסה, אך היעדר ישימות רחבה מעכב גישות אלה של ניסוי וטעייה. די בהטיית שלב הדגימה בזווית הטיה אופטימלית אחת כדי לשפר את התפלגות הכיוונים הודות לשינוי הגיאומטריה של ניסוי ההדמיה9 (איור 1). בשל התצורה הגיאומטרית של המדגם המכוון המועדף ביחס לקרן האלקטרונים, עבור כל צביר של כיוונים מועדפים, הטיית הרשת יוצרת חרוט של זוויות הארה ביחס לצביר. לפיכך, זה מפזר את התצוגות וכתוצאה מכך משפר את דגימת מרחב פורייה ואת האיזוטרופיה של רזולוציה כיוונית.

יש, בפועל, כמה נזקים להטיית הבמה. הטיית שלב הדגימה מציגה מעבר צבע מיקוד על פני שדה הראייה, שעשוי להשפיע על דיוק הערכות פונקציית העברת הניגודיות (CTF). איסוף נתונים מוטים עשוי גם להוביל לתנועת חלקיקים מוגברת הנגרמת על ידי אלומה הנגרמת על ידי השפעות טעינה מוגברות בעת הדמיה של דגימות מוטות. הטיית הרשת מובילה גם לעלייה בעובי הקרח הנראה לעין, מה שבתורו מוביל למיקרוגרפים רועשים יותר ועשוי בסופו של דבר להשפיע על הרזולוציה של שחזורים 5,9,10. ייתכן שניתן יהיה להתגבר על בעיות אלה על ידי יישום סכמות עיבוד נתונים חישוביות מתקדמות המתוארות בקצרה בסעיפי הפרוטוקול והדיון. לבסוף, הטיה יכולה להוביל לחפיפה מוגברת של חלקיקים, ולעכב את צינור עיבוד התמונה הבא. למרות שניתן למתן זאת במידה מסוימת על ידי אופטימיזציה של ריכוז החלקיקים ברשת, זהו בכל זאת שיקול חשוב. כאן, מתואר פרוטוקול פשוט ליישום לאיסוף נתונים מוטים באמצעות חבילת התוכנה Leginon (תוכנה אוטומטית לרכישת תמונות), זמין בגישה פתוחה ותואם למגוון רחב של מיקרוסקופים11,12,13,14. השיטה דורשת לפחות גרסה 3.0 ומעלה, כאשר גרסאות 3.3 ואילך מכילות שיפורים ייעודיים כדי לאפשר איסוף נתונים מוטה. אין צורך בתוכנה או ציוד נוספים עבור פרוטוקול זה. הוראות נרחבות בנושא תשתיות חישוביות ומדריכי התקנה ניתנים במקום אחר15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מדגם

  1. השתמש ברשתות המכילות רדיד זהב ותמיכה ברשת זהב16 (ראה טבלת חומרים) מכיוון שאיסוף נתונים מוטה יכול להדגיש תנועה הנגרמת על ידי קרן17.
    הערה: עבור המחקר הנוכחי, דגימות על רשתות היו זגוגית באמצעות טכניקת צלילה ידנית ו blotting18 בחדר קר לח (יותר מ 80%) (~ 4 ° C).
  2. הימנע משימוש ברשתות המכילות תמיכת נחושת ורדיד פחמן או שכבה רציפה של פחמן אמורפי אלא אם כן הדבר הכרחי לחלוטין, מכיוון שרשתות אלה עלולות להוביל לתנועה גדולה יותר הנגרמת על ידי קרן16 כאשר שלב הדגימה מוטה.
    הערה: נראה כי שכבות תמיכה חלופיות, כגון תחמוצת גרפן/גרפן, מפחיתות את התנועה הנגרמת על ידי הקרן בהשוואה לפחמן אמורפי19,20.
  3. סנן מראש רשתות וזהה אזורים המאופיינים בעובי קרח מקובל ובפיזור חלקיקים. רשתות המכילות חלקיקים צפופים מדי יובילו לחפיפת חלקיקים במהלך איסוף נתונים מוטה, דבר שעשוי להשפיע על שלבי עיבוד הנתונים במורד הזרם.
    הערה: צעדים אלה הם סובייקטיביים מאחר שזיהוי אזורים טובים של קרח מתבצע על ידי בדיקה חזותית של תמונות לא ממוקדות עבור אזורים שבהם ניגודיות החלקיקים ברורה. ייתכן שהדבר לא יהיה ריאלי עבור כל הדגימות מכיוון שחלק מהדגימות לא יפוזרו ביעילות באזורים של קרח דק, מה שיוביל לאתגרים במהלך איסוף הנתונים (המתוארים בסעיף הדיון).
  4. ויטריפיק את הרשתות המכילות את דגימת החלבון שלך. כאן, למטרות הדגמה, אנו משתמשים בחלבון DNA Protection during Starvation (DPS) (ראו טבלת חומרים) בטווח שבין 0.1-0.5 מ"ג/מ"ל עם רדיד זהב ורשתות תמיכה מזהב.
    הערה: החלבון טוהר כפי שתואר קודם לכן, למעט לא בוצע מחשוף פרוטאז TEV21. טווח ריכוז החלבון עבור מדגם מעניין יצטרך להיות מותאם בנפרד, שכן קשה לאמוד טווח אידיאלי שהוא ישים באופן אוניברסלי וכמעט בוודאות ישתנה בין דגימות שונות.

2. הגדרת איסוף נתונים מוטים

  1. יישרו את המיקרוסקופ כדי להבטיח הארה מקבילה של הדגימה ולמזער סטיות בתרדמת22.
    הערה: המיקרוסקופ חייב להיות מיושר היטב לאיסוף נתוני SPA סטנדרטיים ללא הטיית במה. אין צורך ביישור מיוחד לאיסוף נתונים מוטים, אך יישור טוב יבטיח שהמיקוד וההדמיה יתקדמו בצורה חלקה. סכמה כללית המשווה איסוף נתונים מוטים ולא מוטים מוצגת באיור 2.
  2. הקלט אטלס רשת ללא הטיית שלב כדי לזהות ריבועים המתאימים לאיסוף נתונים או בדוק ריבועים באופן ידני בהגדלה המשמשת בצומת רכישת ריבועים. חפשו ריבועים שבהם נייר הכסף שלם, אינו נראה מיובש ובעל עובי קרח אידיאלי.
    הערה: צומת רכישה ריבועי הוא צומת ההגדלה הנמוכה המשמש להדמיה בקנה מידה רב בלגינון.
    1. לאיסוף נתונים אוטומטי טיפוסי ללא הטיה, רשום אטלס רשת, המספק סקירה כללית של איכות הרשת הכוללת ואינדיקציה ראשונית לאזורים מתאימים לאיסוף נתונים.
    2. לאחר מכן, בחר ריבועים מתאימים דרך האטלס ושלח אותם לתור. לאחר מכן, באמצעות בחירה ידנית של חורים או באמצעות מאתר חורי EM אוטומטי, עמדו בתור והגישו את יעדי החורים.
    3. לבסוף, השתמש במאתר חורי EM אוטומטי להגשת יעדי חשיפה להגדלה גבוהה.
      הערה: עבור איסוף נתונים מוטים, ייתכן שיהיה צורך להציב ריבועים בתור באופן ידני לקבלת תוצאות עקביות, במיוחד אם זווית ההטיה האופטימלית לא נקבעה מראש וסביר להניח שהיא תותאם במהלך איסוף הנתונים. אטלס הרשת יכול היה גם להיות מוקלט באמצעות הטיית במה מוגדרת מראש אם זווית ההטיה המשמשת לאיסוף נתונים נקבעה קודם לכן.
  3. הזיזו את שלב הדגימה לריבוע עניין.
  4. קבע את הגובה האוצנטרי למיקום הבמה באמצעות α-נדנוד בהטיית הבמה ± 15°. כוונן את גובה Z כדי להביא את הבמה לגובה אאוצנטרי באמצעות לוח המקשים עבור המיקרוסקופ. ודא שהיסט התמונה מינימלי במהלך שגרת α הנדנודים.
    הערה: אם הגובה האוצנטרי אינו מזוהה כראוי, ייראה שינוי תמונה גדול בעת הטיית הבמה בהגדלה הריבועית. זה יכול לקרות גם אם יש עיוותים מקומיים ברשת, לדוגמה, אם הרשת שבורה או כפופה מאוד בקרבת האזור המצולם. למרות שעדיף להימנע מאזורים כאלה לאיסוף נתונים, חובה להעריך במדויק את הגובה האוצנטרי אם אלה מייצגים את אחד האזורים המבטיחים המעטים לאיסוף נתונים. איור 3 מראה כיצד מיקוד ללא זיהוי נכון של גובה אאוצנטרי יכול לגרום לשינויים גדולים בתמונה בהגדלה הריבועית.
  5. מצא גובה Z מדויק יותר, השתמש בצומת מיקוד ולחץ על Simulate.
    1. בדרך כלל, הערך את גובה ה- Z בצומת המיקוד בהגדלה המשמשת בצומת רכישה ריבועית.
      הערה: רצף המיקוד של צומת Focuser יכול לכלול גם הערכת מיקוד Z עדינה בצומת Hole Acquisition (כלי בתוכנת Leginon) במהלך איסוף הנתונים.
    2. התאם את ההגדרות עבור צומת המיקוד והפעל/השבת את אפשרות המיקוד Z העדינה במהלך התור הראשוני של ריבועים.
      הערה: חשוב לוודא שהגובה האיוצנטרי מזוהה במדויק כאשר איסוף נתונים אוטומטי מתחיל, דבר שעשוי לדרוש הפעלה מחדש של מיקוד Z עדין (שלב 2.10).
  6. הטה את שלב הדגימה לזווית ההטיה הרצויה לאיסוף נתונים בגובה האאוצנטרי האמיתי, ומרכז מחדש את הבמה במידת הצורך. זוויות הטיה של 0°, 30° ו- 60° שימשו במחקר זה. לחץ על Simulate בצומת Square Acquisition כדי להתחיל להציב יעדים בתור עבור חשיפות צומת רכישת חורים.
    הערה: כפי שמצוין בשלב 2.2.1, ניתן להקליט את אטלס הרשת באמצעות הטיית במה מוגדרת מראש, אשר תייתר את הצורך להטות את הבמה שוב בשלב זה. פעולה זו פועלת היטב ומאיצה את התהליך אם זווית ההטיה המשמשת לאיסוף נתונים מוגדרת מראש. הפרוטוקול הנוכחי נכתב תוך התחשבות בדגימות חדשות, שבהן המשתמש עשוי לרצות לבדוק זוויות הטיה שונות לאיסוף נתונים.
  7. בחרו יעד מיקוד Z ואזורים עם חורים המתאימים לחשיפות להגדלה גבוהה.
  8. לחץ על שלח יעדים כדי לעמוד בתור להדמיה. אל תלחץ על שלח יעדים בתור עד שתסיים לתור את כל הריבועים.
  9. החזירו את שלב הדגימה למצבו הבלתי מוטה. עברו לריבוע הבא וחזרו על שלבים 2.3-2.8 עד למספר מספיק של חשיפות לחורים.
  10. עבור אל צומת פילוח החור ולחץ על שלח יעדים בתור לאחר שכל הריבועים עומדים בתור.
    הערה: אם מיקוד Z בסדר בוטל בעבר כדי לחסוך זמן (שלב 2.5), יש להפעיל אותו מחדש לפני שליחת התור.
  11. בדוק ידנית מטרות שנבחרו על-ידי צומת רכישת החשיפה בהגדלה גבוהה כדי לבדוק אם מאתר החורים האוטומטי של EM יכול לזהות במדויק אזורים מתאימים לרכישת תמונה כאשר שלב הדגימה מוטה.
    1. במהלך הליך זה, בחר 'אפשר אימות משתמש של יעדים נבחרים' בהגדרות צומת רכישת חשיפה . לאחר שהמשתמש מרוצה מדיוק המיקוד, בטל את הבחירה באפשרות זו לאיסוף נתונים אוטומטי.
      הערה: יעדים בהגדלה גבוהה צומת רכישת חשיפה מצולמים בדרך כלל באמצעות אסטרטגיית היסט תמונה בהטיית אלומה, הפועלת באותה מידה הן עבור איסוף נתונים מוטים והן עבור איסוף נתונים ללא הטיה23,24,25,26. להערכת CTF מדויקת בשלבי עיבוד נתונים במורד הזרם, יש לבצע את כיול סטיית תרדמת העדשה עבור אסטרטגיית איסוף הנתונים של הסטת התמונה בהטיית אלומה.

3. עיבוד נתונים

  1. התחל עיבוד נתונים מהיר 10,27,28,29 עם תיקון תנועה של סרטים מוקלטים, הערכת CTF, בחירת חלקיקים ויצירת שחזורים ראשוניים במהלך איסוף הנתונים.
    הערה: במחקר הנוכחי, cryoSPARC Live10 (ראה טבלת חומרים) שימש לעיבוד מקדים. עיבוד נתונים מהיר מספק שחזור קריו-EM ראשוני וקירוב להתפלגות הזוויתית, אשר יכול ליידע את המשתמש על מידת האנאיזוטרופיה של הרזולוציה. אלה יכולים, בתורם, לשמש כדי להנחות את המשתמש אם זווית ההטיה המשמשת לאיסוף נתונים גבוהה מספיק.
  2. דמיינו את המפה המשוחזרת והתוו את התפלגות זווית אוילר כדי לאמוד את מידת כיווני החלקיקים המועדפים.
    הערה: ניתן להמיר את התפלגות זווית אוילר ישירות להתפלגויות דגימת מרחב פורייה כדי לקבוע את המידה הפוטנציאלית של אנאיזוטרופיה ברזולוציה. ממשק משתמש גרפי (GUI) פותח כדי לסייע למשתמש להעריך את האיכות של התפלגות זווית אוילר ולקבוע זווית הטיה אופטימלית30,31. ניתן להשיג את הכלי ממאגר Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.
  3. במידת הצורך, התאם את זווית הטיית הבמה שבה נאספים הנתונים כדי להתגבר על ההשפעות של כיוון מועדף. ניתן להגדיל את הזווית אם הכיוון המועדף נשאר בעיה, כפי שמעידה המפה והתפלגות אוילר ב-3.2. לחלופין, ייתכן שהמשתמש ירצה לפצל את איסוף הנתונים לקבוצות ולהקליט באמצעות מספר זוויות הטיה שונות, כגון 20°, 30° ו- 40°.
    הערה: למרות שרוב ה-TEMs חייבים להיות בעלי יכולת להטות את הבמה ל-70°, הטיות שלב הדגימה הנפוצות (בהן השתמשנו) נעות בין 20°-40°.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DPS ב-0.3 מ"ג/מ"ל שימש להדגמת הדמיה בהטיות של 0°, 30° ו-60°. נתונים מזוויות הטיה שונות נאספו באותה רשת באזורי רשת שונים. רזולוציית CTF המתאימה להטיות בזווית גבוהה יותר נוטות להיות גרועות יותר, כפי שהיה במקרה של השוואת שלושת מערכי הנתונים במחקר זה. איור 4 מציג תמונות מייצגות השוואתיות וממוצעי סיווג דו-ממדיים. למרות שריכוז החלבון אינו משתנה על פני זוויות ההטיה השונות, זווית הטיה גבוהה יותר גורמת לאזור המצולם להיראות צפוף יותר במונחים של ריכוז חלקיקים. זה יכול להיות בעייתי לעיבוד נתונים מכיוון שחפיפת חלקיקים יכולה לסבך שחזורים תלת-ממדיים ושכלולים זוויתיים. סיווג דו-ממדי איטרטיבי יצר באופן שגרתי ערימה נקייה של חלקיקים עם מערכי נתונים מוטים של 0° ו-30°, בעוד שמערך הנתונים של 60° דרש ניקוי זהיר של ערימות החלקיקים כדי להבטיח שממוצעי המחלקה יראו חפיפה מינימלית עבור חלקיקים סמוכים. ממוצע הכיתה מאיור 4C בתיבה האדומה מייצג דוגמה לחפיפת חלקיקים. למרות שמרכוז מחדש במהלך הסיווג יכול לגרום לאות מחלקיקים שכנים להיות ממוצע, חפיפה חלקיקית משמעותית יכולה לפגוע בדיוק של פרמטרים של יישור חלקיקים, ולייצר שחזורים המאופיינים ברזולוציה נמוכה יותר. הפתרון הטוב ביותר למניעת חפיפת חלקיקים הוא סינון מראש של רשתות עם עובי קרח ופיזור חלקיקים אופטימליים. סקירה כמותית מקיפה של המדדים להערכת שיפורים מאיסוף נתונים מוטים מתוארת במקום אחר32.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של יתרונות ואתגרים באיסוף נתונים מוטה. החלונית העליונה מציגה תצוגת תקריב של חור רשת. פסי הרשת צבועים בזהב, זגוגית כחולה וחלקיקים מקרומולקולריים אדומים. חצים מציינים את כיוון קרן האלקטרונים. הלוח התחתון מייצג אוסף של חורים עם אותה ערכת צביעה כמו בחלונית העליונה. הכוכב השחור מייצג את יעד המיקוד העדין לפני רכישת התמונה בהגדלה גבוהה. זווית ההטיה מסומנת כ- 'α'. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמת זרימת עבודה המשווה אסטרטגיית איסוף נתונים ללא הטיה וללא הטיה. השוואה מדורגת של איסוף נתונים ללא הטיה והטיה מראה את השלב הנוסף של הערכה ידנית של הגובה האוצנטרי ומרכוז מחדש עבור כל ריבוע מוטה (2 ו- 3 עבור איסוף נתונים מוטים). שאר זרימת העבודה דומה בין שתי האסטרטגיות. אלה כוללים בחירת ריבוע מתאים להדמיה (1 לאיסוף נתונים מוטים ולא מוטים), ייזום סכימת תור על ידי בחירת ריבוע להדמיה (המכונה סימולציה; 2 ו -4 לאיסוף נתונים ללא הטיה והטייה, בהתאמה), מתן יעד מיקוד גובה אאוצנטרי ויעדי רכישת הגדלת חורי תור (3 ו -5 לאיסוף נתונים ללא הטיה והטייה, בהתאמה). ולבסוף הגשת התור של יעדי חשיפה נבחרים להגדלה גבוהה (4 ו-6 לאיסוף נתונים ללא הטיה והטיה, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות מייצגות של הרשת בהגדלה ריבועית עם זוויות הטיה שונות. תמונות שנאספו קרוב ורחוק מגובה Z אאוצנטרי מוצגות בלוח העליון והתחתון, בהתאמה. הציר האופטי של הקרן מסומן על ידי מרכז הטבעות הקונצנטריות האדומות. החץ הירוק מציין את ריבוע העניין. קיימת תכונת רשת שבורה הצמודה לריבוע העניין לצורך התייחסות. הצמצם האובייקטיבי מוסר כדי להקל על הצפייה. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חשיפות מייצגות לחורים וממוצעים דו-ממדיים שנאספו בזוויות הטיה שונות. לוחות (A), (B) ו-(C) מתייחסים להדמיה המבוצעת כאשר שלב הדגימה אינו מוטה ב- 0° או מוטה ל- 30° ו- 60°. ממוצעי מחלקות דו-ממדיות המושפעים מצפיפות מוצגים בתיבה האדומה ב-(C). סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כיוון חלקיקים מועדף הנגרם על ידי היצמדות הדגימה לממשק אוויר-מים הוא אחד מצווארי הבקבוק העיקריים האחרונים לקביעת מבנה שגרתית ברזולוציה גבוהה באמצעות cryo-EM SPA 4,5,6. סכימת איסוף הנתונים המוצגת כאן מספקת אסטרטגיה קלה ליישום לשיפור התפלגות האוריינטציה של חלקיקים בתוך מערך נתונים. נציין כי הפרוטוקול אינו דורש ציוד או תוכנה נוספים ואינו משפיע על מהירות איסוף הנתונים. השיקולים הבאים חשובים במהלך איסוף נתונים עבור דגימות מוטות.

ראשית, הריבוע המצולם חייב להיות בגובה אאוצנטרי לצורך מיקוד אופטימלי. הגובה האיוצנטרי מותאם על-ידי הקלטת תמונות עם זוג הטיה בזוויות הטיית במה קטנות (בדרך כלל 0.5°-2°) וזיהוי מיקוד בהתבסס על קשר מוגדר מראש בין היסט תמונה לביטול המיקוד. אם ריבוע היעד דורש התאמה גדולה בגובה האוצנטרי, הדבר יגרום לשינוי תמונה משמעותי של התמונה הריבועית, כך שכאשר הבמה מוטה שוב, שדה הראייה עלול להיחסם על ידי הצמצם האובייקטיבי.

שנית, החור העגול בדרך כלל הופך מלבני יותר ויותר עם הטיות גבוהות יותר בהגדלה בינונית (הגדלת צומת רכישת חור ). בהיעדר כיול מדויק של שינוי תמונה, ייתכן שניתן לצלם חלק מנייר הכסף יחד עם חלקיקים המשובצים בקרח זגוגי לצורך הגדלת חשיפה נתונה. לכן, באופן אידיאלי, כיול שינוי התמונה חייב להיות מדויק. חלופה אחרת היא להגדיל את ההגדלה כך שהשטח המצולם ביחס לגודל החור יקטן. בהגדלה גבוהה יותר, לטעויות בהטיית הקרן כתוצאה מהסטת תמונה תהיה השפעה קטנה יותר על יכולתו של המשתמש לנווט לאזור של קרח זגוגית. עם זאת, זה בא על חשבון הפחתת מספר החלקיקים במיקרוגרפים המתקבלים, באופן יחסי לעלייה בהגדלה.

שלישית, למיקוד אוטומטי יש סיכוי גדול יותר להיכשל באיסוף נתונים מוטים עקב תנועה מוגברת הנגרמת על ידי קרן ועובי דגימה מוגבר. לכן, השגת מיקוד מדויק יכולה, מדי פעם, להציב כמה אתגרים לאיסוף נתונים מוטים, במיוחד אם יעד המיקוד הוא רדיד הזהב במרכז ארבעה חורים, שהוא נוהג סטנדרטי לאיסוף נתונים מוטים. במקרים של כשלים תכופים בהערכת מיקוד, חלופה היא להגדיר את קצה החור כיעד המיקוד. הדבר חייב לספק אות מספיק למתאם פאזה מדויק בין זוגות תמונות המושרות על ידי הטיית הקרן לבין התאמת המיקוד לאחר מכן. מניסיוננו, התמקדות בקצה החור גורמת רק לעתים רחוקות לכשל במיקוד האוטומטי.

ולבסוף, כשבוחרים תמונות בהגדלה גבוהה הרחק ממרכז הרשת, ההבדל במיקוד בין תמונות יעד משני צדי ציר ההטיה עשוי להיות משמעותי. גודל ההבדל תלוי בזווית ההטיה והמרחק מנקודת המיקוד. לדוגמה, בזווית הטיה של 30°, שתי מטרות המרוחקות 6 מיקרומטר זו מזו על פני הרשת ונבחרו בדיוק בניצב לציר ההטיה יהיו בעלות הפרש של 3 מיקרומטר בביטול המיקוד ביניהן (הקשר הוא: דלתא defocus = sin (זווית הטיה) * (מרחק מציר הטיה)). מטרות שנבחרו לאורך ציר ההטיה יהיו בעלות אותו מיקוד דה-פוקוס, בעוד שאחרות ייפלו איפשהו באמצע. אם ציר ההטיה מוגדר ב-Leginon במהלך הכיול, התוכנה מפצה באופן אוטומטי על השינוי בביטול המיקוד. עם זאת, על המשתמשים להיות מודעים לכך שהאפשרות של שיפועי מיקוד גדולים יותר במהלך הדמיה בהגדלה גבוהה בכל זאת קיימת. מעברי צבע גדולים של מיקוד אמורים להשפיע באופן מינימלי על השחזור הסופי33, אך ייתכן שיהיה צורך להשתמש בתיבות גדולות יותר במהלך עיבוד הנתונים כדי למנוע השפעות החלקה. בנסיבות אלה, שימוש בטווח צמצום מיקוד במהלך איסוף נתונים עשוי להיות מוצדק, ואקראיות של מיקוד מגיעה באופן טבעי מהטיה של הבמה. התאמות ביטול מיקוד לכל חלקיק במהלך עיבוד נתונים יכולות לשפר את הרזולוציות של שחזורים סופיים. עם זאת, מכיוון שמידול מדויק של התאמות CTF עשוי להיות מאתגר עבור זוויות הטיית במה גבוהות, יש להקפיד על ניטור איכות הנתונים, וה- CTF מתאים במהלך אוצרות החשיפה. באופן כללי, עובי קרח תת-אופטימלי גורם לדיוק נמוך יותר במידול התאמות אומדן CTF. לכן, יש להקפיד לצלם באזורים שבהם הקרח דק, בהנחה שפיזור החלקיקים מספיק טוב באזורים אלה.

התפלגות כיוון משופרת ואחידה יותר מובילה לשיפור מקביל ברזולוציה הכיוונית של מפות cryo-EM המשוחזרות. בנוסף, התפלגות אוריינטציה אחידה יותר משפרת את מקדם פיצוי הדגימה, המתייחס ישירות לרזולוציה גלובלית30,31. לפיכך, שיפור קולקטיבי של התפלגות האוריינטציה אמור לשפר את הדיוק של מידול אטומי ועידון 9,30,31. באופן עקרוני, זה יספק טיעון חזק ליישום שגרתי של איסוף נתונים מוטה. עם זאת, ישנן מספר אזהרות שהמשתמש חייב להיות מודע אליהן. ראשית, שיפוע המיקוד המוגבר ועובי הקרח יכולים להשפיע על הרזולוציה הגלובלית הכוללת, ככל הנראה בשל שילוב של רעש רקע מוגבר ותנועה מוגברת הנגרמת על ידי אלומה, בשילוב עם בעיות עקיפות אחרות המתעוררות כתוצאה מכך17. השפעה זו צפויה להיות בולטת יותר במקרים בהם הקרח עבה יותר מטבעו. עם זאת, מכיוון שרוב הדגימות סובלות ממידה מסוימת של אוריינטציה מועדפת, מה שעלול בתורו להוביל לאי אחידות הדגימה, איסוף נתונים מוטים עשוי להיות מועיל בדרך כלל כל עוד ההשפעות המזיקות ממוזערות או מתמתנות. שנית, ייתכן שיהיה צורך להטות את הבמה עד 60° עבור דגימות מסוימות המאופיינות באוריינטציה מועדפת חמורה. עדויות אנקדוטליות שלא פורסמו מעבודתנו ומדיווחי עמיתינו מצביעות על כך שאפילו הטיות ~40° אינן מספיקות כדי להתגבר על אנאיזוטרופיה ברזולוציה עבור דגימות מסוימות. מאמצים לזיהוי זווית הטיה אופטימלית עבור קבוצה של התפלגויות נמצאים בעיצומם, בהתבסס על הרעיונות שהותוו אצל בולדווין ואחרים.31. לבסוף, יש לציין כי, באופן עקרוני, שחזור ממדגם המאופיין בכיוון מועדף יחיד פתולוגי לחלוטין עדיין יהיה חרוט חסר 30° גם כאשר הנתונים נאספים בזווית הטיה של 60°. בניסויים מדומים, חרוט חסר של 30 מעלות לא צפוי להשפיע במידה רבה על פרשנויות ניסוייות. הטיה של 60 מעלות כנראה מספיקה אפילו לדגימות המועדפות ביותר מבחינה פתולוגית. עם זאת, במקרים בהם יהיה צורך להטות את הבמה בעד 60°, יש לבצע אופטימיזציה קפדנית של ריכוז החלקיקים בשדה הראייה, שכן חפיפת חלקיקים תסבך את עיבוד הנתונים. לא ניתן להטות ליותר מ-60° (או 70° בשלבי מיקרוסקופ נבחרים) ב-TEM סטנדרטיים, עקב מגבלות של תכנון שלב הדגימה. במקרים כאלה, אופטימיזציה נוספת עם תוספים וביוכימיה מדגם עשוי להידרש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לביל אנדרסון, צ'ארלס באומן וז'אן-כריסטוף דוקום (TSRI) על עזרתם במיקרוסקופיה, התקנות לגינון ותשתית העברת נתונים. אנו מודים גם לגורדון לואי (מכון סאלק) וליונג זי טאן (האוניברסיטה הלאומית של סינגפור) על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים לכריס רוסו (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) על שסיפק לנו את הפלסמיד לביטוי DPS. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות של ארה"ב (U54AI150472, U54 AI170855 ו-R01AI136680 ל-DL), הקרן הלאומית למדע (NSF MCB-2048095 ל-DL), קרנות הרסט (ל-DL) וקתדרת ארתור וג'ולי וודרו (ל-J. P. N).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryosparc Live v3.1.0+210216 Structura Biotechnology
DPS protein Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098.
K2 Summit Direct Electron Detector Gatan
Leginon software suite C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60.
Manual plunging device Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids
Talos Arctica FEI/Thermo Fisher
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids Quantifoil N1-A14nAu30-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
  3. Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
  5. Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
  6. Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
  7. Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
  8. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
  9. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  10. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  11. Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  12. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  13. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
  14. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  15. NYSBC.org Homepage. , Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022).
  16. Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
  17. Russo, C. J., Henderson, R. Charge accumulation in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).
  18. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  21. Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
  22. Herzik, M. A. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).
  23. Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
  24. Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
  25. Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
  26. Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
  27. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  28. Structura Biotechnology Inc. , Available from: https://cryosparc.com/live (2022).
  29. DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
  30. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
  31. Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
  32. Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. cryoEM: Methods and Protocols. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).
  33. Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading). Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 185
איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S.,… More

Aiyer, S., Strutzenberg, T. S., Bowman, M. E., Noel, J. P., Lyumkis, D. Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon. J. Vis. Exp. (185), e64136, doi:10.3791/64136 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter