Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse og strukturel evaluering af epitelcellemonolag i en fysiologisk størrelse mikrofluidisk kulturanordning

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64148
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, School of Science and Engineering, Tulane University

Summary

Den præsenterede protokol beskriver udviklingen og anvendelsen af en phalloidin-baseret filamentøs actinfarvningsteknik med konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) til visualisering af klæbende cellelagstruktur i mikrofluidiske dynamiske kulturkanaler og traditionelle statiske kulturkamre med fast brønd. Denne tilgang hjælper med at evaluere cellelagssammenløb, monolagsdannelse og lagtykkelsesensartethed.

Abstract

In vitro mikrofluidiske eksperimenter har stort potentiale til at afsløre mange indsigter i de mikrofysiologiske fænomener, der forekommer under tilstande som akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) og respirator-induceret lungeskade (VILI). Imidlertid står undersøgelser i mikrofluidiske kanaler med dimensioner, der er fysiologisk relevante for de terminale bronchioler i den menneskelige lunge, i øjeblikket over for flere udfordringer, især på grund af vanskeligheder med at etablere passende cellekulturbetingelser, herunder mediestrømningshastigheder, inden for et givet dyrkningsmiljø. Den præsenterede protokol beskriver en billedbaseret tilgang til evaluering af strukturen af NCI-H441 humane lungeepitelceller dyrket i en iltuigennemtrængelig mikrofluidisk kanal med dimensioner, der fysiologisk er relevante for de terminale bronchioler i den menneskelige lunge. Ved hjælp af phalloidin-baseret filamentøs actinfarvning afsløres cellernes cytoskeletale strukturer ved konfokal laserscanningsmikroskopi, hvilket muliggør visualisering af individuelle såvel som lagdelte celler. Efterfølgende kvantificering bestemmer, om de anvendte cellekulturbetingelser producerer ensartede monolag, der er egnede til yderligere eksperimentering. Protokollen beskriver cellekultur og lagevalueringsmetoder i mikrofluidiske kanaler og traditionelle miljøer med fast brønd. Dette inkluderer kanalkonstruktion, cellekultur og nødvendige betingelser, fiksering, permeabilisering og farvning, konfokal mikroskopisk billeddannelse, billedbehandling og dataanalyse.

Introduction

Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) er en akut tilstand som følge af fornærmelse mod og udbredelse af skade i lungeparenchymen, hvilket resulterer i lungeødem i alveolerne, utilstrækkelig gasudveksling og efterfølgende hypoxæmi1. Dette initierer en cyklus af proinflammatorisk cytokinfrigivelse, neutrofilrekruttering, toksisk mediatorfrigivelse og vævsskade, som i sig selv medfører et yderligere inflammatorisk respons2. Derudover kan lungeoverfladeaktivt stof, som stabiliserer luftvejene og forhindrer skader forårsaget af gentagen rekruttering / derekruttering (R / D), inaktiveres eller på anden måde gøres dysfunktionel af de kemiske processer, der forekommer under ARDS, hvilket resulterer i yderligere stress og skade på det omgivende parenkym3. Hvis der opstår tilstrækkelig skade, kan mekanisk ventilation være nødvendig for at sikre tilstrækkelig systemisk iltning4. Imidlertid pålægger mekanisk ventilation sine egne udfordringer og traumer, herunder muligheden for respiratorinduceret lungeskade (VILI), karakteriseret som skade på lungeparenkymet forårsaget af de mekaniske belastninger, der pålægges under overinflation (volutrauma) og / eller R / D af luft-væskegrænsefladen i de væske-okkluderede luftveje (atelectrauma)5. Trykgradienten, der opleves af epitelceller udsat for en luft-væske-grænseflade (som i en væske-okkluderet bronchiole) i atelectrauma-modellen, kan resultere i et permeabilitetsopstået obstruktivt respons (POOR), hvilket fører til en POOR-get-POORer dydigskadecyklus 6,7,8.

In vitro-eksperimenter kan give mikroskala indsigt i disse fænomener, men aktuelle undersøgelser i mikrofluidiske kanalmiljøer med fysiologisk relevante dimensioner står over for flere udfordringer9. For det første udgør optimering af cellekulturbetingelser en betydelig adgangsbarriere for cellekulturforskning i mikrofluidiske miljøer, da der findes et smalt skæringspunkt, inden for hvilket mediestrømningsparametre, dyrkningsvarighed og andre kulturbetingelser tillader optimal dannelse af cellelag. Dette omfatter de diffusionsbegrænsninger, der er pålagt af den iltuigennemtrængelige karakter af den mikrofluidiske kulturkanalindeslutning. Dette kræver nøje overvejelse af mediestrømningsparametre, da lave strømningshastigheder kan fratage celler ilt, især dem, der er længst væk fra indløbet; På den anden side kan høje strømningshastigheder skubbe celler ud af kulturkanalen eller resultere i forkert eller ujævn lagudvikling. Diffusionsbegrænsninger kan afhjælpes ved at anvende oxygengennemtrængelige materialer såsom polydimethylsiloxan (PDMS) i et luft-væske-interface (ALI)-kulturapparat Mange konventionelle mikrofluidiske kulturkanaler, f.eks. kanalerne i ECIS-systemet (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing), er imidlertid i sagens natur iltuigennemtrængelige på grund af arten af det fremstillede kabinet10. Denne protokol sigter mod at tilvejebringe en teknik til analyse af cellelag dyrket i et iltuigennemtrængeligt kabinet.

Ved sammenligning af levedygtigheden af dyrkningsbetingelser er observationer af specifikke lagegenskaber, såsom tilstedeværelsen af et monolag, overfladetopologi, sammenløb og lagtykkelsesensartethed, nødvendige for at bestemme, om cellelaget produceret af et bestemt sæt kulturbetingelser opfylder de ønskede specifikationer og faktisk er relevante for det eksperimentelle design. En begrænset evaluering kan udføres ved metoder som ECIS, der anvender målinger af elektrisk potentiale (spænding) skabt af modstand mod højfrekvent vekselstrøm (AC) (impedans) pålagt af elektrisk isolerende membraner af celler dyrket på guldelektroder i flowarrayet. Ved at modulere frekvensen af AC anvendt på celler kan specifikke frekvensafhængige cellulære egenskaber af cellerne og cellelagene, såsom overfladevedhæftningsstyrke, tæt forbindelsesdannelse og celleproliferation eller sammenløb, målrettes og undersøges11. Disse indirekte former for målinger er imidlertid noget vanskelige at fortolke ved begyndelsen af et eksperiment og kvantificerer muligvis ikke alle relevante aspekter af cellelaget. Blot at observere cellelaget under et fasekontrastmikroskop kan afsløre arten af visse kvaliteter såsom sammenløb; Mange relevante egenskaber såsom tilstedeværelsen af et monolag og lagtykkelsens ensartethed kræver imidlertid en tredimensionel (3D) evaluering, som ikke er mulig med brightfield, fasekontrast eller fluorescerende mikroskopisk billeddannelse12.

Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en filamentøs actinfarvningsteknik for at muliggøre billeddannelsesbaseret verifikation af et monolag og evaluering af cellelagets ensartethed ved hjælp af konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM). Filamentøs actin (F-actin) blev anset for et passende mål for fluoroforkonjugatet, delvis på grund af den måde, hvorpå F-actin tæt følger cellemembranen, hvilket muliggør en visuel tilnærmelse af hele cellevolumen13. En anden vigtig fordel ved målretning af F-actin er den måde, hvorpå farvning af F-actin visuelt belyser cytoskeletale forstyrrelser eller ændringer pålagt af de belastninger og belastninger, som cellerne oplever. Tværbindingsfiksering med methanolfri formaldehyd blev brugt til at bevare cellernes og cellelagets morfologi, da dehydrerende fikseringsmidler såsom methanol har tendens til at flade celler, groft forvrænge cellelaget og ændre dets egenskaber14,15.

For at bestemme lagevalueringsteknikkens evne til at afbøde disse udfordringer blev celler dyrket i traditionelle kulturkamre med otte brønde såvel som i mikrofluidiske kanaler for at evaluere forskellene, hvis nogen, i de cellelag, der blev produceret. Til faste kulturbrønde blev der anvendt otte-brøndkammerede dækglasenheder. Til mikrofluidisk kultur blev flowarrays (kanallængde 50 mm, bredde 5 mm, dybde 0,6 mm) optimeret til dyrkning af udødeliggjorte humane lungeepitelceller (NCI-H441) i et miljø med dimensioner, der er fysiologisk relevante for de terminale bronchioler, der er til stede i åndedrætszonen i den menneskelige lunge16. Selvom denne protokol blev udviklet med kulturmiljøet i ECIS-flowarrays i tankerne, kan den gælde for ethvert iltuigennemtrængeligt dynamisk kulturmiljø, for hvilket evaluering af dyrkede cellelagskarakteristika eller kulturbetingelser er nødvendig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NCI-H441 human epitellungecellelinje blev anvendt til denne undersøgelse (se materialetabel).

1. Cellekultur i den mikrofluidiske kanal

  1. Fabriker den mikrofluidiske kanal og udfør forbehandlingen ved at følge nedenstående trin.
    1. Få et enkeltkanals flowarray (se materialetabel), og adskil den øverste del fra polycarbonatbundpladen.
    2. Få et #1.5 rektangulært dækglas (tykkelse 0.17 mm) med dimensioner på 60 mm x 22 mm. Rengør overfladerne på dækglasset i et ultralydbad og behandl den ene side med en 0,1 mg / ml opløsning af Poly-D-lysin ved stuetemperatur i 5 minutter før tørring ved 60 ° C i 30 minutter.
    3. Fastgør et 0,13 mm tykt dobbeltklæbemiddel (se materialetabel), laserskåret for at imødekomme dimensionerne på flowarray-toppen og flowkanalen (50 mm længde, 5 mm bredde), på flowarray-toppen, og sørg for at justere kanaludskæringernenøjagtigt 17.
    4. Fastgør en 0,1 mm tyk mylarafstandsstykke (se materialetabel), laserskåret for at imødekomme dimensionerne på flowarraytoppen og strømningskanalen, på klæbestrimlen, idet man sørger for nøjagtigt at justere kanaludskæringerne.
    5. Gentag trin 1.1.3 og 1.1.4, indtil den ønskede kanalhøjde er opnået (brug f.eks. to afstandsstykker og tre klæbestrimler til en kanalhøjde på 0,6 mm).
    6. Fastgør et rektangulært dækglas til den nederste klæbestrimmel med den Poly-D-lysinbehandlede side vendt mod klæbemidlet. Når samlingen er færdig, som vist i figur 1, påføres et fast og lige tryk på toppen og bunden af konstruktionen og holdes i 1 min.
      BEMÆRK: Konstruktionen af kanalkabinettet, herunder dækglas, klæbemidler, afstandsstykker og flowarray-top, er nu afsluttet.
    7. Skyl kanalen med deioniseret vand ved hjælp af en sprøjte, og kontroller samtidig for lækager.
    8. Steriliser kanalkabinet i en ultraviolet (UV) sterilisator i 30 min18.
    9. Brug steril teknik til at behandle kanalen med 2,0 μg/ml humant fibronectin (se materialetabel) i fosfatbufret saltvand (PBS) og inkubere i mindst 30 minutter ved 37 °C19.
  2. Udfør cellekultur i den mikrofluidiske kanal ved at følge nedenstående trin.
    1. I en steril laminar flowhætte skal du bruge en mikropipette til at overføre en jævn suspension af NCI-H441-celler i RPMI 1640-medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) (se materialetabel) for at så to mikrofluidiske kanaler, hver med celler med en overfladetæthed på 150.000 celler / cm2.
      1. Til kanaler på 50 mm x 5 mm x 0,6 mm skal du bruge 0,25 ml af en 2,5 x 106 celler/ml suspension til at fylde hver kanal samt en del af portene. Kontroller, at cellerne er blevet fordelt jævnt inden for kanalerne ved hjælp af et brightfield-mikroskop.
    2. De to kanaler dyrkes i henholdsvis 24 timer og 48 timer ved 37 °C med 5 % CO2 ved hjælp af en programmerbar sprøjtepumpe (se materialetabellen), idet brugte medier trækkes ud af kanalen og friske medier ind i kanalen fra en steril mediebeholder, der er fastgjort til kanalindtaget, og som består af en afskåret 20 ml sprøjte dækket med paraffinfilm.
      1. Efter en ventetid på 10 minutter efter cellesåning indføres og pumpes friske medier fra reservoiret gennem kanalen med en variabel strømningshastighed, der begynder ved 0,2 μL/min og ramper op til 10 μL/min i 4 timer, hvorefter20 opretholdes ved denne hastighed.
        BEMÆRK: Denne variable strømningshastighed giver dyrkningsbetingelser, der gør det muligt for celler at (1) tyngdekraften bundfælde sig på kulturoverfladen, (2) klæbe til kulturoverfladen og (3) danne et sammenflydende monolag.
  3. Udfør cellefiksering inde i de mikrofluidiske kanaler ved anvendelse af formaldehydopløsning.
    FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt og skal håndteres i en passende kemisk stinkhætte21.
    1. I en kemisk damphætte fremstilles formaldehydopløsninger ved at anvende 4% formaldehyd i PBS (methanolfri) (se materialetabel) for at skabe to 4 ml portioner, fortynding af den første til en koncentration på 1% formaldehyd og den anden til 2% formaldehyd ved anvendelse af Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (DPBS; med Ca 2+ og Mg2+) som fortyndingsmiddel. Overfør formaldehydopløsninger til separate 5 ml sprøjter og mærk i overensstemmelse hermed. Træk 20 ml DPBS op i en separat 20 ml sprøjte.
    2. Fjern mikrofluidiske kanaler fra kulturapparatet og anbring dem i den kemiske damphætte.
    3. Saml fikserings- og farvningsapparatet.
      1. Fastgør et 10 cm segment af overførselsrør til sideporten på en trevejs stophane via en Luer-hanlås til slangemodhageadapteren (se materialetabellen), og tilslut derefter stophanen til flowarrayets indløbsport.
      2. Fastgør derefter et andet 10 cm segment af overførselsrør til flowarrayets udløbsport ved hjælp af den samme type slangemodhageadapter.
      3. Endelig skal du sikre de frie ender af begge overførselsrør i en kemisk og biologisk farlig affaldsbeholder, såsom et mærket tomt 50 ml konisk centrifugerør.
    4. Drej stophanen for at blokere flowarrayets indløbsport, og skyl affaldsledningen med DPBS. Drej derefter stophanen for at blokere affaldsledningen, og vask langsomt celler med 2 ml DPBS. Gentag skylletrinnet med den nye opløsning hver gang. En ny opløsning (eller koncentration af opløsning) introduceres til kanalen.
    5. Skub langsomt 2 ml 1% fikseringsopløsning gennem kanalen og lad den sidde i 5 min22.
    6. Skub langsomt 2 ml 2% fikseringsopløsning gennem kanalen og lad den sidde i 15 minutter.
    7. Vask celler ved langsomt at indføre 2 ml frisk DPBS til kanalen i tre separate tilfælde (5 minutter hver).
    8. Udfør trin 1.3.3-1.3.7 for begge mikrofluidiske kanaler parallelt.
  4. Plette, permeabilisere, og tilføj monteringsmedier til cellerne i den mikrofluidiske kanal.
    1. Forbered 0,1% saponinopløsning ved at tilsætte 1 mg saponin (se materialetabel) pr. ml DPBS for at producere 4 ml opløsning og forsigtigt hvirvel for at blande23. Træk 8 ml DPBS op i en 20 ml sprøjte.
    2. Der tilsættes et F-actinfarvningsphalloidinreagens og et Hoechst-reagens med kernefarvning (se materialetabellen) til 0,1 % saponinopløsningen ved to dråber (0,1 ml) af hvert reagens pr. ml saponinopløsning. Hold forberedt farvning / permeabiliserende opløsning væk fra lys ved at dække med aluminiumsfolie24.
    3. Slangen skylles med en lille mængde farvnings-/permeabiliseringsopløsning (som beskrevet i trin 1.3.4), hvorefter 2 ml af opløsningen føres ind i den mikrofluidiske kanal, og kanalen dækkes med aluminiumsfolie, inden den får lov til at sidde ved stuetemperatur i 30 minutter.
    4. Skyl farvnings-/permeabiliseringsopløsningen ud to gange med 2 ml DPBS i 5 minutter pr. skylning.
    5. For bedre billedkvalitet skal du tilføje et passende monteringsmedie (med et brydningsindeks, der nøje matcher mikroskopets objektivolie og dækglas, se materialetabel) i kanalen.
      1. Brug en mikropipette til at indføre en minimal mængde af et blødt sæt antifade-beslag i hver port i den mikrofluidiske kanal, og sørg for, at bundoverfladen er helt dækket, og at ingen bobler fanges inden for det ønskede billeddannelsesområde25. Forsegl enderne af kanalen og kontroller cellelagets integritet ved at observere under et brightfield-mikroskop.
    6. Udfør trin 1.4.3-1.4.5 for begge mikrofluidiske kanaler parallelt.
      BEMÆRK: Billedceller så hurtigt som muligt efter farvning for maksimal billedkvalitet. Hvis der forekommer fotoblegning, eller langtidsopbevaring ønskes, kan andre monteringsmedier med antifade eller prøvebevarende egenskaber anvendes. Bemærk, at hårdt hærdende monteringsmedier vil forvrænge cellernes 3D-struktur og i forlængelse heraf cellelaget; Af denne grund foretrækkes bløde monteringsmedier26.
  5. Billedceller i den mikrofluidiske kanal ved at følge nedenstående trin.
    1. Juster indstillingerne for konfokalmikroskopet (se materialetabellen), herunder lasereffekt, forstærkning, forskydning og scanningsparametre såsom scanningshastighed, scanningsområde, scanningsformat, opløsning og pinhole diameter27.
    2. Test billedplacering ved at tage referencescanninger samt Z-stakke, indtil de ønskede billedparametre og betingelser er opfyldt. Opkaldsparametre ved sekventielt højere forstørrelsesmål, indtil målet om 40x olienedsænkning er nået og optimeret28.
    3. Brug flowarray-bundpladen som reference til at konstruere Z-stakke fem steder, på den potentielle placering af den første elektrode på indløbssiden, halvvejs mellem midten og den forrige placering, midten, halvvejs mellem midten og placeringen af den sidste elektrode (på udløbssiden) og ved den sidste elektrode, som angivet i figur 2.
  6. Udfør billedbehandling og dataanalyse.
    1. Eksporter XZ- og YZ-tværsnit ved hjælp af softwarepakken til konfokalmikroskop (se materialetabel).
    2. Brug et billedbehandlingsprogram (se Materialetabel) med kantdetekteringsfunktioner (tærskelværdi 15,0) til at måle det samlede billedareal i pixel ved hjælp af tryllestavsværktøjet uden for billedet og derefter arealet eksklusive cellelagets samlede tværsnitsareal i pixel ved hjælp af værktøjet Tryllestav i den del af billedet, der er udvendigt til cellelaget29.
    3. Brug databehandlingssoftware (se materialetabellen) til at trække pixelværdien for det udvendige område fra pixelværdien for det samlede areal for at finde pixelværdien for tværsnitsarealet.
    4. Konverter pixelværdier med tværsnitsareal til μm2-værdier ved at gange pixelværdier med kvadratet på μm/pixel-værdien, som angivet i mikroskopsoftwaren til det pågældende billede (0,31 μm/pixel for Z-stakke taget i 1024p-opløsning uden zoom på et 40x olienedsænkningsobjektiv).
    5. Beregn middelværdier og standardafvigelser for data og grafresultater.

Figure 1
Figur 1: Eksploderet skematisk oversigt over den mikrofluidiske kanalkonstruktion. Det øverste element er den øverste del af flowarrayet, tynde grå elementer er klæbestrimler, tynde blå elementer er mylarafstandsstykker, og bundelementet er det rektangulære dækglas. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fem billeddannelsessteder langs det konsekvent lagproducerende område af den mikrofluidiske kulturkanal. Billeddannelsessteder er som følger: indløbssiden, nær hvor den første elektrode ville være på det intakte flowarray; halvvejs mellem indløbssiden og midten af kanalen; midten af kanalen; halvvejs mellem midten og udgangssiden og udløbssiden, nær hvor den sidste elektrode ville være på det intakte flowarray. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Cellekultur i det otte-brøndede kammerdækglas

  1. Udfør forbehandling af det otte-brøndede kammerdækglas.
    1. Få et sterilt otte-brønds kammerdækglas fremstillet med en # 1.5 dækglas og celleadhærensforøgende overfladebehandling (figur 3, se materialetabel).
    2. Ved hjælp af steril teknik behandles overfladen af dyrkningsbrønde med 2,0 μg/ml humant fibronectin i PBS og inkuberes i mindst 30 minutter ved 37 °C19.
  2. Udfør cellekultur i det kammerdækkede dækglas ved at følge nedenstående trin.
    1. I en steril laminær strømningshætte overføres 0,5 ml portioner af opløsninger af NCI-H441-celler jævnt suspenderet i RPMI 1640-medium med 10% FBS ved volumetriske tætheder på 81.000, 162.000 og 324.000 celler / ml for at frø kulturbrøndene ved overfladetætheder på henholdsvis 45.000, 90.000 og 180.000 celler / cm2. Kontroller, at cellerne er jævnt fordelt i brøndene ved hjælp af et brightfield-mikroskop.
    2. Kulturceller i 24 timer, 48 timer og 96 timer ved 37 °C med 5% CO2, der erstatter medier dagligt.
  3. Udfør formaldehydfiksering i det otte-brøndkammerede dækglas.
    FORSIGTIG: Formaldehyd er giftigt og skal håndteres i en passende kemisk stinkhætte21.
    1. I en kemisk damphætte fremstilles formaldehydopløsninger ved at fremstille to portioner 4% formaldehyd i PBS (methanolfri), idet den første fortyndes til en koncentration på 1% formaldehyd og den anden til 2% formaldehyd ved anvendelse af Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS; med Ca 2+ og Mg2+) som fortyndingsmiddel.
    2. Fjern det otte-brønds kulturkammerdækglas fra inkubatoren og læg det ind i den kemiske damphætte.
    3. Vask forsigtigt celler med 0,5 ml DPBS ved hjælp af en mikropipette ved langsomt at indføre væske langs den øverste del af hjørnet af hvert hul.
    4. Fjern eksisterende væske i hvert hul ved langsomt at ekstrahere det fra hjørnet af brøndene ved hjælp af en mikropipette. Ved hjælp af væskeindføringsmetoden (trin 2.3.3) indføres 0,5 ml 1% fikseringsopløsning i hvert hul, og det lades sidde i 5 min22.
    5. Eksisterende væske fjernes i hvert hul ved hjælp af væskeekstraktionsmetoden nævnt i trin 2.3.4. Brug væskeindføringsmetoden nævnt i trin 2.3.3 til at indføre 0,5 ml 2% fikseringsopløsning i hvert hul og lade det sidde i 15 minutter.
    6. Brug væskeindførings- og ekstraktionsmetoderne (trin 2.3.3 og 2.3.4) til at vaske celler ved at indføre og fjerne 0,5 ml frisk DPBS i hvert hul i tre separate tilfælde i 5 minutter hver.
  4. Udfør farvning, permeabilisering og montering af medietilsætning i dækglas med otte brønde.
    1. Forbered 0,1% saponinopløsning ved at tilsætte 1 mg saponin pr. ml DPBS og forsigtigt hvirvel for at blande23.
    2. Til 0,1% saponinopløsningen tilsættes to dråber (0,1 ml) hver af et F-actinfarvningsphalloidinreagens og et kernefarvningsreagens pr. ml saponinopløsning. Hold den tilberedte opløsning væk fra lys ved at dække med aluminiumsfolie24.
    3. Indfør 0,2 ml farvning / permeabiliserende opløsning til hver brønd og dæk det kammerbelagte dækglas med aluminiumsfolie, før du lader det sidde ved stuetemperatur i 30 minutter.
    4. Skyl farvning/permeabiliserende opløsning ud to gange med 0,5 ml DPBS.
    5. For bedre billedkvalitet tilsættes et passende monteringsmedie (med et brydningsindeks, der nøje matcher mikroskopets objektivolie og dækglas) i brøndene.
      1. Brug en mikropipette til at indføre en minimal mængde af et blødt sæt antifalmebeslag i hvert hul, og sørg for, at bundoverfladen er helt dækket, og at ingen bobler fanges inden for det ønskede billeddannelsesområde25. Kontroller cellelagets integritet ved at observere under et brightfield-mikroskop.
        BEMÆRK: Billedceller så hurtigt som muligt efter farvning for maksimal billedkvalitet. Hvis der forekommer fotoblegning, eller langtidsopbevaring ønskes, kan andre monteringsmedier med antifade eller prøvebevarende egenskaber anvendes. Bemærk, at hårdt hærdende monteringsmedier vil forvrænge cellernes 3D-struktur og dermed cellelaget, så blødt hærdende monteringsmedier foretrækkes26.
  5. Udfør billeddannelse i det otte-brønds kammerdækglas.
    1. Juster indstillingerne for konfokalmikroskopet, herunder lasereffekt, forstærkning, forskydning og scanningsparametre såsom scanningshastighed, scanningsområde, scanningsformat, opløsning og pinhole diameter27.
    2. Test billedplacering ved at tage referencescanninger samt Z-stakke, indtil de ønskede billedparametre og betingelser er opfyldt. Opkaldsparametre ved sekventielt højere forstørrelsesmål, indtil målet om 40x olienedsænkning er nået og optimeret28.
    3. Konstruer Z-stakke af tre tilfældige placeringer i hver match-up af såtæthed/kulturvarighed.
  6. Udfør billedbehandling og dataanalyse.
    1. Eksporter XZ- og YZ-tværsnit ved hjælp af softwarepakken til konfokalmikroskop.
    2. Brug et billedbehandlingsprogram med kantdetekteringsfunktioner (tærskelværdi 15,0) til at måle det samlede billedareal i pixel ved hjælp af værktøjet Tryllestav uden for billedet og derefter området eksklusive cellelagets samlede tværsnitsareal i pixel ved hjælp af værktøjet Tryllestav i den del af billedet , der ligger uden for cellelaget29.
    3. Brug en databehandlingssoftware til at trække pixelværdien for det udvendige område fra pixelværdien for det samlede areal for at finde pixelværdien for tværsnitsarealet.
    4. Konverter pixelværdier med tværsnitsareal til μm2-værdier ved at gange pixelværdier med kvadratet på μm/pixel-værdien som angivet i mikroskopsoftwaren for det pågældende billede (0,31 μm/pixel for Z-stakke taget i 1024p-opløsning uden zoom på et 40x olienedsænkningsobjektiv).
    5. Beregn middelværdier og standardafvigelser og grafresultater.

Figure 3
Figur 3: Diagram over det otte-brønds kammerdækglas, der anvendes til det faste brøndkultur-, farvnings- og billeddannelseseksperiment, der sammenligner virkningerne af indledende cellesåningstæthed og kulturvarighed på dannelsen af cellelag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den præsenterede metode muliggør visualisering af epitelcellelag dyrket i mikrofluidiske kulturkanaler og bruger en demonstration i traditionelle cellekulturmiljøer med fast brønd som validering. Erhvervede billeder vil eksistere på et spektrum af kvalitet, signalintensitet og cellulær målspecificitet. Vellykkede billeder vil demonstrere høj kontrast, hvilket giver mulighed for billedanalyse og kvantificering af data til efterfølgende statistisk evaluering. Mislykkede billeder vil være svage, uklare, slørede eller på anden måde ubrugelige til subjektiv eller kvantitativ evaluering. Nogle billeder kan være egnede til subjektiv lagkarakteristikbestemmelse, mens de stadig er af utilstrækkelig kvalitet til kvantitativ analyse. Således vil graden og omhuen, som protokollen følges, direkte påvirke egnetheden af et givet billede til at tjene som datakilde til statistisk analyse.

Figur 4 viser den vellykkede anvendelse af teknikken i forbindelse med et mikrofluidisk dynamisk kulturmiljø og viser billedoptagelse ved indløb og udløb af to mikrofluidiske enheder. Figur 4A,B giver eksempler på lag, der er dyrket i 24 timer, og figur 4C,D viser eksempler på lag, der er dyrket i 48 timer. Figur 5 illustrerer de tilknyttede data, der er indsamlet fra mikrofluidikkanaleksperimentet, og omfatter tre prøver fra hver af de fem mikrofluidiske kanalbilleddannelsessteder, der er angivet i figur 2, fra hver dyrkningsvarighed. Fejlbjælker angiver standardafvigelser.

Figur 6 viser et 2D-billede af XY-planet i midten af den mikrofluidiske kanal, og figur 7 viser en 3D-visning af samme sted med dybdefarvekodning. Figur 8 repræsenterer vellykket billedoptagelse inden for et tæthedsvarighedseksperiment, der analyserer virkningerne af indledende cellesåningstæthed og kulturvarighed på NCI-H441-cellelagdannelse i det otte-brøndkammerede dækglasmiljø. Figur 8A-C angiver dyrkningsvarigheder på henholdsvis 24 timer, 48 timer og 96 timer. Figur 8X-Z angiver indledende cellesåningstætheder på henholdsvis 180.000, 90.000 og 45.000 celler / cm2. Figur 9 viser kvantitative data indsamlet fra det otte-brøndede dækglaseksperiment, herunder prøver fra tre steder i hver tæthed-varighed match-up. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelser, og p-værditest blev udført for at bestemme statistisk signifikante forskelle mellem tilsyneladende tætte værdier.

Disse to repræsentative eksperimenter inden for de dynamiske mikrofluidiske og statiske otte-brønds miljøer er forskellige use-case-eksempler, der demonstrerer, hvordan teknikken kan kontekstualisere eksperimentelle fund ved visuelt at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet af fysiologisk relevante monolag.

Figure 4
Figur 4: NCI-H441-cellelag dyrket i den mikrofluidiske kanal i 24 og 48 timer, afbildet på indsugnings- og udløbssiden som vist i figur 2. A) 24 timer, indsugningssiden. B) 24 timer, udløbssiden. C) 48 timer, indsugningssiden. D) 48 timer, udløbssiden. Blå repræsenterer kernefarvningen, og grøn repræsenterer farvningen af filamentøs actin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Grafisk repræsentation af de data, der blev indsamlet under 24-48 timers mikrofluidisk kanalbilleddannelseseksperiment. Dette omfatter seks tværsnitsarealprøver fra hvert af fem steder langs den relevante længde af den mikrofluidiske kanal (som vist i figur 2). Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: 2D-billede taget i XY-planet på et centralt sted inden for den mikrofluidiske kanal. Blå repræsenterer kernefarvningen, og grøn repræsenterer farvningen af filamentøs actin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: 3D-model af samme mikrofluidiske kanalplacering som figur 6. Farvekodningen viser dybdedata. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: NCI-H441 cellelag dyrket i det otte-brøndede kammerdækglas. For 24 timer (A), 48 timer (B) og 96 timer (C) ved indledende såtætheder på 180.000 (X), 90.000 (Y) og 45.000 (Z) celler /cm 2. Blå repræsenterer kernefarvningen, og grøn repræsenterer farvningen af filamentøs actin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Grafisk gengivelse af de data, der blev indsamlet under tætheds-varighed otte-brønds kultureksperiment. Dette omfatter seks tværsnitsarealprøver fra hver match-up af tæthedsvarighed. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den præsenterede protokol beskriver kulturen, tværbindingsfiksering, farvning, permeabilisering og konfokal mikroskopisk visualisering af NCI-H441 humane lungeepitelceller i det dynamiske miljø i et enkeltkanals mikrofluidisk flowarray såvel som i det statiske miljø i et traditionelt otte-brøndkammerdækglas. Med enhver mikrofluidisk cellekulturprotokol er strømningsbetingelserne for cellekulturmediet af afgørende betydning, da den høje hastighed har potentialet til at vaske cellerne væk eller forstyrre den normale samling af cellemonolaget. I mellemtiden har lavhastighedsstrømning potentialet til at "sulte" eller "kvæle" (henholdsvis utilstrækkelig næringsstof- og ilttilgængelighed) cellelaget på grund af diffusionsbegrænsningerne pålagt af den mikrofluidiske kanals uigennemtrængelige natur samt strømningsegenskaberne30. Ved at begynde med en 10 minutters ventetid (hvor celler forbliver suspenderet i det samme medie, der oprindeligt fyldte kanalen), derefter gå videre til en strømningshastighed på 0,2 μL / min, før de endelig ramper op til 10 μL / min i løbet af 4 timer, er disse konkurrerende behov afbalanceret for at fremme både celleadhærens og overlevelse.

Et andet kritisk trin i protokollen er korrekt forberedelse af den mikrofluidiske kanal, herunder konstruktion og forbehandling. Der skal udvises omhu for at sikre, at dækglasset er monteret korrekt på kammerkonstruktionen for at undgå lækage og potentiel forurening. Korrekt fastgørelse af dækglasset er også nødvendigt for at sikre, at kanalhøjden er konsistent og nøjagtigt gengivet mellem successive forsøg med forskellige konstruerede enheder. Mindre variation kan skyldes tolerancen for tykkelsen af de anvendte klæbestrimler samt den relative kompressibilitet. Minimering af enhver variabilitet vil hjælpe med konsistensen af eksperimentelle resultater. Korrekt forbehandling af den konstruerede kanal er vigtig for at sikre, at cellerne får lov til at klæbe til og indlede spredning på glasoverfladen. Ultralydsrensning af glasset forbedrer Poly-D-lysinadhærens, hvilket fremmer overholdelse af fibronectin. Tilsætning af fibronectin, et glycoprotein, der naturligt syntetiseres og udskilles af humane epitelceller, fremmer yderligere vedhæftningen af NCI-H441-cellerne til dækglasoverfladen, hvilket muliggør normal cellemonolagsudvikling31.

Yderligere er et af de vigtigste aspekter af denne protokol billedplaceringen. På trods af omhyggeligt kontrolleret forberedelse vil der på grund af det søjleformede volumen, der er tilgængeligt i områderne med de to kanalåbninger, være flere celler til stede på dækglasoverfladen i området direkte nedenunder såvel som ved siden af disse åbninger, selv når de overholder korrekte cellekulturteknikker. Af denne grund bør områder nær åbningerne ikke betragtes som en del af det "normale" dyrkede cellelag, da der vil forekomme betydelig flerlags-/cellestabling der. I stedet er det centrale område af den mikrofluidiske kanal et passende område at afbilde, da denne placering er uforstyrret af den fejl, der pålægges af kanalhøjdevariation nær åbningerne. Elektrodeplaceringerne på flowarrayet kan bruges til at guide billeddannelsessteder, og som tommelfingerregel skal alle scanninger, der er beregnet til at fange lag, der virkelig er repræsentative for de mikrofluidiske kanalforhold, tages på analoge steder inden for grænserne af de to længst fra hinanden elektroder på flowarrayet. Derudover er 40x forstørrelsesmålet i den beskrevne protokol specificeret til brug; Dette kan dog ændres, så det passer til brugerens behov. 40x forstørrelse blev valgt som den optimale forstørrelse på grund af dens evne til at tilbyde billeddannelse med høj opløsning og høj forstørrelse, mens den stadig bevarer et tilstrækkeligt antal celler til at fungere som en statistisk gyldig prøve.

En ændring, der kan foretages i den mikrofluidiske kanal, inkluderer ændring af kanalhøjden, hvilket kan opnås ved at variere antallet af afstandsstykker og klæbemidler, der bruges til at konstruere den mikrofluidiske kanal. Ændring af kanalhøjden vil sandsynligvis nødvendiggøre justering af flowparametrene for at sikre, at forskydningsspændingen ikke fjerner celler under fodringen. Som sådan vil enhver variation i kanalhøjde påvirke den ideelle starthastighed, ramp-up-hastighed og den endelige hastighed for medieflow. Den beskrevne protokol i denne artikel kan tjene som et middel til eksperimentelt at udlede passende strømningshastigheder sammen med indirekte metoder såsom ECIS. Derudover kan strømningshastigheder ændres, så de passer til behovene i forskellige cellelinjer, hvilket kan kræve tilpasning for at etablere optimale forhold. En anden ændring, der kan foretages, med nogle tilføjelser til trinene i denne protokol, er at udvide brugssagen for den beskrevne teknik ud over den relative sammenligning af cellelagets tværsnitsareal. Ved passende kalibrering ved hjælp af mikrosfærer eller mikroperler af kendte dimensioner kan der foretages nøjagtige volumetriske, topologiske og absolutte tværsnitsarealmålinger. Kalibrering ved hjælp af et referenceobjekt er nødvendig i dette tilfælde på grund af konfokalmikroskopets begrænsede Z-opløsning og potentialet for over- eller undersampling i Z-dimensionen på grund af den manuelle kontrol over Z-stack-trinstørrelse, som konfokale scanningssystemer tilbyder32.

En begrænsning ved denne protokol er manglen på ægte volumetrisk måling på grund af manglen på lodrette kalibreringstrin. Ovennævnte kalibrering og verifikationsteknikken ved hjælp af fluorescerende mikroperler af kendte dimensioner kan anvendes til virkelighedstro skalering. Derudover indebærer denne protokol brugen af forberedte, brugsklare pletter. Immunofluorescerende farvning ved hjælp af primære og sekundære antistoffer kræver ofte en flerdages protokol, der er mere involveret end den, denne artikel diskuterer. Det er dog sandsynligvis muligt at bruge immunfluorescerende farvning på denne måde, selvom nogle eksperimenter kan være nødvendige for at optimere arbejdsgangen. I betragtning af de yderligere trin, der er involveret i immunfluorescerende farvningsprotokoller, skal man sørge for at undgå klipning af det dyrkede cellelag under de mange vasketrin, da dette kan ændre egenskaberne af det cellelag, der i sidste ende evalueres, og derfor ugyldiggøre eventuelle konklusioner, der ville følge. Yderligere udvikling af denne teknik kan omfatte automatisering af billed- og dataanalyserne, herunder detektion og kvantificering af interesseregioner (ROI) til bestemmelse af tværsnitsareal. Derudover kan udvidelse af denne teknik til at omfatte forskellige intra- og ekstracellulære målstrukturer (måske farvning til mål såsom tight-junction-proteiner) udvide brugssagen for denne metode til 3D-co-lokalisering inden for mikrofluidiske cellekulturenheder.

For at producere de mest fysiologisk repræsentative cellelag skal lungeepitelceller dyrkes i mikrofluidiske kanaler med en luft-væske-grænseflade (ALI) på dyrkningsoverfladen, hvilket typisk opnås ved anvendelse af polydimethylsiloxan (PDMS), et fleksibelt materiale, der gøres gennemtrængeligt ved introduktion af porer i μm-skala. ALI-kulturbetingelser tillader dannelse af cellelag, der mest ligner de fysiologiske egenskaber ved in vivo lungeepitel33. Selv om det er teknisk muligt, er det upraktisk og utilgængeligt for de fleste forskere at anvende ECIS i et ALI-kulturmiljø med en PDMS-kulturoverflade i et dynamisk mikrofluidisk miljø, da der ikke findes kommercielt tilgængelige apparater til en så kompleks cellekultursamling34. En årsag til denne vanskelighed kan være det paradoksale behov for en permeabel kulturoverflade, der stadig er i stand til at fungere som en fast elektrode med henblik på ECIS-målinger. Som sådan er der i øjeblikket behov for en metode til visuelt at verificere karakteristika og fysiologisk relevans af cellelag dyrket i iltuigennemtrængelige kulturmiljøer som dem, der findes i ECIS-flowarrays.

Denne metode udvider den traditionelle metode til at sikre korrekt sammenløb ved hjælp af todimensionel mikroskopi ved at muliggøre 3D-visualisering, hvilket i høj grad udvider antallet af cellelagsegenskaber, der kan observeres, kvantificeres og analyseres. Derudover tillader dette en subjektiv bestemmelse af tilstedeværelsen af et monolag, lagensartethed og andre egenskaber, der anses for relevante til eksperimentelle formål. Denne protokol er vigtig, fordi den tjener som et middel til visuel verifikation og evaluering af cellelag, der produceres i mange iltuigennemtrængelige miljøer, såsom i ECIS-eksperimenter, der evaluerer barrierefunktionsegenskaber hos epitelceller, der udsættes for atelectrauma. Dette tjener også som en metode, der kan bruges i fremtidigt arbejde til at bestemme, om et sæt dynamiske mikrofluidiske kulturbetingelser producerer cellelag, der er relevante og egnede til yderligere eksperimentering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Alan Shepardson for at designe skæremønsteret til 3M-klæbemidlet og mylararket, der anvendes i mikrofluidisk kanalkonstruktion og til test af cellekulturmediestrømningshastigheden og sprøjtepumpeprogrammeringen. Finansiering blev leveret af NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 og Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A1R HD25 Confocal Microscope System Nikon A1R HD25 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/confocal-microscopes/a1hd25-a1rhd25/specifications
ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) Invitrogen R37110 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110
Adhesive Transfer Tape Double Linered 3M 468MP https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/
Air-Tite HSW Soft-Ject Disposable Syringes Air-Tite RL5 14-817-53 https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml
BAISDY 4 mil (0.1 mm) Thick Mylar Sheet BAISDY AS022 https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC
Branson Ultrasonics M Series Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics 15-336-100 https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100
Corning Fibronectin, Human Fisher Scientific CB-40008 https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true
DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133
ECIS Cultureware Disposable Electrode Arrays 8 x 10 ECIS Flow Array Applied BioPhysics 1F8x10E PC https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E
Enterprise Technology Solutions UV Sterilizer Cabinet, White Enterprise Technology Solutions 50-211-1163 https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 26140079 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079
Finnpipette F2 Variable Volume Pipettes Thermo Scientific 4642090 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090
Fisherbrand 50mL Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes Fisher Scientific 06-443-21 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles (#1.5) Fisher Scientific 12-544-GP https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-458 https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458
Gibco RPMI 1640 Medium Gibco 11875093 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093
Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free) Invitrogen FB002 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002
ImageJ Fiji ImageJ ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads
Immersion Oil F 30 cc Nikon MXA22168 https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/accessories/immersion-oil/specifications
Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator, 821 L, Polished Stainless Steel Thermo Scientific 3950 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950
Laxco LMC-3000 Series Brightfield Compound Microscope System Laxco LMC3BF1 https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1
Masterflex Fitting, Nylon, Straight, Male Luer Lock to Hose Barb Adapters, 1/16" ID; 25/PK Masterflex ZY-45505-31 https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&
gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC
UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k
pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0
udmwaAuDHEALw_wcB
Microsoft Excel Microsoft 0016 https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547
National Target All-Plastic Disposable Syringes Thermo Scientific 03-377-24 https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8
NCI-H441 Human Epithelial Lung Cells American Type Culture Collection (ATCC) HTB-174 https://www.atcc.org/products/htb-174
NE-1600 Six Channel Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1600 https://www.syringepump.com/NE-16001800.php
NIS Elements AR Nikon NIS Elements AR https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) Invitrogen R37605 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass Thermo Scientific 155411 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361
Parafilm M Wrapping Film Fisher Scientific S37441 https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441
PendoTech 3-Way Stopcock, Polysulfone, Male/Female Luer Inlet x Female Luer Branch PendoTech ZY-19406-49 https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649
Phosphate Buffered Solution (PBS), pH 7.4 Gibco 10010023 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023
Poly-D-Lysine Gibco A3890401 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401
Reynolds Aluminum Wrap Foil Reynolds 458742928317 https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M
Saponin Millipore Sigma (Sigma Aldrich) 47036 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant Invitrogen S36917-5X2ML https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML
Thermo Scientific 1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet Package Thermo Scientific 13-100-752PM https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood
Tygon Transfer Tubing, BioPharm Platinum-Cured Silicone, 1/16" ID x 1/8" OD; 50 Ft Cole-Parmer EW-95702-01 https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 5, 18 (2019).
  2. Rawal, G., Yadav, S., Kumar, R. Acute respiratory distress syndrome: An update and Review. Journal of Translational Internal Medicine. 6 (2), 74-77 (2018).
  3. Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface-tension-induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 94 (2), 770-783 (2003).
  4. Modrykamien, A. M., Gupta, P. The acute respiratory distress syndrome. Baylor University Medical Center Proceedings. 28 (2), 163-171 (2017).
  5. Jacob, A. -M., Gaver, D. P. Atelectrauma disrupts pulmonary epithelial barrier integrity and alters the distribution of tight junction proteins ZO-1 and Claudin 4. Journal of Applied Physiology. 113 (9), 1377-1387 (2012).
  6. Kay, S. S., Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Pressure gradient, not exposure duration, determines the extent of epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. Journal of Applied Physiology. 97 (1), 269-276 (2004).
  7. Jacob, A. M., Gaver, D. P. An investigation of the influence of cell topography on epithelial mechanical stresses during pulmonary airway reopening. Physics of Fluids. 17 (3), 031502 (1994).
  8. Gaver, D. P., et al. The POOR get POORer: A hypothesis for the pathogenesis of ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 202 (8), 1081-1087 (2020).
  9. Jain, P., et al. Reconstruction of ultra-thin alveolar-capillary basement membrane mimics. Advanced Biology. 5 (8), 2000427 (2021).
  10. Byrne, M. B., Leslie, M. T., Gaskins, H. R., Kenis, P. J. A. Methods to study the tumor microenvironment under controlled oxygen conditions. Trends in Biotechnology. 32 (11), 556-563 (2014).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300 (2014).
  12. Jaccard, N., et al. Automated method for the rapid and precise estimation of adherent cell culture characteristics from phase contrast microscopy images. Biotechnology and Bioengineering. 111 (3), 504-517 (2013).
  13. Hagiyama, M., et al. Modest static pressure suppresses columnar epithelial cell growth in association with cell shape and cytoskeletal modifications. Frontiers in Physiology. 8, 00997 (2017).
  14. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of Nucleic Acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  15. Zhu, L., Rajendram, M., Huang, K. C. Effects of fixation on bacterial cellular dimensions and integrity. Iscience. 24 (4), 102348 (2021).
  16. Lust, R. M. The Pulmonary System. XPharm: The Comprehensive Pharmacology Reference. , Elsevier. 1-6 (2007).
  17. EpilogueLaser. FusionSeries: Pro & Edge Laser System Manual and Original Instructions. EpilogueLaser. , Golden, CO: Author. (2022).
  18. Chitnis, D. S., Katara, G., Hemvani, N., Chitnis, S., Chitnis, V. Surface disinfection by exposure to germicidal UV light. Indian Journal of Medical Microbiology. 26 (3), 241 (2008).
  19. Sandell, L., Sakai, D. Mammalian cell culture. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 5 (1), 4 (2011).
  20. New Era Pump Systems. Multi-Phaser Programmable Syringe Pump: NE-1000 Series User Manual. New Era Pump Systems. , Farmingdale, NY. (2014).
  21. Thermo Fisher Scientific. Safety Data Sheet: Image-iT Fixative Solution (4% formaldehyde, methanol-free). Thermo Fisher Scientific. , Waltham, MA. (2018).
  22. Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Rao, U. K., Ranganathan, K., Elizabeth, J. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Immunocytochemical Methods and Protocols. 588, 63-66 (2009).
  24. Thermo Fisher Scientific. ActinGreen 488 ReadyProbes Reagent Protocol. Thermo Fisher Scientific. , Walther, MA. (2022).
  25. Slowfade Glass soft-set Antifade Mountant. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML?SID=srch-hj-S36917-5X2ML (2022).
  26. Ravikumar, S., Surekha, R., Thavarajah, R. Mounting media: An overview. Journal of Dr. NTR University of Health Sciences. 3 (5), 1-8 (2014).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochemistry and Biophysics Reports. 25, 100916 (2021).
  28. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  29. Ferriera, F., Rasband, W. ImageJ User Guide. National Institutes of Health. , Bethesda, MD. (2012).
  30. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  31. Smith, H. S., Riggs, J. L., Mosesson, M. W. Production of fibronectin by human epithelial cells in culture. American Association for Cancer Research. 39 (10), 4138-4144 (1979).
  32. Sieck, G. C., Mantilla, C. B., Prakash, Y. S. Volume measurements in confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, Academic Press. 296-315 (1999).
  33. Heijink, I. H., et al. Characterisation of cell adhesion in airway epithelial cell types using electric cell-substrate impedance sensing. European Respiratory Journal. 35 (4), 894-903 (2009).
  34. Zhang, X., Wang, W., Li, F., Voiculescu, I. Stretchable impedance sensor for mammalian cell proliferation measurements. Lab on a Chip. 17 (12), 2054-2066 (2017).

Tags

Denne måned i JoVE nummer 185
Forberedelse og strukturel evaluering af epitelcellemonolag i en fysiologisk størrelse mikrofluidisk kulturanordning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. … More

Damle, E. B., Yamaguchi, E., Yao, J. E., Gaver III, D. P. Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device. J. Vis. Exp. (185), e64148, doi:10.3791/64148 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter