Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der normalen und aberranten Cytosinmethylierung in intakten Zebrafischembryonen.
Abstract
Die Cytosinmethylierung ist bei Wirbeltierarten hoch konserviert und spielt als Schlüsselfaktor für epigenetische Programmierung und Chromatinzustand eine entscheidende Rolle in der frühen Embryonalentwicklung. Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin voran. Epigenetische Reprogrammierung ist eine kritische Phase während der utero-Entwicklung , und die mütterliche Exposition gegenüber Chemikalien hat das Potenzial, das Epigenom innerhalb der Nachkommen neu zu programmieren. Dies kann möglicherweise zu nachteiligen Ergebnissen wie unmittelbaren phänotypischen Folgen, langfristigen Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationalen Auswirkungen vererbter epigenetischer Markierungen führen. Obwohl die Bisulfit-basierte Sequenzierung es Forschern ermöglicht, die Cytosinmethylierung mit Basenpaarauflösung abzufragen, sind sequenzierungsbasierte Ansätze unerschwinglich und schließen daher die Fähigkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Aufgrund der Leichtigkeit der automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin als physiologisch intaktes Modell zur Aufdeckung von xenobiotisch vermittelten Signalwegen verwendet, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen embryonalen Entwicklung beitragen. Daher beschreiben wir unter Verwendung kommerziell verfügbarer 5-mC-spezifischer Antikörper eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie, automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse. Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die erfolgreich 5-mC-Spiegel in situ in Zebrafischembryonen während der frühen Entwicklung nachweist und quantifiziert. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.
Introduction
Enzymatische Modifikationen treiben die aktive Methylierung und Demethylierung von Cytosin zu 5-Methylcytosin (5-mC) und die anschließende Oxidation von 5-mC zu 5-Hydroxymethylcytosin, 5-Formylcytosin und 5-Carboxylcytosin 1,2 voran. Tris(1,3-dichlor-2-propyl) phosphat (TDCIPP) ist ein in den Vereinigten Staaten weit verbreitetes Flammschutzmittel, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es den Verlauf der Cytosinmethylierung nach früher embryonaler Exposition von 0,75 Stunden nach der Befruchtung (hpf) bis zur frühen Gastrulation (6 hpf) verändert3,4,5,6,7,8 . Bei Wirbeltieren sind 5-mC und seine modifizierten Derivate entscheidend für die Regulierung der frühen Embryonalentwicklung9. Die Befruchtung eines Embryos löst die Demethylierung der elterlichen DNA aus, gefolgt vom mütterlichen mRNA-Abbau, der Aktivierung des zygotischen Genoms und der Remethylierung des zygotischen Genoms9. Zu den biologisch relevanten Prozessen, die die Cytosinmethylierung nutzen, gehören die Histonmodifikation, die Rekrutierung von Transkriptionsmaschinen, die RNA-Methylierung, die epigenetische Reprogrammierung und die Bestimmung der Chromatinstruktur10,11. Die Cytosinmethylierung ist auch bei Wirbeltierarten konserviert, was unterstreicht, wie wichtig es ist, zu verstehen und zu untersuchen, wie aberrante Cytosinmethylierung den Entwicklungsverlauf eines Organismus beeinflussen kann11. Darüber hinaus reagiert die Entwicklung in utero empfindlich auf mütterliche Exposition und hat das Potenzial, nachteilige Ergebnisse wie unmittelbare phänotypische Folgen, langfristige Auswirkungen auf die Krankheitsanfälligkeit bei Erwachsenen und transgenerationale Effekte von vererbten epigenetischen Markierungen zu verursachen12,13,14.
Lange Strecken von Cytosin-Guanin-Paaren oder CpG-Inseln waren die primären Schwerpunkte von Forschern, die darauf abzielen, die Dynamik der Cytosinmethylierung über das Genom 15,16,17 zu charakterisieren. Bisulfit-basierte Strategien wie die Bisulfitsequenzierung des gesamten Genoms, die Bisulfitsequenzierung mit reduzierter Repräsentation und die Bisulfitamplikonsequenzierung stellen den Goldstandard für die Abfrage der Cytosinmethylierung bei Basenpaarauflösung dar. Sequenzierungsbasierte Ansätze sind jedoch unerschwinglich und schließen daher die Möglichkeit aus, die Cytosinmethylierung über Entwicklungsstadien, mehrere Konzentrationen pro Chemikalie und Replikation von Embryonen pro Behandlung hinweg zu überwachen. Darüber hinaus liefern sequenzierungsbasierte Ansätze keine Informationen über die räumliche Lokalisation, die für das Verständnis potenziell betroffener Zelltypen und -bereiche innerhalb eines sich entwickelnden Embryos entscheidend ist. In ähnlicher Weise beruhen globale DNA-Methylierungsassays wie die methylierungsabhängige Restriktionsanalyse, 5-mC-Enzym-verknüpfte Immunoassays (ELISAs) und die 5-Methyl-2'-Desoxycytidin-(5-mC)-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) auf Zell- oder Gewebehomogenaten und schließen daher die Fähigkeit aus, die Lokalisation und das Ausmaß der Cytosinmethylierung über Raum und Zeit innerhalb intakter Proben zu überwachen12,18.
Aufgrund der einfachen automatisierten In-vivo-Bildgebung , genetischer Manipulationen, schneller Ex-utero-Entwicklungszeit und Haltung während der Embryogenese werden Zebrafischembryonen weiterhin häufig als physiologisch intakte Modelle verwendet, um xenobiotisch vermittelte Signalwege aufzudecken, die zu nachteiligen Ergebnissen während der frühen Embryonalentwicklung beitragen. Daher beschreibt das folgende Protokoll unter Verwendung kommerziell verfügbarer Antikörper, die spezifisch für 5-mC sind, eine kostengünstige Strategie für die schnelle und effiziente raumzeitliche Überwachung der Cytosinmethylierung in einzelnen, intakten Zebrafischembryonen durch Nutzung der gesamten Immunhistochemie (IHC), automatisierter High-Content-Bildgebung und effizienter Datenverarbeitung unter Verwendung der Programmiersprache vor der statistischen Analyse.
Nach heutigem Kenntnisstand ist diese Methode die erste, die 5-mC in intakten Zebrafischembryonen überwacht. Die Methode ermöglicht den Nachweis von DNA-Methylierung innerhalb der Zellmasse und hat auch die Fähigkeit, Cytosin-Methylierung von Eigelb-lokalisierten mütterlichen mRNAs während des mütterlichen zu zygotischen Übergangs nachzuweisen. Insgesamt wird diese Methode für die schnelle Identifizierung von Chemikalien nützlich sein, die das Potenzial haben, die Cytosinmethylierung in situ während der epigenetischen Reprogrammierung zu stören.
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Protocol
Erwachsene Züchter wurden in Übereinstimmung mit einem vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Tierverwendungsprotokoll (#20180063) an der University of California, Riverside, behandelt und behandelt.
1. Embryonenentnahme durch Zebrafische und chemische Exposition
- Fügen Sie Becken mit geschlechtsreifen und reproduktiv lebensfähigen erwachsenen männlichen und weiblichen Zebrafischen Zuchtfallen hinzu. Fügen Sie mindestens drei Fallen pro 6-L-Tank mindestens 12 Stunden vor der Entnahme um ~9:00 Uhr hinzu, was der ungefähren Zeit der Befruchtung und des Laichens von Eiern in Tanks entspricht.
- Bereiten Sie am Morgen der Entnahme eine frische Expositionslösung vor. Die Expositionslösung wird mit einer 5-ml-Pipette hergestellt und 5,0 mL partikelfreies Systemwasser in eine 60 mm Glas-Petrischale gegeben.
- Verwenden Sie dann eine 10-μL-Glas-Mikrokapillarpipette, um 10 μl Vehikel (Dimethylsulfoxid oder DMSO) oder chemische Stammlösung in Systemwasser in der Glasschale zu übertragen.
- Schwenken Sie die Glaspetrischale, um sicherzustellen, dass sich die Stammlösung auflöst. Weitere 5,0 ml Systemwasser in die Glas-Petrischale geben. Schwenken Sie die Glas-Petrischale, um die Belichtungslösung zu homogenisieren.
- Wiederholen Sie dies für jede Behandlungsgruppe in Wiederholungen von vier, um vier Replikate pro Behandlung zu erhalten.
- Nachdem die Belichtungslösungen vorbereitet wurden, verschließen Sie das Glasgeschirr mit Glasdeckeln, um die Verdunstung zu minimieren.
- Lassen Sie beim Entfernen der Zuchtfallen aus jedem Tank vorsichtig das Wasser in jeder Falle in den Tank abfließen, bevor Sie es aus den Tanks entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Fallen mit der rechten Seite nach oben bleiben.
- Bringen Sie die Zuchtfallen in die Laborspüle und spülen Sie sie mit einer Spritzflasche, die mit Umkehrosmosewasser (RO) gefüllt ist, in ein Fischnetz, das zuvor mit 10% Bleichmittel getränkt und mit Wasser gespült wurde. Spülen Sie die Embryonen, bis alle Trümmer beseitigt sind und nur saubere Embryonen übrig bleiben.
- Die Embryonen aus dem Fischnetz mit einer mit RO-Wasser gefüllten Spritzflasche in eine 100 mm große Kunststoff-Petrischale geben. Sortieren Sie 50 lebende Embryonen nach dem Zufallsprinzip 0,75 h nach der Befruchtung (hpf) und entfernen Sie überschüssiges RO-Wasser.
- Legen Sie die sortierten Embryonen mit einem Mikrospatel in die Behandlungslösung. Alle Embryonen müssen sich frühestens um 9:45 Uhr im Vehikel oder in der Behandlungslösung befinden. Schwenken Sie die Glasschalen, um sicherzustellen, dass die Embryonen gleichmäßig in der Behandlungslösung beschichtet sind.
- Nachdem vier Replikatschalen (N = 50 pro Replikat) für jede Behandlungsgruppe aufgestellt wurden, setzen Sie den Glasdeckel auf die Belichtungsschalen und geben Sie alle Schalen in einen temperaturgesteuerten Inkubator, der auf 28 °C bis 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf oder 10 hpf eingestellt ist.
- Frisches 4%iges Paraformaldehyd (PFA) mindestens 4 h vor Beendigung der Exposition zubereiten und bei 4 °C lagern.
- Drehen Sie die Kochplatte auf 115 °C, stellen Sie 20 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml RO-Wasser) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen her und wiegen Sie 800 mg Paraformaldehyd aus.
- In einem chemischen Abzug 1x PBS-Lösung in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben geben, 800 mg Paraformaldehyd hinzufügen und dann 2 μL 10 N NaOH hinzufügen. Legen Sie ein Thermometer in den Kolben, stellen Sie den Kolben auf die Heizplatte und beobachten Sie die Temperatur unter Rühren.
- Wenn die Temperatur 62-65 °C erreicht, entfernen Sie die 4% PFA von der Heizplatte und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) abkühlen. Lagern Sie die 4% PFA bei 4 °C.
- Sobald die Expositionsdauer abgelaufen ist, entnehmen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und übertragen Sie alle lebenden Embryonen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Saugen Sie die Restexpositionslösung mit einer 1-ml-Pipette ab. Saugen Sie keine Embryonen ab.
- Geben Sie 500 μL gekühltes 4% PFA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie die Embryonen in 4% PFA durch mehrmaliges Invertieren. Lassen Sie die Embryonen über Nacht 4% PFA fixieren.
HINWEIS: Es wird nicht empfohlen, Embryonen länger als 12 h in PFA zu lassen.
2. Dechorionation von Embryonen
- Am nächsten Tag saugen Sie die 4% PFA ab, resuspendieren Sie die Embryonen in 1x PBS und pipettieren Sie vorsichtig für 30 s. Falls erforderlich, stoppen Sie das Protokoll bei diesem Schritt und lagern Sie die Embryonen in 1x PBS bei 4 °C für bis zu 48 h.
- Mit einer Kunststoff-Transferpipette die fixierten Embryonen vorsichtig in eine mit RO-Wasser gefüllte Glasschale übertragen und 30 s lang sanft schwenken. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Verwenden Sie Spritzennadeln unter 5,0-facher Vergrößerung mit einem Standard-Stereomikroskop, um alle Embryonen manuell zu dechorionieren. Tun Sie dies, indem Sie die Nadelspitze verwenden, um das Chorion zu punktieren und es sanft vom Eigelb und der Zellmasse abzuziehen4.
- Sobald die Embryonen dechorioniert wurden, verwenden Sie eine Glasmikrokapillarpipette, um bis zu 25 intakte Embryonen in einen Immunchemie-Korb (IHC) zu übertragen und den IHC-Korb in eine 96-Well-Platte zu legen. Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um das RO-Wasser aus jedem Brunnen abzusaugen.
3. Immunhistochemie mit 5-mC-spezifischen Antikörpern
- Resuspendieren Sie die Embryonen in 500 μL Blockierpuffer (1x PBST + 2% Schafserum + 2 mg/ml Rinderserumalbumin) pro Vertiefung und wickeln Sie die Platte mit Parafilm und Aluminiumfolie ein, um sie vor Licht zu schützen. Bei 4 °C 4 h auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren.
- Entfernen Sie die Parafilmfolie und das Aluminium und verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um den Blockierpuffer aus jeder Vertiefung abzusaugen. Ersetzen Sie es durch 500 μL einer 1:100-Verdünnung eines monoklonalen Maus-Anti-5-mC-Antikörpers im Blockierungspuffer. Inkubation aller Embryonen mit primären Antikörpern mit Ausnahme einer Untergruppe von Vehikelkontrollembryonen, die mit dem Blockierungspuffer inkubiert werden, um Hintergrundgeräusche zu berücksichtigen. Achten Sie darauf, die Integrität der Embryonen nicht zu stören oder Embryonen während dieses Schrittes abzusaugen.
- Wickeln Sie die Platte wieder in Parafilm und Aluminiumfolie ein und lassen Sie die Platte über Nacht bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren.
- Am nächsten Tag entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie sie durch 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 1x PBST für 15 min pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler (100 U/min).
- Ersetzen Sie 1x PBST durch eine 1:500 Verdünnung von Ziegen-Anti-Maus-IgG-Antikörpern im Blockierpuffer und inkubieren Sie alle Embryonen mit dem sekundären Antikörper. Lassen Sie die Platte bei 4 °C über Nacht auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren.
- Am nächsten Tag den sekundären Antikörper entfernen und die Restlösung dreimal mit 1x PBST für 15 min pro Waschgang auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) waschen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier für bis zu 48 h gestoppt werden, wenn die IHC-Körbe in sauberen Brunnen gelagert werden, die mit 1x PBS gefüllt sind. - Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um 1x PBST aus jedem Brunnen abzusaugen und den IHC-Korb in eine mit RO-Wasser gefüllte Glas-Petrischale zu stellen. Sortieren Sie unter einem Standard-Stereomikroskop zufällig intakte Embryonen in eine 96-Well-Platte, was zu einem Embryo pro Vertiefung führt.
- Entfernen Sie mit einer 1-ml-Pipette das gesamte RO-Wasser aus den einzelnen Vertiefungen und ersetzen Sie es durch 200 μL 1x PBS. Zentrifugieren Sie die Platte für 3 min bei 1 x g.
4. Automatisierte Bildgebung von Embryonen innerhalb von 96-Well-Platten
- Bilden Sie die Embryonen mit einem 2x-Objektiv unter Durchlicht und FITC mit einem High-Content-Screening-System (Table of Materials) ab.
HINWEIS: Ein fluoreszierendes Bild jedes Embryos wurde automatisch mit der oben genannten Vergrößerung und einem FITC-Filter19 aufgenommen.- Wählen Sie Autofokus , um sicherzustellen, dass sich der Fokus der Kamera auf der Unterseite der Platte befindet und um die untere Dicke versetzt ist.
- Wählen Sie eine FITC-Wellenlänge mit einer Belichtungsdauer von 100 ms und stellen Sie den Autofokus auf Laser mit Z-Offset ein. Beobachten und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Bildaufnahme in mehreren Vertiefungen, bevor Sie mit der Plattenaufnahme beginnen.
HINWEIS: Das Gerät erfasst automatisch Bilder von allen ausgewählten Vertiefungen, die Embryonen enthalten. Eine 96-Well-Platte benötigte ca. 30 Minuten für die Bildaufnahme und Datenspeicherung. Für die Dauer des Aufnahmezeitraums wurde die Innentemperatur innerhalb des Bildgebungssystems auf RT gehalten.
- Nach der Bildaufnahme führen Sie eine Datenanalyse mit dem High-Content-Screening-System und einem benutzerdefinierten automatisierten Bildanalyseverfahren durch. Wählen Sie jeden Embryo auf der 96-Well-Platte aus, der auf Gesamtfläche und integrierte Intensität der Fluoreszenz analysiert werden soll.
HINWEIS: Die Analyse umfasste die Bereitstellung von Bildern, die Überlagerungen von Datenpunkten aus der Analyse enthielten. - Tabellieren Sie dann die Datenpunkte und exportieren Sie sie aus dem High-Content-Screening-System, indem Sie unter Measure die Option Open Data Log to a spreadsheet auswählen. Die Teile der Plattenerfassung und Datenanalyse sind in Abbildung 1 dargestellt.
5. Datenanalyse
- Laden Sie die exportierte Tabelle in ein Computerprogramm hoch, in dem das Deployer-Paket (dplyr) verwendet wird, um Daten für jedes Bohrloch zu sortieren, zu summieren und nach Bohrlochnummer zu filtern. Das writexl-Paket wird dann verwendet, um die summierten Daten in eine Tabelle zu exportieren. Der 5mC-Programmcode wird in Supplemental File 1 angezeigt.
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Representative Results
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, festzustellen, ob eine Behandlung die relative Häufigkeit von 5-mC beeinflusst, indem die Gesamtfläche und relative Intensität der Fluoreszenz in fixierten und markierten Zebrafischembryonen bewertet wird. Nach Abschluss des Protokolls kann zunächst mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop festgestellt werden, ob der IHC für die gesamte Montage erfolgreich war. Wenn markierte Embryonen unter einem FITC- oder GFP-Filter beobachtet werden, wird ein positives Ergebnis durch ein positives FITC-Signal innerhalb des Embryos angezeigt, während ein negatives Ergebnis durch das Fehlen von Fluoreszenz innerhalb der Kontrollembryonen angezeigt wird. Mit einem High-Content-Screening-System können diese Ergebnisse auch während der Bildaufnahme mit einem FITC-Filter bestätigt werden. Darüber hinaus identifiziert und quantifiziert das benutzerdefinierte Modul während der Datenanalyse die Gesamtfläche und die integrierte Intensität der Fluoreszenz. Repräsentative Bilder erfolgreicher Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt, wo die aufgenommenen Bilder erfolgreich vom benutzerdefinierten Modul gemessen wurden und einzelne Datenpunkte (als blaue Überlagerung dargestellt) sowohl für die Gesamtfläche als auch für die integrierte Intensität erfasst wurden.
Während der Datenextraktion ist die Schwellenwertstringenz innerhalb des benutzerdefinierten Moduls eine zusätzliche Variable, die optimiert werden muss, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren und die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, einen signifikanten behandlungsspezifischen Unterschied in der 5-mC-Häufigkeit zu erkennen. Während der Optimierung lieferte dieser letzte Schwellenwert die signifikanteste Trennung zwischen Medianen der Kontroll- und Behandlungsgruppe (z. B. das größte Signal-Rausch-Verhältnis). Repräsentative Ergebnisse bei variierenden benutzerdefinierten Modulschwellenwerten, die sich auf das Signal-Rausch-Verhältnis auswirken, sind in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 1: Ein Flussdiagramm mit einer grafischen Darstellung des Protokolls für die Exposition und den In-situ-Nachweis von 5-Methylcytosin für 6 HPF-Zebrafischembryonen. Die Richtung des Flussdiagramms ist mit schwarzen Pfeilen versehen. Die Expositionen traten in Replikaten von vier Replikatschalen pro Behandlung und 50 Embryonen pro Replikationsschale auf. Abkürzungen: cm = Zellmasse; ys = Dottersack. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Optimierung des benutzerdefinierten Moduls. Die Panels A-D zeigen die Optimierung des kundenspezifischen Moduls durch Bewertung des Medians und der Verteilung der 5-mC-spezifischen Gesamtfläche und der integrierten Intensität innerhalb von Zebrafischembryonen bei 6 hpf. (A,B) Verschiedene getestete Schwellenwerte sind in der Legende rechts aufgeführt (Unterschied von 100 zwischen den einzelnen Schwellenwerten) und sind nach Stringenz geordnet, wobei 1500 und 2500 die geringsten bzw. strengsten getesteten Schwellenwerte darstellen. (C,D) Verschiedene getestete Schwellenwerte sind in der Legende rechts aufgeführt (Differenz von 250 zwischen den einzelnen Schwellenwerten) und nach Stringenz geordnet, wobei 1500 und 2500 die geringsten bzw. strengsten getesteten Schwellenwerte darstellen. Das (*) in C,D bezeichnet Schwellenwerte, die sich signifikant von Vehikelembryonen unterscheiden (p < 0,05). Für A,B waren alle getesteten Schwellenwerte von der Fahrzeugkontrolle signifikant. Die x-Achse bezeichnet die Exposition gegenüber einem Fahrzeug (0,1% DMSO) oder 0,78 μM TDCIPP (Positivkontrolle). Die y-Achse bezeichnet die relative Fluoreszenz. Panel A zeigt die Gesamtfläche von 5-mC, die in Embryonen als Funktion der Behandlung nachgewiesen wurde, während Panel B die integrierte Intensität von 5-mC innerhalb desselben Bereichs anzeigt. Ein Embryo wird durch einen einzigen Datenpunkt für insgesamt N = 96 für jede Behandlungsgruppe repräsentiert. Alle Expositionen wurden in Replikaten von vier Schalen pro Behandlung mit 50 Embryonen pro Glasschale durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Datei 1: 5mC Programmcode. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Während dieses Protokolls gibt es einige Schritte, die kritisch sind. Erstens ist es bei der Dechorionierung von Embryonen wichtig, die Nadel vom Gewebe des Embryos / Dottersacks / der Zellmasse wegzuzeigen, da diese Teile des sich entwickelnden Embryos sehr zerbrechlich und leicht zu durchstechen sind. Zweitens, wenn Sie markierte Embryonen in einzelne Vertiefungen übertragen, verwenden Sie eine Glaspipette, um Embryonen zu übertragen, da sie an einer Kunststoffpipette haften. Drittens ist bei der Durchführung von IHC für die gesamte Montage darauf zu achten, dass die Platte vor Licht geschützt ist. Lassen Sie die Platte schließlich nach Abschluss des gesamten IHC-Protokolls vor der Bildgebung über Nacht in 1x PBS bei 4 ° C inkubieren, da dies die Autofluoreszenz minimiert, die die Bildgebung beeinträchtigen kann.
Wenn es Embryonen gibt, die während der Dechorionation oder IHC abgetrennt wurden, schließen Sie diese Embryonen vom Rest des Protokolls aus. Wenn keine Fluoreszenz nachgewiesen wird, kann dies durch längeres Inkubieren (bis zu 16 h) gelöst werden. Da es sich um einen 5-mC-spezifischen Antikörper handelt, können sowohl DNA als auch RNA markiert werden. Ein allgemeines Verständnis der räumlichen Lokalisierung ist wichtig.
Es gibt einige Einschränkungen bei dieser Methode. Erstens handelt es sich um eine nicht zielgerichtete Technik, dh sie liefert nicht die genaue Menge von 5 mC, sondern die relative Häufigkeit basierend auf der Gesamtfläche und der integrierten Intensität der Fluoreszenz. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll nur vor der Segmentierung an Embryonen getestet, so dass beim Testen späterer Entwicklungsstadien möglicherweise zusätzliche Optimierungen erforderlich sind. Da das Verfahren IHC-basiert ist, kann es außerdem anfällig für unspezifische Bindungen sein; Daher ist es nicht sicher, dass es sich nur um eine 5-mC-Färbung handelt, die in DNA lokalisiert ist, sondern auch um eine 5-mC-Färbung, die auf RNA lokalisiert ist. Schließlich kann eine Optimierung der Datenanalyseschwelle erforderlich sein, abhängig von der Chemikalie und der Stringenz der bevorzugten Bedingungen.
Insgesamt bietet diese Methode eine schnelle und kostengünstige Detektion von 5 mC über mehrere Entwicklungsstadien und chemische Konzentrationenhinweg 3. Es bietet daher eine Alternative zu kostenintensiven Bisulfit-Sequenzierungsansätzen. Durch das Angebot dieses Protokolls können Forscher diese Methode verwenden, um Chemikalien schnell zu screenen und zu beurteilen, wie die Häufigkeit von 5-mC während der frühen Embryonalentwicklung beeinflusst werden kann. Darüber hinaus kann diese Methode als Prescreening-Tool verwendet werden, um den Konzentrationsbereich, den Entwicklungszeitraum und/oder das Empfindlichkeitsfenster zu identifizieren, in dem die interessierende Chemikalie die 5-mC-Häufigkeit beeinflusst. Alternativ kann dieselbe Methode für einen anderen Biomarker und Antikörper verwendet werden, obwohl eine weitere Optimierung erforderlich ist. Mit dieser Methode kann ein Forscher schnell, effizient und kostengünstig eine Chemikalie untersuchen und identifizieren, die die relative Häufigkeit von 5 mC in Zebrafischembryonen verändert, bevor er in arbeitsintensive Bisulfit-Sequenzierungsansätze investiert. Diese Methode ist jedoch zebrafischspezifisch, und weitere Forschung ist erforderlich, um festzustellen, ob 5-mC in situ in frühen Embryonen anderer Modellorganismen nachgewiesen werden kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine bekannten konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen haben, die die in diesem Papier berichtete Arbeit hätten beeinflussen können.
Acknowledgments
Die Forschungsunterstützung wurde durch ein UCR Graduate Division Fellowship für SAB, ein NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) für SAB und ein National Institutes of Health Stipendium (R01ES027576) und USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) für DCV bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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