Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Протоколы для CRISPR/Cas9 мутагенеза восточной плодовой мухи Bactrocera dorsalis

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64195
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 2
1Key Laboratory of Sustainable Forest Ecosystem Management - Ministry of Education, Northeast Forestry University, 2Shenzhen Branch, Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Genome Analysis Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Summary

В данной статье представлены пошаговые протоколы для мутагенеза CRISPR/Cas9 восточной плодовой мухи Bactrocera dorsalis. Подробные шаги, предусмотренные этим стандартизированным протоколом, послужат полезным руководством для генерации мутантных мух для функциональных исследований генов у B. dorsalis.

Abstract

Восточная плодовая муха, Bactrocera dorsalis, является высокоинвазивным и адаптивным видом вредителей, который наносит ущерб цитрусовым и более чем 150 другим фруктовым культурам во всем мире. Поскольку взрослые плодовые мушки обладают большой летной способностью, а самки откладывают яйца под кожуру плодов, инсектициды, требующие прямого контакта с вредителем, обычно плохо работают в поле. С развитием молекулярно-биологических инструментов и высокопроизводительной технологии секвенирования многие ученые пытаются разработать экологически чистые стратегии борьбы с вредителями. К ним относятся RNAi или пестициды на основе редактирования генов, которые подавляют или заглушают гены (молекулярные мишени), такие как обонятельные гены, участвующие в поисковом поведении, у различных насекомых-вредителей. Чтобы адаптировать эти стратегии для борьбы с восточной плодовой мухой, необходимы эффективные методы исследования функциональных генов. Гены с критическими функциями в выживании и размножении B. dorsalis служат хорошими молекулярными мишенями для нокдауна генов и / или глушения. Система CRISPR/Cas9 является надежным методом, используемым для редактирования генов, особенно у насекомых. В данной статье представлен систематический метод мутагенеза CRISPR/Cas9 B. dorsalis, включая разработку и синтез направляющих РНК, сбор эмбрионов, инъекцию эмбрионов, выращивание насекомых и мутантный скрининг. Эти протоколы послужат полезным руководством для генерации мутантных мух для исследователей, заинтересованных в функциональных исследованиях генов у B. dorsalis.

Introduction

Восточная плодовая муха, Bactrocera dorsalis, является космополитическим видом насекомых-вредителей, который наносит ущерб более чем 150 видам фруктовых культур, включая гуаву, манго, Eugenia spp., суринамскую вишню, цитрусовые, мушмулу и папайю1. Ущерб, причиненный только провинции Гуандун (Китай), оценивается более чем в 200 миллионов юаней. Взрослые самки вставляют свои яйца под кожуру созревающих или созревших плодов, вызывая гниение и абсциссию плодов, что снижает качество плодов и общую урожайность урожая2. Поскольку взрослые плодовые мушки обладают большой летной способностью, а их личинки попадают в кожуру плодов, инсектициды, требующие прямого контакта с вредителем, плохо работают в поле. Кроме того, широкое использование инсектицидов повысило устойчивость B. dorsalis к различным сельскохозяйственным химикатам, что еще больше затрудняет борьбу с этими вредными вредителями3. Поэтому разработка эффективных и экологически чистых стратегий борьбы с вредителями крайне необходима.

В последнее время, с развитием молекулярно-биологических инструментов и высокопроизводительных технологий секвенирования, ученые пытаются разработать экологически чистые стратегии борьбы с вредителями, такие как RNAi, которые нацелены на функциональность важных генов (молекулярных мишеней) различных насекомых-вредителей. Гены, которые имеют решающее значение для выживания и размножения вредителя, могут быть идентифицированы с помощью функциональных генных исследований и в дальнейшем служить потенциальными молекулярными мишенями для улучшения специально целевых и экологически чистых инструментов борьбы с вредителями4. Чтобы адаптировать такие стратегии к борьбе с восточной плодовой мухой, необходимы эффективные методы исследования функциональных генов.

Система эндонуклеазы CRISPR/Cas (кластеризованная регулярно чередующаяся короткая палиндромная система/CRISPR-ассоциированная) была первоначально обнаружена у бактерий и архей и оказалась адаптивным механизмом, участвующим в распознавании и деградации чужеродной внутриклеточной ДНК, такой как та, которая вводится путем заражения бактериофагов5. В системе CRISPR типа II эндонуклеаза Cas9 управляется небольшими ассоциированными РНК (crRNA и tracrRNA) для расщепления проникающей ДНК 6,7,8 и стала одним из наиболее широко используемых инструментов для редактирования генов на сегодняшний день 9,10,11,12. Поскольку система CRISPR/Cas9 имеет ряд преимуществ, таких как высокая эффективность глушения генов и низкая стоимость, она уже применялась для редактирования генов у различных видов насекомых, включая Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 и Bombyx mori16. У B. dorsalis гены, связанные с цветом тела, диморфизмом крыльев и определением пола, были успешно выбиты с использованием CRISPR/Cas9 17,18,19. Однако подробные процедуры применения CRISPR/Cas9 у этого насекомого остаются неполными. Кроме того, некоторые шаги, предоставленные исследователями для редактирования гена B. dorsalis, также разнообразны и нуждаются в стандартизации. Например, формы Cas9 отличались в опубликованных ссылках 17,18,19.

В данной статье представлен систематический метод мутагенеза B. dorsalis с использованием системы CRISPR/Cas9, включая разработку и синтез направляющих РНК, сбор эмбрионов, инъекцию эмбрионов, выращивание насекомых и мутантный скрининг. Этот протокол послужит полезным руководством для генерации мутантных мух для исследователей, которые заинтересованы в функциональных исследованиях генов у B. dorsalis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Целевой дизайн и синтез sgRNA in vitro

  1. Предсказать структуру интересующих генов-мишеней и определить границы между экзонами и интронами с помощью биоинформационного анализа генома B. dorsalis (используемые здесь программные приложения перечислены в Таблице материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: BLAT20 использовался для поиска потенциальных локусов генов в геноме. Высококачественные показания РНК-seq (транскриптом) были выровнены с приобретенными локусами гена с использованием Hisat221. Samtools22 использовался для генерации отсортированных bam файлов. Отсортированные файлы bam были введены в Stringtie223 для предоставления расшифровки сборки. Собранные транскрипты и информация о локусах генов были объединены Трансдекодером24. Результаты, полученные от Трансдекодера, были визуализированы в инструментах25 IGV, и границы между экзонами и интронами могли быть определены.
  2. Определите подходящие целевые области в пределах сайта гена-мишени-кандидата. Общая длина должна быть менее 750 bp для более удобного секвенирования (рисунок 1B). Разработка специальных праймеров для амплификации целевой области из геномной ДНК дикого типа с помощью ПЦР (Рисунок 1B) (Праймеры: F-праймер: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-праймер: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Клонируйте продукты ПЦР в тупой конечный вектор26 и выбирайте 20 отдельных бактериальных колоний для секвенирования, чтобы определить, насколько сохранена целевая область в лабораторных популяциях насекомых.
  3. Типичный целевой сайт содержит мотив трехнуклеотидной последовательности (NGG или CCN) и последовательность 20 bp, прилегающую к мотивам NGG или CCN (20 bp-NGG или CCN-20 bp). Проведите бласт-кандидаты на целевые участки против генома B. dorsalis и убедитесь, что прогнозируемая эффективность достаточно высока, а скорость нецеленаправленности низкая; некоторые программы с открытым исходным кодом могут автоматически предсказать это. В этом протоколе sgRNAcas9 -AI27 используется для выбора и оценки оптимальных целей. Подробную информацию об использовании можно найти в руководстве по этому программному обеспечению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтение отдается возможным целевым участкам, закрытым для 5' UTR гена-мишени и 1-2 Gs в начале последовательности 20 bp. Для достижения большой делеции, которая будет идентифицирована с помощью ПЦР с последующим электрофорезом агарозного геля, рекомендуется проектирование двух мишеней28 , разделенных более чем 100 bp (рисунок 1C).
  4. Используйте коммерчески доступный набор для синтеза гРНК для генерации разработанной sgRNA. Выполните каждый шаг в соответствии с руководством пользователя. Повторно суспендировать продукт гРНК в воде, свободной от нуклеаз, количественно оценить концентрацию с помощью спектрофотометра UV-Vis и хранить при -80 °C перед использованием (концентрация успешно синтезированной одиночной гРНК [10 мкл] с используемым здесь набором составляет около 4000-6000 нг/мкл или даже выше).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя генерация мутантных мух является первым шагом для каждого исследователя, соответствующий отрицательный контроль для последующего эксперимента / анализа имеет решающее значение. Создание этих элементов управления вместе с мутантами экономит время и усилия исследователей. Например, установить скремблированную sgRNA в качестве отрицательного элемента управления.

2. Сбор и подготовка эмбрионов

  1. Поместите куколки B. dorsalis в пластиковые клетки. Обеспечьте смесь сахара и дрожжей (1:1) в качестве пищи вместе с источником воды после того, как взрослые выйдут из организма (рисунок 2A, B). Условия выращивания - относительная влажность 55% (RH), 26,5 ° C и цикл 14:10 L / D (огни включаются в шесть утра, огни выключаются в восемь вечера).
  2. Большинство взрослых достигают половой зрелости через 10 дней после появления. Обеспечьте подходящую среду, чтобы помочь взрослым мухам спариваться как можно больше. В идеале используйте световую подставку со светом 30-50 люкс. Это может улучшить плодовитость самок, следовательно, повысить эффективность сбора эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Помещение взрослых особей (в возрасте 5-6 дней после появления) в тускло освещенную (<100 люкс) среду может способствовать спариванию. Как правило, пик яйцекладки приходится на 15:00 (14:10/L:D, свет в 06:00, свет выключается в 20:00); для получения достаточного количества эмбрионов рекомендуется размещение камер яйцекладки в клетках за 30 мин до 15:00.
  3. Поместите 200-сетчатую марлю в камеру яйцекладки, на расстоянии 1-2 мм от крышки камеры. Это поможет с получением как можно большего количества эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте эмбрионам пропитываться апельсиновым соком или растираться марлей, так как это может значительно снизить выживаемость эмбрионов.
  4. Поместите новую камеру яйцекладки в клетку, когда установка микроинъекции будет готова. Собирайте эмбрионы каждые 10 мин с помощью мелкой влажной щетки, затем выровняйте их на самодельной инъекционной пластине (оргстекло длиной 55 мм, шириной 13,75 мм и высотой 5 мм, посередине открывается неглубокая канавка 45 мм х 5 мм х 0,3 мм, чтобы облегчить размещение яиц). Если эмбрионы имеют высокое внутреннее давление, незначительное высыхание при <10% относительной влажности в течение 10 мин является необязательным. Окуните эмбрионы в галогенуглеродное масло во время инъекции, чтобы избежать дальнейшего высыхания (рисунок 2C).

3. Микроинъекция эмбриона

  1. Подготовьте стеклянную инъекционную иглу с помощью съемника микропипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка параметров в соответствии с руководством пользователя важна. В этих протоколах различные формы игл могут быть изготовлены с использованием параметров, предложенных в руководстве по съемнику микропипетки. Стеклянный капилляр должен быть максимально чистым, чтобы пыль не забивала иглу.
  2. Подготовьте рабочий раствор. Смешайте белок Cas9 и соответствующую sgRNA со следующими рабочими концентрациями: sgRNA, 300 нг/мкл; Белок Cas9, 150 нг/мкл. Добавьте 1 мкл фенольного красного цвета в смесь, чтобы служить удобным способом маркировки введенных эмбрионов. Поместите приготовленную смесь на лед, чтобы избежать деградации сгРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наконечники пипеток без нуклеазы и трубки для ПЦР. Концентрация белка Cas9 должна быть меньше или равна 150 нг/мкл; более высокие концентрации токсичны и значительно снижают выживаемость эмбриона. Cas9 также может быть доставлен в формате ДНК или мРНК для достижения успешного редактирования генов17,19. В этом протоколе рекомендуется белок Cas9, поскольку мРНК восприимчивы к деградации, а экспрессия белка Cas9 из плазмидной ДНК требует времени для транскрипции и трансляции.
  3. Задайте параметры для инжектора. Первоначальная программа - Пи-500 гПа, Ti-0,5 с и PC-200 гПа. Отрегулируйте эти параметры дополнительно по мере необходимости во время микроинъекции.
  4. Добавьте 3 мкл смеси в инъекционную иглу. Избегайте введения пузырьков воздуха, которые могут засорить иглу. Откройте иглу с помощью Микрогринка.
  5. Подключите иглу к микроманипулятору в соответствии с руководством пользователя (рисунок 2E).
  6. Положите тарелку с выровненными эмбрионами на объективный стол. Отрегулируйте положение микропипетки под тонким оптическим микроскопом, установив микропипетку и эмбрион в одну плоскость. Отрегулируйте громкость капель, нажав на педаль; Рекомендуется 1/10 объема эмбрионов.
  7. Вставьте кончик иглы в задний (вегетативный полюс) эмбриона. Доставьте смеси в эмбрион, нажав на педаль от инжектора. Если добавить фенол красный, мгновенно наблюдается слегка красноватый цвет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой объем цитоплазматического обратного потока от точечного отверстия не уменьшит выживаемость эмбриона. Инъекции 200 эмбрионов достаточно для успешного мутагенеза одного гена. Добавление большего количества галогенуглеродного масла для погружения эмбрионов может предотвратить дальнейшее высыхание. Инъекция должна быть выполнена до образования полюсных клеток, что гарантирует, что каждая мутация может быть эффективно унаследована.

4. Выращивание насекомых после инъекций

  1. Поместите инъекционную пластину с введенными эмбрионами в искусственную климатическую камеру, поддерживаемую при 55% относительной влажности, 26,5 ° C и цикле 14:10 л / д (свет включается в шесть утра, свет выключается в восемь вечера).
  2. После инъекции формирование эмбриона обычно занимает 24 ч для завершения и 36 ч для вылупления. Используйте мелкоконечную щетку, чтобы перенести личинок на подготовленную личиночную диету. Собирайте личинок три или четыре раза в день, пока больше личинки не вылупятся. Как правило, личинкам требуется 2-3 дня, чтобы закончить вылупление и окукливаться в течение 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для кормления личинок использовалась диета на основе кукурузы. Рецепт содержит 150 г кукурузной муки, 150 г банана, 0,6 г бензоата натрия, 30 г дрожжей, 30 г сахарозы, 30 г бумажного полотенца, 1,2 мл соляной кислоты и 300 мл воды29. Минимизируйте время, в течение которого личинки остаются в масле (<2 ч). Выводите личинок на диету сразу после вылупления как можно дальше. Это может значительно увеличить выживаемость и показатели окукливания. Не обеспечьте слишком много диеты (диеты с 2/3 чашки Петри 90 мм хватит на 30 личинок); в противном случае он станет заплесневелым и снизит выживаемость личинок.
  3. Поместите зрелых личинок во влажный песок, чтобы окуклиться. Стадия окукливания занимает около 10 дней. Переместите куколок в пластиковые клетки до начала эклозии.

5. Скрининг мутантов

  1. Блок-схема мутантного скрининга проиллюстрирована на рисунке 3А. Скрещивание G0 взрослых особей, полученных путем микроинъекции, со взрослыми особями дикого типа для получения гетерозиготных линий. Проверьте тип мутаций, которые потомки (G1) несут путем генотипирования.
  2. Самокрещивание G1 с тем же мутантным генотипом для получения гомозиготных линий в G2. Если генотипы мутантов в G1 совершенно разные, скрещивайте гетерозигот с мухами дикого типа. Гомозиготные линии обычно получают в G3. Поддерживайте две или три гомозиготные линии для последующих экспериментов фенотипирования.
  3. Используйте геномную ДНК из свежего пупариума или одной средней ноги отдельных взрослых особей для выполнения генотипирования. Проектирование специальных грунтовок для усиления целевой области; праймеры должны устанавливать не менее 50 бит/с вверх и вниз по течению от целевого сайта. Подробности грунтовки см. в шаге 1.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку количество ДНК в пупарии чрезвычайно низкое, рекомендуются коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК.
  4. Выполняют ПЦР с использованием следующих условий цикла: 98 °C в течение 3 мин, затем 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 15 с при температуре отжига, подходящей для проектируемых грунтовок, 72 °C в течение 35 с, с последующим окончательным продлением 72 °C в течение 10 мин.
  5. Последовательность очищенных продуктов ПЦР. При обнаружении нескольких перекрывающихся пиков, прилегающих к целевому участку (рисунок 3B), происходит успешный мутагенез. Субклонирование очищенных продуктов ПЦР в тупой вектор и выделение 10 отдельных бактериальных колоний для секвенирования для проверки генотипа мутантов. Поддерживайте линии с мутациями сдвига кадра и преждевременными окончаниями трансляции (рисунок 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости выполнять секвенирование одного клона для проверки генотипа особей G0. Просто упорядочивайте продукты ПЦР и поддерживайте людей с очевидными пиками перекрытия, прилегающими к целевому участку. После первоначальной инъекции рекомендуется отбор 10 эмбрионов для извлечения геномной ДНК и секвенирование продуктов ПЦР на основе стандартов на этапе 5.3. Это может помочь заранее предсказать частоту мутаций. В этом исследовании секвенирование Сэнгера для определения генотипа было выполнено компанией по секвенированию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе представлены подробные шаги по разработке мутантов B. dorsalis с использованием технологии CRISPR / Cas9, включая репрезентативные результаты отбора гДНК, сбора эмбрионов и микроинъекции, поддержания насекомых и скрининга мутантов.

Пример целевого сайта выбранного гена расположен в третьем экзоне (рисунок 1С). Этот участок сильно консервирован, и одна полоса была обнаружена гелевым электрофорезом для шаблона ДНК для синтетической гРНК (рисунок 1D) и гРНК, полученной путем транскрипции in vitro (рисунок 1E).

Инъекция в 200 свежесобранных яиц была выполнена, как описано в разделе 3. Эмбрионы поддерживали путем соблюдения протоколов, описанных на этапах 4.1-4.3. Как было обнаружено путем секвенирования продуктов ПЦР, 80% особей G0 являются мозаичными мутантами (таблица 1). Здесь были выбраны мутанты с делецией 8 bp, которая привела к преждевременному прекращению трансляции аминокислот в G1 (рисунок 3C). Это должно привести к изменению соответствующих функций этого генного продукта у B. dorsalis. Выбранные G1 скрещивали с диким типом для получения гетерозигот G2. Самопересекающиеся гетерозиготы G2 и гомозиготы были восстановлены в следующем поколении, демонстрируя, что эта схема успешна для развития мутантов B. dorsalis и может быть более широко применена в функциональных генных исследованиях у этого и близкородственных видов.

Figure 1
Рисунок 1: Получение сгРНК. (А) Общие процедуры получения сгРНК. (B) Целевая область, усиленная ПЦР из гДНК (100 bp). (C) Пример структуры гена-мишени и сайта расщепления мишени Cas9. (D) ПЦР-сборка сгРНК (~100 bp). (E) Синтез sgRNA путем транскрипции и очистки in vitro . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Микроинъекция эмбриона. (А) Процесс и способ инъекции. (B) Устройство для сбора эмбрионов, откладывающее яйца на марле. (C) Выровнять эмбрионы водой и покрыть галогенуглеродным маслом. (D) Съемник микропипетки. (E) Вся установка системы микроинъекции. Микроскоп (слева), микроинжектор и микроманипулятор (посередине) и автоматический воздушный насос (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Скрининг мутантов. (А) Спаривание мутантов и приобретение гомозигот. (B) продукты ПЦР из мутантного генома, который генерирует определенный набор пиков на мишени. (C) Один из типов мутаций и аминокислотных изменений. Мутации делеции приводят к преждевременному прекращению трансляции. Сокращения: HE = гетерозиготы, HO = гомозиготы. Контроль: эмбриону вводят скремблированные sgRNAs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Инъекционная смесь Введенные эмбрионы Вылупившиеся личинки Куколки Мозаика G0
(Мозаика/Всего взрослых)
BdorOrco_gRNA1 (300 нг/мкл) 200 83 66 49/60 (81%)
BdorOrco_gRNA2 (300 нг/мкл)
Cas9 (150 нг/мкл)
Фенол красный (1 мкл)
BdorOrco_scrambled гРНК1 (300 нг/мкл) 200 78 76 0/70 (0%)
BdorOrco_scrambled гРНК2 (300 нг/мкл)
Cas9 (150 нг/мкл)
Фенол красный (1 мкл)

Таблица 1: Выживаемость B. dorsalis и мутагенез после микроинъекций.

Проблема Потенциальная причина(и) Решения
Неэффективный сбор эмбрионов 1. Взрослые находятся в плохом состоянии 1. Обеспечить доступность пищи и воды, особенно содержание сахара в пище.
2. Недостаточное спаривание 2. Спаривание заранее при 30-50 люкс тусклых условиях. Лучше всего выбирать 12-15-дневных спаренных взрослых особей.
Плохая выводимость яиц после инъекций 1. Эмбрионы низкого качества 1. Соберите свежие и пухлые яйца и аккуратно смажьте их пропитанной водой щеткой.
2. Игла не подходит 2. Кончик иглы как можно меньше, чтобы свести к минимуму повреждение яйцеклетки во время инъекции.
3. Неправильное выращивание яиц после инъекции 3. Яйца должны быть гидратированы после инъекции, чтобы предотвратить обезвоживание от высыхания. Яйца также могут быть перенесены непосредственно в пищу после инъекций.
Низкая выживаемость личинок 1. Заплесневелая пища не подходит для роста личинок 1. Для только что вылупившихся личинок добавьте небольшое количество пищи. Слишком много пищи будет плесневеть или высыхать и влиять на рост личинок.
2. Только что вылупившиеся личинки, замоченные в масле надолго 2. Только что вылупившиеся личинки должны быть вовремя перенесены в личиночную пищу или яйца должны быть собраны непосредственно в пищу после инъекции.
Частота мутаций у взрослых низкая 1. Низкое качество гРНК 1. Строгая экспериментальная операция по синтезу высококачественной гРНК для предотвращения деградации.
2. Неэффективные цели приводят к нецелевым показателям 2. Скрининг высокоэффективных целей, как упоминалось в нашем обсуждении.

Таблица 2: Возможные проблемы с конструированием мутантов, потенциальные причины и решения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Система CRISPR/Cas9 является наиболее широко используемым инструментом редактирования генов и имеет различные применения, такие как генная трепия30, селекция сельскохозяйственных культур31 и фундаментальные исследования генных фукций32. Эта система уже применялась для редактирования генов у различных видов насекомых и служила эффективным инструментом для функциональных генных исследований у вредителей. Протоколы, которые мы представляем здесь, стандартизируют процедуру проектирования и синтеза направляющих РНК, сбора эмбрионов, инъекции эмбрионов, выращивания насекомых и скрининга мутантов. Кроме того, была добавлена таблица устранения неполадок для обобщения потенциальной проблемы на каждом этапе, и были предложены их решения для облегчения рабочей нагрузки и повышения эффективности (таблица 2). Эта процедура обеспечивает надежный способ редактирования генов, представляющих интерес, и улучшает функциональные геномные исследования у B. dorsalis.

Во-первых, выбор генов-мишеней имеет решающее значение для повышения эффективности системы CRISPR/Cas9, а несколько программ с открытым исходным кодом, таких как ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 и CRISPR optimal target finder36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu), могут автоматически генерировать цели и прогнозировать потенциальные нецелевые показатели. Поскольку высокая частота плодовитости B. dorsalis облегчает сбор эмбрионов, мутантные частоты можно предсказать, пожертвовав частью эмбрионов для извлечения ДНК и секвенирования целевой области. Если секвенирование недоступно в лаборатории, также рекомендуется использовать эндонуклеазу T7 I для прогнозирования частоты мутаций37. Целевые сайты с высокой скоростью геномной делеции могут быть выбраны с помощью этих трех методов, и, следовательно, эффективность редактирования генов у B. dorsalis может быть увеличена.

Стадия развития эмбриона определяет, будут ли мутации передаваться по наследству. Чтобы получить наследственные мутации, редактирование генов должно происходить в половых клетках. Как правило, смесь sgRNA и Cas9 не может быть доставлена в половые клетки после образования полюсных клеток. У B. dorsalis образование полюсных клеток происходило через 3 ч после откладки яиц38, тогда как протокол, описанный здесь для B. dorsalis, занимает 30 мин от сбора эмбриона до конца микроинъекции. Во время инъекции в вегетативном конце эмбриона почти не образуются полюсные клетки; поэтому генные мутации, полученные в G0, должны эффективно наследоваться. Время, затрачиваемое микроинъекцией, также меньше, чем метод, упомянутый в ранее опубликованных работах (обычно 1-3 ч)18,19.

Важно свести к минимуму механические или химические повреждения в процессе сбора и обработки эмбрионов. Используйте тонкую щетку, чтобы аккуратно выровнять эмбрионы на инъекционной пластине. Положение инъекции должно отражать работу, ранее проделанную при дрозофиле (Методы - лаборатория Николаса Гомпеля, http://gompel.org/methods) и Ceratitis capitata39. Вводить эмбрионы на вегетативный полюс; никогда не вставляйте иглу в шест животного. Подготовьте иглу, следуя направляющей съемника микропипетки; отверстие иглы должно быть как можно меньше, чтобы избежать чрезмерного цитоплазматического обратного потока. Метод, упомянутый в опубликованных исследованиях B. dorsalis, обычно дехорионизировал эмбрионы с ипохоритом натрия 17,18,19; это может привести к химическому повреждению и снижению выживаемости эмбрионов. В этом протоколе эмбрионы не дехорионизируются, и инъекция по-прежнему хорошо работает. Химический ущерб эмбрионам может быть минимальным.

Выращивание насекомых после инъекций очень важно. Стандартизированный протокол выращивания, представленный здесь, может служить ориентиром для выращивания других видов плодовых мух, особенно видов Bactrocera . Эмбрионы могут быть погружены в масло, чтобы избежать высыхания во время инъекции, используя нашу самодельную инъекционную пластину. Минимизируйте время, проведенное личинками в масле (<2 ч), чтобы достичь выживаемости в G0 выше 50%.

Для обнаружения мутантов рекомендуется неинвазивный метод геномной экстракции ДНК. Например, некоторые исследователи чешуекрылых предполагают, что эксувиаты конечных личинок звезды могут быть использованы для извлечения геномной ДНК для дальнейшего генотипирования. Для B. dorsalis один неинвазивный метод включает извлечение геномной ДНК из свежего пупариума. Инъекция нескольких sgRNAs, нацеленных на маркерный ген и интересующий ген, также может улучшить идентификацию мутантов. Например, совместно введенные sgRNAs, нацеленные на цвет глаз (kmo) и рецептор ювенильного гормона (Met), могут производить 75% потомства с двойными мутациями у комаров. Мет-мутанты были предварительно проверены на основе цвета глаз личинок37. Это должно быть оценено в B. dorsalis в будущем для дальнейшего повышения эффективности редактирования генов у этого вида насекомых с использованием системы CRISPR / Cas9.

В заключение, система CRSIPR/Cas9 является мощным инструментом в функциональной геномике у B. dorsalis. Наши подробные протоколы предоставляют полезную информацию, которая поможет исследователям достичь эффективного сбора эмбрионов, идеальных показателей выживаемости личинок и желаемой эффективности редактирования. Это может быть простым и быстрым способом помочь исследователям получить мутагенез у B. dorsalis. Этот метод не может быть применен в функциональных исследованиях летальных генов, поскольку унаследованные мутации нуждаются в успешном скрещивании. Будущие исследования могут быть сосредоточены на разработке трансгенных инструментов для экспрессии стадийных или тканеспецифических элементов CRISPR, чтобы преодолеть это ограничение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет никаких конфликтов интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Шэньчжэньской программой науки и техники (грант No KQTD20180411143628272) и специальными фондами для научно-технических инноваций и промышленного развития нового района Шэньчжэнь Дапенг (грант No PT202101-02).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6x DNA Loading Buffer TransGen Biotech GH101-01
Artificial climate chamber ShangHai BluePard MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit Axygen AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT NA NA For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass WPI  1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Hisat2 NA NA For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV NA NA For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder NARISHIGE EG-401
Olympus Microscope Olympus Corporation SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit TransGen Biotech CB101-02 https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers Instrument Company  https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040A
SAMtools NA NA For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI NA NA sgRNA design
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter  Instrument Company  P-97
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech BM101-02
Transdecoder NA NA For combining the results of assemble transcripts and gene loci information
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36498
Ultra-trace biological detector Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Christenson, L. D., Foote, R. H. Biology of fruit flies. Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).
  2. Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
  3. Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
  4. Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  7. Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
  8. Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  10. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  11. Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
  12. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  13. Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
  14. Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
  15. Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
  16. Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
  17. Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
  18. Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
  19. Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
  20. Kent, W. J. BLAT-the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).
  21. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  22. Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
  23. Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
  24. TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
  25. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).
  26. Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
  27. Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
  28. Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
  29. Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
  30. Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
  31. El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
  32. Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
  35. Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
  36. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  37. Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
  38. Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  39. Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).

Tags

Биология выпуск 187
Протоколы для CRISPR/Cas9 мутагенеза восточной плодовой <em>мухи Bactrocera dorsalis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y.,… More

Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y., QiQiGe, W., Liu, W., Yan, S., Wang, G. Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis. J. Vis. Exp. (187), e64195, doi:10.3791/64195 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter