Summary
Detta dokument presenterar steg-för-steg-protokollen för CRISPR/Cas9-mutagenes av den orientaliska fruktflugan Bactrocera dorsalis. Detaljerade steg som tillhandahålls av detta standardiserade protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för funktionella genstudier i B. dorsalis.
Abstract
Den orientaliska bananflugan, Bactrocera dorsalis, är en mycket invasiv och adaptiv skadedjursart som orsakar skador på citrusfrukter och över 150 andra fruktgrödor över hela världen. Eftersom vuxna fruktflugor har stor flygkapacitet och kvinnor lägger sina ägg under fruktskinnet, fungerar insekticider som kräver direktkontakt med skadedjuret vanligtvis dåligt i fältet. Med utvecklingen av molekylärbiologiska verktyg och sekvenseringsteknik med hög kapacitet försöker många forskare utveckla miljövänliga strategier för skadedjurshantering. Dessa inkluderar RNAi eller genredigeringsbaserade bekämpningsmedel som nedreglerar eller tystar gener (molekylära mål), såsom luktgener som är involverade i sökbeteende, i olika skadedjur. För att anpassa dessa strategier för orientalisk fruktflugekontroll behövs effektiva metoder för funktionell genforskning. Gener med kritiska funktioner i överlevnad och reproduktion av B. dorsalis fungerar som bra molekylära mål för gennedslag och / eller tystnad. CRISPR/Cas9-systemet är en pålitlig teknik som används för genredigering, särskilt hos insekter. Denna uppsats presenterar en systematisk metod för CRISPR/Cas9-mutagenes av B. dorsalis, inklusive design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Dessa protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för forskare som är intresserade av funktionella genstudier i B. dorsalis.
Introduction
Den orientaliska bananflugan, Bactrocera dorsalis , är en kosmopolitisk insektsskadeart som orsakar skador på över 150 arter av fruktgrödor, inklusive guava, mango, Eugenia spp., Surinam körsbär, citrus, loquat och papaya1. Skadorna som orsakats enbart i Guangdongprovinsen (Kina) uppskattas till över 200 miljoner yuan. Vuxna kvinnor sätter in sina ägg under huden av mogna eller mogna frukter, vilket orsakar förfall och abscission av frukten, vilket minskar fruktkvaliteten och det totala utbytet av grödan2. Eftersom vuxna fruktflugor har stor flygkapacitet och deras larver borrar in i frukthuden, fungerar insekticider som kräver direktkontakt med skadedjuret dåligt i fältet. Dessutom har den omfattande användningen av insekticider ökat resistensen hos B. dorsalis mot olika jordbrukskemikalier, vilket gör kontrollen av dessa skadliga skadedjur ännu svårare3. Därför behövs det ett desperat behov av att utveckla effektiva och miljövänliga strategier för skadedjursbekämpning.
Nyligen, med utvecklingen av molekylärbiologiska verktyg och sekvenseringsteknik med hög kapacitet, försöker forskare utveckla miljövänliga strategier för skadedjurshantering, såsom RNAi, som riktar sig mot funktionaliteten hos viktiga gener (molekylära mål) för olika skadedjur. Gener som är avgörande för skadegörarens överlevnad och reproduktion kan identifieras genom funktionella genstudier och fungerar vidare som potentiella molekylära mål för förbättring av specifikt riktade och miljövänliga verktyg för skadedjursbekämpning4. För att anpassa sådana strategier till orientalisk fruktflugekontroll behövs effektiva metoder för funktionell genforskning.
CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) endonukleassystemet upptäcktes ursprungligen i bakterier och arkéer och visade sig vara en adaptiv mekanism som är involverad i igenkänning och nedbrytning av främmande intracellulärt DNA, såsom det som infördes genom att infektera bakteriofager5. I CRISPR-systemet av typ II styrs Cas9-endonukleas av små associerade RNA (crRNA och tracrRNA) för att klyva intrångs-DNA 6,7,8 och har blivit ett av de mest använda verktygen för genredigering hittills9,10,11,12. Eftersom CRISPR/Cas9-systemet har flera fördelar, såsom hög effektivitet för gendämpning och låg kostnad, har det redan använts för genredigering i olika insektsarter, inklusive Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 och Bombyx mori16. I B. dorsalis har gener relaterade till kroppsfärg, vingdimorfism och könsbestämning framgångsrikt slagits ut med CRISPR/Cas917,18,19. Detaljerade procedurer för CRISPR/Cas9-applicering i denna insekt är dock fortfarande ofullständiga. Dessutom är vissa steg som tillhandahålls av forskare för B. dorsalis genredigering också varierade och i behov av standardisering. Till exempel var formerna av Cas9 olika i publicerade referenser17,18,19.
Detta dokument tillhandahåller en systematisk metod för mutagenes av B. dorsalis med hjälp av CRISPR / Cas9-systemet, inklusive design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Detta protokoll kommer att fungera som en användbar guide för att generera mutanta flugor för forskare som är intresserade av funktionella genstudier i B. dorsalis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Måldesign och in vitro-syntes av sgRNA
- Förutsäga strukturen hos målgener av intresse och bestämma gränserna mellan exoner och introner via bioinformatisk analys av B. dorsalis -genomet (program som används här listas i materialförteckningen).
OBS: BLAT20 användes för att söka potentiella genloci i genomet. De högkvalitativa RNA-seq-läsningarna (transkriptom) anpassades till den förvärvade genen loci med hjälp av Hisat221. Samtools22 användes för att generera de sorterade bam-filerna. De sorterade bam-filerna matades in till Stringtie223 för att tillhandahålla monteringsutskrifterna. Assemble-transkriptionerna och gen-loci-informationen kombinerades av Transdecoder24. Resultaten från Transdecoder visualiserades i IGV-verktyg25 och gränserna mellan exoner och introner kunde bestämmas. - Identifiera lämpliga målregioner inom kandidatens målgenplats. Den totala längden måste vara mindre än 750 bp för bekvämare sekvensering (figur 1B). Designa specifika primers för att förstärka målområdet från genomiskt DNA av vild typ med PCR (figur 1B) (Primers: F-primer: AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, R-primer: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Klona PCR-produkterna till en trubbig ändvektor26 och välj 20 enskilda bakteriekolonier för sekvensering för att bestämma hur bevarad målregionen är i laboratorieinsektpopulationerna.
- Ett typiskt målställe innehåller ett tre-nukleotidsekvensmotiv (NGG eller CCN) och en 20 bp-sekvens intill NGG- eller CCN-motiven (20 bp-NGG eller CCN-20 bp). Spräng kandidatens målplatser mot B. dorsalis-genomet och se till att den förutsagda effektiviteten är tillräckligt hög och att off-targeting-frekvensen är låg; Flera program med öppen källkod kan automatiskt förutsäga detta. I detta protokoll används sgRNAcas9 -AI27 för att välja och utvärdera de optimala målen. Detaljer om användning finns i manualen för denna programvara.
OBS: Möjliga målplatser stängda för 5 'UTR för målgenen och 1-2 Gs i början av 20 bp-sekvensen gynnas. För att uppnå en stor deletion som kommer att identifieras med PCR följt av agarosgelelektrofores rekommenderas att man utformar två mål28 åtskilda av över 100 bp (figur 1C). - Använd det kommersiellt tillgängliga gRNA-syntespaketet för att generera det designade sgRNA. Utför varje steg enligt användarhandboken. Återsuspendera gRNA-produkten i nukleasfritt vatten, kvantifiera koncentrationen med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer och förvara vid -80 ° C före användning (koncentrationen av framgångsrikt syntetiserat enkelt gRNA [10 μL] med satsen som används här är cirka 4000-6000 ng / μL, eller ännu högre).
OBS: Även om generering av mutantflugorna är det första steget för varje forskare, är lämplig negativ kontroll för nedströms experiment / analys avgörande. Att generera dessa kontroller tillsammans med mutanterna sparar forskare tid och ansträngning. Ställ till exempel in krypterat sgRNA som en negativ kontroll.
2. Insamling och beredning av embryon
- Placera B. dorsalis puppor i plastburar. Ge en blandning av socker och jäst (1:1) som mat tillsammans med en vattenkälla efter att de vuxna har närmat (figur 2A, B). Uppfödningsförhållandena är 55% relativ luftfuktighet (RH), 26,5 ° C och en 14:10 L / D-cykel (lampor tänds klockan sex på morgonen, lampor släcks klockan åtta på kvällen).
- De flesta vuxna når sexuell mognad 10 dagar efter uppkomsten. Ge en lämplig miljö för att hjälpa vuxna flugor att para sig så mycket som möjligt. Använd helst ett ljusstativ med ett ljus på 30-50 lux. Detta kan förbättra kvinnornas fecunditet, vilket förbättrar effektiviteten i embryosamlingen.
OBS: Att sätta de vuxna (i åldern 5-6 dagar efter uppkomsten) i en svagt upplyst (<100 lux) miljö kan främja parning. I allmänhet händer toppen av oviposition klockan 03:00 (14:10 / L: D, lampor på 06:00, lampor släckta klockan 08:00); För att få tillräckligt med embryon rekommenderas att placera ovipositionskammare i burarna 30 minuter före 03:00. - Placera en 200-mesh gasbind i ovipositionskammaren, 1-2 mm från kammarlocket. Detta kommer att hjälpa till med att få så många embryon som möjligt.
OBS: Undvik att låta embryona blötläggas i apelsinjuice eller gnidas med gasväv, eftersom detta kan minska embryonas överlevnad avsevärt. - Sätt en ny ovipositionskammare i buret när mikroinjektionsinställningen är klar. Samla embryona var 10: e minut med en fin våt borste och lägg dem sedan på en självtillverkad injektionsplatta (plexiglas med en längd av 55 mm, en bredd på 13,75 mm och en höjd av 5 mm, En 45 mm x 5 mm x 0,3 mm grunt spår öppnas i mitten för att underlätta äggplacering). Om embryona har högt inre tryck är lätt uttorkning vid <10% RH i 10 min valfri. Doppa embryona i halokarbonolja under injektionen för att undvika ytterligare uttorkning (figur 2C).
3. Mikroinjektion av embryot
- Förbered glasinjektionsnålen med en mikropipettdragare.
OBS: Det är viktigt att ställa in parametrarna efter användarhandboken. I dessa protokoll kan olika nålformer göras med hjälp av de parametrar som föreslås av manualen för mikropipettdragaren. Glaskapillären måste vara så ren som möjligt för att förhindra att damm täpper till nålen. - Förbered arbetslösningen. Blanda Cas9-proteinet och motsvarande sgRNA till följande arbetskoncentrationer: sgRNA, 300 ng/μl; Cas9-protein, 150 ng/μl. Tillsätt 1 μl fenolrött till blandningen för att fungera som ett bekvämt sätt att markera injicerade embryon. Lägg den beredda blandningen på is för att undvika nedbrytning av sgRNA.
OBS: Använd nukleasfria pipettspetsar och PCR-rör. Koncentrationen av Cas9-protein måste vara mindre än eller lika med 150 ng/μl. Högre koncentrationer är giftiga och minskar embryonets överlevnad avsevärt. Cas9 kan också levereras i DNA- eller mRNA-format för att uppnå framgångsrik genredigering17,19. I detta protokoll rekommenderas Cas9-protein eftersom mRNA är mottagliga för nedbrytning, och uttrycket av Cas9-protein från plasmid-DNA tar tid för transkription och översättning. - Ställ in parametrarna för injektorn. Det ursprungliga programmet är Pi-500 hPa, Ti-0,5 s och PC-200 hPa. Justera dessa parametrar ytterligare efter behov under mikroinjektion.
- Tillsätt 3 μl av blandningen i injektionsnålen. Undvik att införa luftbubblor som eventuellt kan täppa till nålen. Öppna nålen med en Microgrinder.
- Anslut nålen till mikromanipulatorn enligt användarhandboken (bild 2E).
- Lägg tallriken med uppradade embryon på målbordet. Justera mikropipettens position under ett fint optiskt mikroskop, ställ in mikropipetten och embryot på samma plan. Justera droppvolymen genom att trycka på pedalen; 1/10 volymen embryon rekommenderas.
- Sätt in nålspetsen i embryonets bakre (vegetabiliska pol). Leverera blandningarna i embryot genom att trycka på pedalen från injektorn. Om fenolrött tillsätts observeras en något rödaktig färg direkt.
OBS: En liten volym cytoplasmatiskt återflöde från pinhålet kommer inte att minska embryonets överlevnad. Injektion av 200 embryon är tillräcklig för framgångsrik mutagenes av en gen. Att tillsätta mer halokarbonolja för att fördjupa embryona kan förhindra ytterligare uttorkning. Injektionen måste utföras före polcellsbildning, vilket säkerställer att varje mutation effektivt kan ärvas.
4. Insektsuppfödning efter injektion
- Sätt injektionsplattan med de injicerade embryona i en konstgjord klimatkammare som hålls vid 55% RH, 26,5 ° C och en 14:10 L / D-cykel (tänds klockan sex på morgonen, släcks klockan åtta på kvällen).
- Efter injektion tar embryobildningen vanligtvis 24 timmar att slutföra och 36 timmar att kläcka. Använd en finborste för att överföra larverna till en beredd larvdiet. Samla larver tre eller fyra gånger dagligen tills inga fler larver kläcks. I allmänhet tar larver 2-3 dagar att avsluta kläckning och förpuppas inom 7 dagar.
OBS: En majsbaserad diet användes för att mata larverna. Receptet innehåller 150 g majsmjöl, 150 g banan, 0,6 g natriumbensoat, 30 g jäst, 30 g sackaros, 30 g pappershandduk, 1,2 ml saltsyra och 300 ml vatten29. Minimera tiden larver lämnas i olja (<2 h). Flytta larverna på kosten omedelbart efter kläckning så långt som möjligt. Detta kan avsevärt öka överlevnads- och valphastigheten. Ge inte för mycket diet (en diet med 2/3 av en 90 mm petriskål räcker för 30 larver); Annars blir det mögligt och minskar larvöverlevnaden. - Sätt de mogna larverna i den våta sanden för att poppa. Valpstadiet tar cirka 10 dagar. Flytta pupporna till plastburar innan eclosion börjar.
5. Mutant screening
- Ett flödesschema över mutantscreeningen illustreras i figur 3A. Korsa G0 vuxna erhållna genom mikroinjektion med vildtyp vuxna för att erhålla heterozygota linjer. Verifiera vilken typ av mutationer avkomman (G1) bär genom genotypning.
- Självkorsa G1 med samma mutanta genotyp för att erhålla homozygota linjer i G2. Om genotyperna hos mutanterna i G1 är helt olika, korsa heterozygoterna med vilda flugor. Homozygota linjer erhålls vanligtvis i G3. Behåll två eller tre homozygota linjer för efterföljande fenotypningsexperiment.
- Använd det genomiska DNA från ett färskt puparium eller ett enda mellanben hos enskilda vuxna för att utföra genotypning. Designa specifika primers för att förstärka målområdet; Primers måste sätta minst 50 bps uppströms och nedströms målplatsen. Se steg 1.2 för primerdetaljer.
OBS: Eftersom mängden DNA i ett puparium är extremt låg rekommenderas kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionssatser. - Utför PCR med följande cykelförhållanden: 98 °C i 3 minuter, följt av 35 cykler på 98 °C i 10 s, 15 s vid en glödgningstemperatur som är lämplig för de konstruerade grundarna, 72 °C i 35 s, följt av en slutlig förlängning på 72 °C i 10 minuter.
- Sekvensera de renade PCR-produkterna. När flera överlappande toppar intill målplatsen detekteras (figur 3B) har framgångsrik mutagenes inträffat. Subklona de renade PCR-produkterna till en trubbig vektor och välj 10 enskilda bakteriekolonier för sekvensering för att verifiera mutanternas genotyp. Behåll linjerna med ramförskjutningsmutationer och för tidiga översättningsavslutningar (figur 3C).
OBS: Det finns inget behov av att utföra enstaka klonsekvensering för att verifiera genotypen för G0-individer. Sekvensera bara PCR-produkterna och underhåll individerna med uppenbara flera överlappningstoppar intill målplatsen. Efter den första injektionen rekommenderas att välja 10 embryon för att extrahera genomiskt DNA och sekvensera PCR-produkterna baserat på standarderna i steg 5.3. Detta kan hjälpa till att förutsäga mutationshastigheter i förväg. I denna studie gjordes Sanger-sekvensering för att bestämma genotypen av ett sekvenseringsföretag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll presenterar detaljerade steg för utveckling av B. dorsalis-mutanter med CRISPR/Cas9-teknik, inklusive representativa resultat från gDNA-selektion, insamling av embryon och mikroinjektion, insektsunderhåll och mutantscreening.
Exemplet på målplatsen för den valda genen finns i den tredje exonen (figur 1C). Denna plats är mycket bevarad, och ett enda band detekterades genom gelelektrofores för DNA-mallen för syntetiskt gRNA (figur 1D) och gRNA erhållet genom in vitro-transkription (figur 1E).
Injektion i 200 nyskördade ägg utfördes enligt beskrivningen i avsnitt 3. Embryona upprätthölls genom att följa de protokoll som beskrivs i steg 4.1-4.3. Som detekterats genom sekvensering av PCR-produkterna är 80% av G0-individerna mosaikmutanter (tabell 1). Här valdes mutanter med 8 bp-radering som resulterade i för tidig avslutning av aminosyraöversättning i G1 (figur 3C). Detta bör leda till förändringar i motsvarande funktioner hos denna genprodukt i B. dorsalis. De valda G1 korsades med vildtyp för att erhålla G2-heterozygoter. Självkorsning av G2-heterozygoter och homozygoter återhämtades i nästa generation, vilket visar att detta schema är framgångsrikt för att utveckla B. dorsalis-mutanter och kan tillämpas mer allmänt i funktionella genstudier i denna och närbesläktade arter.
Figur 1: Beredning av sgRNA. (A) Allmänna förfaranden för sgRNA-beredning. (B) Målområde förstärkt med PCR från gDNA (100 bp). (C) Exempel på målgenstruktur och målklyvningsställe med Cas9. (D) PCR-montering av sgRNA (~ 100 bp). (E) Syntes av sgRNA genom in vitro-transkription och rening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Embryomikroinjektion . (A) Processen och injektionsmetoden. B) Anordning för embryosamling, som lägger ägg på gasväv. (C) Fyll embryon med vatten och täck med halokarbonolja. (D) Mikropipettdragare. (E) Hela installationen av mikroinjektionssystemet. Mikroskop (vänster), mikroinjektor och mikromanipulator (mitten) och automatisk luftpump (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mutantscreening . (A) Parning av mutanter och förvärv av homozygoter. B) PCR-produkter från det muterade genomet som genererar en särskild uppsättning toppar vid målet. (C) En av mutationstyperna och aminosyraförändringarna. Raderingsmutationer leder till för tidig uppsägning av översättningen. Förkortningar: HE = heterozygoter, HO = homozygoter. Kontroll: embryo injicerat med krypterade sgRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Injektionsblandning | Injicerade embryon | Kläckta larver | Puppor | Mosaik G0 | ||
| (Mosaik/Totalt antal vuxna) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μl) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μl) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μl) | ||||||
| Fenolrött (1 μl) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μl) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μl) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μl) | ||||||
| Fenolrött (1 μl) | ||||||
Tabell 1: B. dorsalis överlevnad och mutagenes efter mikroinjektioner.
| Problem | Potentiella orsaker | Lösningar | |
| Ineffektiv embryosamling | 1. Vuxna är i dåligt skick | 1.Se till att det finns mat och vatten, särskilt sockerhalten i livsmedlet. | |
| 2. Otillräcklig parning | 2. Parning i förväg under 30-50 Lux dim förhållanden. Det är bäst att välja 12-15 dagar gamla parade vuxna. | ||
| Dålig luktbarhet hos ägg efter injektion | 1. Embryon av dålig kvalitet | 1. Plocka färska och fylliga ägg och pensla dem försiktigt med en vattendränkt borste. | |
| 2. Nålen passar inte | 2. Nålspetsen är så liten som möjligt för att minimera skador på ägget under injektionen. | ||
| 3. Felaktig uppfödning av ägg efter injektion | 3. Ägg måste hållas hydratiserade efter injektion för att förhindra att uttorkning torkar ut. Ägg kan också överföras direkt till mat efter injektion. | ||
| Låg larvöverlevnad | 1. Möglig mat är inte lämplig för larvtillväxt | 1. För nykläckta larver, tillsätt en liten mängd mat. För mycket mat kommer att mögla eller torka ut och påverka larvernas tillväxt. | |
| 2. Nykläckta larver blötläggs i olja under lång tid | 2.De nykläckta larverna måste överföras till larvmaten i tid eller äggen ska plockas direkt i maten efter injektionen. | ||
| Mutationshastigheten för vuxna är låg | 1. Låg kvalitet på gRNA | 1. Rigorös experimentell drift för att syntetisera högkvalitativt gRNA för att förhindra nedbrytning. | |
| 2. Ineffektiva mål leder till off-targets | 2. Screening av högeffektiva mål genom som vår diskussion nämnde. | ||
Tabell 2: Möjliga problem med att konstruera mutanter, potentiella orsaker och lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CRISPR/Cas9-systemet är det mest använda genredigeringsverktyget och har olika tillämpningar, såsom genförtunning30, grödavel 31 och grundläggande studier av genfuktioner32. Detta system har redan använts för genredigering hos olika insektsarter och har fungerat som ett effektivt verktyg för funktionella genstudier i skadedjur. De protokoll vi presenterar här standardiserar proceduren för design och syntes av guide-RNA, insamling av embryon, embryoinjektion, insektsuppfödning och mutantscreening. Dessutom lades en felsökningstabell till för att sammanfatta det potentiella problemet från varje steg, och deras lösningar tillhandahölls för att lätta arbetsbelastningen och förbättra effektiviteten (tabell 2). Denna procedur ger ett tillförlitligt sätt att redigera gener av intresse och förbättrar de funktionella genomiska studierna i B. dorsalis.
För det första är målgenval avgörande för att öka effektiviteten i CRISPR/Cas9-systemet, och flera program med öppen källkod som ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 och CRISPR optimal target finder 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) kan automatiskt generera mål och förutsäga potentiella off-target-priser. Eftersom den höga fecunditetshastigheten för B. dorsalis underlättar embryosamlingen kan mutanthastigheter förutsägas genom att offra en del av embryona för DNA-extraktion och sekvensering av målregionen. Om sekvensering inte är tillgänglig i labbet rekommenderas också att använda T7-endonukleas I för att förutsäga mutationshastigheter37. Målplatser med höga genomiska deletionshastigheter kan väljas genom dessa tre metoder, och därför kan effektiviteten av genredigering i B. dorsalis ökas.
Utvecklingsstadiet av embryot avgör om mutationer kommer att ärvas. För att få ärftliga mutationer måste genredigering ske i könsceller. I allmänhet kan blandningen av sgRNA och Cas9 inte levereras till könsceller efter att polcellsbildning har inträffat. I B. dorsalis inträffade polcellsbildningen vid 3 h efter äggläggning 38, medan protokollet som beskrivs här för B. dorsalis tar30 minuter från embryosamling till slutet av mikroinjektionen. Under injektionen bildas nästan inga polceller i den vegetabiliska änden av embryot; Därför bör genmutationer som erhålls i G0 effektivt ärvas. Den tid som förbrukas av mikroinjektion är också mindre än den metod som nämns i tidigare publicerade artiklar (vanligtvis 1-3 h)18,19.
Det är viktigt att minimera mekanisk eller kemisk skada under processen med embryosamling och hantering. Använd en fin borste för att försiktigt rada upp embryon på injektionsplattan. Injektionspositionen bör återspegla det arbete som tidigare utförts i Drosophila (Metoder - Nicolas Gompels laboratorium, http://gompel.org/methods) och Ceratitis capitata39. Injicera embryon vid vegetabiliska polen; Sätt aldrig in nålen i djurpolen. Förbered nålen enligt mikropipettdragarguiden; Nålens öppning ska vara så liten som möjligt för att undvika överdriven cytoplasmatisk återflöde. Den metod som nämns i publicerade studier i B. dorsalis dekorionerade i allmänhet embryona med natriumhypokorit17,18,19; Detta kan orsaka kemiska skador och minska embryonas överlevnad. I detta protokoll dekorioneras inte embryon, och injektionen fungerar fortfarande bra. Den kemiska skadan på embryona kan vara minimal.
Insektsuppfödning efter injektion är mycket viktigt. Det standardiserade uppfödningsprotokollet som tillhandahålls här kan fungera som referens för uppfödning av andra fruktflugearter, särskilt Bactrocera-arter . Embryona kan nedsänkas i olja för att undvika uttorkning under injektionen med vår egentillverkade injektionsplatta. Minimera tiden larven spenderar i oljan (<2 h) för att uppnå överlevnad i G0 över 50%.
En icke-invasiv metod för genomisk DNA-extraktion rekommenderas för mutantdetektion. Till exempel föreslår vissa lepidopteranforskare att exuviaterna hos de slutliga instarlarverna kan användas för att extrahera genomiskt DNA för ytterligare genotypning. För B. dorsalis innebär en icke-invasiv metod att extrahera genomiskt DNA från ett färskt puparium. Injektion av flera sgRNA riktade mot en markörgen och genen av intresse kan också förbättra identifieringen av mutanter. Till exempel kan saminjicerade sgRNA som riktar sig mot ögonfärg (kmo) och juvenil hormonreceptor (Met) producera 75% av avkomman med dubbla mutationer i myggor. Met-mutanter screenades preliminärt baserat på ögonfärgen hos larver37. Detta bör utvärderas i B. dorsalis i framtiden för att ytterligare förbättra effekten av genredigering hos denna insektsart genom att använda CRISPR/Cas9-systemet.
Sammanfattningsvis är CRSIPR/Cas9-systemet ett kraftfullt verktyg inom funktionsgenomik i B. dorsalis. Våra detaljerade protokoll ger användbar information för att hjälpa forskare att uppnå effektiv embryosamling, idealiska överlevnadsnivåer för larver och önskad redigeringseffektivitet. Detta kan vara ett enkelt och snabbt sätt att hjälpa forskare att få mutagenes i B. dorsalis. Denna teknik kunde inte tillämpas i funktionella studier av dödliga gener eftersom de ärftliga mutationerna kräver framgångsrika korsningar. Framtida studier kan fokusera på att utveckla transgena verktyg för att uttrycka scen- eller vävnadsspecifika CRISPR-element för att bryta igenom denna begränsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272) och särskilda medel för vetenskapsteknologisk innovation och industriell utveckling av Shenzhen Dapeng New District (Bidrag nr PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
References
- Christenson, L. D., Foote, R. H.
- Ma, X., et al. The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province. Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).
- Jin, M., et al. Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis. Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).
- Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges. Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pyzocha, N. K., et al. RNA-guided genome editing of mammalian cells. Gene Correction. , Humana Press. Totowa, NJ. 269-277 (2014).
- Weiss, D., et al. CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Li, H., et al. Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system. STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).
- Zhu, G. -H., et al. Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis. The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).
- Li, Y., et al. CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).
- Liu, Q., et al. Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms. Insect Biochemistry & Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).
- Zhao, S., et al. Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system. Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).
- Bai, X., et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis. Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).
- Zheng, W., et al. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae). Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).
- Kent, W. J.
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Danecek, P., et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience. 10 (2), (2021).
- Kovaka, S., et al. Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2. Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).
- TransDecoder. , Available from: https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 (2018).
- Robinson, J. T., et al.
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Zheng, Q. P., et al. Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells. Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).
- Ren, L., et al. Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly. Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).
- Xiao, Q., et al. Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).
- El-Mounadi, K., et al. Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9. Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).
- Hsu, P. D., et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Ai, D., et al. Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (Hübner). Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).
- Xie, S., et al. sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites. PloS One. 9 (6), 100448 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
- Zhu, G. H., et al. Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).
- Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Gabrieli, P., et al. Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae). Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).
