Summary
تم عرض طريقة جديدة لإعداد العينات لتحليل المستعمرات البكتيرية الكبيرة القائمة على أجار عبر قياس الطيف الكتلي لتصوير الليزر / التأين بمساعدة المصفوفة.
Abstract
يمثل فهم العواقب الأيضية للتفاعلات الميكروبية التي تحدث أثناء العدوى تحديا فريدا لمجال التصوير الطبي الحيوي. يمثل قياس الطيف الكتلي للتصوير بالامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) طريقة تصوير في الموقع خالية من الملصقات قادرة على توليد خرائط مكانية لمجموعة واسعة من الأيضات. في حين يتم الآن تحليل عينات الأنسجة المقسمة بشكل روتيني عبر هذه التقنية ، فإن تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويرية للركائز غير التقليدية ، مثل المستعمرات البكتيرية التي تزرع عادة على أجار في أبحاث علم الأحياء الدقيقة ، لا تزال صعبة بسبب ارتفاع محتوى الماء والتضاريس غير المستوية لهذه العينات. توضح هذه الورقة سير عمل إعداد العينة للسماح بتصوير تحليلات قياس الطيف الكتلي لأنواع العينات هذه. وتتمثل هذه العملية في استخدام مستعمرات كبيرة للاستزراع البكتيري المشترك لاثنين من مسببات الأمراض المعدية المعوية: المطثية العسيرة والمكورات المعوية البرازية. كما تبين أن دراسة التفاعلات الميكروبية في بيئة الآجار المحددة جيدا هذه تكمل دراسات الأنسجة التي تهدف إلى فهم التعاون الأيضي الميكروبي بين هذين الكائنين الممرضين في نماذج عدوى الفئران. يتم تقديم تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري لمستقلبات الأحماض الأمينية أرجينين وأورنيثين كبيانات تمثيلية. تنطبق هذه الطريقة على نطاق واسع على التحليلات الأخرى ، ومسببات الأمراض أو الأمراض الميكروبية ، وأنواع الأنسجة حيث يكون القياس المكاني للكيمياء الحيوية الخلوية أو الأنسجية مطلوبا.
Introduction
الميكروبيوم البشري هو نظام بيئي ديناميكي للغاية يتضمن تفاعلات جزيئية للبكتيريا والفيروسات والعتائق وغيرها من حقيقيات النوى الميكروبية. في حين تمت دراسة العلاقات الميكروبية بشكل مكثف في السنوات الأخيرة ، لا يزال هناك الكثير مما يجب فهمه حول العمليات الميكروبية على المستوى الكيميائي 1,2. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم توفر الأدوات القادرة على قياس البيئات الميكروبية المعقدة بدقة. أتاح التقدم في مجال قياس الطيف الكتلي التصويري (IMS) على مدار العقد الماضي رسم الخرائط المكانية في الموقع وبدون تسمية للعديد من المستقلبات والدهون والبروتينات في الركائز البيولوجية 3,4. برز الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) باعتباره أكثر تقنيات التأين شيوعا المستخدمة في تصوير قياس الطيف الكتلي ، بما في ذلك استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية لاستئصال المواد من سطح قسم الأنسجة الرقيقة للقياس بواسطة قياس الطيفالكتلي 4. يتم تسهيل هذه العملية من خلال تطبيق مصفوفة كيميائية مطبقة بشكل متجانس على سطح العينة ، مما يسمح بإجراء قياسات متسلسلة في نمط نقطي عبر سطح العينة. ثم يتم إنشاء الخرائط الحرارية لشدة الأيونات المراد تحليلها بعد الحصول على البيانات. مكنت التطورات الحديثة في مصادر التأين وتقنيات أخذ العينات من تحليل الركائز غير التقليدية مثل العينات الخلوية البكتيرية 5 والثدييات 6،7،8 المزروعة على أجارالمغذيات. يمكن أن توفر المعلومات المكانية الجزيئية التي يوفرها IMS نظرة ثاقبة فريدة في الاتصالات الكيميائية الحيوية لتفاعلات الميكروب والميكروب المضيف أثناء العدوى9،10،11،12،13،14.
عند الإصابة بعدوى المطثية العسيرة (CDI) ، تتعرض المطثية العسيرة لبيئة ميكروبية سريعة التغير في الجهاز الهضمي ، حيث من المحتمل أن تؤثر التفاعلات متعددة الميكروبات على نتائج العدوى15،16. والمثير للدهشة أنه لا يعرف سوى القليل عن الآليات الجزيئية للتفاعلات بين المطثية العسيرة والميكروبات المقيمة أثناء العدوى. على سبيل المثال ، المكورات المعوية هي فئة من مسببات الأمراض المتعايشة الانتهازية في ميكروبيوم الأمعاء وقد ارتبطت بزيادة التعرض وشدة CDI17،18،19،20. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل عن الآليات الجزيئية للتفاعلات بين مسببات الأمراض هذه. لتصور اتصال الجزيئات الصغيرة بين أعضاء ميكروبيوم الأمعاء ، نمت المستعمرات البكتيرية هنا على أجار لمحاكاة تفاعلات الميكروب والميكروب وتكوين الأغشية الحيوية البكتيرية في بيئة خاضعة للرقابة. ومع ذلك ، فإن الحصول على توزيعات أيضية تمثيلية على تحليل قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI لعينات الثقافة البكتيرية يمثل تحديا بسبب المحتوى المائي العالي والتضاريس السطحية غير المستوية لهذه العينات. يحدث هذا إلى حد كبير بسبب الطبيعة المحبة للماء للغاية للأجار واستجابة سطح أجار غير المنتظمة أثناء إزالة الرطوبة.
كما أن المحتوى المائي العالي للأجار يمكن أن يجعل من الصعب تحقيق طلاء متجانس لمصفوفة MALDI ويمكن أن يتداخل مع تحليل MALDI اللاحق الذي يتم إجراؤه في الفراغ21. على سبيل المثال ، تعمل العديد من مصادر MALDI عند ضغوط تتراوح بين 0.1 و 10 Torr ، وهو فراغ كاف لإزالة الرطوبة من الآجار ويمكن أن يتسبب في تشوه العينة. هذه التغيرات المورفولوجية في الآجار الناجم عن بيئة الفراغ تسبب فقاعات وتشقق في مادة الآجار المجففة. تقلل هذه القطع الأثرية من التصاق الآجار بالشريحة ويمكن أن تتسبب في فك العينة أو تقشرها في نظام تفريغ الجهاز. يمكن أن يصل سمك عينات الآجار إلى 5 مم من الشريحة ، مما قد يؤدي إلى خلوص غير كاف من البصريات الأيونية داخل الجهاز ، مما يتسبب في تلوث و / أو تلف بصريات أيون الأجهزة. يمكن أن تؤدي هذه التأثيرات التراكمية إلى تخفيضات في الإشارة الأيونية العاكسة لتضاريس السطح ، بدلا من التفاعلات الكيميائية الحيوية الميكروبية الأساسية. يجب تجفيف عينات أجار بشكل متجانس والالتصاق بشدة بشريحة مجهرية قبل تحليلها في الفراغ.
توضح هذه الورقة سير عمل تحضير العينة للتجفيف المتحكم فيه للمستعمرات الكبيرة للثقافة البكتيرية المزروعة على وسط أجار. تضمن عملية التجفيف البطيئة متعددة الخطوات (مقارنة بتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا) أن الآجار سوف يجف بشكل موحد مع تقليل آثار الفقاعات أو تكسير عينات الآجار المثبتة على شرائح المجهر. باستخدام طريقة التجفيف التدريجي هذه ، يتم لصق العينات بشدة بشريحة المجهر وقابلة للتطبيق اللاحق للمصفوفة وتحليل MALDI. ويتجلى ذلك باستخدام مستعمرات بكتيرية نموذجية من المطثية العسيرة نمت على نماذج أنسجة الآجار والفئران التي تؤوي CDI مع وبدون وجود مسببات الأمراض المتعايشة والانتهازية ، المكورات المعوية البرازية. تسمح تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI لكل من النماذج البكتيرية والأنسجة برسم الخرائط المكانية لملامح مستقلب الأحماض الأمينية ، مما يوفر نظرة ثاقبة جديدة حول التمثيل الغذائي للميكروبات الحيوية والاتصالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوان في مستشفى الأطفال في فيلادلفيا وكلية الطب بجامعة بنسلفانيا بيرلمان (بروتوكولات IAC 18-001316 و 806279).
تنبيه: المطثية العسيرة (المطثية العسيرة) والمكورات المعوية البرازية (E. faecalis) هي مسببات الأمراض BSLII ويجب التعامل معها بحذر شديد. استخدم بروتوكولات إزالة التلوث المناسبة عند الضرورة.
1. نمو المستعمرات الكبيرة للثقافة البكتيرية والتحضير للشحن بين عشية وضحاها
- تحضير المستنبتات الليلية لبكتيريا المطثية العسيرة والإبرازية وزراعتها بشكل فردي عند 37 درجة مئوية في غرفة لاهوائية (85٪ نيتروجين، 10٪ هيدروجين، 5٪ ثاني أكسيد الكربون) في مرق تسريب الدماغ والقلب المكمل ب 0.5٪ مستخلص الخميرة و 0.1٪ ل-سيستين (BHIS). استخدم 1.5٪ أجار لجميع العينات المطلية.
- تطبيع وسائط الثقافة البكتيرية إلى الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). صفيحة 5 ميكرولتر من كل مستعمرة كبيرة على ألواح أجار BHIS + l-cysteine وتنمو لاهوائيا لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية. بالنسبة للأنواع الكبيرة المختلطة ، امزج وسائط الاستزراع البكتيري بنسبة 1: 1 قبل الطلاء.
- قم بإعداد شرائح المجهر المطلي بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO) باستخدام مقياس الأومتر لتحديد جانب الشريحة بالطلاء الموصل. استخدم ناسخا ذو رأس ماسي لحفر وتسمية الجانب المطلي ب ITO من شريحة المجهر.
- قم باستئصال الثقافة بأكملها من لوحة نمو الآجار ثم قم بتركيبها على شريحة مجهر مغلفة ب ITO مع التأكد من عدم احتجاز فقاعات الهواء بين الآجار والشريحة.
ملاحظة: يجب أن يسمح المحتوى المائي في وسط الآجار للثقافة بالالتصاق بشكل طبيعي بسطح شريحة المجهر. ويرد شريط فيديو يجسد هذه العملية في الوثائق التكميلية ل Yang et al.22. - ضع المستعمرات في صناديق شرائح مجهرية للحماية. قم بتخزين صناديق الشرائح في 8 × 8 في أكياس نقل العينات البيولوجية مع حفنة من الكريات المجففة وختم للشحن بين عشية وضحاها لمزيد من المعالجة والتحليل.
ملاحظة: من المهم الحفاظ على بيئة جافة للمزارع البكتيرية عند شحنها في ظل الظروف المحيطة لإبطاء نمو البكتيريا والتمثيل الغذائي والحفاظ على تثبيت العينات البكتيرية حتى التحليل. تم تحسين طريقة الشحن هذه من خلال تجارب مكثفة ويفضل على شحن المستعمرات المجمدة في الثلج الجاف. تميل التغيرات الرئيسية في درجات الحرارة قبل التجفيف إلى التسبب في الفك والفقاعات تحت عينة الآجار المركبة.
2. التجفيف المحيط ل المطثية العسيرة + المستعمرات الكبيرة البكتيرية البرازية
- قم بإزالة مستعمرات بكتيريا الأغاروز المثبتة على شرائح مجهر مغلفة ب ITO من مواد التعبئة والتغليف. ضع العينات في صندوق جاف مع مجفف لمدة 48-72 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذه عملية تجفيف خفيفة وبطيئة تقلل من الفقاعات أو التشقق أو انفصال وسائط الآجار عن سطح شريحة المجهر. - تخلص بشكل صحيح من جميع مواد التغليف الملوثة وقم بإزالة التلوث من مكان العمل بمطهر مناسب للجراثيم / مبيد للجراثيم.
- افحص المستعمرات بصريا بحثا عن تشوهات في سطح أجار (على سبيل المثال ، الفقاعات ، التشقق ، النزول).
ملاحظة: يجب أن ينخفض ارتفاع سطح الأغاروز بشكل واضح وأن يكون مسطحا عبر الشريحة.
3. الفراغ والتجفيف بوساطة الحرارة من المطثية العسيرة + E. البراز المستعمرات البكتيرية الكبيرة
ملاحظة: تم بناء جهاز تجفيف فراغي مصمم خصيصا (الشكل 1) لتسهيل إزالة الرطوبة الزائدة من عينات أجار. يستخدم هذا الجهاز مضخة تفريغ دوارة دوارة متصلة في خط بفلتر حيوي HEPA ، ومصيدة باردة ، وغرفة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، حيث يتم وضع العينات البكتيرية. يتم توصيل محول الجهد المتغير بخيوط سلكية معزولة ، مما يسمح للمستخدم بتسخين الغرفة لتسريع عملية التجفيف.
- أغلق خط التفريغ إلى غرفة العينة وقم بتشغيل مفتاح الطاقة إلى مضخة الريشة الدوارة للسماح لمضخة التفريغ بالتسخين وتحقيق ضغط فراغ مناسب.
- قم بتشغيل محول الجهد المتغير لتسخين خيوط الأسلاك الملفوفة حول الغرفة. اضبط مصدر الطاقة المتغير حتى تصل درجة الحرارة الداخلية لغرفة التفريغ إلى ~ 50 °C. أثناء تسخين المضخة ، ضع ملاطا من الثلج الجاف والإيثانول بنسبة 100٪ في مكثف المصيدة الباردة.
ملاحظة: يقوم المصيدة الباردة بتكثيف أي أبخرة أو جراثيم من العينة ويتجنب تلوث نظام مضخة الريشة الدوارة وزيت مضخة التفريغ. - افتح حجرة التفريغ باستخدام مفتاح ربط لفك مشابك شفة المخلب المزدوجة مقاس 16 مم. أدخل عينات الأغاروز في الحجرة وأغلق الحجرة بإحكام باستخدام مشابك شفة المخلب المزدوجة مقاس 16 مم.
- افتح صمام المضخة لإخلاء الغرفة. اترك العينات تجف لمدة 60-120 دقيقة (على سبيل المثال ، عند ~ 150 mTorr).
ملاحظة: وقت التجفيف هذا كاف لإزالة معظم الرطوبة في أقسام أجار صغيرة. قد يكون من الضروري التحديد التجريبي لوقت التجفيف الأمثل لإزالة الرطوبة وتقليل ارتفاع الآجار اعتمادا على الإعداد الفردي والعينات. يمكن أن تتسبب أوقات التجفيف الأطول بشكل كبير في أن يصبح الآجار المجفف هشا وعرضة للتشقق. - عند الانتهاء ، قم بتهوية غرفة التفريغ ببطء إلى الضغط المحيط عن طريق إغلاق الصمام الموجود على مضخة الريشة الدوارة وفتح الصمام الخارجي للهواء المحيط. افتح الغرفة باستخدام البروتوكول المذكور سابقا وقم بإزالة عينة الأغاروز المجففة من الغرفة.
- قم بتخزين العينة في صندوق جاف مع مادة مجففة حتى يتم تطبيق المصفوفة.
ملاحظة: يوضح الشكل 2 صورا لسطح الآجار قبل التجفيف وبعده.
4. تطبيق مصفوفة MALDI عن طريق الرش الآلي
ملاحظة: بعد تجفيف عينات الأغاروز تماما وانخفاض ارتفاع أقسام الاستزراع بشكل ملحوظ ، استخدم بخاخ مصفوفة روبوتي لتطبيق طلاء رقيق لمركب مصفوفة MALDI كيميائي بشكل متجانس. يجب إجراء هذا الإجراء في غطاء دخان كيميائي وبمعدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ونظارات المختبر ومعطف المختبر.
- حدد مصفوفة MALDI المناسبة. لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم مصفوفة 1،5-ديامينونافثالين (DAN) MALDI لامتزازها وتأين الأحماض الأمينية في وضع الأيونات السالبة.
- تحضير 10 مل من محلول مصفوفة دان مالدي 10 مجم / مل في 90/10 (v / v) أسيتونيتريل / ماء. استخدم مذيبات HPLC من الدرجة ، صوتنة لمدة 30 دقيقة ، وقم بتصفية المحلول من خلال مرشحات حقنة نايلون 0.2 ميكرومتر قبل إدخال مضخة حقنة البخاخ الآلية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد محاليل الغسيل لضمان نظافة خط الرش بين كل استخدام.
ملاحظة: يتم اختيار محاليل الغسيل لزيادة قابلية ذوبان المصفوفة والملوثات الأخرى في خط الرش وتسهيل إزالتها من النظام. محاليل الغسيل المستخدمة هنا هي 90/10 (v / v) أسيتونيتريل / ماء ، 50/50 (v / v) ماء / ميثانول ، 99/1 (v / v) أسيتونيتريل / حمض الخليك ، و 95/5 (v / v) ماء / هيدروكسيد الأمونيوم. - قم بتوصيل العينة بصينية الرش وقم بتحميل المحاليل المعدة في خط الرش (الشكل 3). باستخدام برنامج الكمبيوتر ، حدد المعلمات اللازمة للسماح بطلاء موحد لمركب المصفوفة: درجة حرارة فوهة 30 درجة مئوية ، ثماني تمريرات ، معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة ، نمط CC ، وقت تجفيف 0 ثانية ، 10 رطل / بوصة مربعة.
ملاحظة: من المقبول عموما أن معظم مسببات الأمراض سيتم تعطيلها عن طريق تطبيق مصفوفة MALDI ، والتي عادة ما تكون عبارة عن حمض أو قاعدة عضوية صغيرة. - بعد انتهاء تسلسل الرش ، أخرج العينة من صينية الرش واحفظها في خزانة تجفيف حتى التحليل.
5. إعداد المستعمرات البكتيرية الكبيرة للحصول على بيانات قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI
ملاحظة: تم إجراء جميع تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري باستخدام مطياف الكتلة بالرنين السيكلوتروني لتحويل فورييه (FTICR). تم تجهيز هذه الأداة بنظام ليزر Nd: YAG MALDI (2 كيلو هرتز ، 355 نانومتر).
- أدخل العينة المغلفة بالمصفوفة في محول شريحة مجهر اللوحة المستهدفة MALDI وانسخ ما لا يقل عن ثلاث علامات إيمانية تشمل منطقة العينة باستخدام علامات دائمة (الشكل 4). استخدم ماسحا ضوئيا مسطحا للحصول على صورة بصرية لشريحة المجهر بما في ذلك العلامات الائتمانية.
ملاحظة: ستسمح العلامات الإيمانية بتسجيل الصورة البصرية على منظر كاميرا MALDI الملاحظ في الجهاز. - حدد طريقة أداة MS المحسنة لنطاق الكتلة المطلوب والحساسية والدقة ، والتي تتضمن معايرة الكتلة وإعدادات ليزر MALDI ومعلمات البصريات الأيونية وظروف خلية ICR. لهذه الطريقة ، حدد نافذة كتلة 100 Da من m / z 100 إلى 200 لتخصيب إشارة الطور الغازي في وضع الأيونات السالبة باستخدام نهج التراكم المستمر للأيونات المختارة (CASI) ، 23 والتي تشمل قيم m / z للمستقلبات ذات الأهمية.
- افتح برنامج الحصول على الصور الخاص بالأداة واستخدم معالج الإعداد لتحديد اسم الملف وموقعه ، وطريقة الحصول على MS ، ومناطق الاهتمام المراد أخذ عينات منها ، والدقة المكانية للصورة.
ملاحظة: عادة ما يتم استخدام الدقة المكانية من 100-300 ميكرومتر لتصوير المستعمرات الكبيرة البكتيرية. - بمجرد تحديد جميع المعلمات ، ابدأ تسلسل الاستحواذ للحصول على طيف كتلي بشكل متسلسل عند كل بكسل عبر المنطقة (المناطق) المحددة ذات الأهمية.
ملاحظة: يعتمد وقت التقاط الصور على إعدادات الجهاز، ولكنه يتراوح عادة من 2 إلى 6 ساعات للصور التي تحتوي على 5000-10000 بكسل.
6. تحليل بيانات قياس الطيف الكتلي للتصوير وتحديد المركبات
- بعد الحصول على الصورة ، احفظ البيانات بامتداد ملف ".mis" ، وهو تنسيق ملف خاص بالبائع لمنصات قياس الطيف الكتلي للتصوير. افتح ملف البيانات في حزم برامج flexImaging أو SCiLS أو قم بتصديره إلى تنسيق بيانات غير مملوك مثل .mzml وتصوره باستخدام برنامج محايد للبائع (على سبيل المثال ، Cardinal24 أو MSIreader25,26).
ملاحظة: يتم عرض متوسط طيف الكتلة عند فتح بيانات التصوير في flexImaging، والذي يمثل متوسط شدة جميع الأيونات المكتشفة في المناطق التي تم أخذ عينات منها. يمكن تحديد قمم الاهتمام مبدئيا بناء على قياسات الكتلة الدقيقة. عادة ما تكون دقة الكتلة التي تزيد عن 5 أجزاء في المليون (جزء في المليون) كافية لتحديد المستقلب على مطياف الكتلة FTICR. - باستخدام البرنامج المشار إليه ، حدد النوافذ الجماعية للقمم ذات الأهمية لإنشاء خرائط حرارية ملونة زائفة لتوزيعات الأيونات عبر المناطق التي تم أخذ عينات منها.
- في متوسط عرض الطيف الكتلي ، قم بتكبير ذروة الاهتمام وحدد نافذة كتلة مناسبة تشمل منطقة ملف تعريف الذروة.
- انقر بزر الماوس الأيمن على نافذة الكتلة المميزة وحدد إضافة مرشح جماعي .... قم بتسمية قيمة m / z المحددة باستخدام التعريف المبدئي للمستقلب المشتبه به على النحو الذي يحدده قياس الكتلة الدقيق عالي الدقة.
- حدد عتبة الكثافة لضبط النطاق الديناميكي للصورة المراد تحليلها المعروضة بواسطة خريطة الحرارة ذات الألوان الزائفة. قم بضبط معلمات تصفية الكتلة بشكل أكبر بحيث تشمل نافذة الكتلة منطقة ملف تعريف الذروة ، ثم أضف مرشح الكتلة.
ملاحظة: يمكن إجراء تطبيع الكثافة حسب الاقتضاء لتحسين القياس الكمي النسبي عبر المناطق المقاسة. استخدمت التجارب هنا الحصول على بيانات CASI (vide infra) ، مما قد يجعل إجمالي عدد الأيونات (TIC) وطرق تطبيع متوسط الجذر (RMS) غير دقيقة. على هذا النحو ، يتم عرض جميع الصور الأيونية الموضحة هنا دون تطبيع.
7. تحضير وشحن المكافحة غير المصابة وأنسجة فأر C. difficile المصابة
- قم بإنصاف الفئران الذكور C57BL / 6 البالغة من العمر 4-8 أسابيع بالمضادات الحيوية (0.5 مجم / مل سيفوبيرازون أو 0.5 مجم / مل سيفوبيرازون + 1 مجم / مل فانكومايسين) في مياه الشرب المخصصة لمدة 5 أيام ، تليها فترة نقاهة لمدة يومين والعدوى اللاحقة.
- القتل الرحيم للحيوانات عن طريق الاختناق CO2 وحصاد عضو الأعور الفأر على الفور. قم بتضمينه في خليط بنسبة 20٪ من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في الماء المقطر.
- ضع العينات على الثلج الجاف ثم قم بتعبئتها وشحنها للتحليل ؛ يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التحليل.
8. الاستئصال بالتبريد لفيروس التحكم غير المصاب C. العسيرة - أنسجة الفئران المصابة
- نظف جميع معدات التقسيم بالتبريد عن طريق الشطف بالإيثانول بنسبة 100٪ واتركها تجف قبل وضع العينات في غرفة التبريد. قم بإعداد شرائح المجهر المطلي ب ITO باستخدام مقياس الأومتر لتحديد جانب الشريحة بالطلاء الموصل. استخدم ناسخا ذو رأس ماسي لحفر وتسمية الجانب المطلي ب ITO من شريحة المجهر.
ملاحظة: يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ونظارات المختبر ومعطف المختبر وأكمام cryostat. - إجراء التشريح بالتبريد على الميكروتوم البردي البحثي. انقل أنسجة CECA للفأر المضمنة في OCT من مجمد -80 درجة مئوية إلى غرفة cryomicrotome (درجة حرارة الغرفة 30 درجة مئوية ، درجة حرارة الجسم -28 درجة مئوية) على الثلج الجاف. قم بتركيب عينات الأنسجة المراد مقارنتها باستخدام قياس الطيف الكتلي التصويري (على سبيل المثال ، التحكم غير المصاب مقابل المصابين بالمطثية العسيرة) على نفس شريحة المجهر لضمان تحضير عينة متطابقة لكلا النوعين من الأنسجة وتمكين مقارنات الأيض الدقيقة.
- داخل حجرة الميكروتوم البردي ، قم بتركيب الأنسجة المضمنة في OCT على ظرف عينة باستخدام محلول OCT إضافي. بعد أن يصلب محلول OCT ، ثبت ظرف الظرف على رأس العينة. ابدأ في التشريح بالتبريد بزيادات 10-50 ميكرومتر للوصول إلى عمق / مستوى الأنسجة المطلوب للعضو.
- بمجرد الوصول إلى المقطع العرضي الأمثل للأنسجة ، ابدأ في جمع المقاطع بسمك 12 ميكرومتر. تعامل مع الشريحة برفق باستخدام فرش الرسم الفنية وضعها على شريحة مجهر مطلية بالتفلون.
- لف شريحة المجهر المطلي ب ITO أعلى قسم الأنسجة لالتقاط الأنسجة من الشريحة المطلية بالتفلون. قم بإذابة جزء الأنسجة على شريحة المجهر عن طريق الضغط على راحة اليد في الجزء الخلفي من الشريحة المطلية ب ITO. استمر في إذابة الجليد حتى ينتقل قسم الأنسجة من نسيج شفاف إلى قوام معتم / غير لامع.
- انقل شرائح المجهر المثبتة على الأنسجة على الثلج الجاف إلى صندوق جاف مع مادة مجففة للتخزين لتحليلها في نفس اليوم ، أو تخزينها في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
9. تحضير مجموعة التحكم غير المصابة مقابل أنسجة سيكال الفأر المصابة بالمطثية العسيرة لتطبيق المصفوفة وقياس الطيف الكتلي التصويري MALDI
- قم بإجراء تطبيق مصفوفة MALDI باستخدام نفس البروتوكول الموضح في الخطوة 4 (درجة حرارة الفوهة 30 درجة مئوية ، ثماني تمريرات ، معدل تدفق 0.1 مل / دقيقة ، نمط CC ، وقت تجفيف 0 ثانية ، 10 رطل / بوصة مربعة).
- قم بإجراء قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI باستخدام نفس البروتوكولات الموضحة في الخطوتين 5 و 6.
- تحليل الصور الأيونية من مكررات بيولوجية متعددة ومقارنة النتائج من أجل الأهمية عبر مقارنات مخطط مربع الكثافة باستخدام البرنامج الإحصائي SCiLS المشار إليه أعلاه.
ملاحظة: تعتمد الاختبارات والمقارنات الإحصائية المناسبة على التطبيق ويمكن أن تشمل التجزئة المكانية ونماذج التصنيف والتحليل المقارن لتحديد السمات الطيفية التمييزية والمترابطة. يمكن أن تشمل التحليلات المقارنة تعيين قيم p للميزات المهمة ، وإنشاء تحليلات المكونات الرئيسية لمقارنات الأنسجة ، وتصور مخططات الصندوق لتحديد الاختلافات. من المفيد أيضا تصور الأنسجة باستخدام الفحص المجهري برايت فيلد لقسم الأنسجة الملطخ عبر الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) بعد قياس الطيف الكتلي للتصوير. يتيح ذلك التحديد الواضح للسمات المورفولوجية في الأنسجة ويمكن تحليلها بالتشاور مع أخصائي علم الأمراض المدرب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد أجرينا قياس الطيف الكتلي للتصوير MALDI بالمستقلب للمستعمرات البكتيرية النموذجية والفئران المستعمرة مع E. faecalis و C. difficile لدراسة دور الأحماض الأمينية في تفاعلات الميكروب والميكروب. تعمل المستعمرات البكتيرية الكبيرة المزروعة على أجار كنموذج محدد جيدا لتحليل التغيرات الكيميائية الحيوية المميزة في تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية. من المهم ضمان عملية تجفيف محكومة لمستعمرات الثقافة البكتيرية الكبيرة المزروعة على وسط أجار لتقليل التشوهات والتشقق في سطح أجار. تم تحقيق ذلك من خلال عملية من خطوتين ، تتضمن التجفيف الأولي باستخدام مادة مجففة تحت درجة الحرارة والضغط المحيطين ، تليها خطوة تجفيف أسرع بمساعدة الفراغ يتم إجراؤها عند درجة حرارة مرتفعة. تم استخدام جهاز تجفيف مصمم خصيصا لتسهيل جفاف الآجار أثناء التقاط إطلاق أي ملوثات بكتيرية أو جراثيم من العينات (الشكل 1). تعد خطوة التجفيف بالتفريغ الإضافية ضرورية لضمان تجفيف العينات تماما ولن تتعرض للتشوه عند التعرض لفراغ MS.
كانت أقسام أجار في البداية 2-4 مم في ارتفاع العينة (الشكل 2 أ) وتم تخفيضها إلى ~ 0.5 مم في الارتفاع وفقا لبروتوكول التجفيف (الشكل 2 ب). من المهم ضمان تجفيف موحد عبر سطح العينة أثناء بروتوكول تحضير العينات هذا. ستؤدي الاختلافات الكبيرة في ارتفاع العينة إلى شعاع ليزر MALDI غير مركز على سطح العينة ، مما قد يؤثر بشكل ضار على كفاءة التأين وكثافة أيون التحليل الناتج. يظهر مثال على عملية تجفيف غير ناجحة في الشكل 2D ، حيث يكون سطح أجار قد فقاعات وتشقق ، مما يجعل العينة غير صالحة للاستعمال لمزيد من التحليل. بمجرد تجفيف العينة البكتيرية تماما ، يتم تطبيق طبقة مصفوفة DAN MALDI باستخدام بخاخ آلي (الشكل 3). تسمح هذه الأداة بالتحكم الدقيق في معلمات الرش ، مما يتيح تطبيق طلاء مصفوفة موحد (الشكل 2C).
بعد تطبيق المصفوفة ، يتم إدخال شرائح المجهر التي تحتوي على العينات في محول شرائح لتحليلها على FTICR MS (الشكل 4). يتم تسجيل الإحداثيات الموجودة على الشريحة بين برنامج الحصول على قياس الطيف الكتلي للتصوير وكاميرا الجهاز عن طريق رسم علامات إيمانية أولا على الشريحة حول المناطق المراد قياسها (يشار إليها برموز "+" في الشكل 4). ثم يتم مسح الشريحة رقميا باستخدام ماسح ضوئي مسطح لتسجيل صورة بصرية ، والتي يتم استخدامها بعد ذلك لتحديد تسلسل الاستحواذ في برنامج flexImaging . قمنا بتحسين إعدادات أداة قياس الطيف الكتلي لنقل واكتشاف أنيونات الأيض. باستخدام التخصيب الأيوني في الطور الغازي CASI ، تم تحديد نافذة عزل الأيونات لتجميع الأيونات بشكل انتقائي عند m / z 150 ± 50 Da (الشكل 5A) ، والتي تحتوي على مجموعة من المركبات التي لوحظت من سطح الأنسجة. هنا على وجه التحديد لعدوى المطثية العسيرة ، وجدنا مسارات الأحماض الأمينية لإظهار أدوار مثيرة للاهتمام ومتغيرة أثناء الهدم البكتيري. واستنادا إلى قياسات دقيقة للكتلة، تم تحديد الإشارات الأيونية عند m/z 131.083 وm/z 173.104 على أنها أورنيثين (خطأ كتلي قدره 0.34 جزء في المليون؛ و m/z 173.104 الشكل 5 ب) وأرجينين (0.43 جزء في المليون خطأ في الكتلة; الشكل 5C) ، على التوالي.
تم إجراء تصوير قياس الطيف الكتلي للمستعمرات البكتيرية الكبيرة على الزراعات الأحادية لبكتيريا المطثية العسيرة وعلى مستعمرات الزراعة المشتركة لبكتيريا المطثية العسيرة + الإشريكية البرازية (الشكل 6). وتبرز صورة بصرية للعينات بعد تطبيق مصفوفة MALDI مناطق الاكتساب ذات الأهمية، والتي تمتد إلى المناطق الخارجية للأغشية الحيوية للمستعمرات (الشكل 6 أ، جيم). يسمح قياس الطيف الكتلي التصويري لهذه العينات برسم الخرائط المكانية لكل من مستقلبات الأحماض الأمينية ornithine و arginine ، والتي وجد أنها متغيرة وموضعية بشكل تفاضلي في وجود E. faecalis (الشكل 6B ، D). على سبيل المثال ، يكون الأرجينين أكثر وفرة بشكل ملحوظ في الزراعة الأحادية لبكتيريا المطثية العسيرة مقارنة بالاستزراع المشترك لبكتيريا المطثية العسيرة + الإشريكية البرازية (الشكل 6 د). لقد قمنا أيضا بتوسيع تحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري لتشمل نماذج الفئران المصابة باستخدام الفئران الإناث C57BL / 6 الخالية من الجراثيم البالغة من العمر 8 أسابيع والتي أصيبت إما بجراثيم المطثية العسيرة ، أو جراثيم المطثية العسيرة + خلايا E. faecalis (بالوزن) (5 × 108 / مل) ، أو طافر ترانسبوزون يحتوي على كل من جراثيم المطثية العسيرة + خلايا E. faecalis (ArcD الطافرة) (5 × 108 / مل) (الشكل 7)27 . تم حصاد الأعور الفأر وتجميده في مركب OCT بنسبة 25٪ للحفاظ على شكل العضو وإخلاصه. ساعد مركب OCT أيضا في دعم أقسام الأنسجة الرقيقة أثناء الاستئصال بالتبريد. على غرار البروتوكول المذكور أعلاه ، يتم طلاء أقسام الأنسجة بطبقة مصفوفة DAN MALDI ، ويتم مسحها ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي مسطح (الشكل 7B) ، ويتم تحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI (الشكل 7C). تم إجراء تلطيخ الأنسجة على أقسام الأنسجة بعد تحليل مطياف الكتلة التصويري ، وتم استخدام المسح البصري برايت فيلد عالي الدقة لتقييم مورفولوجيا الأنسجة (الشكل 7 أ). من الواضح أن طبقة الخلايا الظهارية ملتهبة أثناء العدوى مقارنة بأنسجة التحكم.
الشكل 1: جهاز تجفيف الفراغ محلي الصنع. يتم استخدام جهاز تجفيف فراغي مصمم خصيصا لتسريع إزالة الرطوبة من عينات أجار. يتم وضع العينات في غرفة التفريغ ، والتي يتم إغلاقها وإخلائها باستخدام مضخة دوارة دوارة ، ثم تسخينها باستخدام محول متغير الجهد. يتم احتجاز أي أبخرة / جراثيم ملوثة من العينة في المصيدة الباردة ومرشحات HEPA المضمنة. عادة ما يتم استخدام ضغوط 100-150 mTorr. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تجفيف وتحضير المستعمرات الكبيرة البكتيرية. صور بصرية لعينات الآجار (A) قبل و (B) بعد إزالة الرطوبة باستخدام التجفيف والتجفيف بمساعدة التفريغ. (ج) يتم تطبيق مصفوفة 1،5-ديامينونفثالين MALDI على المزرعة البكتيرية المشتركة بعد التجفيف باستخدام بخاخ آلي. (د) يؤدي التجفيف غير الناجح عادة إلى التشقق والفقاعات داخل الآجار ، مما يجعله غير قابل للاستخدام لمزيد من التحليل. الاختصارات: DAN = 1،5-ديامينونفثالين. MALDI = الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الرش الروبوتي لمصفوفة MALDI على عينات الأغاروز. صور (A) بخاخ HTX M5 TM و (B) عينات من الأغاروز محملة في بخاخ المصفوفة الروبوتية لتطبيق مصفوفة MALDI. الاختصار: MALDI = الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: محول مطياف الكتلة مع عينات محملة للتحليل. يتم تحميل عينات الأغاروز المغلفة بالمصفوفة في محول شرائح MTP لتحليل MALDI. تظهر العلامات الائتمانية كعلامات زائد سوداء ("+"). الاختصار: MALDI = الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أطياف الكتلة التمثيلية لقمم أيونات الأيض المحددة. (أ) وضع الأيونات السالبة يسمح تحليل MALDI لعينات المستنبتة البكتيرية بالكشف عن عشرات المستقلبات. تسمح قياسات الكتلة الدقيقة عالية الدقة بالتحديد المبدئي ل (B) ornithine عند m / z 131.083 (خطأ كتلة 0.34 جزء في المليون) و (C) أرجينين عند m / z 173.104 (خطأ كتلة 0.43 جزء في المليون). يتم الحصول على أطياف الكتلة باستخدام قوة تحليل الكتلة (FWHM) البالغة 75000 عند m / z 150. الاختصارات: MALDI = الامتزاز/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة؛ FWHM = العرض الكامل بنصف الحد الأقصى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تحليل قياس الطيف الكتلي التصويري للمستعمرات البكتيرية الكبيرة. (أ ، ج) توضح الصور البصرية لعينات الأغاروز مناطق القياس لتحليل قياس الطيف الكتلي للتصوير ، والتي يتم تمييزها بخطوط بيضاء متقطعة. (ب، د) تعرض صور أيون MALDI للأورنيثين (م / ض 131.083 ، 0.038 جزء في المليون) والأرجينين (م / ض 173.104 ، 0.60 جزء في المليون) توزيعات مكانية فريدة عبر الثقافات البكتيرية. لاحظ أن مقاييس الشدة المطلقة تختلف بالنسبة لصور أيون الاستزراع المشترك الموضحة في اللوحتين B و D. على سبيل المثال ، يكون الأرجينين أكثر وفرة بشكل ملحوظ في الزراعة الأحادية ل C. difficile بالنسبة إلى الثقافة المشتركة في اللوحتين C و D ، مما يعني أن مقياس الكثافة هذا متعلق بوفرة الأرجينين في الزراعة الأحادية ، ويبدو أنه لا يوجد أرجينين موجود في هذه الثقافة المشتركة. على العكس من ذلك ، فإن الثقافة المشتركة في A و B تعرض شدة الأرجينين على مقياس شدة مطلق أقل ، لأن هذه هي العينة الوحيدة في الصورة. الاختصارات: MALDI = الامتزاز/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة؛ CASI = التراكم المستمر للأيونات المحددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل قياس الطيف الكتلي التصويري لأنسجة الفئران المصابة. (أ) تسمح صور برايتفيلد المجهرية للأنسجة الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين من سيكا الفئران المصابة بتصور مورفولوجيا الأنسجة. (ب) تظهر الصور البصرية لأنسجة الفأر ceca العينات بعد تطبيق طبقة مصفوفة DAN MALDI. (C) تعرض صور أيون MALDI للأورنيثين (م / ض 131.083 ، 0.88 جزء في المليون) والأرجينين (م / ض 173.104 ، 0.15 جزء في المليون) توزيعات مكانية فريدة عبر عينات الأنسجة. الاختصارات: MALDI = الامتزاز/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة؛ دان = 1،5-ديامينونفثالين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء قياس الطيف الكتلي للتصوير MALDI ، من المهم أن يكون لديك سطح عينة مسطح لتوفير قطر بؤري ثابت لليزر MALDI الساقط على ركيزة العينة. يمكن أن تتسبب الانحرافات في ارتفاع العينة في انحراف شعاع الليزر MALDI عن التركيز ، مما يتسبب في حدوث تغييرات في قطر الحزمة وشدتها ، مما قد يؤثر على كفاءة تأين MALDI. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات في كفاءة التأين إلى اختلافات في شدة التحليل عبر سطح الأنسجة لا تعكس الكيمياء الحيوية الأساسية للأنسجة ، ولكنها بدلا من ذلك تعكس تضاريس السطح. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم مصادر التأين MALDI تعمل عند ضغوط تحت الغلاف الجوي، وعينات الآجار المماهية هي عينات هشة عند تعرضها في ظروف الفراغ . يمكن أن يتسبب فراغ هذه المصادر في جفاف عينات الأغاروز ، مما قد يغير سطح العينة أثناء التجفيف. العينات التي تحتوي على جيوب هوائية أو كميات كبيرة من الماء معرضة بشدة لهذه التغييرات. تصادف هذه المشكلة بشكل شائع أثناء تحليل قياس الطيف الكتلي التصويري MALDI للعينات البكتيرية المزروعة على أجار. يحتوي أجار المغذيات على نسبة عالية من الماء لتسهيل نمو البكتيريا. ومع ذلك ، من الضروري إزالة أكبر قدر ممكن من الرطوبة قبل تطبيق طلاء مصفوفة MALDI وإدخال العينة إلى فراغ مطياف الكتلة.
لذلك فإن عينات الآجار المائية لا تفضي إلى تحليل الفراغ . بالإضافة إلى التغيرات المورفولوجية التي تسببها ظروف الفراغ ، هناك أيضا مشكلات محتملة موجودة مع ارتفاعات العينة التي تبرز بعيدا جدا عن محول شريحة اللوحة المستهدفة MALDI ، والذي يستخدم للاحتفاظ بالعينة المثبتة على الشريحة المجهرية وإحضارها إلى الموضع المناسب لنقطة الاتصال بالليزر MALDI. يتم الاستدلال على آلية مرحلة MALDI بإحكام مع المكونات الميكانيكية الأخرى للمرحلة ، وأثناء وجودها في الموقع ، لا يوجد سوى خلوص بضعة ملليمترات بين سطح لوحة هدف العينة والطرف الأمامي لبصريات مصدر الأيونات. يمكن أن يتسبب ذلك في كشط العينة ، مما قد يؤدي إلى تحريك العينة المراد تحليلها أو تفكيكها تماما. علاوة على ذلك ، في حين أن عينات الآجار المائية تلتصق بشكل طبيعي بسطح شريحة المجهر ، فإن هذا يميل إلى أن يكون أضعف بكثير من التصاق عينة أجار جافة تماما. لذلك ، تبرز عينات الآجار المائية بعيدا عن سطح اللوحة المستهدفة للعينة ولها التصاق أضعف ، مما يتسبب في زيادة خطر تفكيك العينة وتقشرها في بصريات الأيونات لأداة المصب.
كما أن هوية مصفوفة MALDI واختيار طريقة التطبيق متغيران مهمان يجب مراعاتهما في تجربة قياس الطيف الكتلي للتصوير. يعتمد اختيار مصفوفة MALDI العضوية إلى حد كبير على ركيزة العينة والمركبات المستهدفة ذات الأهمية. على سبيل المثال ، تتكون العديد من المستقلبات منخفضة الوزن الجزيئي (MW < 300 Da) من العديد من الأحماض العضوية والفوسفات والأجزاء الأخرى ، والتي تتأين بسهولة أكبر في القطبية السلبية28. بالنسبة لتحليل الوضع السلبي ، يفضل استخدام المصفوفات الأساسية ، بحيث تكون هياكلها الكيميائية أكثر قابلية لقبول البروتون (على سبيل المثال ، 9-أمينواكريدين ، 1،5-ديامينونابتالين) ، وبالتالي ترك شحنة سالبة على العديد من أيونات الأيض الصغيرة ذات الأهمية. أجرينا شاشة مصفوفة للتحليلات المستهدفة ذات الأهمية ووجدنا أن مصفوفة 1،5-ديامينونابتالين (DAN) أنتجت أعلى إشارة لمستقلبات الأحماض الأمينية ذات الأهمية لعينات الأنسجة الضابطة. أثناء تطبيق مصفوفة MALDI ، يتم استخراج التحليلات ذات الأهمية من ركيزة العينة وتتبلور مع مصفوفة MALDI. وفي بعض الحالات، تيسر ظروف تطبيق المصفوفة "الأكثر رطوبة" زيادة الاستخراج والتبلور المشترك، مما يؤدي إلى تحسين الكشف عن المواد المراد تحليلها عند تحليل MALDI. ومع ذلك، إذا كانت عملية تطبيق المصفوفة تستخدم الكثير من المذيب، فقد تكون المواد المراد تحليلها غير متمركزة داخل النسيج. من المهم تحقيق توازن بين الاستخراج الفعال للتحليل والحفاظ على الدقة المكانية للتحليلات في الأنسجة عند اختيار شروط تطبيق المصفوفة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام جهاز التسامي المصمم خصيصا لتطبيق طبقة مصفوفة متجانسة على أسطح العينات وينتج أحجام بلورية مصفوفة صغيرة للغاية29,30. ومع ذلك ، فإن هذه العملية جافة تماما وقد لا تكون مثالية لاستخراج المادةالمراد تحليلها 31. يوفر البخاخ الآلي المستخدم هنا تحكما دقيقا وقابلا للتكرار في ضغط الرش ومعدل التدفق ودرجة حرارة الفوهة والمعلمات الأخرى التي يمكن أن تسمح بطرق محسنة لاستخراج التحليل والتبلور المشترك للمصفوفة32.
تم تحسين المعلمات الفعالة على FTICR MS المستخدمة هنا لنقل واكتشاف أيونات الأيض في وضع الأيونات السالبة. يتضمن ذلك ضبط عناصر RF و DC في منطقة نقل الأيونات لنقل الأيونات ذات الوزن الجزيئي المنخفض بشكل تفضيلي (<m / z 200). تشمل المعلمات التي لها تأثير كبير على انتقال الأيونات سعة RF القمعية (65 فولت) ، وإعداد الكتلة Q1 لعزل أيون مرشح الكتلة الرباعي (m / z 150) ، وتأخير وقت الرحلة بين خلية تراكم القطب السداسي وخلية ICR (0.400 مللي ثانية). تنقل قيم المعلمات المختارة هذه بشكل أكثر كفاءة أيونات ذات قيم m / z منخفضة على حساب كفاءات نقل الأيونات ذات القيم m / z الأكبر. علاوة على ذلك ، استخدمنا نهج التراكم المستمر للأيونات المختارة (CASI) ، والذي يسمح بالتخصيب الانتقائي للأيونات في نافذة اهتمام كتلة محددة. في هذا النهج ، يتم استخدام مرشح الكتلة الرباعية لنقل نطاق صغير من قيم m / z بشكل انتقائي من مصدر التأين إلى خلية تراكم القطب السداسي في الجهاز ، في حين أن الأيونات ذات قيم m / z خارج نافذة الكتلة هذه لها مسارات أيونية غير مستقرة ولا تنتقل عبر مرشح الكتلة الرباعي. وهذا يسمح بالتخصيب الانتقائي للتحليلات ذات الوفرة المنخفضة ذات الأهمية لتحسين حد الكشف والمدى الديناميكي بما يصل إلى ثلاثة أوامر من حيث الحجم من خلال القضاء على الضوضاء الكيميائية. تسمح قوة تحليل الكتلة العالية ودقة الكتلة لمنصة أداة FTICR بالفصل السهل للمركبات متساوية الضغط (أي نفس الكتلة الاسمية) والتحديد المبدئي للمستقلبات.
يمكن أن يسمح التحكم الدقيق والقابل للتكرار في تحضير العينات ، وتطبيق مصفوفة MALDI ، وتحليلات قياس الطيف الكتلي التصويري بمناظر قابلة للتكرار للكيمياء الحيوية البكتيرية في المستعمرات وعينات الأنسجة. تعمل المستعمرات البكتيرية الكبيرة كنماذج مبسطة لتوصيف التواصل الأيضي لمسببات الأمراض أثناء العدوى الميكروبية ، والتي يمكن مقارنتها بعد ذلك بأنظمة أكثر تعقيدا مثل الأنسجة الحيوانية. على سبيل المثال ، وجد أن الأرجينين وفير بشكل منخفض في عينة الثقافة المشتركة ل C. difficile + E. faecalis مقارنة بثقافة المطثية العسيرة وحدها (الشكل 6) ، والتي تدعمها قدرة E. faecalis الملحوظة على استهلاك الأرجينين كمصدر للطاقة وتصدير الأورنيثين من الخلية من خلال ArcD antiporter33. أدت نتائج المستعمرة الكبيرة إلى التحقيق في هذا التنظيم للأحماض الأمينية في نموذج حيواني. أظهرت الفئران المصابة بالمطثية العسيرة + المطثية البرازية (بالوزن) أرجينين أقل بكثير من الفئران المصابة بالمطثية العسيرة وحدها (الشكل 7C) ، ملخصة نتائج صورة المستعمرة.
لاختبار فرضية استقلاب الأرجينين ومشاركة مضاد ArcD ، استخدمنا متحولا transposon يقرع نقل الأيض من خلال مضاد ArcD الخاص ب E. faecalis. تظهر الفئران المصابة بالمطثية العسيرة + E. faecalis (arcD::Tn) زيادة في الكشف عن الأرجينين وانخفاضا في اكتشاف الأورنيثين بالنسبة لنموذج العدوى المشتركة من النوع البري (الشكل 7C) وتنقذ بشكل عام مستويات الأحماض الأمينية الأصلية التي لوحظت في نموذج عدوى المطثية العسيرة وحدها (الشكل 7 أ). تؤكد هذه العلاقة العكسية لتنظيم الأيض النتائج التي تفيد بأن E. faecalis يتغذى على مغذيات الأحماض الأمينية المنتجة من المطثية العسيرة. علاوة على ذلك ، أظهر التحليل النسيجي تلفا خلويا واسع النطاق من الفئران المصابة بكل من المطثية العسيرة و E. faecalis ، والتي لوحظت في المقام الأول في سلالة من النوع البري من E. faecalis مقابل طفرة ArcD transposon. تدعم هذه النتائج النتائج التي توصلنا إليها مؤخرا بأن الأرجينين والأورنيثين هما مفتاح ضراوة المطثية العسيرة والسلوك و
اللياقةالبدنية 27. بشكل عام ، يوضح سير العمل هذا طريقة فعالة لإعداد المستعمرات البكتيرية الكبيرة القائمة على أجار لقياس الطيف الكتلي التصويري MALDI ويظهر أن هذه الأنظمة يمكن أن تكون بمثابة نماذج مفيدة لفحص التعاون الميكروبي أثناء العدوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) بموجب جائزة GM138660. تم دعم JTS من قبل زمالة تشارلز ومونيكا بوركيت الصيفية للعائلة من جامعة فلوريدا. تم دعم JPZ من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة K22AI7220 (NIAID) و R35GM138369 (NIGMS). تم دعم ABS من خلال منحة التدريب على البيولوجيا الخلوية والجزيئية في جامعة بنسلفانيا (T32GM07229).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
- Biteen, J. S., et al. Tools for the microbiome: nano and beyond. ACS Nano. 10 (1), 6-37 (2016).
- Shreiner, A. B., Kao, J. Y., Young, V. B. The gut microbiome in health and in disease. Current Opinion in Gastroenterology. 31 (1), 69-75 (2015).
- Watrous, J. D., Alexandrov, T., Dorrestein, P. C. The evolving field of imaging mass spectrometry and its impact on future biological research. Journal of Mass Spectrometry. 46 (2), 209-222 (2011).
- Gessel, M. M., Norris, J. L., Caprioli, R. M. MALDI imaging mass spectrometry: spatial molecular analysis to enable a new age of discovery. Journal of Proteomics. 107, 71-82 (2014).
- Fang, J., Dorrestein, P. C. Emerging mass spectrometry techniques for the direct analysis of microbial colonies. Current Opinion in Microbiology. 19, 120-129 (2014).
- Wheatcraft, D. R. A., Liu, X., Hummon, A. B. Sample preparation strategies for mass spectrometry imaging of 3D cell culture models. Journal of Visualized Experiments. (94), e52313 (2014).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Capturing small molecule communication between tissues and cells using imaging mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (146), e59490 (2019).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry of three-dimensional cell culture systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C.
- Dunham, S. J. B., Ellis, J. F., Li, B., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging of complex microbial communities. Accounts of Chemical Research. 50 (1), 96-104 (2017).
- Frydenlund Michelsen, C., et al. Evolution of metabolic divergence in Pseudomonas aeruginosa during long-term infection facilitates a proto-cooperative interspecies interaction. Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10 (6), 1323-1336 (2016).
- Si, T., et al. Characterization of Bacillus subtilis colony biofilms via mass spectrometry and fluorescence imaging. Journal of Proteome Research. 15 (6), 1955-1962 (2016).
- Wakeman, C. A., et al. The innate immune protein calprotectin promotes Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus interaction. Nature Communications. 7, 11951 (2016).
- Phelan, V. V., Fang, J., Dorrestein, P. C. Mass spectrometry analysis of Pseudomonas aeruginosa treated with azithromycin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (6), 873-877 (2015).
- Ferreyra, J. A., et al. Gut microbiota-produced succinate promotes C. difficile infection after antibiotic treatment or motility disturbance. Cell Host & Microbe. 16 (6), 770-777 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).
- Schubert, A. M., et al. Microbiome data distinguish patients with Clostridium difficile infection and non-C. difficile-associated diarrhea from healthy controls. mBio. 5 (3), 01021-01014 (2014).
- Auchtung, J. M., et al. Identification of simplified microbial communities that inhibit Clostridioides difficile infection through dilution/extinction. mSphere. 5 (4), 00387 (2020).
- Zackular, J. P., et al. Dietary zinc alters the microbiota and decreases resistance to Clostridium difficile infection. Nature Medicine. 22 (11), 1330-1334 (2016).
- Tomkovich, S., Stough, J. M., Bishop, L., Schloss, P. D. The initial gut microbiota and response to antibiotic perturbation influence Clostridioides difficile clearance in mice. mSphere. 5 (5), 00869 (2020).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous matrix deposition on dried agar for MALDI imaging mass spectrometry of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Yang, J. Y., et al. Primer on agar-based microbial imaging mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Prentice, B. M., et al. Dynamic range expansion by gas-phase ion fractionation and enrichment for imaging mass spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (19), 13092-13100 (2020).
- Bemis, K. D., et al. Cardinal: an R package for statistical analysis of mass spectrometry-based imaging experiments. Bioinformatics. 31 (14), 2418-2420 (2015).
- Robichaud, G., Garrard, K. P., Barry, J. A., Muddiman, D. C. MSiReader: An open-source interface to view and analyze high resolving power MS imaging files on Matlab platform. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (5), 718-721 (2013).
- Bokhart, M. T., Nazari, M., Garrard, K. P., Muddiman, D. C. MSiReader v1.0: Evolving open-source mass spectrometry imaging software for targeted and untargeted analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (1), 8-16 (2018).
- Smith, A. B., et al. Enterococci enhance Clostridioides difficile Pathogenesis. Nature. , (2022).
- Korte, A. R., Lee, Y. J. MALDI-MS analysis and imaging of small molecule metabolites with 1,5-diaminonaphthalene (DAN). Journal of Mass Spectrometry. 49 (8), 737-741 (2014).
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (9), 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: Enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Analytical Chemistry. 84 (4), 2048-2054 (2012).
- Huizing, L. R., et al. Development and evaluation of matrix application techniques for high throughput mass spectrometry imaging of tissues in the clinic. Clinical Mass Spectrometry. 12, 7-15 (2019).
- Anderton, C. R., Chu, R. K., Tolić, N., Creissen, A., Paša-Tolić, L. Utilizing a robotic sprayer for high lateral and mass resolution MALDI FT-ICR MSI of microbial cultures. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 556-559 (2016).
- Gilmore, M. S., Clewell, D. B., Ike, Y., Shankar, N. Enterococci: From commensals to leading causes of drug resistant infection. Massachusetts Eye and Ear Infirmary. , Boston. (2014).
